JPS63157977A - ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクローナル抗体を含有する敗血症治療薬及びリューマチ性疾患治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ　）に対して特異
性の高いモノクロナール抗体（ｍＡｂ　）を合成する雑
種細胞系、ＴＮＦに対するモノクロナール抗体、この雑
種細胞系及び抗体の製法、ならびにこのモノクロナール
抗体の使用に関する。

マウス骨髄腫細胞と免疫されたマウスからの脾臓細胞と
の融合（コーラ−及びミルシュタイン著、ネイチャー第
２５６巻１９５７年４９５〜４９７頁参照）により、均
質な（モノクロナール）抗体を産生ずる連続的な細胞系
を得ることが可能であることが初めて示された。それ以
来、種々の雑種細胞（ハイブリドーマと呼ばれる）を製
造するため、そしてそれが産生ずる抗体を種々の科学的
研究に使用するための多くの試みがなされた（カレント
・トピックス・イン・マイクロバイオロジイ・アンド・
イムノロシイ第８巻：リンホサイト・バイブリド−マス
、シュプリンガー出版社１９７８年参照）。

その生物学的性質のため、ＴＮＦは腫瘍性疾患の興味深
くかつ有望な処置剤であることが明らかである。天然細
胞中のＴＮＦの濃度がきわめて低いため、初期には詳細
な研究は失敗に終った。

ヒト蛋白質を下等生物中でクローニングできる可能性を
有する遺伝子操作が開発されるまでは、ＴＮＦを微生物
中で発現させることはできなかった。高度に精製された
形で、この組換えＴＮＦ　（ｒＴＮＦ　）は天然ＴＮＦ
　（ｎＴＮＦ　）と同じ効果を有する。

科学的研究ならびに治療上の使用は、ＴＮＦの活性ばか
りでなく蛋白質ＴＮＦ自体を検出することを必要にした
。生物学的活性の測定は常に血判で費用がかかる。

本発明は、組換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ　）により
免疫されたマウスの骨髄腫細胞と脾臓細胞との細胞融合
により得られたものであり、そして天然及び／又は組換
えＴＮＦと反応するモノクロナール抗体を産生ずる雑種
細胞系、ならびに天然及び／又は組換えＴＮＦと反応す
る新規なモノクロナール抗体である。

ングし、そして細胞が生長したのち、抗ヒト腫瘍壊死因
子特異性を有するモノクロナール抗体を分離することを
特徴とする、このモノクロナール抗体の製法である。

モノクロナール抗体の製造は公知の方法（モノクロナー
ル・アンテイボデイズ、ケネットら著、プレナム・プレ
ス社発行、１９８０年３６３〜４１９頁参照）に基づい
て行われた。

ＢＡＬＢ／ｃマウスを、大腸菌からの精製組換えＴＮＦ
の少量を繰返し注射することにより免疫した。血清中に
充分な抗体が検出されるとすぐに、この動物の脾臓細胞
を骨髄腫細胞と融合し、そして雑種を培養した。

個々の培養物は、ＴＮＦに対する特異的抗体の濃度につ
いてのスクリーニング試験にかけられた。

適当なハイプリドーマの単一細胞から導かれたコロニー
を、制限希釈クローニング法により分離した。この方法
により４種の雑種細胞系が得られ、これらが異なる性質
を有するモノクロナール抗体を分泌することにより区別
された。

すなわち雑種細胞系ＡＭ−１、ＡＭ−１１４、ＡＭ　−
１９５及びＡＭ−１９９である。これらの細胞系は、英
国ソリズバリイＳＰ４０Ｊ６・ボートン・ダウン所在の
応用微生物学及び研究のためのＰＨＬ　Ｓセンター、動
物細胞培養物のヨーロッパ収集所（ＥＣＡＣＣ）に、番
号８７−０５０８０１．８７−０５０８０２．８７−０
５０８０３及び８７−０５０８０４として寄託されてい
る。

これらの雑種細胞を、試験管内及び生体内の両方の培養
により生長させた。生体内での高い生長速度はこの培養
法を特に好適にした。プリスタン（Ｒ）により前処理さ
れた名称Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃマウスに、各雑種株の細胞
を腹腔内注射により与えた。形成された腹水腫瘍を８〜
１０日後に採取した。

ＴＮＦに対するモノクロナール抗体は、試験管内細胞培
養又は腹水液からの上澄液を〆精製処理することにより
分離された。精製はブルッフらの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ第５６巻１９８２年６１６〜
６１９頁参照）に基づいて行われた。

モノクロナール抗体の分子の特性は下記のように決定さ
れた。

精製された抗体の分子量は１５００００ダルトンに等し
いかそれより大きい（ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により測定）。

抗体ＡＭ−１、ＡＭ−１１４及びＡＭ−１９９はＩｇＧ
１型のもので、その重鎖はガンマ１である。

抗体ＡＭ−１９５はＩｇＧ３型のもので、その重鎖はガ
ンマ３である。軽鎖はすべての抗体においてカッパであ
る（　ＥＬＩＳＡにおけるサブタイプ特異的抗体により
測定）。

モノクロナール抗体は、〉１０°Ａ’／ｍｏｌ程度の高
い親和定数を有し、リンホトキシンと交叉反応しない。

ＴＮＦ分子上の個々の抗体のための結合部位の相対的位
置は、抗体の競合結合により調べられた。

ＴＮＦをマイクロ滴定板上に固定した。１種のビチオン
標識抗体を、他の未標識抗体とともに保温した。ＴＮＦ
上の類似の部位に対し抗体の相互反応がある組合せを調
べた。抗体ＡＭ−１９５が結合するエピトープは、ＡＭ
−１及びＡＭ＝１９９のためのそれと相違する。ＡＭ−
１１４についてわずかな競合が観察された。

ＴＮＦ活性は普通の細胞毒検定法により測定された。組
換え及び天然ＴＮＦを過剰の抗体とともに保温した。両
ＴＮＦ標本の細胞毒活性は抗体ＡＭ−１９５により中和
された。ＡＭ−１１４による中和は１／１０の強さであ
った。この知見は、抗原上の異なる領域が種々の抗体と
別様に反応すると仮定することにより説明できる。ＡＭ
−１９５モノクロナ一ル抗体だけが、生物学的活性に対
して責任のある部位と反応する。

抗体の結合及びＴＮＦの中和の結果は、ＴＰＮの少なく
とも６種の異なるエピトープを認めることができ、そし
てモノクロナール抗体の採取により定義しうろことを示
すものである。

抗体を用いて特定の抗原を検出するためには、原則とし
て二つの検定方法が可能である。両者において、抗原中
に天然の標識がない場合には一方の成分を標識する必要
がある。抗原に、例えば放射活性標識同位体により標識
を行い、この場合は通常は競合置換検定法例えばラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）を用い、あるいは抗体を標識
する。この場合の好ましい検定法の型はイムノラジオメ
トリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬ
ＩＳＡ）又は化学発光測定法である。これら種々の測定
法及びその変法の詳細は、この技術の専門家に公知であ
る。

他の選択は、低分子量ハプテンの抗体とのカップリング
であり、これは第二の反応により特異的に検出できる。

普通に用いられるものの例は、ストレプトアビジンと反
応するビオチンである。従って本発明のすべての抗体は
、長鎖ビオチンにより標識され、後続の段階においてス
トレプトアビジン／セイヨウワサビパーオキシダーゼを
用いて可視化された。

本明細書に記載される検定法は、固相サンドイッチＥＬ
ＩＳＡである。未標識の抗体（ＡＭ−１又はＡＭ−１９
９）を受身吸着又は共有結合により表面例えばマイクロ
滴定板に結合し、そしてこの表面を既知の手段で非特異
的結合に対してブロックした。ＴＮＦ含有試料及びビオ
チンで標識した抗体ＣＡＭ−１９５）を、ピペットでウ
ェル中に入れ、そして保温した。試料中のＴＮＦを１０
ｐｇ／ｍｌの検出限界で検出できることが示された。ｒ
ＴＮＦはマウスＬ９２９の類１］定において８、Ｏｘ　
１０’　Ｕ　／１ｎ９の比活性を有するので、このＥＬ
ＩＳＡ法により０．１ＵのＴＮＦ／ｍｌを検出すること
が可能である。ウェスタン・プロッティング法は抗体が
ヒト血清のどの成分とも交叉反応しないことを示した。

従って本発明の抗体は、ＴＮＦにより処置された患者の
血清中のＴＮＦを測定するために用いることができる。

これらの抗体は現行の診断の目的に、例えば血清及び血
漿中のＴＮＦレベルを検査するために用いることもでき
る。

本発明の抗体はＴＮＦを不活性化するので（実施例６参
照）、血中ＴＮＦ濃度が上昇する疾７瞥、例えば敗血症
性ショックの処置のために使用できる。さらに次の障害
におけるＴＮＦ抗体での処置があげられる。移植拒絶反
応、アレルギー、自己免疫性疾患、リウマチ性障害、肺
ショック、炎症性骨疾患、凝固障害及び火傷。この目的
に適する抗体は、ＴＮＦの細胞毒活性を中和するもので
ある。

ＴＮＦを含有する生物学的材料からＴＮＦを抽出するた
めに、免疫アフイニテイクロマトグラフイな用いること
もできる。このためには抗体を既知の方法によりゲルマ
トリックスに結合し、これにＴＮＦ含有溶液を通過させ
る。

下記の実施例により本発明をより詳細に説明する。

　１２　一 実施例１ モノクロナール抗体の製造 （ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫 雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全なフロイントのアジュ
バント０．５　ｍｌ中のｒＴＮＦ　３０μｇを用いて腹
腔内注射（ｉ、ｐ、）により免疫した。１４日後に動物
に、不完全なフロイントのアジュバント中の抗体６０μ
ｇを再び腹腔内注射により投与した。さらに２回の腹腔
内注射による免疫を、各３０μｇの抗体を用いて１４日
の間隔で行った。最後の抗体投与の３日後に、２匹の動
物の肺臓を摘出した。

（ｂ）肺臓細胞懸濁液の製造 摘出された肺臓から、ステンレススチール製スクリーン
（目幅１００μｍ）にこの器官を強制的に通過させるこ
とにより、細胞懸濁液を製造した。ぶどう糖４．５ｇμ
、グルタミン１０ｍＭ。

ペニシリン１０００　単位／　ｍＡ’、ストレプトマイ
シン１００μｇ／ｍｌ及び胎児牛血清１５％が追加され
たダルベツコの最小必須培地（ＤＭＥＭ　）中に細胞を
移した。細胞をこの培地で６回洗浄したのち、同じ培地
中に希望する濃度に再懸濁した。一般に各胸臆から約５
〜１０ＸＩ０７個の細胞が得られた。

（ｃ）骨髄腫細胞の生長 骨髄腫細胞Ｓｐ　２１０−Ａｇ　１４　（ＡＴＣＣＡ　
　ＣＲＬ８２８７　）を融合のために使用した。この細
胞は２０μｍ７７ｍ１の８−アザグアニンに耐性である
できない。この細胞を、ぶど１５糖４．５’９／Ａ、グ
ルタミン１０ｍＭ、ペニシリン１０００単位／　ｍｌ、
ストレプトマイシン１００μ９７ｍ１及び胎児牛血清１
５％が追加されたＤＭＥＭ　（完全培地）中で培養した
。この細胞を、生長の対数増殖期において融合に用いた
。

（ｄ）細胞融合 胸臆細胞懸濁液を骨髄腫細胞と５：１の割合で混合し、
血清不合のＤＭＥＭで洗浄した。洗浄された細胞を血清
不含のＤＭＥＭ　６０　Ｉｌｌ中に再懸濁し、内容５０
ｍ１のポリプロピレン製円錐管中でグリコール（ＰＥＧ
、ベーリンガー社）の５０％溶液０．５　ｍｌを、きわ
めて注意深くペレットに添加し、ペレットを軽くたたい
てＰＥＧと混合し、次いで混合物を１０００　ｒｌｍで
６分間遠心分離した。ＤＭＥＭ　１０７ｎｌを添加し、
細胞ペレットを注意深く懸濁し、次いで２００　Ｏｒｐ
ｍで３分間遠心分離した。細胞ペレットを２Ｘ１０’細
胞／　ｍｌの濃度でＨＡＴ培地中に再懸濁し、その０．
２　ｍｌをマイクロ滴定板上に分散した。前日に、主と
してマクロファージである腹腔内単核細胞約５００００
個を、供与者細胞としてウェル中に入れた。

（ｅ）ハイプリドーマの選択及び培養 細胞融合したのち、細胞をリトルフィールドＨＡＴ培地
（サイエンス第１４５巻１９６４年７０９〜７１２頁参
照）中で６７℃において、ＣＯ２を５％含有する湿った
雰囲気中で培養した。

１週間に２回、培地の半分を新しいＨＡＴ培地＝　１５
− で置き換えることにより培養物を育てた。数週間ののち
、ハイプリドーマ細胞培養物からの上澄液を、抗ヒト腫
瘍壊死因子活性の存在について調べた。スクリーニング
試験において正の結果を示したハイブリドーマを、クロ
ーニングのために選択した。このためにはハイブリドー
マを制限希釈法に付し、その際９６個のマイクロ滴定ウ
ェルのそれぞれに平均で０．５個の細胞／ウェルを入れ
、そして１０５個のマウス胸腺細胞を供与者細胞として
添加した。このクローニング操作により選択された抗体
産生細胞を増殖し、凍結し、そして液体窒素中で胎児牛
血清１０％及びジメチルスルホキシド１０％を含有する
完全培地中に貯蔵した。

（ｆ＞特異的ＴＮＦ抗体のためのスクリーニング試験ｒ
ＴＮＦを、ＰＢＳ　（燐酸塩緩衝塩水、ＮａＣ１ｏ、　
８％及び燐酸ナトＩＪウム０．０２モルを含有し、ＨＣ
’１又はＮａＯＨでＩ）Ｈ７，４にしたもの）中に３μ
ｊｑ／ｍｌに希釈した。この溶液の各０，１ｒｎｌをマ
イクロタイター（用板のウー・・中に入れた。室温で２
時間のルブミン溶液（シグマ社、ＲＩＡ等級）０．３ｎ
ｌで３０分以内に処理し、次いで上澄液を捨てた。

生長しているハイプリドーマ細胞系（約２０〜ｂ スからの血清の希釈液を、室温で２時間以上保温した。

ウェルなＰＢＳ　Ｏ，３ｍ／！で数回洗浄した。

次いで適当な濃度の抗マウス免疫グロブリン抗体（マイ
ルズ社製）　、０．１　ｍｌとともに室温で２時間保温
した。これらの抗体を酵素標識としてのパーオキシダー
ゼとカップリングした。正のパーオキシダーゼ反応を有
するウェルは、抗原に特異的な抗体を示した。

最初に用いた３６０個のウェルの８０％において、細胞
の生長が観察された。これらのうち１２個がＴＮＦスク
リーニング試験において正の結果を示した。繰返し試験
すると、そのうちの１１個が正であった。４種の異なる
モノクロナールハイプリドーマを本発明のために追求し
た。

それはＡＭ　−１、ＡＭ−，１９５、ＡＭ−１１４及び
ＡＭ−１９９である。

（ｇ）ハイプリドーマ細胞培養の展開 細胞培養における展開（試験管内）： 約２　Ｘ　１０７個の細胞を、１７５ｃｒｎ２の生長面
積を有する細胞培養ビン中に入れた。３日後に、細胞不
含の上澄液は、細胞により分泌されたモノクロナール抗
体を１０〜２０μｇ／ｍｌの範囲で含有していた。

マウス腹水における展開（生体内）： ＢＡＬＢ／ｃマウスに、腹膜の条件付けのためにプリス
タン（Ｒ）０．５ｍｌを腹腔内注射により与えた。

ＰＢＳ中の５〜１０Ｘ１０’個のハイプリドーマの懸濁
液を、前処置された各動物に１〜２週間の期間にわたり
投与した。８〜１０日ののち、腹膜を針で刺し、細胞を
含有する腹水液を採取した。

腹水液の試料の細胞成分を遠心分離（５０゜Ｑｒｐｌ、
５分）により除去した。モノクロナール抗体を含有する
上澄液を小分けして一７０℃で凍結するか、あるいはク
ロマトグラフィにより少なくとも９０％に精製した。純
度はドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により評価された（西独特許出願公開３６３０
１６０号明細書参照）。

（ｈ）モノクロナール抗体の型の決定 モノクロナール抗体を、ＥＬＩＳＡ系において特性決定
した。マイクロ滴定板のくぼみにｒＴＮＦ（５μｇ／ｍ
ｌ）を充填した。このように準備された板を、細胞培養
からの精製モノクロナール抗体とともに室温で２時間保
温したのち、第２の保温段階（室温で２時間）を、種々
のクラス及びサブクラスの抗マウス免疫グロブリンなら
びに種々のクラスの免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖（マ
イルズ社製）とともに行った。他の段階で、パーオキシ
ダーゼで標識したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（マイル
ズ社Ｍ）を添加した。１時間保温したのち、着色基質で
あるテトラメチルベンジジン（マイルズ社製）及び過酸
化水素を添加して酵素反応を開始した。その結果を第１
表にまとめて示す。

第　　１　　表 抗体　　　クラス　　　重鎖　　　軽鎖ＡＭ−１ＩｇＧ
　　　　ガンマ１　　　カッパＡＭ−１１４ＩｇＧ　　
　　ガンマ１　　　カッパＡＭ−１９５ＩｇＧ　　　　
ガンマ３　　　カッパＡＭ１９９　　　　ＩｇＧ　　　
　ガンマ１　　　カッパ（１）モノクロナール抗体の標
識 ＮＨ８−ＬＣ−ビオチン（ピアス社製）をＰＢＳに溶解
し、濃度を１■／　ｍｌにした。この溶液の０．１　ｍ
ｌを精製モノクロナール抗体（０，５■／　ｍｌ　ＰＢ
Ｓ　）０゜１ｒｎｌと混合し、この溶液を室温で２時間
保温した。反応に続いて、溶液をＰＢＳで１１ｎｌとな
し、４℃でＰＢＳに対して透析した。透析液すなわち透
析管中の溶液を、使用するまで４℃で貯蔵した。

実施例２ ＴＮＦに対するモノクロナール抗体の親和性親和性定数
を、ＥＬＩＳＡからのデータを用いて測定した。このた
めには精製抗体を一定量のＴＮＦに対して滴定し、そし
て抗体の結合を、パーオキシダーゼで標識したウサギ抗
マウス免疫グロブリンの結合により検出した。特異性プ
ログラムを用いて結合のデータを分析した。

第　　２　　表 モノクロナール抗体の親和性定数 抗体　　　Ｋａ×和”１３　Ｘ　ｍｏｌ−’ＡＭ−１１
，５±６０％ ＡＭ−１１４　　　　１．４　±３０％ＡＭ−１９５３
，５±６０％ ＡＭ−１９９　　　　２．０　±６０％これらの会合定
数Ｋａは、抗ＴＮＦ抗体の高い親和性を示している。

実施例３ ＴＮＦの細胞毒活性の中和 ＴＮＦの試験管内での生物学的活性を、アガーワルらに
より記載された方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

第２６０巻１９８５年２３４５〜２３５４頁参照）と同
様にして、マウス細胞系Ｌ　９２９　（ＡＴＣＣＡ　Ｃ
ＣＬ　１）の溶解により測定した。モノクロナール抗体
によるＴＮＦの細胞毒活性の中和の試験において、ＴＮ
Ｆ濃度は少なくとも９０％の細胞が溶解する濃度であっ
た。抗体をマイクロ滴定板中で完全培地中に１：２で段
階的に希釈した。

組換え又は天然ＴＮＦ　（１，り　ｎｆｌ／ｍｌ）　０
．０５　ｍｌを各抗体溶液（０，１ｍｌ）に添加し、混
合物を室温で２時間保温した。次いで培地０．０５　ｍ
ｌ中のＬ９２９細胞５００００個を添加し、インキュベ
ーター中で２０〜２４時間保温したのち、細胞を固定し
、クリスタルバイオレットで染色した。

ＴＮＦの細胞毒効果は細胞の溶解に導き、従って細胞は
染色中に洗浄除去される。しかし充分な抗体が存在する
場合には、ＴＮＦの細胞毒効果は中和され、そして細胞
は染色される。

第　　３　　表 ＴＮＦの細胞毒活性の中和 ｍ　ＡＫ　　　　　　　中和 ＡＭ−１− ＡＭ−１１４＋ ＡＭ−１９５＋＋ ＡＭ−１９９− 第３表から認められるように、中和試験において３＝傘
＃＃；種類の抗体が見出された。ＴＮＦの中和は、ＡＭ
−１９５では０，２μ９／ｌｎｌ及びＡＭ−１１４では
２μｍ７　／　ｍｌのモノクロナール抗体濃度において
認められたが、２０　ｐ９　／ｍｌ　（Ｄ　ＡＭ−１及
びＡＭ−１９９では中和は不完全であった。

実施例２における会合定数の測定は、各抗体がほぼ同じ
程度に結合することを示した。抗体を、強く中和するも
の、弱く中和するもの又は全く中和しないものに類別す
ることは、ＴＮＦ分子上の種々のエピトープを区別でき
るようにする情報を提供する。抗体の結合及びＴＮＦの
中和についての結果は、ＴＮＦの少なくとも３種の異な
るエピトープを認識することができかつモノクロナール
抗体の収集により定義することができることを示す。

実施例４ ＴＮＦの測定 （ａ）好適な１対のモノクロナール抗体の選択２種の抗
体の同じエピトープへの競合的結合と、異なるエピトー
プへの付加的結合とを区別するために、抗体だけを用い
かつ可能なすべての対の組合せにおいて、固定化された
ＴＮＦへの結合を試験した。ＴＮＦは実施例１に記載の
ように結合した。精製ＴＮＦを、２４０　Ｄ　Ｏｎｆ１
／ｍｌから出発して１：４段階に希釈した。次いでビオ
チン化された抗体ＡＭ−１９５を添加したのち、９０分
間保温した。ウェルをＰＢＳ／　０．０５％ツイーン（
Ｒ）２０で洗浄し、ストレプトアビジン−パーオキシダ
ーゼ錯体（ＢＲＬ社）を添加し、混合物を６０分間保温
した。洗浄工程ののち、パーオキシダーゼ基質（実施例
４ｂ参照）　０．１　ｍｌを各ウェルに添加した。競合
的結合は、シグナルを消失させる結果となる。第４表か
ら明らかなように、モノクロナール抗体ＡＭ−１９５を
結合するＴＮＦエピトープは、ＡＭ−１又はＡＭ−１９
９のためはＡＭ−１９９抗体とビオチンで標識したＡＭ
−１９５を用いて、次の実験を行った。

第　　４　　表 ビオチンで標識したＡＭ−１９５のＴＮＩｉ’への結合
に対するｍＡＫの影響 ％　　結　　合 μｇｍＡＫ、Ａｌ　１９５１１４’　　１９９　１（ｂ
）酵素イムノアッセイの設計 抗体ＡＭ−１又はＡＭ−１９９を、受身吸着又は共有結
合により担体（小球、炉材、ポリスチレン又はポリ塩化
ビニル製マイクロ滴定板、ν紙又は他の材料）上に固定
した。モノクロナール抗体の特異性は、特異的な抗原（
この場合はＴＮＦ　）だけが、この抗原上の単一分子結
合部位を介して結合することを可能にする。結合できる
ＴＮＦの量は溶液中の抗原の濃度及び量に比例する。

抗原は、抗体ＡＭ−１９５が他の分子結合部位に結合す
ることにより認識される。抗体ＡＭ−１９５は１個のシ
グナルを有する。それ故、固定化されたシグナルの量は
固定化された抗原の量に、従って調べられる溶液中の抗
原の濃度にも直接比例する。

アッセイの操作： （１）被覆 精製抗体ＡＭ−１はＡＭ−１９９を粘着緩衝液（重炭酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，５，４，２，９／ｌ−ｏ、
　ｏ　５　Ｍ　）中に０．５　ｐｊｉ　／ｍｌ！に希釈
した。マイクロ滴定板のウェルにこの溶液０．１　ｍｌ
を入れ、４℃で１６〜２０時間保温した。

（２）遮断 （１）により得られた溶液を吸引濾過し、ウェルをＰＢ
Ｓ　（ＮａＣ１，２Ｆｌ／Ｌ　ＫＣＩ　Ｏ，２９／Ｌ　
Ｎａ２ＨＰＯ４”　２　Ｉ（２０１，４４ｇ／１１　、
　ＫＨ２ＰＯ４０，２ｇ／１３．　ｐＨ７，０）で２回
洗浄し、次いで１％牛血清アルブミン（シグマ社、ＲＩ
Ａ等級）により室温で３０分間遮断した。

（６）系列希釈及びＴＮＦ試料 （２）からの溶液を吸引濾過し、ウェルをＰＢＳで２回
洗浄した。ｒＴＮＦを緩衝液Ｉ〔牛血清アルブミン（シ
グマ社、ＲＩＡ等級）１ｇをＰＢＳ　Ｉ　Ａに添加した
もの〕により２．５　ｎ　ｇ／ｍｌとなし、１：２段階
に希釈した。試料各［１，１ｍ７Ｉをピペットにより各
ウェル中に入れ、室温で２〜４時間保温した。

緩衝液（洗浄用緩衝液：　ＰＢＳ　＋　０．１％ツィー
ノ旬２０）により３回洗浄したのち、ビオチンで標識し
た抗体ＡＭ−１９５をＱ、　１ｍｌ添加した。実施例１
（ｈ）の方法により製造した接合物を緩衝液■により１
　：４００に希釈し、室温で２時間又は４〜１０℃で１
６〜２０時間保温した。

（４）増幅系 ウェルを洗浄用緩衝液により３回洗浄したのち、ストレ
プトアビジン−パーオキシダーゼ錯体（ＢＲＬ社、ＰＢ
Ｓ／ＢＳＡ緩衝液中に１：２［１０［１に希釈したもの
）　０．１　ｍｌとともに室温で３０分間保温した。

（５）展開 ウェルを洗浄用緩衝液により６回洗浄し、パーオキシダ
ーゼ基質０．１　ｍｌをピペットにより各ウェル中に入
れ、室温で３０分間保温した。２Ｍ−Ｈ２Ｓｏ４Ｄ、　
１　ｍＡ　／ウェルにより反応を停止した。

マイクロ滴定板における吸光を、４５０　ｎｍの波長に
おいて１時間以内に記録した。特性を示す検量線を第１
図に曲線０−０−０として示す。ＴＮＦの検出限界は１
０　ｐｇ／ｙｌｌである。

パーオキシダーゼ基質 ＴＭＢ溶液：　ＤＭＳＯ中の４２　ｍＭ−ＴＭＢ　（３
Ｊ′、５＋５’−テトラメチルベンジジン、マイルズ）
。

基質用緩衝液：水１１に加えた酢酸ナトリウム５０３、
くえん酸１ｇによりｐＨ４，９に調整。

ＴＭＢ溶液０．１　ｍｌを基質用緩衝液１０ｍ１に振動
しながら徐々に添加し、次いで６０％Ｈ２Ｏ２超純粋、
メルク社）　１．４７μｌを添加した。

（ｃ）ヒト血清中のＴＮＦの測定 組換え及び／又は天然ＴＮＦを緩衝液■（実施の０．１
　ｍｌをピペットにより、実施例４（ｂ）に記載のよう
にして抗体ＡＭ−１９９又はＡＭ−１によりあらかじめ
被覆された各ウェル中に加えた。後続の操作を実施例４
（ｂ）と同様に行った。その結果を第１図に曲線・１−
・として示す。

第１図から明らかなように、ヒト血清のどの成分も、モ
ノクロナール抗体を用いるＴＮＦの測定を妨害しない。

（ｄ）抗体とリンホトキシンとの交叉反応抗体とリンホ
トキシンとの可能な交叉反応を、実施例１（ｅ）に記載
のようにして試験した。その際マイクロ滴定板のウェル
を精製された組換えリンホトキシンにより被覆した。抗
体ＡＭ−１、ＡＭ−１１４、ＡＭ−１９５又はＡＭ−１
９９のリンホトキシンとの結合は認められなかった。

実施例５ ウェスタンＯブロッティング法によるモノクロナール抗
体を用いる血清中のＴＮＦの検出種々の量のＴＮＦが添
加されたヒト血清を、ゲル電気泳動により１２．５％ゲ
ル中でレムリの方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、第８
０巻１９７３年５７５〜５９９頁参照）により分別した
。ウェスタン・プロッテング法は、バーネット（Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

第１１２巻１９８１年１９５〜２０３頁参照）及びライ
ネスら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第２６０巻１９
８５年１１６３〜１１６９頁参照）により報告された方
法である。ゲル上の蛋白質をニトロセルロース膜（シュ
ライヘル及びシュル）上ニ１夜プロットした。このニト
ロセルロース膜ヲ１％ゼラチン溶液（バイオ−ラド社、
ゼラチン１０ｇをＰＢＳ　１１１に加えたもの）ととも
に室温で６時間保温した。次いでニトロセルロース膜を
、緩衝液（ＰＥＳ中の１％ゼラチン）中に１μｇ／　ｍ
ｌに希釈された抗体溶液２０ｍ１とともに室温で２時間
保温した。上澄液を傾斜により除去し、膜を数回洗浄し
た。パーオキシダーゼで標識した抗マウス免疫グロブリ
ンを用いて、ＴＮＦをニトロセルロース膜上で見えるよ
う、にした。検出限界はＴＮＦ　３０　ｎｇである。

第２図に、ＴＮＦを種々の量で添加されたヒト血清のゲ
ル電気泳動による分画（Ａ）及びこのゲル電気泳動分画
についてモノクロナール抗体ＡＭ−１９５を用いて行っ
たウェスタン・ブロッティングの結果ＣＢ）を示す。第
２図から明らかなように、ＡＭ−１９５はヒト血清中の
成分と反応せず、したがってＴＮＦに対して特異的であ
ると認めることができる。抗体ＡＭ−１、ＡＭ−１１４
及び康−１９９についても同じ結果が得られた。

実施例６ ＴＮＦの中和 ＴＮＦに対するｍＡＫの保護作用を、生体内条件下で雌
性のＢＡＬＥ　／　ｃマウス（試験１．２及び４）及ヒ
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（試験６）において調べた。４〜
６週令のマウスを無作為に１群６匹又は５匹に分けた。

被験物質を静脈内注射により外側尾静脈内に投与した（
投与量１０　ｍｌ７ｋｇ　）。

注射の前に、ＴＮＦを緩衝液Ａ　Ｃ１５０ｍＭ−ＮａＣ
１及び０．１８％牛血清アルブミン（シグマ社、ＲＩＡ
等級）〕に溶解し、４〜１０℃で６時間貯蔵した。ＴＮ
Ｆの毒性はこの時間後に最高であった。

最初にＴＮＦを、次いで１５〜６０分後にｍＡＫを添加
した。２４時間後に死亡率を測定した。第５表にその結
果を示す（この表中、例えば６１５は動物５匹のうち６
匹が死んだことを意味する）。

第　　５　　表 緩衝液Ａ　　　　　　　　ｏ／３　ｏ／ｓ　　Ｃ１５ｏ
／５１１１ＡＫ　１０　　　０／３　ｏ１５　ｏ／ｓ　
Ｏ１５ｍＡＫ５−　　　０／３０１５０１５０１５ＴＮ
Ｆ１　　　３／３０１５４１５４１５ＴＮＦ　１　＋ｍ
Ａｐ　１１／３　２１５　１１５　３１５ＴＮＦ　１　
十ｍＡＫ５　　　　０／６０１５　０１５　０１５ＴＮ
Ｆ２　　　３／３５１５１１５４１５ＴＮＦ　２　＋ｍ
ＡＫ　２　　　　３／３　４１５　２１５　５１５ＴＮ
Ｆ２＋ｍＡＫ１０　０／３０１００１５０１５第５表か
ら明らかなように、中和性の抗体ＡＭ−１９５はマウス
において致死量のＴＮＦを中和することができる。動物
の生存率は抗体及びＴＮＦの重量比に依存する。ＴＮＦ
の毒性の完全阻止は５：１の比率において認められた。

ＴＮＦが三量体であると考えると（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ
、第２１１巻１９８７年１７９頁参照）、これは１．６
　：　１の抗体：　ＴＮＦのモル比に相当する。

マウスにおいてＴＮＦを非中和性抗体により中和するこ
とはできない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のモノクロナール抗体を用いてＴＮＦ
を測定するための検量線を示すグラフ、第２図はＴＮＦ
を種々の量で添加したヒト血清のゲル電気泳動による分
画及びウェスタン・プロッティング法の結果を示す図で
ある。 出願人　バス７・アクチェンゲゼルシャフト代理人　弁
理士　小　　林　　正　　雄Ｐｉ／ｙｎｌ　　ＴＮＦ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）により免疫され
   たマウスの骨髄腫細胞と脾臓細胞との細胞融合により得
   られたものであり、そして天然及び／又は組換えＴＮＦ
   と反応するモノクロナール抗体を産生する雑種細胞系。 ２、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞を、そして系Ｓ
   ｐ２／Ｏ−Ａｇ１４からの骨髄腫細胞を用いたものであ
   ることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の雑
   種細胞系。 ３、ＥＣＡＣＣ８７−０５０８０１−８７であることを
   特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の雑種細胞系
   。 ４、天然及び／又は組換えＴＮＦと反応するモノクロナ
   ール抗体。 ５、（ａ）１５００００ダルトン以上の分子量及び（ｂ
   ）ガンマ１重鎖及びカッパ軽鎖を有し、（ｃ）天然及び
   ／又は組換えＴＮＦの細胞毒活性を中和する作用を有し
   ないことを特徴とする、特許請求の範囲第４項に記載の
   モノクロナール抗体。 ６、（ａ）１５００００ダルトン以上の分子量及び（ｂ
   ）ガンマ１重鎖及びカッパ軽鎖を有し、（ｃ）天然及び
   ／又は組換えＴＮＦの細胞毒活性を弱く中和する作用を
   有することを特徴とする、特許請求の範囲第４項に記載
   のモノクロナール抗体。 ７、（ａ）１５００００ダルトン以上の分子量及び（ｂ
   ）ガンマ３重鎖及びカッパ軽鎖を有し、（ｃ）天然及び
   組換えＴＮＦの細胞毒を中和する作用を有することを特
   徴とする、特許請求の範囲第４項に記載のモノクロナー
   ル抗体。 ８、細胞融合により抗体を産生する雑種細胞系を製造し
   、この細胞をサブクローニングし、そして細胞が生長し
   たのち、抗ヒト腫瘍壊死因子特異性を有するモノクロナ
   ール抗体を分離することを特徴とする、天然及び／又は
   組換えＴＮＦと反応するモノクロナール抗体の製法。 ９、組換えＴＮＦに対して免疫されたマウスからの脾臓
   細胞を細胞融合のために用いることを特徴とする、特許
   請求の範囲第８項に記載の方法。 １０、融合の相手として細胞系Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を
   用いることを特徴とする、特許請求の範囲第８項に記載
   の方法。 １１、脾臓細胞としてヒト組換えＴＮＦに対して免疫さ
   れたＢＡＬＢ／ｃマウスからの細胞を用いることを特徴
   とする、特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２、天然及び／又は組換えＴＮＦと反応するモノクロ
   ナール抗体を、天然及び組換えＴＮＦの検出、生物学的
   液体中のＴＮＦの測定、ＴＮＦ測定用の免疫学的試験の
   製造、疾患の抑制、又は免疫吸着クロマトグラフィを用
   いるＴＮＦの分離のために使用する方法。