JPS60209528A - ヒト腫瘍壊死因子の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト腫瘍壊死因子の精製方法に関するもので
ある。詳しくは、以下明細書中に記載の性状を有するヒ
ト腫瘍壊死因子に対して作成したモノクローナル抗体を
相持同定化した、アフィニティーカラムを用い、該ヒト
腫瘍壊死因子を含む粗製溶液より、該ヒ）・肺癌壊死因
子を効率良く高度に精製する方法に関する。

ヒト１厘瘍壊死因子（以）’ＴＮＦと略する）に関して
は、１１．ｅｅｄらｌ：、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ　１１．５巻３９５頁（１９７５年）は、ヒト末梢血
中の付着性細胞より、Ｍａ　ｔ　ｔ　ｈ　ｅｗｓらＣＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４４巻１３５頁（１９８１年）〕
は、ヒト末末梢血球および骨髄性単球性白血病患者由来
の白血病細胞より、ＴＮＦ様の活性を有する因子を見出
したとの報告をしているが、動物実験における抗腫瘍効
果すら確認されていないなど、その本体については明確
な記載はなく、まして′ｎ４′製方法については、はと
んどふれられていない。

特開昭５８−１３８３８３号には、ヒトＴＮＦの精製方
法として、限外濾過法、透析法、イオノ交換法、アフィ
ニティークロマト法、ゲル濾過法、電気泳動法等を組合
せることができると記載があり、更に効率良く安価に精
製するためには特異抗体を吸着体としたアフィニティー
クロマト法を用いることが述べられて文−り、実施例中
には、ウサギの抗血清の　ＩｇＧ画分を用いたアフィニ
ティークロマトカラム精製の開示がある。しかし、抗血
清、特異抗体を用いるアフイニテイーカシムクロマトを
考えると、抗体供給の面で不充分であるばかりか、得ら
れる抗体の均一性も保証されない。よって当然のことな
がら、これらの抗体を用いたアフィニティーカラムでは
、精製にも安定性がなく再現性も得られないという欠点
があった。加えて該特許の実施例に示されている溶離条
件であるｐｉ（２，３では、ヒト腫瘍壊死因子の安定性
が保たれないことから、失活による活性回収率の低下Ｖ
′ｉさけられなかった。このような精製法で、医薬とし
て用いるヒ）［瘍壊死因子を一定の品質で効率良く安価
に大量に、安定供給をすることは、極めて困難であった
。以上の実状に鑑み、本発明者らは、鋭意研究を行なっ
た結果、特異抗体に代えて、抗ヒト腫瘍壊死因子のモノ
クローナル抗体を使ったアフィニティーカラムを精製工
程に導入したところ、驚くべきことに精製すべきヒト腫
瘍壊死因子の至適ＰＨ範囲である（　ＰＨ４１，，５−
１１，５）に於いて溶離出来ることが判り、極めて高回
収率で高純度の該物質を一定した品質で得られることを
見い出し本発明に到達した。本発明に用いるモノクロー
ナル抗体は、その品質が均一であるはかりか、抗血清作
成の際の免疫操作等のけん雑な操作をくり返し行なわな
くても大量に容易に得られることから、工業的規模での
生産を考える上でも極めて有利である。

本発明に云うヒト腫瘍壊死因子とは アミノ酸　含有量（モル％） アスパラキン　７．８ ＋アスパラギン酸 トレオニン　３．６ セリ／８．２ グルタミン＋グルタミン酸　Ｊ２９ トリフ゛ト７ア／１４ グリシ／７１ アラニン　８．５ バリン　７．８ シスチン　１．４ イソロイシン　５．０ ロイシン　１１．４ チロシン　４．６ ンエニルアラニ／２７ リジ７３．９ ヒスチジ／２０ アルキニ１５３ プロリン　６，５ ボリペノテドのザブユニットからなる構造を有し７、か
つ前記特性を有する蛋白質。

ａ）分子月　４０，０００±４．０００（ゲル濾過法） ２０．０００±４．ｔＪｏＯ（ＳＤＳ　−ポリアクリル
アミド電気泳動法） ｂ）等４１１点　６０±０．５（笠省１４点箪気泳動法
）Ｃ）本文定義のＬ−Ｍ細胞を用いる評価における活性
を有する。

以上の性状を有し、ヒト由来活性化マクロファージより
誘４される。ヒト由来活性化マクロファージとは分化誘
導能を有する物質共存下で培養した末梢血単球も１．＜
Ｖ：ｔある種の骨髄性単球性白血病患者の白血病細胞か
ら樹立された株細胞などを用いることができる。株細胞
とじてけＩ−Ｉ　Ｌ　−６０細胞ＣＮａｔｕｒｅ　２７
０巻、３４７頁（１９７７年）〕、ＴＨＰ−１細胞［Ｉ
ｎｔ。

Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、２６巻、１７’ｌ’ｊｊ（１９８０
年）］などがあけられる。

分化誘導能を有する物質として［１２−Ｑ−テトラデカ
ノイルホルボール−１３−アセテート、ホルボール−１
２，１３−ジデカノエート、ホルボール−１２，１３−
ジペンゾエートなどのホルボールエステル類、メゼレイ
ンなどのジチルヘア類、テレオシジ／、ビタミンＡ酸、
ビタミンＡアルコールなどのヒタミ７　Ａ　ｇ導体、ジ
メチルスルホキシド、ペプトンまたげカゼイン加水分解
物などが好適に用いられる。

本発明における活性化マクロファージはグラム陰性菌由
来のエンドトキシノもしくはダラム陽性菌またげ酵母の
菌体壁を共存下に培養することによりＴ　Ｎ　Ｉ”様物
質をより多量に産生ずる。

本発明で精製を？Ｊ′なうヒト腫瘍壊死因子の物性は、
以下に記載する実験方法１〜８の各方法によって測定し
たものである。

実験方法 １）分子量測定法 Ａ）セファクリルＳ−２００（ファルマシア社製スウエ
ーデ／ンのカラム（１，５Ｘ　１００ｃｍ）を用い、０
．１Ｍ塩化ナトリウム／　５０　ｍ　Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ’７．４）にてゲル濾過を行った。分子量測定用標
準蛋白質（ファルマシア製、リボヌクレアーゼＡ１キモ
トリプシノ〜ゲンＡ１オブアルブミン、アルドラーゼ）
を用いて分子量検量線を作成し、Ｌ−Ｍ細胞を用いた活
性評価により分子量の測定をした。本発明にかかるヒト
腫瘍壊死因子は、オブアルブミ／とほぼ同じ位置に溶出
し、分子量は４０．０００±４，０００となる。

Ｂ）　Ｓｅｇｒｅｓｔらの方法ＣＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　
ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＹ２８−Ｂ巻、５４頁（１９７２年
）〕に従い、トリス／グリシ：／／５ＤＳ（ｐＨ８，３
）でＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルにｌＯμｇの試料
を性力し、電気泳動を行った。標準分子量キット（ファ
ルマシア社製）を用いて分子量検量線を作成し、Ｌ−Ｍ
細胞での活性評価と、染色（クーマシー・プリリア／ト
φブルーＲ−２５０）により分子量を決定した。本発明
にかかるヒト腫瘍壊死因子１ｊ２０，０００±４．００
０位置に、染色バンドと活性を示す。

２）等電点測定法 アト−株式会社製の等電点電気泳動装置（Ｓ、Ｔ−１０
７１ＥＣ型）を用い、ファルマライト（ファルマシア社
製、ＰＨ４〜６，５）とグリセロールを含む５％ポリア
クリルアミド平板ゲル（厚み１　ｍｍ、長さ１０儂、巾
１０ぼ）をｒ「成した。

陽極側にｏ、ｏ４Ｍ、ＤＬ−グルタミン酸、陰極側に０
．２Ｍ５Ｌ−ヒスチジンを使用して、７００Ｖで５０分
間の前泳動を行った。続いて試料５０μｇを付与し、７
（ｌＯＶで１時間、５００ｖで１６時間泳動を行った。

泳動終了後ゲルを２、５　ｍｍ巾で切出し、次いで各ゲ
ル片を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍトリ
スーー塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）０．２ｍ１−Ｃ抽出ｐ
、　各抽出液についてＬ−Ｍ細胞を用いた活性評価を行
った。

６．０±０．５となる。

３）Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価 Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価は、１ｕｆｆ　ＣＬｙｍｐ
ｌ＋ｏｋｉ’ｎｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２巻、Ｅ、Ｐｘｃ
ｋ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｐｒｅｓｓ　２３５頁（１
９８０年）〕あるいは［Ｊ−Ｉｒｎｍｕｎｏｌ、　１２
６巻、２３５頁（１９８１年）〕の方法に準じ、本発明
者らが改良したものであシ、本発明にかかるヒト腫瘍壊
死因子がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション・ｃｃＬｘ、２）を殺−ｒ効果を測定゛
するものでおる。すなわち、順次墳Ｌ−Ｍ細胞の培地懸
濁液０．１ｍｌを９６穴の組織培養用マイクロプレート
（フロー・ラボシトリ−社）に加えた。培地Ｙ′ｉ１■
／ｖ％のウシ胎児ＪｆＪｌ　清ｋ　含ｔｒイーグルのミ
ニマム・エンセ／シャル培地（その組成は、たとえば、
「組織培養」中井準之助他編集、朝食書店、１９６７年
に記載されている）を用いた。マイクロプレートを５％
の炭酸ガスを含む空気中、３７℃で４８時間培養した。

培養終了後、グルタルアルデヒド２０μｌを加え細胞を
固定した。固定後、マイクロプレートを洗浄、乾燥して
、００５％メチレ／ブルー溶液を０１１ｄを加え、生き
残った細胞を染色した。余分なメチレンブルーを−洗い
流し度ヲタイターテノク・マルチスキャン（フロー・ラ
ボラトリ−社）で測定した。この吸光度は、生き残った
細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞の５０％を殺すために必
要な生理活性量を１単位／ｍｌと定義し、試料を加えな
い対照の吸光度の５０％の値に相当する試料の希釈率を
、グラフあるいは計算によってめ、その希釈率の逆数を
試料の生理活性量（単位／ｒｎｌで表記する）とした。

一方、蛋白質量は、Ｂｒａｎｆｏｒｄ　らの方法〔Ａｎ
ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２巻２４８頁（１９７６年）
〕により、クーマシー・ブリリアント・ブルー〇２５０
を用いる色素結合法から算出した。

本発明にかかる腫瘍壊死因子の死活法は、４×１０６〜
２　Ｘ　Ｉ　Ｑ７単位／ｍ９蛋白質であった。

４）　Ｍｅｔｈ　Ａ　Ｓａｒｃｏｍａ担癌マウスを用い
る活性評価 ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹部床内に２　Ｘ　ｉ　０５コの
Ｍｅｔｈ’　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植し、７日後
移植した腫瘍の大きさが直径７〜８朋となり、出血性壊
死がなく良好な血行状態にある腫瘍を有するマウスを選
び、腫瘍内に生理食塩水で希釈した０、　０５　ｍｌの
試料を注射し、２４時間後に次の判定基準に則り壊死反
応の判定を行った。

（−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （＋＋）：中程度の出血性壊死 （移植癌表面の真中から５０％以上 にわたって壊死） （＋１＋）：顕著な出血性壊死 （移植癌の中央部が重度に壊死し、 周囲の癌組織がわずかに残った状態） また試料投与後２０日１に癌が完全に退縮したかどうか
を観察し完治率をめた。

以上の方法により測定した本発明にかかる腫瘍壊死因子
の活性を次頁の表に示す。

−（０７匹）　−十升相　（２０日−９１００６２１３
０’２／６ ２００　６　０１２３　３／６ １．０００　６　００１５　６／６ 対照（生理食塩水）　６　６０００　０／６壷完治率：
完全に癌が退縮したマウス数／実験マウス数 ５）アミノ酸組成 本発明にかかるヒト腫瘍壊死因子を用いて次の検討を行
なった。

試料調整用の厚み１朋、長さ１１ｃｍ、巾１５Ｇのポリ
アクリルアミド１５％を含む５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ド平板ゲルを作成し／こ。作成法の詳細は、アト−株式
会社［スラブ型５ＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動］
のパンフレットによった。装置はアト−株式会社製５Ｊ
−１０６ａｔ　ｓ　Ｉ）Ｈ型を用いた。

該平板ゲル１枚当り、本発明にかかるヒト腫瘍壊死因子
を４００μｇ付与した。付与に際して前処理として、１
％Ｓ’ＤＳ水溶液１００μｌと４０％蔗糖水溶液５０μ
ｌに４００　ｔｉｇのヒト腫瘍壊死因子を含む５００μ
ノの水溶液を混合し、５０°０３０分の熱処理を行なっ
た。電気泳動は１５０Ｖ定電圧て、４時間３０分を猥し
た。この操作を５回くりかえして行なった。泳動後、外
側の一部をクーマシー・ブリリアント・プルＬ−Ｇ２５
０で５分間染色を行ない、脱色後明瞭に見える染色バン
ドを中心に、２．５　ｍｍ間隔で５本に切出しを行なっ
た。次いで１％の重炭酸アンモニウム１，５ｄの中に該
ゲル片を浸漬して、４°Ｃで２４時間抽出を行なった。

抽出後、パスツールピペットにて抽出液を取り出し、同
液で洗浄を行なって、各２．５７ｄｆりの抽出液を５ス
ライス分、取得した。得られた抽出液は、確認のためＬ
−Ｍ細胞を用いる活性評価を行なった。

中心のバンドの部分に活性が総て回収された。

合計５回の電気泳動を行ない、１２ｍ９のチャージ試料
より、０．９　ｍ９の抽出試料を得た。

該抽出試料溶液をセファデックスＧ２５のカシム（０，
９，Ｘ１０ｍ）に付し、脱塩を行なった。

次いで、トミー精工社製、遠心真空乾燥機コンセントレ
ータ（ＥＣ−１０）を用いて、２５℃、２時間１．５０
　Ｏｒｐｍで乾燥を行ない、アミノ酸分析用分析試料と
した。

真空中の４Ｍメタ／スルホ／酸で１１０℃、２４時間加
水分解を行ない、高速アミノ酸分析計（日立、８３５型
）を用いてアミノ酸組成（モル％）を測定した。

本発明の精製法を用い更に上記処理を行なって得たヒ）
ＴＮＦのアミノ酸組成は以下に示すととくの値となる。

尚、システィンは加水分解後、空気酸化してシスチンに
変換。

（以下余白） アミノ酸組成 アミノ酸　含有量（モル％） アスパラギ／＋アスパラギン酸　７．８トレオニ／３．
６ セリ７８．２ グルタミン＋グルタミン酸　１２．９ ト　リ　プ　ト　フ　ァ　／　１．４ グリシン　７．１ アシ二ノ　８．５ バ　リ　／　７．８ シスチ／１．４ イソロイシン　５．０ ロイシ／１１．４ チロシ／４．６ フエニルアラニ／２．７ リジン　３．９ ヒスチジ／２．０ アルギニノ　５．３ プロリ／６．５ ６）レクｆ／カラムへの吸着性 市販の各ｆΦレクチノ固定化樹脂を市販セパコールミ二
カラム（バイオ之ンド礼製）β′充力目し、１５０ｍＭ
の塩化ナトリウムを含む５０　ｍ　Ｍリン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７，５）で充分に洗浄後、同緩衝液に溶解した１０μ
ｇの本発明にかかるヒｌ−、ＴＮＦ試料を付与し、付い
て下記に示す溶出液で溶出を行なった後、素通り画分と
溶出両分とをＬ−Ｍ細胞を用いる活性評価法にかり、測
定（７た。総てのカラムにおいて、総ての活性が素通り
画分に回収される。

７）電気泳動の易動度 セルロースアセテート膜としてセパラックスＳ（富士写
真フィルム社製）を用い、ｐＨ８，６イオン強度０．０
６〜０．０７で泳動を行なった。泳動終了後１關巾で切
片を作成した。得られた切片を生理食塩水で抽出し、Ｌ
−Ｍ細胞の活性評価を行ない、易動度をめた。同時に染
色用サンプルを泳動し、ボンソー３Ｒ（半井化学薬品株
式会社製）で染色を行なった。

本発明の生理活性物質は、γ−グロブリン領域に泳動さ
れる染色バンドの位置に活性を示す。

８）ジスルフィド結合の還元による影響ジスルフィド結
合還元剤としてジチオスレイトール（０，１ｍＭ　、　
１　ｍＭ　）または２−メルカプトエタノール（０，１
ｍ　Ｍ　、　１　ｍ　Ｍ　）を用い、本発明になる生理
活性物質２μｇ　１ＷＬｌを０．１５Ｍ塩化ナトリウム
１５０ｍＭす／酸緩衝液（ｐａ１７．４）中、２５℃で
２時間反応させた。反応後、Ｌ−Ｍ細胞を用いて残存活
性を測定し、ジスルフィド結合還元剤を用いなかった対
照の残存活性に対する比をめ、その結果を次の表に示す
０なお、これまでの説明で明らかなように、本発明にな
る新規生理活性物質は、溶液中での分子量、すなわちゲ
ル濾過時の分子量が４０，０００±４，０００でｆ）９
．５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のサブ 子量力ｉ２ｏ、ｏｏｏ±４，０００である。し力・も５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の抽出ザ／プ
ルをゲル濾過に付すと、伸性画分が分子量４０，０００
±４．０００付近にあることｔｊら、本発明にかかるヒ
トＴＮＦは、サブユニット構造を有する蛋白質と考えら
れる。

本発明は以１の性状を有するヒ）ＴＮＦの精製方法に関
する。詳しくは、上記性状を有するヒトＴＮＦに対して
作成したモノクローナル抗体を、担持固定した、アフイ
ニテイーカンムを用い該ヒトＴＮＦを効率良く高純度に
精製する方法に関する。

次に本発明の精製に使用するモノクローナル抗体につい
て述べる。すなわち 本発明に用いる抗ヒト腫瘍壊死因子モノクローナル抗体
の製造方法としては、例えばマウスリンパ系Ｂ細胞とミ
エローマ細胞を細胞融合することにより創り出された新
規なＭ種細胞を培養することにより得ることができる０
この雑種細胞は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ　
、　２５６巻、４９５−４９７頁　１９７５年）によっ
て確立され、例えばＧ−Ｋ１５ｈ１ｅｒら（Ｓｏｍａｔ
ｉｃ　、　ＣｅｌｌＧｅｍｅｔｉｃｓ　、　３　＋　３
０３　、１９７７年）　、　Ｒ，、Ａ。

Ｇｏｌｄｓｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ　、　２６７巻、
７０７　。

１９７７年）゛、谷ロ克ら（臨床免疫、　、１２　（４
）。

２８４−２８９頁、１９８０年）記載の方法等で得られ
ることができる。すなわち、抗原としては、前述のＴＨ
’Ｐ−１細胞の培養液を通常の生化学的分離方法を組合
せて分離精製を行なったヒト腫瘍壊死因子（比活性５Ｘ
１０５Ｖ／■）をあらかじめ免疫しておいたマウスＢＡ
ＬＢ／Ｃの牌臓からのＢ細胞（ここで用いるヒト腫瘍壊
死因子は必らずしも高純度のものを用いる必要はなく、
例えば純度１％以上のものであれは免疫は達成される。

）と、同マウス骨髄の腫瘍からのミエローマ細胞（例え
は、Ｐ’３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）を、ポリエチレングリコ
ールの存在下で融合させ、融合した細胞のみを選択的に
生き残らせるように調整した培地（ＩＩ　Ａ　ｉ”培地
）で培養し雑種細胞を得る。雑種細胞が目的とする抗ヒ
ト腫瘍壊死因子に対する抗体を産生じているかどうかを
「酵素免疫測定法」（石川栄治他著、医学書院、１９８
７年）記載の酵素測定法にて測定し、抗体産生能力のあ
る細胞をクロー二／グし抗ヒト腫瘍壊死因子モノクロー
ナル抗体を産生ずる雑種細胞を得る。

次に、抗ヒト腫瘍壊死因子モノクローナル抗体は、この
ようにして得られた維種＃１胞を１０〜２０％牛脂児血
清添加ＲＰＭＩ−１６４，０培地中にて大量培養するこ
とにより得られた培養液、又はプリスタン（２，６，１
０，１４−テトラメチルペンタデカ／）をあらかじめ腹
腔内に注射しでおいた免疫に用いたと同系のマウスの腹
腔内に、上記の雑種細胞を注射し増殖させて得られた腹
水から回収することができる。該腹水もしくは、該培養
を硫安沈澱、イオン交換クロマト等の通常の生化学的精
製方法で精製することにより得る。

本発明に用いるモノクローナル抗体とけ、限界希釈法を
用いてクローン化した融合細胞か生産する抗体で、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動でみて単一のバンドまで精
製されており、ヒト腫瘍壊死因子と混合することで、本
明細書中に記載のＬ−Ｍ細胞を用いる活性評価法に於て
、その活性を完全に消滅させる能力を有するものでおる
。

次いで、このようにして得られたモノクロ−ナル抗体を
用いて、アフィニティーカラムを作成する方法を示す。

すなわち このモノクローナル抗体の一種又は二種を用いてカップ
リングを行なう。通常、抗体固定化神体として用いる樹
脂であるセファロースＣＬ＝４Ｂ（ファルマシア社、ス
ウエーテｙ　）　ヲ、臭化シアンで活性化し、次いでカ
ップリングを行なって、モノクローナル抗体カラムを作
成した。

このようにして作成したモノクローナル抗体カラムを用
いて、本発明にががるヒト腫瘍壊死因子を含む粗製液の
精製は行なわれる。本発明にかかるモノクローナル抗体
カラム釦付す粗製液としては、画一の分化誘導能を有す
る物質共存下で培養した末梢四単球もしくは、ある種の
、骨髄性単球白血病患者の白血病細胞から樹立された株
細胞、たとえば、ＴＨＰ−１細胞の培養上清液などが上
げられる。又、上記ヒト腫瘍壊死因子を遺伝子組換操作
技術を用いて作成した場合、該ヒト腫瘍壊死因子を含む
培養大腸菌抽出液などもその対象となり得る。これら得
られた培養の原液そのもの、もしくけイオン強度等合せ
る為に適当な希釈液で希釈した液、限外濾過器で適当な
濃度迄濃縮を行なった液、艷には、硫安塩析等の前処理
を行なった液、イオン交換樹脂等を用いて、粗く精製を
ほどこした液、ゲル濾過等で適当な分子昂７分画を行な
った液、いずれの液をも用いることは可能である。但し
その際には、ＰＨは中性付近にイオン強度は等張付近に
合せる必要がある。

次いで、必要に応じて生理食塩水もしくは、等張で中性
の−を示す各種緩衝溶液にて充分に洗浄を行なった後に
、溶離を行なう。溶離に用いる溶液としては、ヒト腫瘍
壊死因子の活性が保持される〆（の領域である４、５〜
１１．５の範凹で用いられる溶離液、具体的には、グリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝層
、尿素水溶液、チオシア／酸水溶液、エチレングリコー
ル水溶液、グアニジン塩酸水溶液等が上げられる。

これ・らの溶離液にて溶離した後、必要に応じてゲル濾
過、限外膜濾過、透析等の後処理にてＰＨ及び塩濃度を
調整し、濾過滅菌をイｊつで、更に必要ならば加熱処ｆ
＃後、凍結乾繰をすることにより、ヒト腫瘍壊死因子の
精製を得ることができる。

実施例にも詳細を述べるが、ヒト腫瘍壊死因子を含むＴ
ＨＰ−１培養液上溝を、本＠明になる精製ユ、程の必須
項目であるモノクローナル抗体カラムに直接付し生理食
塩水で充分洗浄した後、０．１〜１クリシン−水酸化ナ
トリウム（ｐＨ１（＋、’　Ｏ）に０４１５Ｍ塩化ナト
リウムを含む溶離液で溶離を行なつ／ヒところ、通常の
イオン交換クロマトグラフィーや、等電点電気泳動分離
といった精製を一般性なって得られる精製度である１０
〜１００培程度の値に比して、実に驚くべきことに９０
％の回収率１０１）　０倍〜５０００倍以上の精製度に
達していることが判明した。

このように、本発明になる精製方法は、従来の方法では
とうてい達することの出来ない高純度の精製サンプルを
好吸率で、しかも大規模精製に適した簡便をやり方で行
なえるという。優れた特徴を有している。次にこの精製
物約３００単位は、前記したＭｅｔｂ　Ａ　ｓａｒｃｏ
ｍａ担ａマウスを用いる評価に於いて（＋）の活性を示
す。

ざらに、結腸癌Ｃｏ１ｏｎ　２６で担癌させたＢＡＬＢ
／Ｃマウスに本生理活性物質の精製物を投与した試験に
於いて、対照群（生理食塩水投与群）に比して有意な癌
の増殖抑制と退縮が認められた。なお、個体によっては
出血性壊死を起こさずに定着癌が退縮、消失する場合が
ある。

本生理活性物質の精製物は、極めて優れた制ガン作用を
有し、その作用は種特異性が少ないので、極めて有用な
抗腫瘍剤として期待できるものである。

以下に実施例を示して本発明をより具体的に述べるが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。　（
以−下余白） 実施例１ 工程１（ヒトＴＮＦの培養生産） ＴＨ’Ｐ−１細胞１．５Ｘ１０’個／ｄの濃度にて、５
％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に分散させた
のち、径１０ｃＩＩＬのフラスチツク・シャーレに２０
−ずつ分注する。３７℃に加温した該細胞溶液に、１２
−０ニテトラグカノイルホルボール−１３−ジアセテー
トおよびビタミンＡ酸をそれぞれ最終濃度ｌμｇ／ｍｌ
および０．５μｇ／ｍｌ；となるように添加し、５％炭
酸ガス培養器中にて、３７°Ｃ９１時間培養する。

１時間後、シャーレ中の培養液を除去し、０．５μｇ／
ｍ７のビタミンＡ酸、１００　ｍ９７Ｉｌｌ（１）ポリ
ヘプトンを含有する５％牛脂児血清−ＲＰＭＩ−１６４
０培地２０ＷＬｌで置換え、さらに２４時間３７℃にて
培養を行った後、培地を除去し、２０ｍ１のＲＰＭＩ−
１６４０培地２０ｎ７Ｋｔ換Ｌ、７２時間さらに培養を
継続する。

その後、゛培養液を集め、３０００　ｒｐｍにて３０分
間、遠心処理を行って、細胞沈渣を除去したのち、Ｌ−
Ｍ細胞に対する細胞障害性を検討し、１８０Ｕ／ｍｌの
活性を有する培養液２１を得る。

工程２（等電点電気泳動法による分画）該培養液０．９
１を、限外濾過法にて１０倍濃縮したのち、Ａｍｐｈｏ
ｌｉｎｅ■〔キャリヤー・アン７オライツ（Ｃａｒｒｉ
ｅｒ−ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ　）　）　（Ｌ　ＫＢ社製
、スウェーデン）−蔗糖密度勾配カラム（４４ｏｍＪ）
に添加したのち、約４２時間通電し、泳動を行ったのち
、カラムの下端より細いチューブでゾーンを乱さな幹よ
うに約２ｍｌ／分の流速で分画する。

ｐ）Ｉ　５．５〜６．５の分画を採取したのち、−を約
７．４に調整したのち、透析にて、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ
■および蔗糖を除去する。

工程３（塩基性陰イオン交換体クロマトグラフィー） 該分画液０，２１に０．８１の０．０２．Ｍ　）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）を加えた後、０．０２　Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．０２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，８）で充分に平衡化したＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）のカラム（１０Ｘ
　４５　ｃｍ　）に徐々に付す。次いで０、７５　ｌの
カラム平衡化緩衝液（０，０２Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．０２Ｍ）リス−塩酸緩衝液、ＰＨ７，８）で洗浄し
た後、００５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．．０２　Ｍ　
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）０．５１で洗浄後、
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐ［４７，２）を用いて溶出を行った。流速は
、０．５　Ａ’　／　ｂｒとし、溶出液ｆｉ　５０　ｔ
ｎｌずつ分画して活性画分を集めた。

該活性画分に同答搦：の０．０２Ｍ）！Ｊスス−酸緩衝
液（ｐＨ７，８）を加えて希釈したのち、０．２１／ｈ
ｒの流速でＤＥＡＥ−セフ７１：ｆｆ−、ＸＣＬ−６Ｂ
のカラム＜　１０ＸＩ　、３α）に付す。

次いで０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０，０２Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）］ｌを用いて、流速２　
Ｑ　ｍｌ／　Ｉ＋ｒで洗浄を行なった後、０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．０２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（
ＰＨ７，２）　０．５　ＡをＭいて、流速２０　ｍｌ／
　ｈｒで溶出を行なう。溶出液は、２５ｄずつ分画して
活性画分を集める。この段階の活性回収率は６０％、精
製度−３００倍である。

工程４（加熱処理） 次に該溶出液を容器に移し７０℃の温浴中に浸した後、
攪拌しながら該溶出液の温度を６０℃になるまで加熱す
る。その後６０℃の別の湯浴に移し、３０分間加熱処理
した溶液は、限外濾過によシ濃縮する。ここまでの精製
工程での活性の回収率は、５５％である。

工程５（ゲル濾過ン ０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．００５　Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）で充分に平衡化し、たセファクリル
Ｓ−２００（ファルマシア社製）のカラム（５Ｘ　８０
　ｃｍ　）に該濃縮液を付し、同緩衝液にてゲル濾過溶
出を行なう。流速は４　ｒｎｌ／　ｈ　ｒで４　ｍｌず
つ分画して活性画分を採取し、活性画分を限外濾過によ
り濃縮する。精製工程１〜４を通しての活性回収率は４
５％、精製度は４．０×１０３倍である。

工程６（アフィニティークロマトグラフィー）グ、ル濾
過によって得られた活性画分の濃縮液をＺｎ２＋キレー
トセフアロースカラムに付す。

キレートセファロース（イミノジ酢酸固定化樹脂）を充
填したカラム（１，６ｘｌＯｃｒｒＬ）に、１１１７９
７ｍ１の塩化亜鉛水溶液６０ｍＡを流速１０ｃｗＬ／ｈ
ｒで流す。

次いで０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５　Ｍす／
酸緩衝液（ｐＨ７，４）で充分に平価化した後、前工程
で得られる濃縮液を流速１０　ｍｌ／　ｈｒで付し、更
に６０１ｎｌの同緩衝液で溶出した非吸着画分を採取す
る。活性はこの両分にほとんどが回収される。工程２〜
６を通しての活性回収率は３０％、精製度Ｆｉ１．０Ｘ
１０’倍である。

工程７（ゲル濾過） 前精製工程で得られた活性画分を濃縮し、０１５Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７
．４）で充分に平衡化したトヨパールＨＷ−５５（東洋
ソーダ株式会社）のカラム（１，５Ｘ９０傭）に付す。

同緩衝液にて流速４ｍｌ／ｈｒでゲル濾過溶出を行ない
、活性画分を採取する。全精製工程を通しての活性の回
収率は２０％、精製度は２．　ＯＸ　１０’倍である。

このようにして得られる本生理活性物質（ヒ）ＴＮＦ）
の比活性は８．０Ｘ１０５単位／１に／蛋白質である０ 工程８（ヒトＴＮＦの免疫） 前記工程７で得られたヒ）　ＴＮＦ精製液を常法に従い
、フロイントの完全アジユバントと１＝１に混合し、蛋
白量として２０〜１００μｇ／回／匹となるように６週
令の雄のＢＡＬＢ／Ｃマスウス背部皮下に２週問おきに
３回免疫を行なう。３回目の免疫後、該マウスの尾静脈
から採血を行ない、遠心して血球分を除いた血清を用い
てＬ−Ｍ細胞に対するヒトＴＮＦ障害作用の阻害効果よ
シ免疫の状態を調べる。免疫が充分出来たマウスの血清
は約１０００倍生理食塩水で希釈しても、ＴＮＦのＬ−
Ｍ細胞障害性を完全に阻害する。免疫の充分行なわれた
マウスの腹腔に約１０，０μｇのＴＮＦ精製液を注射し
た後３日後に、該マウスを次の工程９に供する。

工程９（細胞融合） 前述のＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法に準じで行なう。工程
８で得られるマウスの牌緘を無菌的外科的に摘出する。

摘出した牌ｊ系をハサミで細く切断し、次いで１００メ
ツシユの金網を通してバラバラにし、Ｉ・リスー塩化ア
／モニウス溶液で充分洗浄後、ハ／スク液で洗浄し融合
に用いる。マウスミエローマ細胞であるＰ３Ｘ６３Ａｇ
８Ｕ１２×１０７コと上記牌細胞２×１０８コをハンク
ス液中で混合し、次いで遠心して上清を除去し／Ｃのち
、ホリエチレンクリコール２，０００（ＰＥＧ２０００
）とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む０．１５
　Ｔｈ、４塩化ナトリウム含有す／酸緩衝液（ｐＨ７，
８）中にて融合を行なう。融合し／Ｃ細胞はＲＰＭＩ−
１６４０溶液で良く洗浄後、ＨＡＴおよび１０％牛脂児
血清を含むＲＰＭＩ−Ｊ６４０培地に懸濁させ９６穴デ
インシユ（コースタ−社米国）６枚に均一にまいた後、
３７０Ｃ１５％炭酸ガスを含む空気中で１週間培養を行
なうと、融合した細胞以外に、はとんどの細胞が死滅し
て、融合した細胞のコロニーが形成されている状態とな
る。

目的とする抗ヒ）ＴＮＦ抗体が産生きれているかどうか
、石川栄治他著「酵素免疫測定法」医学書院、１９７８
年記載の酵素免疫測定法と、Ｌ−Ｍ細胞障害性を阻害す
る活性測定法と２種の方法を用いて培養上清の測定を行
ない、両方の測定法とも（＋）の活性を有するウェルを
決めて、その中に存在するコロニーを１つのコロニーが
１つのウェルになるようガラス毛細管を用いてクローニ
ングし、７日間培養後、再び、酵素免疫測定法およびＬ
−Ｍ細胞障害性阻害法の２法を用いて抗体産生能をチェ
ックを行ない、最終的に、目的とするヒトＴＮ’Ｆのモ
ノクローナル抗体を産生じている細胞が数種知得られる
。

ＩｇＧを産生じている細胞が、はとんどである。

得らｔた融合細胞（雑種細胞）は、再度限外希釈法にて
クロー二／グを行ない、モノクローナル抗体産生株化細
胞とする。

工程１０（モノクローナル抗体の生産）次に、得られる
融合細胞を用いて大量にモノクローナル抗体を取得する
。１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で
３７℃、５％炭酸ガスを含む空気中で培養する。あらか
じめプリスタｙ（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
た、６週令の雄のＢ　Ａ’　Ｌ　Ｂ　／　Ｃマウスの腹
腔内に５×１０６〜Ｉ　Ｘ　１０７コ／匹づり培養して
おいた細胞を注射する。１週間はどして腹水化したマウ
スより腹水を注射器で採取し、該腹水を遠心して細胞を
除き上清を採取する。１匹当シ約２　ｍｌで３０匹のマ
ウスよ、！１ｌ１５０Ｈの腹水上清を得る。４種類のモ
ノクローナル抗体を含有する腹水をそれぞれ、４０％硫
酸アンモニウム水溶液を用いて沈殿し、得られた沈殿物
を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ
７，４）に溶解したのちＩ）ＥＡＥ−セファロースカラ
ム（ファルマシア社製、スウェーデン）に付し溶出液分
画とし７て、純度９５％以上（７，５％ポリアクリルア
ミドゲル（ｐＨ８，９）の電気泳動）の抗ヒ）ＴＮＦモ
ノクローナル抗体各５００■ずつ取得する。

工１１１１（抗ヒトモノクローナル抗体カラムの作成） 得うれた抗ヒトモノクローナル抗体の３００■を、０．
５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍの炭酸ナトリウム
水溶液に透析する。あらかじめ臭化シアンで活性化した
セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）　５０ｃ
ｃに０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸ナト
リウム水溶液（ｐＨ８，３）中で、該透析抗体を４°Ｃ
でゆつくシ攪拌しながら一晩反応させる。反応後、樹脂
は、良く洗浄し未反応の活性基を保護する為にＩＭのエ
タノールアミン水溶液と反応させ、更に８Ｍ尿素で洗浄
し、次いで生理食塩水で充分洗浄して、アフィニティー
カラム用の抗体固定化カラムを作成する。

工程１２（アフィニティーカラムを用いてのヒトＴＮＦ
の精製） 工程１１で作成したアフィニティーカラムを用いて工程
１で得られたヒ）　ＴＮＦの精製を試みる。工程１１の
樹脂を２．５×８ｃｒｎのカラムに充填する。生理食塩
水で充分洗浄後、工程１の培養液０．５１を流速Ｊ　Ｏ
ｍｉ／ｈｒで流す。次いで生理食塩水５００ｍＡ、同じ
流速で洗浄した後、０１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．
１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ＰＨ１０，（
１）で溶出する。溶出画分け２計ずつ分画し活性画分を
集める。この工程での活性回収率７５％、精製度はＩ　
Ｘ　１０４倍、比活性け、５　Ｘ　１０”単位／ｍ９蛋
白質である。

実施例２ 実施例１０工程１１に従って市販のエポキシ化活性セフ
ァロース（ファルマシア社製）に、実施例１と別の種類
の抗ヒ）ＴＮＦモノクローナル抗体を固定してアフィニ
ティーカラム（Ｎ。

２）を作成する。

次いで、とのカラムに実施例１、工程１で得られるヒ）
ＴＮＦ含有培養液０．５１を実施例１、工程１２と同様
に付し、生理食塩水で充分洗浄したのち、１Ｍチオシア
ン酸ナトリウム（ＰＨ７，５）で溶出を行なう。このよ
うにして得られる溶離画分は、０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含むリン酸緩衝液罠透析を行なって、活性を測定す
る。

得られるヒ）ＴＮＦの回収率７３％、精製度、８．０Ｘ
１０３倍、比活性４．５Ｘ１０５単位／ｍ９蛋白質であ
る。

以上のととく本発明記載のモノクローナル抗体を用いる
精製法によれは、実施例１の工程２〜工程７のような多
段階にわたる複雑な精製法を用いなくても、高い収率で
高純度のヒ）ＴＮＦが容易に取得できる。本発明記載の
ヒトＴＮＦの性状は、実施例１で示したモノクローナル
抗体′・アフィニティーカラムを用いて和製した試料を
用いて測定する。特にアミノ酸分析用には、精製したヒ
）　ＴＮＦ試料をセファテックスＧ２５で脱塩して本文
明細書中記載の測定に供する。

比較実施例は特にあけないが、実施例１の中に示した通
常の精製法に比較しても本発明の方法がいかに優れてい
るかは明白であろう。更に本発明の方法は、工業規模の
大量ｆ＃製を行なう上でも、抗体供給が安定してお９、
品質が一定したカラムが、必要なスケールでできること
から極めて有用である。本発明は、医−目的の高　１純
度ヒトＴＮＦを安定に供給する精製法として特に有効な
ものである。　２ 手続補正書（方式） ％式％ 事件の表示 特願昭５９−６５２２６号 発明の名称 ヒト腫瘍壊死因子の精製方法 補正をする者 事件との関係・特許出願人 （００５）　旭化成工朶株式会社 代理人 郵便番号１０５ 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビル５階
明細書の浄書（内容に変更なし） 手続補正書 昭和５９年１０月９日 （ ＠許庁長官　志賀　学　殿 １　事件の表示 特願昭５９−６５２２６号　（ ２発明の名称 ヒト腫瘍壊死因子の精製方法 Ｓ　補正をする者 事件との関係・特許出願人 （００３）　旭化成工業株式会社 ４代理人 郵便番号１０５ 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビルｐ階
明細書の発明の詳細な説明の欄 −補正の内容 明細書の記載を下記のとお逆補正する。

［）第５６頁４行の 「抗ヒトモノクローナル」を 「抗ヒトＴＮＦモノクローナル」と補正する。

２）第３６頁６行の 「抗ヒトモノクローナル」を 「抗に）　Ｔ　：Ｊ　Ｆモノクローナル」と補正する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒト＠瘍壊死因子の精製を行なうに際し、該ヒト腫瘍壊
   死因子に対して作成したモノクローナル抗体の少なくと
   も一種以上を担持固定化した、アフィニティーカラムに
   、該ヒト腫瘍壊死因子の粗精製液を付す工程を経ること
   を特徴とする、ヒト腫瘍壊死因子の精製方法。