JPS6219532A - インタ−ロイキン２レセプタ−発現誘導物質ａ - Google Patents
インタ−ロイキン２レセプタ−発現誘導物質ａInfo
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- JPS6219532A JPS6219532A JP60159749A JP15974985A JPS6219532A JP S6219532 A JPS6219532 A JP S6219532A JP 60159749 A JP60159749 A JP 60159749A JP 15974985 A JP15974985 A JP 15974985A JP S6219532 A JPS6219532 A JP S6219532A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、インターロイキン２ （以下ｒＩＬ２」と
記す）レセプター（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｒｅ
ｃｅｐ−ｔｏｒ ＋以下ｒｌＬ２ＲＪと記す）の発現を
誘導する物質（以下ｒＡＤＦＪと記す）に関する。
記す）レセプター（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｒｅ
ｃｅｐ−ｔｏｒ ＋以下ｒｌＬ２ＲＪと記す）の発現を
誘導する物質（以下ｒＡＤＦＪと記す）に関する。
（従来の技術〕
ＡＤＦは、ＩＬ２ＲであるとされているＴａｃ抗原（Ｎ
ａｔｕｒｅ、３００’ 、 ２６７−２６９（１９８２
）、Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、８０゜６９５７−６９５１（
１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ、 ３１１．６３５−６３８
（１９８４））を誘導する物質としてヒト成人型Ｔ白血
病患者より樹立したＴ白血病細胞株（以下ｒＡＴＬ細胞
」と記す）の培養液上清中に存在することが見い出され
た（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４．１６２３−１６３０
．（１９８５）、 Ｊ、Ｍｏｌ。
ａｔｕｒｅ、３００’ 、 ２６７−２６９（１９８２
）、Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、８０゜６９５７−６９５１（
１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ、 ３１１．６３５−６３８
（１９８４））を誘導する物質としてヒト成人型Ｔ白血
病患者より樹立したＴ白血病細胞株（以下ｒＡＴＬ細胞
」と記す）の培養液上清中に存在することが見い出され
た（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４．１６２３−１６３０
．（１９８５）、 Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｃｅ１１． Ｉｍｍｕｎｏｌ、２．１７−２６．（１９
８５）） 、従ってＡＤＦは、ＩＬ２Ｒの発現を誘導す
ることにより、生体内においてはＩＬ２のＴＥ０１胞分
化増殖作用等の活性を発現せしめ又は生体内ＩＬ２を有
効に機能せしめるものであり、このような特異な生物活
性から免疫不全、腫瘍等の治療として広く応用され得る
ことが期待できる。
８５）） 、従ってＡＤＦは、ＩＬ２Ｒの発現を誘導す
ることにより、生体内においてはＩＬ２のＴＥ０１胞分
化増殖作用等の活性を発現せしめ又は生体内ＩＬ２を有
効に機能せしめるものであり、このような特異な生物活
性から免疫不全、腫瘍等の治療として広く応用され得る
ことが期待できる。
Ｔａｃ抗原を誘導する可溶性物質としては、本発明者ら
の研究によればインターロイキン１ （ｉｎｔｅｒ−１
ｅｕｋｉｎ １ ）があるが、インターロイキン１のア
ミノ酸配列等の化学的性質（Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、 ８
１．７９０７−７９１１、 （１９８４））と本発明の
ＡＤＦのそれとは全く相違するものである。
の研究によればインターロイキン１ （ｉｎｔｅｒ−１
ｅｕｋｉｎ １ ）があるが、インターロイキン１のア
ミノ酸配列等の化学的性質（Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、 ８
１．７９０７−７９１１、 （１９８４））と本発明の
ＡＤＦのそれとは全く相違するものである。
また、本発明者らは先に、ＡＴＬ細胞の培養上清をゲル
濾過クロマトグラフィーに付し、分子量４０から３５ｋ
ｄと２０から１５ｋｄのＡＤＦ活性を有する画分を得た
が（Ｊ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２＋ １
７−２６、 （１９８５））、その後の研究によれば、
ここにおいて得られたＡＤＦ画分は純粋なものでなく、
いくつかの蛋白の混合物であることが明らかになった。
濾過クロマトグラフィーに付し、分子量４０から３５ｋ
ｄと２０から１５ｋｄのＡＤＦ活性を有する画分を得た
が（Ｊ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２＋ １
７−２６、 （１９８５））、その後の研究によれば、
ここにおいて得られたＡＤＦ画分は純粋なものでなく、
いくつかの蛋白の混合物であることが明らかになった。
従って、このＡＤＦ蛋白画分と精製された本発明のＡＤ
Ｆ蛋白標品とは別異のものであり、このように精製され
て初めて単一物質がＩＬ２Ｒの発現誘導に関与している
ことが明らかにさたれのである。いいかえれば、従来の
ＡＤＦ画分は、いくつかの蛋白性物質の混合物としてＩ
Ｌ２Ｒ発現誘導活性を有していたものである。加えてこ
のような混合物を医薬として使用するには、種々の問題
があることは充分予想できる。
Ｆ蛋白標品とは別異のものであり、このように精製され
て初めて単一物質がＩＬ２Ｒの発現誘導に関与している
ことが明らかにさたれのである。いいかえれば、従来の
ＡＤＦ画分は、いくつかの蛋白性物質の混合物としてＩ
Ｌ２Ｒ発現誘導活性を有していたものである。加えてこ
のような混合物を医薬として使用するには、種々の問題
があることは充分予想できる。
従って本発明の目的は、活性を有するために必要な蛋白
のみに精製されたＡＤＦを得ることにある。
のみに精製されたＡＤＦを得ることにある。
軟土の問題点を解決するため、本発明者らは種種研究の
結果、ついに以下の性質を有するＡＤＦを単一物質とし
て単離することに成功した。即ち（１） 分子量＝２
０から１０ｋｄ（セファクリルＳ−２００ゲル濾過法） （２）等電点：ｐ１５．５から４．５ （３）アミノ酸配列（Ｎ−末端より）：Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｐ−Ａｌａ−ＡｌａＡＴＬ細胞を得るには、例えば以
下の二つの方法がある。
結果、ついに以下の性質を有するＡＤＦを単一物質とし
て単離することに成功した。即ち（１） 分子量＝２
０から１０ｋｄ（セファクリルＳ−２００ゲル濾過法） （２）等電点：ｐ１５．５から４．５ （３）アミノ酸配列（Ｎ−末端より）：Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｐ−Ａｌａ−ＡｌａＡＴＬ細胞を得るには、例えば以
下の二つの方法がある。
第１の方法は、ＡＴＬ患者末梢血より樹立するものであ
る。即ち、ＡＴＬと診断された患者より末梢血を採取し
、フィコール法を用いて白血球を得、ヒト末梢血、ある
いはヒト牌細胞より調製しつ た粗ＩＬ−２を添加した１０％ｌシ胎児血清（Ｆｅ２）
を含むＲＰ旧−１６４０培地で培養を開始する。安定な
増殖を示す様になった後、徐々に粗ＩＬ２を培地から抜
き培養開始数ケガ後、１０％ＦＣ３を含有したＲＰＭＩ
−１６４０培地のみで増殖、継代可能な細胞株を得る。
る。即ち、ＡＴＬと診断された患者より末梢血を採取し
、フィコール法を用いて白血球を得、ヒト末梢血、ある
いはヒト牌細胞より調製しつ た粗ＩＬ−２を添加した１０％ｌシ胎児血清（Ｆｅ２）
を含むＲＰ旧−１６４０培地で培養を開始する。安定な
増殖を示す様になった後、徐々に粗ＩＬ２を培地から抜
き培養開始数ケガ後、１０％ＦＣ３を含有したＲＰＭＩ
−１６４０培地のみで増殖、継代可能な細胞株を得る。
得られた細胞株がＡＴＬ細胞であることを確認するため
、ＥロゼツトＯＫＴシリーズ＋ ｓ−Ｉｇ、ＡＴＬＡ、
Ｔａｃなど表面形質を検索する。尚これらの抗原マーカ
ーを説明すれば、いずれも良くしられたものであり、臨
床面で広く用いられている。
、ＥロゼツトＯＫＴシリーズ＋ ｓ−Ｉｇ、ＡＴＬＡ、
Ｔａｃなど表面形質を検索する。尚これらの抗原マーカ
ーを説明すれば、いずれも良くしられたものであり、臨
床面で広く用いられている。
Ｅロゼツトはヒツジ赤血球に対するレセプターの検索で
あり、主にＴリンパ球に発現されている。
あり、主にＴリンパ球に発現されている。
ＯＫＴシリーズには０ＫＴ−３，４，６，８，などがあ
るが、Ｔ−３はＴ細胞抗原リセプター関連抗原であり、
ヒト末梢血Ｔリンパ球の同定に、又Ｔ−４はヘルパー１
９７８球サブセットの同定に、Ｔ−６はβ−２ミクログ
ロブリン関連抗原で、コモン胸腺由来Ｔリンパ球の同定
に、Ｔ−８はサプレッサー／キラーＴリンパ球サブセッ
トの同定にそれぞれ用いられている。ｓ−Ｉｇは細胞表
層免疫グロブリンであり、Ｂリンパ球に特異的に発現さ
れている。ＡＴＬＡはヒト成人Ｔ白血病抗原であり、ウ
ィルス由来の蛋白質が抗原となっている。又ＴａｃはＩ
Ｌ２Ｒであるとされている。これらの抗原に対するモノ
クローナル抗体はいずれ市販されているか、もしくは容
易に入手可能であることからそれぞれのモノクローナル
抗体にＦＩＴＣを結合させ、検体の細胞と反応させれば
容易に細胞表面抗原の同定ができる。
るが、Ｔ−３はＴ細胞抗原リセプター関連抗原であり、
ヒト末梢血Ｔリンパ球の同定に、又Ｔ−４はヘルパー１
９７８球サブセットの同定に、Ｔ−６はβ−２ミクログ
ロブリン関連抗原で、コモン胸腺由来Ｔリンパ球の同定
に、Ｔ−８はサプレッサー／キラーＴリンパ球サブセッ
トの同定にそれぞれ用いられている。ｓ−Ｉｇは細胞表
層免疫グロブリンであり、Ｂリンパ球に特異的に発現さ
れている。ＡＴＬＡはヒト成人Ｔ白血病抗原であり、ウ
ィルス由来の蛋白質が抗原となっている。又ＴａｃはＩ
Ｌ２Ｒであるとされている。これらの抗原に対するモノ
クローナル抗体はいずれ市販されているか、もしくは容
易に入手可能であることからそれぞれのモノクローナル
抗体にＦＩＴＣを結合させ、検体の細胞と反応させれば
容易に細胞表面抗原の同定ができる。
第２の方法は、ヒト成人Ｔ白血病ウィルス（ＡＴＬν）
を用いた末梢血トランスフォーメーション（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ）である、 （Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２１７．７３
７（１９Ｂ２））。
を用いた末梢血トランスフォーメーション（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ）である、 （Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２１７．７３
７（１９Ｂ２））。
即ちγ線（１２，０００ラド）照射により、増殖能を完
全に停止させたＡＴＬＶ産生ＡＴＬ細胞例えばＭＴ−２
細胞と健常４由来末梢血をフィコール処理して得られた
白血球細胞をともにＲＰＭＩ−１６４０培−ケガ後、継
代可能な細胞株が得られるようになるが、増殖が不安定
な場合は、ヒト末梢血由来などのＩＬ２を添加する。得
られた細胞株がＡＴＬ細胞であることを確認するためＥ
ロゼツト、 ＯＫＴシリーズ＋ ｓ−Ｉｇ＋ ＡＴＬＡ
＋ Ｔａｃなどの表面形質の検索を第一の方法と同様に
行なう。
全に停止させたＡＴＬＶ産生ＡＴＬ細胞例えばＭＴ−２
細胞と健常４由来末梢血をフィコール処理して得られた
白血球細胞をともにＲＰＭＩ−１６４０培−ケガ後、継
代可能な細胞株が得られるようになるが、増殖が不安定
な場合は、ヒト末梢血由来などのＩＬ２を添加する。得
られた細胞株がＡＴＬ細胞であることを確認するためＥ
ロゼツト、 ＯＫＴシリーズ＋ ｓ−Ｉｇ＋ ＡＴＬＡ
＋ Ｔａｃなどの表面形質の検索を第一の方法と同様に
行なう。
次にＡ Ｔ、Ｌ細胞を用いてＡＤＦを産生ずる方法の一
例を示す。ＡＴＬ細胞を増殖させるのに好適な条件例え
ば、ウシ胎児血清（Ｆ ＣＳ）を含む培地にて、ＡＴＬ
細胞を培養し、ＡＴＬの細胞数を増やした後、細胞を分
離洗浄して、ＡＤＦ産生に最適な条件例えば、Ｆｅ２な
どの蛋白質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに
培養することにより夾雑蛋白質の少ないＡＤＦを得るこ
とができる。
例を示す。ＡＴＬ細胞を増殖させるのに好適な条件例え
ば、ウシ胎児血清（Ｆ ＣＳ）を含む培地にて、ＡＴＬ
細胞を培養し、ＡＴＬの細胞数を増やした後、細胞を分
離洗浄して、ＡＤＦ産生に最適な条件例えば、Ｆｅ２な
どの蛋白質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに
培養することにより夾雑蛋白質の少ないＡＤＦを得るこ
とができる。
ＡＴＬ細胞を培養するのに用いる培地の主成分は市販の
培地でよい。例えばＲメＭｌ−１６４０培地、改良イー
グル培地（ＭＥＭ）、ダルベツコ改良イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）、又はクリック培地でよい。これらの培地に対
する添加物としてｉ）１ｍｊ！当たり２０〜２５０単位
、理想的には１ｍ１当り約１００単位のペニシリン、ｉ
ｉ）１ｍｌ当り１μｇ〜１００μｇ、理想的には１ｍ４
２当り１０μｇのゲンタマイシン、ｉｉｉ）１ｍｊ！当
り、２０〜２５０μｇ、理想的には１００μｇのストレ
プトマイシン、１Ｖ）１＋＋＋Ｉ！当り約１００−１０
００μｇ。
培地でよい。例えばＲメＭｌ−１６４０培地、改良イー
グル培地（ＭＥＭ）、ダルベツコ改良イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）、又はクリック培地でよい。これらの培地に対
する添加物としてｉ）１ｍｊ！当たり２０〜２５０単位
、理想的には１ｍ１当り約１００単位のペニシリン、ｉ
ｉ）１ｍｌ当り１μｇ〜１００μｇ、理想的には１ｍ４
２当り１０μｇのゲンタマイシン、ｉｉｉ）１ｍｊ！当
り、２０〜２５０μｇ、理想的には１００μｇのストレ
プトマイシン、１Ｖ）１＋＋＋Ｉ！当り約１００−１０
００μｇ。
理想的には１ｍ１当り約３００μｇの新鮮Ｌ−グルタミ
ン、ｖ）１〜３ｇ／ｌ理想的には２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ
，、ｖｉ） ５ Ｘ １０−’〜５ Ｘ １０−’Ｍ
％理想的には５ Ｘ １０−’Ｍの２−メルカプトエタ
ノールなど必要に応じて用いることが出来る。ＡＴＬ細
胞の細胞数を増、やすのに最適な培地として、例えば上
述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは１０％ＦＣ３
を添加した培地を用いる。
ン、ｖ）１〜３ｇ／ｌ理想的には２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ
，、ｖｉ） ５ Ｘ １０−’〜５ Ｘ １０−’Ｍ
％理想的には５ Ｘ １０−’Ｍの２−メルカプトエタ
ノールなど必要に応じて用いることが出来る。ＡＴＬ細
胞の細胞数を増、やすのに最適な培地として、例えば上
述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは１０％ＦＣ３
を添加した培地を用いる。
Ｔ細胞よりリンホカインを生産する場合は、通常は培地
にＦｅ２のような蛋白質を添加したり、マイトゲンを添
加したりすることが必須であったが、これに対して、Ａ
ＴＬ細胞を使用して、ＡＤＦを生産する場合は、培地に
Ｆｅ２のような血清成分、あるいは、その他の血清成分
を加える必要がなく、又通常用いられているＴ細胞また
はＢ細胞に対するマイトゲンも加える必要がない。
にＦｅ２のような蛋白質を添加したり、マイトゲンを添
加したりすることが必須であったが、これに対して、Ａ
ＴＬ細胞を使用して、ＡＤＦを生産する場合は、培地に
Ｆｅ２のような血清成分、あるいは、その他の血清成分
を加える必要がなく、又通常用いられているＴ細胞また
はＢ細胞に対するマイトゲンも加える必要がない。
ＡＴＬ細胞を用いてＡＤＦを生産する上記方法は種々の
環境的条件で行なわれる。即ち、好ましくはＡＴＬ細胞
培養物は約３５＠〜３７℃の温度の範囲において約５％
〜１０％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべき
である。培養器としてはファルコン・ラブウェア・ディ
ヴイジョン。
環境的条件で行なわれる。即ち、好ましくはＡＴＬ細胞
培養物は約３５＠〜３７℃の温度の範囲において約５％
〜１０％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべき
である。培養器としてはファルコン・ラブウェア・ディ
ヴイジョン。
ベクトン・ディッキンソン・エンド・コーポレーション
（Ｆａｌｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、 Ｄｉｖ、Ｂｅｃｔ
ｏｎ、 Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ Ｃｏ、）から市販
されているファルコン＆３０１３又３０２５のような組
織培養フラスコを使用することができる。又、上記ファ
ルコン・ラブウェアから市販されているボトルＮａ３０
２７のようなローラーボトル、あるいは、スピンナージ
ャーフラスコも使用することが可能である。ＡＴＬ細胞
を培養して細胞数を増やすための培養開始時の細胞密度
はｌＸｌ０’／＋ｗｌであることが好ましい。上述の条
件でＡＴＬ細胞を培養すると通常４〜５日で４〜６Ｘ１
０’／…ｌに細胞密度が増加するので再び新しい培地を
加えて、ｌＸｌ０’／ｍｊ！まで細胞密度を下げ、再び
培養を続ける。この様にして目的とする細胞数になるま
でＡＴＬ細胞の培養を続けた後、細胞を遠心分離し、細
胞を蛋白質を含まぬ完全合成培地で洗ってから、新しい
完全合成培地に接種する。この時の細胞の当初密度は、
ｌＸｌ０’〜ｌＸｌ０’であることが好ましく、理想的
には５Ｘ１０’／ｍｊ？である。ＡＴＬ細胞を培養する
ことによって生産されるＡＤＦ量は経時的に変化する０
例えば、５Ｘ１０’／ｎｊ！の初発細胞密度でＡＴＬ細
胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（ペニシリン１００単位／
ｍｌ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍ１及びＮａ
ＨＣＯｓ ２ ｇ ／ ｌを含む）で培養すると、ＡＤ
Ｆ活性は３日〜５日後に最高に達する。この様にＲＰｔ
ｌ−１６４０培地中でＡＴＬ細胞よりＡＤＦを生産する
至適培養時間は約３日〜５日間である。
（Ｆａｌｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、 Ｄｉｖ、Ｂｅｃｔ
ｏｎ、 Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ Ｃｏ、）から市販
されているファルコン＆３０１３又３０２５のような組
織培養フラスコを使用することができる。又、上記ファ
ルコン・ラブウェアから市販されているボトルＮａ３０
２７のようなローラーボトル、あるいは、スピンナージ
ャーフラスコも使用することが可能である。ＡＴＬ細胞
を培養して細胞数を増やすための培養開始時の細胞密度
はｌＸｌ０’／＋ｗｌであることが好ましい。上述の条
件でＡＴＬ細胞を培養すると通常４〜５日で４〜６Ｘ１
０’／…ｌに細胞密度が増加するので再び新しい培地を
加えて、ｌＸｌ０’／ｍｊ！まで細胞密度を下げ、再び
培養を続ける。この様にして目的とする細胞数になるま
でＡＴＬ細胞の培養を続けた後、細胞を遠心分離し、細
胞を蛋白質を含まぬ完全合成培地で洗ってから、新しい
完全合成培地に接種する。この時の細胞の当初密度は、
ｌＸｌ０’〜ｌＸｌ０’であることが好ましく、理想的
には５Ｘ１０’／ｍｊ？である。ＡＴＬ細胞を培養する
ことによって生産されるＡＤＦ量は経時的に変化する０
例えば、５Ｘ１０’／ｎｊ！の初発細胞密度でＡＴＬ細
胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（ペニシリン１００単位／
ｍｌ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍ１及びＮａ
ＨＣＯｓ ２ ｇ ／ ｌを含む）で培養すると、ＡＤ
Ｆ活性は３日〜５日後に最高に達する。この様にＲＰｔ
ｌ−１６４０培地中でＡＴＬ細胞よりＡＤＦを生産する
至適培養時間は約３日〜５日間である。
このようにして得られたＡＴＬ細胞の培養液上清より、
ＡＤＦは、塩析、真空透析、限外濾過。
ＡＤＦは、塩析、真空透析、限外濾過。
ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニイティークロマトグラフィー、クロマ
トフオーカシング、逆相クロマトグラフィー、ゲル電気
泳動等の種々の方法によって上述の培養上清から濃縮し
て精製できる。例えばセファクリルＳ −２００（Ｐｈ
ａｒ＋ｗａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌｓ＋
スウェーデン）カラムクロマトグラフィー。
フィー、アフィニイティークロマトグラフィー、クロマ
トフオーカシング、逆相クロマトグラフィー、ゲル電気
泳動等の種々の方法によって上述の培養上清から濃縮し
て精製できる。例えばセファクリルＳ −２００（Ｐｈ
ａｒ＋ｗａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌｓ＋
スウェーデン）カラムクロマトグラフィー。
スペローズＨＲ／１２カラムクロマトグラフィー（Ｓｕ
ｐｅｒｏｓｅ ＨＲ／１２＋ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆ
ｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
ｐｅｒｏｓｅ ＨＲ／１２＋ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆ
ｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
ハイドロオキシアパタイトクロマトグラフィー。
オクタドデシルシラン（Ｏｃｔａ Ｄｏｄｅｓｙｌｅ
５ｉｌａｎｅ（ＯＤＳ Ｃｌ８））カラムを用いた逆
相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ Ｌ Ｃ）等の組
み合わせによりＡＤＦを純化することが可能である。尚
、ＡＴＬ細胞の濃縮液をセファクリルＳ−２００カラム
を用いて分画すると分子量４０〜３０ｋｄ及び、２Ｏ−
１０ｋｄに相当する２つのＡＤＦ活性のピークが認めら
れるが、本発明のＡＤＦは低分子、即ち分子量２Ｏ−１
０ｋｄの位置に認められる物質に相当する。
５ｉｌａｎｅ（ＯＤＳ Ｃｌ８））カラムを用いた逆
相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ Ｌ Ｃ）等の組
み合わせによりＡＤＦを純化することが可能である。尚
、ＡＴＬ細胞の濃縮液をセファクリルＳ−２００カラム
を用いて分画すると分子量４０〜３０ｋｄ及び、２Ｏ−
１０ｋｄに相当する２つのＡＤＦ活性のピークが認めら
れるが、本発明のＡＤＦは低分子、即ち分子量２Ｏ−１
０ｋｄの位置に認められる物質に相当する。
得られたＡＤＦの物理化学的性質は、以下のとおりであ
る。
る。
＋１１ 分子量
上述の方法でＡＴＬ−２より生産されるＡＤＦは以下の
性質を有する。
性質を有する。
前もってＰＢＳで平衡化セファクリルＳ−２００カラム
に濃縮されたＡＴＬ−２培養土清を添加し、ＰＢＳで溶
出すると、分子量４０−３０．２Ｏ−１０ｋｄに対応す
る位置にＡＤＦが溶出する。又、ＦＰＬＣシステム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＋
スウェーデン）を用いたスペローズＨＲ／１２カラムク
ロマトグラフィーにおいては分子ｔ３０−２５ｋｄと１
５−４３ｋｄに対応する位置にＡＤＦが溶出された。
に濃縮されたＡＴＬ−２培養土清を添加し、ＰＢＳで溶
出すると、分子量４０−３０．２Ｏ−１０ｋｄに対応す
る位置にＡＤＦが溶出する。又、ＦＰＬＣシステム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＋
スウェーデン）を用いたスペローズＨＲ／１２カラムク
ロマトグラフィーにおいては分子ｔ３０−２５ｋｄと１
５−４３ｋｄに対応する位置にＡＤＦが溶出された。
（２）等電点
前述の方法でＡＴＬ−２より得たＡＤＦを含む培養液を
限外濾過により濃縮しセファクリルＳ−２００ゲル濾過
クロマトグラフイーを行ない分画した粗ＡＤＦ、即ち、
高分子および低分子ＡＤＦを含んだサンプルをｐＨ６〜
４の範囲でフｌルマシアモノｐカラムを用いてクロマト
フオーカシングを行なうと、ＡＤＦはｐｏｓ、ｓ〜４．
５の間に溶出されｐｒが５．５から４．５の酸性蛋白質
であることが明らかとなった。さらにセファクリルＳ−
２００ゲルクロマトグラフイー以後数段階の精製工程を
終了した低分子性ＡＤＦを含んだ試料を用いて、前述の
如く同様にクロマトフオーカシングを行なうとＡＤＦは
ｐＨ５，２、４，７、４，４の位置に？容出され低分子
性ＡＤＦはｐｉが５．２． ４．７． ４．４のミクロ
ヘテロジャナイティーを示す酸性蛋白であることが示さ
れた。これはＩ！！鎖構造の違いを反映しているものと
考えられる。
限外濾過により濃縮しセファクリルＳ−２００ゲル濾過
クロマトグラフイーを行ない分画した粗ＡＤＦ、即ち、
高分子および低分子ＡＤＦを含んだサンプルをｐＨ６〜
４の範囲でフｌルマシアモノｐカラムを用いてクロマト
フオーカシングを行なうと、ＡＤＦはｐｏｓ、ｓ〜４．
５の間に溶出されｐｒが５．５から４．５の酸性蛋白質
であることが明らかとなった。さらにセファクリルＳ−
２００ゲルクロマトグラフイー以後数段階の精製工程を
終了した低分子性ＡＤＦを含んだ試料を用いて、前述の
如く同様にクロマトフオーカシングを行なうとＡＤＦは
ｐＨ５，２、４，７、４，４の位置に？容出され低分子
性ＡＤＦはｐｉが５．２． ４．７． ４．４のミクロ
ヘテロジャナイティーを示す酸性蛋白であることが示さ
れた。これはＩ！！鎖構造の違いを反映しているものと
考えられる。
（３）Ｎ末端部分のアミノ酸配列
最終精製工程であるＯＤＳカラムを用いた逆相高速液体
クロマトグラフィーで、単一ピークとなった低分子性Ａ
ＤＦのＮ末端部分のアミノ酸−次構造をアミノ酸シーク
エンサーで決定すると以下のＮ末端構造からなる分子で
あることが明らかとなった。
クロマトグラフィーで、単一ピークとなった低分子性Ａ
ＤＦのＮ末端部分のアミノ酸−次構造をアミノ酸シーク
エンサーで決定すると以下のＮ末端構造からなる分子で
あることが明らかとなった。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−＾１ａ−Ａｌａこうして得られた
ＡＤＦは、免疫不全、癌、自己免疫感染症などの治療薬
として有用であり、ＡＤＦ単独もしくはＩＬ２や他のリ
ンホカイン、免疫活性物質との併用で、治療薬としての
広範囲の適用が可能である。と同時に、本蛋白やそれを
構成するペプチドはそれ自体もしくはそれに対する抗体
と組み合わせて、各種疾病の診断にも用いうる。又ＡＤ
ＦとＩＬ２を併用させることにより、ＩＬ２の作用の増
強も可能である。面木ＡＤＦは単にＩＬ２Ｒ全２Ｒ増強
するのみならず、他にも多くの免疫活性を示し免疫活性
物質として当該分野で良く知られる有用性も併せもつ。
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−＾１ａ−Ａｌａこうして得られた
ＡＤＦは、免疫不全、癌、自己免疫感染症などの治療薬
として有用であり、ＡＤＦ単独もしくはＩＬ２や他のリ
ンホカイン、免疫活性物質との併用で、治療薬としての
広範囲の適用が可能である。と同時に、本蛋白やそれを
構成するペプチドはそれ自体もしくはそれに対する抗体
と組み合わせて、各種疾病の診断にも用いうる。又ＡＤ
ＦとＩＬ２を併用させることにより、ＩＬ２の作用の増
強も可能である。面木ＡＤＦは単にＩＬ２Ｒ全２Ｒ増強
するのみならず、他にも多くの免疫活性を示し免疫活性
物質として当該分野で良く知られる有用性も併せもつ。
ＡＤＦの活性は以下の方法で測定する。
Ｉ Ｌ ２ Ｒ（Ｔａｃ抗原）の発現が調節的であるＮ
Ｋ様腫瘍株であるＹＴ細胞（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１３虹。
Ｋ様腫瘍株であるＹＴ細胞（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１３虹。
１６２３−１６３０． （１９８５））の、Ｔａｃ抗原
発現誘導を指標としてＡＤＦの活性測定を行なった。即
ち３Ｘ１０’コのＹＴ細胞をサンプル存在下、２４時間
５％Ｃ（ｈ通気中゛培養する。１％ＦＣ３及び０．１％
ＮａＮｉを含むハンクスバランスド溶液で２回洗浄し螢
光物質であるＦ Ｉ Ｔ Ｃ（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ
１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を結合した抗Ｔａｃ抗
体で３０分間４０°Ｃで反応させ染色する。ネガティブ
コントロールとしてＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇ抗体を
用いる。染色された細胞の螢光強度はフローサイトメト
リー（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｍ −０ｒｔｈｏ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ、、ＮＪ）で測定し、陽性
率を求める。
発現誘導を指標としてＡＤＦの活性測定を行なった。即
ち３Ｘ１０’コのＹＴ細胞をサンプル存在下、２４時間
５％Ｃ（ｈ通気中゛培養する。１％ＦＣ３及び０．１％
ＮａＮｉを含むハンクスバランスド溶液で２回洗浄し螢
光物質であるＦ Ｉ Ｔ Ｃ（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ
１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を結合した抗Ｔａｃ抗
体で３０分間４０°Ｃで反応させ染色する。ネガティブ
コントロールとしてＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇ抗体を
用いる。染色された細胞の螢光強度はフローサイトメト
リー（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｍ −０ｒｔｈｏ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ、、ＮＪ）で測定し、陽性
率を求める。
実施例１
（１）ＡＤＦ産生ＡＴＬ細胞の樹立
ＡＤＦ産生ＡＴＬ細胞としては、例えばＡＴＬ−２細胞
株がある。ＡＴＬ−２細胞株は成人Ｔ細胞白血病（ＡＴ
Ｌ）と診断された６１オ男子の末梢血より樹立したもの
である。培養開始時の患者末梢血は細胞核の異型性から
白血病細胞と判定されたものであり、白血病細胞の表面
形質はＥロゼツト （＋） 、 ０ＫＴ−３（＋）
、 ４ （＋） 、 ６（−） 、 ８ （）
、 Ｉａ（＋）であり血清中のＡＴＬＡ抗体は陽性で
あった。培地はＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣ５
含有）にヒト末梢血、あるいは肺細胞由来の粗ＩＬ２を
添加したものを用いた。
株がある。ＡＴＬ−２細胞株は成人Ｔ細胞白血病（ＡＴ
Ｌ）と診断された６１オ男子の末梢血より樹立したもの
である。培養開始時の患者末梢血は細胞核の異型性から
白血病細胞と判定されたものであり、白血病細胞の表面
形質はＥロゼツト （＋） 、 ０ＫＴ−３（＋）
、 ４ （＋） 、 ６（−） 、 ８ （）
、 Ｉａ（＋）であり血清中のＡＴＬＡ抗体は陽性で
あった。培地はＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣ５
含有）にヒト末梢血、あるいは肺細胞由来の粗ＩＬ２を
添加したものを用いた。
培養開始３ケ月後から安定な増殖を示す様になり、３−
４日毎の継代培養が可能になった。更に培養開始後１０
ケ月前後からＩＬ２依存性を漸次脱しＩＬ２を添加しな
くとも１０％のＦｅ２を含むＲＰＭＩ−１６４０培地の
みで増殖継代が可能となり、現在に至る迄、３年８ケ月
にねたり継代培養が続けられている。ＡＴＬ−２の細胞
の形質はＥロゼツト （＋） 、 ０ＫＴ−３（−）
、 ４ （＋） 。
４日毎の継代培養が可能になった。更に培養開始後１０
ケ月前後からＩＬ２依存性を漸次脱しＩＬ２を添加しな
くとも１０％のＦｅ２を含むＲＰＭＩ−１６４０培地の
みで増殖継代が可能となり、現在に至る迄、３年８ケ月
にねたり継代培養が続けられている。ＡＴＬ−２の細胞
の形質はＥロゼツト （＋） 、 ０ＫＴ−３（−）
、 ４ （＋） 。
８ （） 、 Ｔａｃ （＋） 、 ＳＩｇ （−）
であり、＾ＴＬＡ（＋）で、電子顕微鏡によりＣ型レト
ロウィルス粒子（ＡＴＬＶ））が多数観察される。
であり、＾ＴＬＡ（＋）で、電子顕微鏡によりＣ型レト
ロウィルス粒子（ＡＴＬＶ））が多数観察される。
ＡＴＬ患者からは種々の表面形質を持つＡＴＬ細胞株が
樹立されるが、ＡＤＦ産生細胞株の多くはＡＴＬ−２細
胞と同様０ＫＴ−４（＋）即ちヘルパーフェノタイプで
ある。
樹立されるが、ＡＤＦ産生細胞株の多くはＡＴＬ−２細
胞と同様０ＫＴ−４（＋）即ちヘルパーフェノタイプで
ある。
（２） Ａ Ｔ Ｌ −２によるＡＤＦの製造２１容
プラスチツクローラー培養器（ファルコン３０２７）（
以下ローラーと称する）中のＩＮの１０％ＦＣ３含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地（２１のグルタミン、１００単位
Ｚｒｒｌ＆ペニシリン。
プラスチツクローラー培養器（ファルコン３０２７）（
以下ローラーと称する）中のＩＮの１０％ＦＣ３含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地（２１のグルタミン、１００単位
Ｚｒｒｌ＆ペニシリン。
１００μｇ／ｍｔ；ｔストレプトマイシン、 ２ｇ／
ＩＩＮａＨＣＯｚを含有）にｌＸｌ０’／ｍ１の細胞密
度にＡＴＬ−２を接種し、２０ｒｐｍで回転させつつ、
５日間、３７℃で培養した。培養後、培養物を遠心分離
して細胞を集め、ＲＰＭＩ−１６４０培地で１回細胞を
洗った後、細胞を２１容ローラ中１βのＲＰＭＩ−１６
４０培地に５Ｘ１０’／ｍ１細胞濃度に懸濁した。ロー
ラーを２Ｏｒｐｍで回転させつつ、３７℃で４日間培養
した。培養後培養物を遠心分離して培養上清を得た。
ＩＩＮａＨＣＯｚを含有）にｌＸｌ０’／ｍ１の細胞密
度にＡＴＬ−２を接種し、２０ｒｐｍで回転させつつ、
５日間、３７℃で培養した。培養後、培養物を遠心分離
して細胞を集め、ＲＰＭＩ−１６４０培地で１回細胞を
洗った後、細胞を２１容ローラ中１βのＲＰＭＩ−１６
４０培地に５Ｘ１０’／ｍ１細胞濃度に懸濁した。ロー
ラーを２Ｏｒｐｍで回転させつつ、３７℃で４日間培養
した。培養後培養物を遠心分離して培養上清を得た。
本培養上清のＡＤＦ活性を検定すると、確かにＡＴＬ−
２細胞はＹＴ細胞上のＩＬ２Ｒの発現を誘導する物質を
産生じていることが示された。
２細胞はＹＴ細胞上のＩＬ２Ｒの発現を誘導する物質を
産生じていることが示された。
（３１ＡＤＦの精製
ＡＤＦはＡＴＬ−２の培養上清より以下の様にして精製
した。
した。
セファクリルＳ−２００ゲルυ゛・クロマトグラフィー
１１ＡのＡＴＬ−２無血清培養上清（ＲＰＭＩ−１６４
０）をアミコン社のＤＣ−２ホローフアイバーシステム
（ＨＩ Ｐ Ｉ Ｏ−８ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ。
０）をアミコン社のＤＣ−２ホローフアイバーシステム
（ＨＩ Ｐ Ｉ Ｏ−８ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ。
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｕｔ ａｔ １０ｋｄ Ａｍ１
ｃｏｎ Ｃｏｒｐ、、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ＋ＬＡ）を用
い、１０ｍ／まで濃縮した後ＰＢＳで平衡化したセファ
クリルＳ−２００カラムによるゲル濾過クロマトグラフ
ィーを行ない分画した。
ｃｏｎ Ｃｏｒｐ、、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ＋ＬＡ）を用
い、１０ｍ／まで濃縮した後ＰＢＳで平衡化したセファ
クリルＳ−２００カラムによるゲル濾過クロマトグラフ
ィーを行ない分画した。
ＡＤＦ活性は分子量４Ｏ−３０ｋｄ及び２Ｏ−１０ｋｄ
に相当する両分に溶出された。尚、標準蛋白質としては
ウシ血清アルブミン（６，６万）、キモトリプシノーゲ
ン（２，４万）、チトクロームＣ（１，３万）を用いた
。分子１１０ｋｄ〜５０ｋｄに相当する両分を集め、ア
ミコンＤｉａｆ ｔｏ Ｙ Ｍ −５メンブレンフイル
ターを用いて濃縮した。（Ａｍｉｃｏｎ、ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｃｕｔ ａｔ ５０００） ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー次に濃縮Ａ
ＤＦサンプルを１０ｍＭ Ｎａ１ＰＯ４（ｐＨ６，８）
で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（１０ｘ１
．５ｃｍ）に添加し、２０ｍ１の１０゜４０、 １１
０． ４００．ｍＭ のＮａ１ＰＯ４，（ｐＨ６，
８）でそれぞれ順次蛋白質を溶出した。主に１１０ｍＭ
のＮａ１ＰＯｎでＡＤＦ活性は溶出された。
に相当する両分に溶出された。尚、標準蛋白質としては
ウシ血清アルブミン（６，６万）、キモトリプシノーゲ
ン（２，４万）、チトクロームＣ（１，３万）を用いた
。分子１１０ｋｄ〜５０ｋｄに相当する両分を集め、ア
ミコンＤｉａｆ ｔｏ Ｙ Ｍ −５メンブレンフイル
ターを用いて濃縮した。（Ａｍｉｃｏｎ、ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｃｕｔ ａｔ ５０００） ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー次に濃縮Ａ
ＤＦサンプルを１０ｍＭ Ｎａ１ＰＯ４（ｐＨ６，８）
で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（１０ｘ１
．５ｃｍ）に添加し、２０ｍ１の１０゜４０、 １１
０． ４００．ｍＭ のＮａ１ＰＯ４，（ｐＨ６，
８）でそれぞれ順次蛋白質を溶出した。主に１１０ｍＭ
のＮａ１ＰＯｎでＡＤＦ活性は溶出された。
ハイドロキシアパタイトカラムより得たＡＤＦ活性画分
（１１０ｍＭ Ｎａ１ＰＯ４溶出液）をさらにＰＢＳで
平衡化したスペローズＨＲ１０／３０１２カラムを用い
たＦ Ｐ Ｌ Ｃ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑ
ｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍ、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデ
ン）システムにかけ、０．５ ｍ ｌ ／ｍｉｎの流速
で分離精製した。ＡＤＦはセファクリルＳ−２００クロ
マト同様、分子量３Ｏ−２５ｋｄと１５−１３ｋｄに相
当する高分子量及び低分子量の２つの両分に溶出された
。
（１１０ｍＭ Ｎａ１ＰＯ４溶出液）をさらにＰＢＳで
平衡化したスペローズＨＲ１０／３０１２カラムを用い
たＦ Ｐ Ｌ Ｃ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑ
ｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍ、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデ
ン）システムにかけ、０．５ ｍ ｌ ／ｍｉｎの流速
で分離精製した。ＡＤＦはセファクリルＳ−２００クロ
マト同様、分子量３Ｏ−２５ｋｄと１５−１３ｋｄに相
当する高分子量及び低分子量の２つの両分に溶出された
。
１０ ｍＭ Ｎａ１ＰＯ４（ｐＨ６，８）で平衡化した
ハイドロキシアパタイトカラムにスペローズＨＲ１０／
３０１２カラムから溶出した低分子性のＡＤＦ活性画分
即ち分子１１５−１３ｋｄに相当する両分を添加し、Ｈ
ＰＬＣにより分離した。蛋白質の溶出は１０ｍＭから４
００ＭｍのＮａ１ＰＯ４（ｐＨ６，８）直線濃度勾配（
１０ｍＭ／ ｍ１ｎ）で行ない溶出速度は０．５ ｍ
ｌ ／＋＋＋ｉｎとした。ＡＤＦ活性は２つの活性ピー
クに分かれ全体の９０％以上の活性を占める高濃度のＮ
ａ、ＰＯａで溶出された両分をプールし、次の精製工程
に移行した。
ハイドロキシアパタイトカラムにスペローズＨＲ１０／
３０１２カラムから溶出した低分子性のＡＤＦ活性画分
即ち分子１１５−１３ｋｄに相当する両分を添加し、Ｈ
ＰＬＣにより分離した。蛋白質の溶出は１０ｍＭから４
００ＭｍのＮａ１ＰＯ４（ｐＨ６，８）直線濃度勾配（
１０ｍＭ／ ｍ１ｎ）で行ない溶出速度は０．５ ｍ
ｌ ／＋＋＋ｉｎとした。ＡＤＦ活性は２つの活性ピー
クに分かれ全体の９０％以上の活性を占める高濃度のＮ
ａ、ＰＯａで溶出された両分をプールし、次の精製工程
に移行した。
ＯＤＳカラム（Ｃ１８）を用いた逆相高速液体ハイドロ
キシアパタイトカラムより得られたへ〇Ｆ活性画分をさ
らにシンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ） ＲＰ−
ＣＩ Ｂ （Ｓｙｃｈｒｏｍ、 Ｉｎｃ、、Ｌｉｎｄｅ
ｎ、 Ｉｎｄｉａｎａ）カラムに添加し、逆相ＨＰＬＣ
システムにより分離した。尚カラムは予め０．１％のＴ
ＦＡで平衡化し、蛋白の溶出は流速１． Ｏｒａ ｌ
／ｗｉｎで０．１％のＴＰＡを含む０〜１００％のアセ
トニトリルの直線濃度勾配により行なった。ＡＤＦ活性
はＣＨ３ＣＮ ５８〜６２％で溶出され蛋白の吸収（Ｏ
Ｄ２８０）と完全に一致した。
キシアパタイトカラムより得られたへ〇Ｆ活性画分をさ
らにシンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ） ＲＰ−
ＣＩ Ｂ （Ｓｙｃｈｒｏｍ、 Ｉｎｃ、、Ｌｉｎｄｅ
ｎ、 Ｉｎｄｉａｎａ）カラムに添加し、逆相ＨＰＬＣ
システムにより分離した。尚カラムは予め０．１％のＴ
ＦＡで平衡化し、蛋白の溶出は流速１． Ｏｒａ ｌ
／ｗｉｎで０．１％のＴＰＡを含む０〜１００％のアセ
トニトリルの直線濃度勾配により行なった。ＡＤＦ活性
はＣＨ３ＣＮ ５８〜６２％で溶出され蛋白の吸収（Ｏ
Ｄ２８０）と完全に一致した。
（４）ＡＤＦ精製蛋白の性質
公王ｌ
上述した如く、セファクリルＳ−２００クロマトグラフ
イーではＡＤＦは４０〜３０及び２０〜１０ｋｄの分子
量を与えて、スペローズＨＲ／１２カラムクロマトでは
３０〜２０ｋｄ及び１５〜１３ｋｄの分子量を与える。
イーではＡＤＦは４０〜３０及び２０〜１０ｋｄの分子
量を与えて、スペローズＨＲ／１２カラムクロマトでは
３０〜２０ｋｄ及び１５〜１３ｋｄの分子量を与える。
さらに低分子性のＡＤＦは５ＯＳ−ＰＡＧＥでは１Ｏ−
１３ｋｄの分子量を与える。
１３ｋｄの分子量を与える。
！１点
あらかじめ２５ｍＭ ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ
（ｐＨ６，３）で平衡化したモノｐカラムにＡＤＦ活
性画分を通した。蛋白質の溶出はｐＨ６〜４．０の１０
ｍＭポリバッフｙ−７４で行ないカラム操作はＦＰＬＣ
システムを用いた。セファクリルＳ−２００溶出ＡＤＦ
画分、即ち高分子および低分子性のＡＤＦの混合物を含
んだサンプルではｐ１５．５−４．５を与え、ハイドロ
キシアパタイトカラム（ＨＰ Ｌ Ｃシステム）溶出画
分の低分子性ＡＤＦのみを含んだサンプルではｐ１５．
２． ４．７． ４．４を与えた。
（ｐＨ６，３）で平衡化したモノｐカラムにＡＤＦ活
性画分を通した。蛋白質の溶出はｐＨ６〜４．０の１０
ｍＭポリバッフｙ−７４で行ないカラム操作はＦＰＬＣ
システムを用いた。セファクリルＳ−２００溶出ＡＤＦ
画分、即ち高分子および低分子性のＡＤＦの混合物を含
んだサンプルではｐ１５．５−４．５を与え、ハイドロ
キシアパタイトカラム（ＨＰ Ｌ Ｃシステム）溶出画
分の低分子性ＡＤＦのみを含んだサンプルではｐ１５．
２． ４．７． ４．４を与えた。
ヱｌム改ｙ丑
低分子性のＡＤＦ蛋白のアミノ酸配列を決定するために
精製ＡＤＦをプロティン・シークエンサ（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ、）に導入した。アミノ
酸配列の決定方法はＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９３．
２６５−２７５（１９５１）に記載されている方法によ
り行った。
精製ＡＤＦをプロティン・シークエンサ（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ、）に導入した。アミノ
酸配列の決定方法はＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９３．
２６５−２７５（１９５１）に記載されている方法によ
り行った。
低分子性のＡＤＦは以下に示すＮ末端構造を示す分子か
らなることが判明した。
らなることが判明した。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ（５） 精製Ａ
ＤＦの免疫活性 ＨＰＬＣによって単一に純化されたＡＤＦサンプルを用
いてＹＴ細胞におけるＩ Ｌ ２ Ｒ，すなわちＴａｃ
抗原の発現について１ｉ１！認した。３Ｘ１０’のＹＴ
ＩＩＩ胞と純化されたＡＤＦサンプルを１０％ＦＣ３を
含むＲＰＭＩ培地（１００μｇ／ｍｉストレプトマイシ
ン、１００単位／ｍＡ’のペニシリン、２ ｇ ／ ｊ
！ ＮａＨＣＯ，を含む）で２４時間培養した。
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ（５） 精製Ａ
ＤＦの免疫活性 ＨＰＬＣによって単一に純化されたＡＤＦサンプルを用
いてＹＴ細胞におけるＩ Ｌ ２ Ｒ，すなわちＴａｃ
抗原の発現について１ｉ１！認した。３Ｘ１０’のＹＴ
ＩＩＩ胞と純化されたＡＤＦサンプルを１０％ＦＣ３を
含むＲＰＭＩ培地（１００μｇ／ｍｉストレプトマイシ
ン、１００単位／ｍＡ’のペニシリン、２ ｇ ／ ｊ
！ ＮａＨＣＯ，を含む）で２４時間培養した。
１％ＦＣ３および０．１％ＮａＮｉを含むハンクスバラ
ンスド溶液で２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗Ｔａｃ抗体と
４℃、３０分間反応させた。反応後細胞を洗浄し細胞に
結合したＦＩＴＣ−抗Ｔａｃ抗体の量をフローサイトメ
トリーを用いて解析した（第１図）。
ンスド溶液で２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗Ｔａｃ抗体と
４℃、３０分間反応させた。反応後細胞を洗浄し細胞に
結合したＦＩＴＣ−抗Ｔａｃ抗体の量をフローサイトメ
トリーを用いて解析した（第１図）。
第１図を説明すれば、ａが対照実験であり実線はＡＤＦ
サンプル加えないＹＴ細胞、また破線はネガティブコン
トロールであり、Ｆ ＩＴＣ−抗Ｔａｃ抗体のかわりに
ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体を用いた螢光パター
ンである。ｂは純化されたＡＤＦを加えたＹＴ細胞の螢
光パターンである。
サンプル加えないＹＴ細胞、また破線はネガティブコン
トロールであり、Ｆ ＩＴＣ−抗Ｔａｃ抗体のかわりに
ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体を用いた螢光パター
ンである。ｂは純化されたＡＤＦを加えたＹＴ細胞の螢
光パターンである。
横軸は螢光強度を、縦軸はそれぞれの螢光強度に対する
細胞数を示す。而ち曲線のカーブが横軸の左にずれるほ
ど、検体の細胞表面のＦＩＴＣ量が多いことを示す。第
１図に示すとおり、明らかに純化されたＡＤＦはＹＴ細
胞のＴａｃ抗原の発現を誘導している。
細胞数を示す。而ち曲線のカーブが横軸の左にずれるほ
ど、検体の細胞表面のＦＩＴＣ量が多いことを示す。第
１図に示すとおり、明らかに純化されたＡＤＦはＹＴ細
胞のＴａｃ抗原の発現を誘導している。
尚、本条件下で単にＴａｃ抗原の発現のみならず純化さ
れたりコンビナンドＩＬ２の結合の増巾も確認された。
れたりコンビナンドＩＬ２の結合の増巾も確認された。
さらにはＡＤＦに加えＩＬ２を共存させると、Ｔａｃ抗
原の発現、ＩＬ２の結合はＡＤＦ単独の時よりも更に増
強させることも確認され、ＡＤＦとＩＬ２による併用の
有用性が示された。
原の発現、ＩＬ２の結合はＡＤＦ単独の時よりも更に増
強させることも確認され、ＡＤＦとＩＬ２による併用の
有用性が示された。
第１図は、本発明のインターロイキン２レセプター発現
誘導物質のＴａｃ抗原誘導活性を調べた結果を示す。
誘導物質のＴａｃ抗原誘導活性を調べた結果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 以下の性質を有するインターロイキン２レセプター発現
誘導物質 （１）分子量：２０から１０ｋｄ（セファクリル−Ｓ２
００ゲル濾過法） （２）等電点：ｐＩ５．５から４．５ （３）アミノ酸配列（Ｎ−末端より）： Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60159749A JPS6219532A (ja) | 1985-07-19 | 1985-07-19 | インタ−ロイキン２レセプタ−発現誘導物質ａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60159749A JPS6219532A (ja) | 1985-07-19 | 1985-07-19 | インタ−ロイキン２レセプタ−発現誘導物質ａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6219532A true JPS6219532A (ja) | 1987-01-28 |
| JPH0555519B2 JPH0555519B2 (ja) | 1993-08-17 |
Family
ID=15700422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60159749A Granted JPS6219532A (ja) | 1985-07-19 | 1985-07-19 | インタ−ロイキン２レセプタ−発現誘導物質ａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6219532A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0299206A2 (en) * | 1987-06-12 | 1989-01-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Recombinant human ADF |
| WO2010061902A1 (ja) | 2008-11-26 | 2010-06-03 | レドックス・バイオサイエンス株式会社 | スクリーニング方法、該スクリーニング方法で選ばれた物質を含有する組成物、結合物質 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0794331A (ja) * | 1993-09-27 | 1995-04-07 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | ラインフィルタ |
-
1985
- 1985-07-19 JP JP60159749A patent/JPS6219532A/ja active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0299206A2 (en) * | 1987-06-12 | 1989-01-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Recombinant human ADF |
| JPS6485097A (en) * | 1987-06-12 | 1989-03-30 | Ajinomoto Kk | Recombinant human adf |
| US8440413B2 (en) | 2006-05-29 | 2013-05-14 | Redox Bioscience, Inc. | Method of screening for a substance that strengthens a bond between thioredoxin and macrophage migration inhibition factor |
| WO2010061902A1 (ja) | 2008-11-26 | 2010-06-03 | レドックス・バイオサイエンス株式会社 | スクリーニング方法、該スクリーニング方法で選ばれた物質を含有する組成物、結合物質 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0555519B2 (ja) | 1993-08-17 |
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