JPS63150297A - 新規ｂ細胞分化因子蛋白標品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は従来Ｂ細胞分化因子（以下、ＢＣＤＦと略称
する。）またはＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と略称する。

）代替因子（以下、ＴＲＰと略称する。）として知られ
ているヒトのＢＣＤＦの性質を有する新規ヒト　ＢＣＤ
Ｆ蛋白標品に関する。

より詳細には、ヒトＢ細胞由来細胞から産生され、ヒト
のＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる新規ヒトＢＣＤＦ
　（以下、Ｂ−ＢＣＤＦと略称する。）蛋白標品に関す
る。

ここで言うヒトＢ細胞由来細胞は、ヒト正常Ｂ細胞およ
びヒトＢ細胞を用いた融合細胞、ヒト形質転換細胞、ヒ
トＢ白血病細胞、ヒトＢリンパ腫細胞等の悪性化ヒトＢ
細胞を含むものである。

〔従来の技術〕

抗原刺激を受は活性化された成Ｉｊ＋　１３細胞は、Ｔ
細胞の助けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体
産生細胞にまで最終的に分化するには、１種またはそれ
以上のＴ細胞由来の分化誘導性の物質が必須であること
が知られている。この物質の存在はＲ，ＩＡ、　Ｄｕｔ
ｔｏｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｒｅｖ、　２３６
６（１９７５）、　Ａ、　ＳｃｈｉｍｐｌとＥ、　Ｗｅ
ｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎ。

Ｂｉｏｌ、　　２３７．１５　（１９７２）　、により
明らかにされている。

彼らはマウスのリンパ球混合物培養後の培養上清中また
は抗原やマイトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ
球培養上清中に存在する物質がマウスのＴ細胞を除去さ
れたリンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリンパ球の
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する１次免疫応答を増幅
させることを見出し、そのような作用を有する活性物質
にＴリンパ球代替因子すなわちＴＲＦという呼称を与え
ている。それ以来ＴＲＦは抗原非特異的に主要組織適合
遺伝子複合体（以下、ＭＨＣと略称する。）の一致を必
要としない様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖を
誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する液
性因子であると定義されている。

その後、このようなり細胞分化因子の存在を示す証拠が
蓄積されており、ヒトにおいてもマウス同様の分化因子
の存在が示唆されている。現在では上述のような、分裂
、増殖した、Ｂ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子を
ＢＣＤＦと総称するようになった。

このようにＢＣＤＦはヒトの体内でＢ細胞の抗体産生機
能に重要な働きをしている。

近年、このようなりＣ肝油性を有する因子の研究が活発
に行なわれており、厚木らはＴ細胞由来のＢＣＤＦ　（
Ｔ−ＢＣＤＦと略する）の存在を見い出し、その性質を
明らかにしている（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８２　、５４９０　（１９８５）　、特開昭
６１−１１５０２４　、特開昭６１−１１５０２５　、
特願昭６０−８６２８４、特願昭６ｌ−１８４８５８）
。

また、ＢＣ叶活性を有する因子はＴ細胞由来細胞以外に
もＢ細胞由来細胞からも生産される事が明らかにされ（
Ｋ、　Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　１３２　＋２９４８　（１９８４）　、特願昭５９−
２４９４８）　、この新規因子をＢ−ＢＣＤＰと呼ぶこ
とにしている。

ここで言う、Ｂ−ＢＣ叶とＴ−ＢＣＤＦは同一物質では
ない。何故ならば、■Ｂ−ＢＣＤＦはＢＣ叶活性のみな
らずインターロイキン１　（以後ＩＬ−１と略する）活
性を合わせもつ（Ｋ、　Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら第６回国
際免疫学会（１９８６））のに対してＴ−ＢＣＤＦには
ＩＬ−１活性は存在しない。■アミノ酸配列が相違する
。この点については「問題点を解決する手段」の項で詳
細に記載する。

またＢ−ＢＣＤＦはＩＬ−１とも同一物質ではない。な
ぜならば、■ＩＬ−１はＴ細胞、線維芽細胞、上皮細胞
等広汎な細胞の成熟、分化、活性化を促す因子として明
らかにされているが（Ｊ、　Ｊ、　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ
　ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　　７．　
４５　　（１９８６））、ＢＣＤＦ活性を有することは
報告されていない。■ＩＬ−１の報告されているアミノ
酸配列（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　８１　、７９０７　（１９８４
）　、Ｎａｔｕｒｅ、　３１５　。

６４１　（９８５））とＢ−ＢＣＤＦのアミノ酸配列が
相違する。

従って、以上のことより、Ｂ−ＢＣＤＦはＴ−ＢＣＤＦ
及びＩＬ−１とは異なった新規なリンホカインである。

しかし、この新規リンホカインであるＢ−ＢＣＤＦの理
化学的諸性質、特に部分アミノ酸配列を明らかにしたと
いう報告は現時点ではない。

Ｂ−ＢＣＤＦの部分アミノ酸配列の決定には２つの大き
な意義がある。

１つはＢ−ＢＣＤＦが既知のリンホカインと異なる新規
蛋白である事が確実にされたこと、もう１つは純粋なり
−ＢＣＤＦを工業的に生産する方法が確立されたことで
ある。

Ｂ−ＢＣＤＦを工業的に生産するうえにおいて、部分ア
ミノ酸配列の決定は次のような意義がある。

すなわち部分アミノ酸配列が決定すれば、このアミノ酸
配列をコードするＤＮＡは一義的に定まる。

このＤＮＡは一般的な方法（Ｍ、　Ｄ、　Ｍａｔｔｅｖ
ｃｃｉ、　Ｊ、Ａｍ。

ｍＲＮＡを調整し、これを鋳型にＣＤＮＡライブラリー
を市販の試薬キット（例えば、アマジャム・ジャパン社
製ＣＤＮＡ合成／クローニングシステム）を用いて作成
し、前述の合成りＮＡをプローブとしてこれと相補的な
ＣＤＮＡクローンを得る事は当該分野ではよく知られた
方法で容易に行ないうる。

得られたＣＤＮＡを発現可能なように適当なベクター　
ＤＮＡに導入し、得られた組み換え体ＤＮＡを真核生物
宿主あるいは原核生物宿主へ導入し、培養すれば純粋な
り−ＢＣＤＦを大量に得ることができる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、Ｂ−ＢＣＤＦの部分アミノ酸配列を決
定することにある。更に詳細に述べると、大量の純粋化
したＢ−ＢＣＤＦを得て、その理化学的諸性質、特にア
ミノ酸部分配列を決定することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはＢ−ＢＣ叶の工業的生産に有利であるヒＩ
−Ｂ−ＢＣＤＦＣＤ上トＢ細胞株を樹立し、この株化細
胞を用いたヒトＢ−Ｂ（：ＤＦ蛋白標品製造法を確立し
た。

ヒ１−Ｂ−ＢＣ叶産生ヒト細胞株の作製は以下のように
行なうことが出来る。ヒト末梢血、扁桃、請帯血などに
よりフィコールバンクなどを用いた密度勾配遠心法等で
リンパ球を分離し、Ｔ、　Ｋａｔｓｕｋｉら（Ｉｎｔ、
　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ−則、　７　（１９７６））の方
法に準じてＨｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ　（
以下、ＥＢＶと略称する。）を用いてヒトＢ細胞を形質
転換（トランスフォーメーション）する。たとえば下記
の方法を用いることが出来る。ウィルス産生細胞株Ｂ９
５−８の培養上清（約１０５ＴＤ　５０／ｎ＋ｊ２のつ
４）Ｌｉスを含む）を１〜２ｘ１０６／ｍｌｌのリンパ
球と共に３７℃で９０分間ゆるやかに振動させた後、細
胞を一度洗浄してから２０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ　１
６４０　　（培地１　ｍ（１にペニシリン０１００単位
、ストレプトマイシン１００μｇを含む）培養液に浮遊
させ、１×１０５細胞／ウエルずつ９６穴マイクロプレ
ートに分注し、炭酸ガス培養器で培養する。５日毎に培
養液を半量交換する。２〜３週間後に形質転換Ｂ細胞が
増殖したウェルの培養上清のＢＣ叶活性（活性測定法は
後述する）を測定し、ＢＣ叶活性を有するウェルの形質
転換Ｂ細胞をリミティングダイリューション法により株
化する。

来る。

ＣＥＳＳを用いたＢ−ＢＣＤＰの製造法には増殖、誘導
、産生の３段階が存在するが、この増殖、誘導、産生の
いずれも特別な条件はなく、一般に用いられている培養
条件を適宜採用して行えばよい。

ＣＥＳＳを用いてＢ−ＢＣＤＦを製造する場合の培地条
件であるが、増殖、誘導、産生のいずれの培地も市販の
培地でよし、１゜ 例えばＲＰＭＩ　１６４０培地、改良イーグル培地（Ｍ
ＥＭ）、ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）また
はクリック培地でよい。これらの培地に対する添加物と
してｉ）　　１　ｎｖ当り約２０〜２５０単位、理想的
には１　ｍｅ当り約１００単位のペニシリン、ｉｉ）１
ｍ７＋当り１μｇ〜１００μｇ、理想的には１ｍβ当り
１０μｇのゲンタマイシン、１ｉｉ）　　１　　ｍｌ当
り２０〜２５０μｇ、理想的には１００μｇのストレプ
トマイシン、ｉｖ）Ｉｍｆｆ当？ｆＪ１００〜１１００
０ｐ、理想的には１　ｍＡ’当り約３００μｇの新鮮Ｌ
−グルタミン、ｖ）　　１０〜６０ｍＭ、理想的には２
５ｍＭのヘペス緩衝液、ｖｉ）８〜２０ｍＭ、理想的に
は１６ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｖｉｉ）　　５　Ｘ　１０
−４〜５　Ｘ　１０−’Ｍ、理想的には５Ｘ１０−’Ｍ
の２−メルカプトエタノールなどを必要に応じて用いる
ことが出来る。

ｃＥｓｓの細胞数を増やす即ち、増殖に好ましい培地と
して、たとえば上述の基本培地にさらに１〜３０％、よ
り好ましくは１０％のウシ胎児血清（Ｆｅ２）等の蛋白
質を添加した培地を用いる。

この増殖培地にて細胞数を増加させた後直ちに産生培地
に移しても良いが、Ｂ−ＢＣＤＦの生産量をあげるため
には細胞を分離、洗浄して、次の誘導培地に移す方法が
有利である。

誘導培地であるが、これも特に限定する必要体ないが、
好ましくは上述の細胞を増殖させる培地（ＰＭＡ）のよ
うなマイトゲンを単独又は組み合せて添加した培地を用
いればよい。

更に詳細に述べると、サイクロヘキシイミドの添加量は
細胞を増殖させる為に用いた培地１ｍβ当りにサイクロ
ヘキシイミドを１μｇ〜１００　μｇ１より好ましくは
２０μｇである。

ＰＭＡの添加量は細胞を増殖させる為の培地１ｍβ当り
にＰＭＡを０．１μｇ〜１００μｇ、より好ましくは１
０μｇである。

サイクロヘキシイミド、ＰＭＡを単独又は組み合せて添
加した培地で培養した場合は誘導法を行なわない場合に
比較して約１０倍程度Ｂ−ＢＣＤＦの産生量は上昇する
。尚、誘導培地で培養する時間は特に限定しないが、好
ましくは２〜１６時間である。

次に、この誘導培地で培養した細胞を分離、洗浄してＢ
−ＢＣＤＦ産生培地に移し培養を行う。

Ｂ−ＢＣＤＦ産生培地は増殖培地と同じで良いが、Ｆｅ
２を添加しない上述の増殖培地が精製のためには有利で
ある。

Ｆｅ２を添加しない完全合成培地中で４８時間培養後も
ＣＥＳＳの生存率は９０％以上保持されている。

このように増殖、誘導、産生という３段階を経てＣＥＳ
ＳはＢ−ＢＣＤＦを生産する。

次に培養条件について記載する。

まず、増殖、誘導、生産の各段階に共通する培養条件で
あるが、ＣＥＳＳの培養は種々の条件で行なえる為に特
に限定はしないが、好ましくはＣＥＳＳ培養は約３５〜
３８°Ｃの温度範囲において約５〜１０％の炭酸ガスを
含む湿度調節空気中で行う方がよい。更に、理想的には
培地のｐＨは約７．０〜７．４と僅かにアルカリ性の条
件下に保持すべきである。ＣＥＳＳは平底ミクロプレー
トなど種々のタイプの培養器上１００μｌ単位などの種
々の容量で接種される。

ファルコン・ラブウェア・ディヴイジョン・ベクトン・
ディヴイソキンソン・エンド・コーポレーション（Ｆａ
ｊ！ｃｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ、　Ｄｉｖ、　Ｂｅｃｔｏ
ｎ。

Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、）から市販されて
いるフラスコ陽、３０１３または３０２４のような組織
培養フラスコも使用できる。別法として上記ファルコン
・ラブウェアから市販されているボトル１１に１．３０
２７のような回転びんも培養容器として使用できる。

またヌンク社から市販されているセルフアクドリー１ｋ
１６４３２７も大量培養するのに使用できる。

さて、ｃｇｓｓを培養して細胞数を増やす増殖段階であ
るが、その条件としては、細胞の当初密度は培地１　ｍ
ＡあたりｌＸｌ０’細胞ないし５×１０５細胞、好まし
くはｌＸＩＯ３細胞である。上述の条件でＣＥＳＳを培
養すると、通常２〜７日で培地１ｍ７！当り５Ｘ１０５
細胞から２Ｘ１０６細胞程度まで細胞密度が増加するの
で、再び新しい培地を加えて培地１ｍβ当りｌＸｌ０’
〜５Ｘ１０５細胞にまで細胞密度を下げ、再び培養を続
ける。このようにして目的とする細胞数になるまでＣＥ
ＳＳの培養を行う。

次に細胞を遠心分離等で分離、洗浄後、Ｂ−ＢＣＤＦ産
生に有利な誘導培地に移し、誘導を行う。くり返えし述
べるが誘導段階は必ずしも必要でない。

誘導培地での培養時間は２〜１６時間である。

この細胞を遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含
まぬ完全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接
種する。これより、Ｂ−ＢＣＤ、Ｆの産生段階が始まる
わけである。この時の細胞の当初密度は培地１ｍβあた
り約ｌＸｌ０’細胞ないしｌＸｌ０’細胞であることが
好ましく、理想的には培地１ｍ！あたり５Ｘ１０５細胞
である。

ＣＥＳＳを培養することによって生産されるＢ−ＢＣＤ
Ｆ量は経時的に変化する。例えば１ｍＡ当り５Ｘ１０’
初発細胞密度でＣＥＳＳをＲＰ旧１６４０培地（１ｍ４
当りペニシリン１００単位、ストレプトマイシン１００
　μｇ　、ゲンタマイシン１０．ｃｏｇおよびＮａＨＣ
ｏ。

１６μＨを含む）で培養すると、ＢＣＤＦ活性は４８時
間後にピークレベルに達する。さらに次の２４時間に存
在するＢＣＤＦ活性は僅かに減少する。このようにＲＰ
ＭＩ　１６４０培地中のＣＥＳＳでＢ−ＢＣＤＦを生産
する至適培養時間は約２４〜７８時間である。

このようにしてＢ−ＢＣＤＦを製造するが、この時の培
養上清中のＢ−Ｂ（：ＤＦ活性の測定は以下の方法であ
行う。

Ｂ−ＢＣＤＦ活性の測定法 種々のヒト細胞由来細胞を培養して生産されたＢ−ＢＣ
ＤＦの活性はＡ、　ＭｕｒａｇｕｃｈｉらＪ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ　１２７　＋４１２　（１９８１）に論じられ
た検定法に準じて測定できる。この検定法はＥＢＶによ
る形質転換ヒｌ−Ｂ細胞株のイムノグロブリン産生８Ｚ
’Ｊ−により活性検定するものである。ＢＣＤＦのシグ
ナルによりイムノグロブリン産生細胞に分化するヒトＢ
細胞株としてＱ、　５ａｅｋｉら（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　１３．３１　（１９８３））で報告さ
れている５ＫＷ６　ＣＬ−４を用いる。

ＢＣＤＦ含有試料をｊｌ！　Ｏｇｚ希釈した一連の希釈
溶液２００μβずつに約１０４のＳＫ讐６　ＣＬ−４を
接種する。希釈は１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ　１６４
０培地（１ｍＡ当りペニシリン単位、ストレプトマイシ
ン１００　μｇ　、ゲンタマイシン１０ｔｔｇおよびＮ
ａ）Ｉｃｅｓ１６ｍＭ　　を含む）で行なう。通常、１
つの試料について２連で行なう。この混合物を９６穴ク
イクロプレート中で７２時間、３７°Ｃにて５％炭酸ガ
スを含む湿度調節された空気中で培養する。途中４８時
間後、各ウェルに１００μβの新鮮な上述の培地を添加
する。４８℃に保温した試験管の中ヘハンクス緩衝液に
溶解した０、５％アガロース溶液３００μ１．ハンクス
緩衝液に懸濁したプロティンＡ結合５ＩｌｌＢＣ４０％
シ／シ懸濁液２０μ！　（プロティンＡ結合５ＲＢＣ、
５ＲＢＣパツク１　ｍｊ２に対し、プロティンＡ０．７
５■を含む生理食塩水０．７’５ｍ２およびＣｒＣＡ　
ｚ　・６Ｈ２０６６０μｇを含む生理食塩水１０ｍＡを
混合し、３７℃で６０分保温後、ＳＲＢＣを生理食塩水
で２回洗浄する）、ハンクス緩衝液で希釈した上述の５
ＫＷ６　ＣＬ−４細胞浮遊液１００μｌ１モルモット補
体溶液（ＳＲＢＣで吸収したモルモット血清をハンクス
緩衝液で３〜４倍希釈して用いる）２０μ！および抗ヒ
ＨｇＭ抗体溶液（ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体全血清、マイ
ルスをハンクス緩衝液で２０〜５０倍希釈して用いる）
２０μ４を上記の順に攪拌しつつ手早く加え、次いでプ
ラスチックシャーレにソスイＰシャーレ、深型。

日水製薬株式会社）上に直径約５　ｃｍの円板を画くよ
うに上述の混合物を手早くまく。寒天が固まってから３
７℃で５％の炭酸ガスを含む湿度調節された空気中で約
１６時間培養する。

この方法によりＢ−ＢＣＤＦの存在下に培養されたｓＫ
ｗ６ＣＬ−４Ｉｆｆ胞はＢ−ＢＣ叶の添加量に依存して
溶血班（プラック）の増加を示す。これはＢ−ＢＣＤＦ
により５ＫＷ６　ＣＬ−４が抗体産生細胞へ分化し、Ｉ
ｇＭを分泌するようになり、寒天中の５ＫＷ６　ＣＬ−
４細胞が分泌したＩｇＭと５ＫＷ６　ＣＬ−４細胞周囲
の抗ヒトＩｇＭ抗体結合５ＲＢＣが結合し、補体の働き
で溶血するものである。

ＢＣＤＦ活性の標準として、Ｔ細胞因子（ＴＦ）を用い
る。なお、八、　Ｍｕｒａｇｕｃｈｉら（Ｊ、　ｏｆ　
Ｉｍｍｕｎｏｌ。

２７　、４１２　（１９８１））の方法に従い、１　ｍ
ｌ中１×１０６細胞のヒトリンパ球をＰＨＡを含む培地
で４８時間培養した培養上清をＴＦとする。このＴＦを
１単位／　ｍ　ｊ２とし、このＴＦにより作成した標準
曲線より測定試料の単位を決定する。

培養上澄からのＢ−ＢＣＤＦの精製の概略は以下の通り
である。

Ｂ−ＢＣＤＦの精製 Ｂ−ＢＣＤＦは塩析、真空透析、限外濾過、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシ
シング、逆相クロマトグラフィー。

焦点電気泳動およびゲル電気泳動等の種々の方法によっ
て上述の培養物上清から濃縮して精製できる。

精製品の理化学的性質は下記のとおりである。

理化学的性質ニ ア 分　　子　　量：　１５，０００〜３０，０００等　　
電　　点：５．０〜５．５ 熱　安　定　性＝５６°Ｃ３３０分処理で９０％以上の
活性が残存する ８０℃、１５分処理で９０％以上の 活性が消失する ｐｌ＋安　定　性：２５°Ｃ，ｐＨ２，３０分処理で９
０％以上の活性が残存する トリプシン処理：活性が低下する ＵＶ　　処　理：活性が低下しない 超遠心処理：　１ｘ１０５Ｇ、６０分処理で上清に活性
が残存する 作　　　　用　：正常ヒトＢ細胞または特定のヒト悪性
化Ｂ細胞を抗体産生細胞 へ分化させる 産　生　細　胞：正常ヒトＢ細胞または特定のヒト悪性
化Ｂ細胞 しかも下記のアミノ酸部分配列を内部に有する。

アミノ酸部分配列１　：　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅｙｓ アミノ酸部分配列ＩＩ　：　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐｌｌｅ　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｘ　　Ｌｅ
ｕｉｎ　　Ｘ （Ｘは未確認アミノ酸） アミノ酸部分配列ｍ　：　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇ
ｉｎ　Ａｓｎ　ＰｈｅＡｌａ　Ｌｙｓ アミノ酸部分配列ＩＶ　：　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　
Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐｒｇ 尚、上記アミノ酸部分配列はＴ−ＢＣＤＦ　（特願昭６
ｌ−１８４８５８）には存在しない。従って、この事実
からもＢ−ＢＣＤＦはＴ−ＢＣ叶とは相違するＢ細胞分
化因子である。

〔効　果〕

本発明のＢ−ＢＣＤＦは従来、明らかにされているＴ−
ＢＣＤＦ、　ＩＬ−１と異なる新規リンホカインで、か
つ広汎な細胞に作用する事から下記のような有用性が期
待される。

Ｂ−ＢＣ叶の臨床への応用は大別して３つ考えられる。

第１はＢ−ＢＣＤＦにより抗ＢＣＤＦ抗体を作り、Ｂ−
ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦのイムノアッ
セイ系を用いて免疫学的な病態の解析に用いることが出
来ると共に、自己免疫疾、壱において散見されるＢ細胞
機能異状の修復にも用いうる。

第２の応用は各種疾患の治療への応用である。

例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にともなうＢ細胞抗
体産生能低下による免疫不全症患者にＢ−ＢＣＩＩＦ単
独または他のリンホカインや免疫療法剤と共に投与する
ことにより抗体産生機能を戻すことが考えられる。

また、重症感染症患者にＢ−ＢＣＤＦ単独または他のリ
ンホカインと共に投与することにより、感染細菌に対す
る抗体産生能を増強させることも考えられる。

第３の応用として次のことが考えられる。Ｂ細胞増殖因
子（ＢＣＧＦ）　（Ｋ、　Ｙｏｓｈｉｚａｋｉ　ら、Ｊ
、　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ、　１３０　、１２４１　（１
９８３））　、その他のリンホカインを含むＴ細胞因子
を培地に加えることにより正常Ｂ細胞を長期培養するこ
とが報告されている　（Ｂ、　５ｒｅｄｎｉ　　ら、Ｊ
、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５４　、１５００（１９
８１））参照）。これらの培養正常Ｂ細胞に対し適当な
時期にＢ−ＢＣＤＦを作用させることにより１ｎｖｉｔ
ｒｏ抗体を産生させることが出来る。特定の抗体、例え
ば病原細菌、病原ウィルス、病原原虫、癌細胞などの表
面にある特定抗原を認識する抗体を産生ずるＢ細胞をモ
ノクローン化し、クローン化正常Ｂ細胞をＢ−ＢＣ叶と
その他のリンホカインを組合せて培養し、有用なモノク
ローナル抗体を産生させることが出来る。これら抗体は
感染症や癌の治療および診断に利用できる。

実施例に従って、本発明を更に具体的に説明する。

プ」Ｅ例Ｉ　　ＣＥＳＳによるＢ−ＢＣＤＦの製造１０
％ＦＣ３含有ＲＰＭＩ　１６４０培地で培養して細胞数
を増加させたＣＥＳＳの細胞懸濁液にＰＭＡを最終濃度
Ｌｏｎｇ／ｍβ、サイクロヘキシイミド最終濃度２（Ｊ
ｕｇ／ｍ！を加え、Ｂ−ＢＣＤＦ生産の誘導を行った。

６時間後に細胞を集め、ＲＰＭＩ　、１６４０培地にて
３回洗った後、１ｍ！当り５Ｘ１０’細胞数でデイソシ
ュ（フアシヨン３００３、ベクトンディソキンソン、オ
ーバーシーズ、インク、カリフォルニア。

［ｌ５Ａ）中、５０　ｍＩｌのＲＰＭＩ　１６４０培地
で培養を行い、Ｂ−ＢＣＤＦの生産をはかった。この培
地には１ｍｌあたり１００単位のペニシリン、１ｍＪあ
たり１００μｇのストレプトマイシン、１ｍｊ！あたり
１０μｇのゲンタマイシン、１６ｍＭのＮａＨＣＯｓ、
　　５　Ｘ　１０−’Ｍの２−メルカプトエタノールを
含有させた。

培養物を空気中５％炭酸ガス含有の湿度調節環境下３７
℃に保った。４８時間後、培養上清を取り、前述の検定
法を用いてＢＣ叶活性を調べた。この結果、１　ｍｌｌ
中約１０単位のＢ−ＢＣＤＦが得られた。

上述のように、ＣＥＳＳを培養して得たＢ−ＢＣＤＦを
含む培養上清よりＢ−ＢＣ叶を以下の方法で精製した。

即ち、無細胞上滑７０ｊ２をホローファイバー（アミコ
ン）ＩＩＰ５−２０　、アミコン・コーポレーション。

マサチューセッツ、　ｔｌｓＡ）を装着した濃縮装置（
アミコンＤＣ４システム、アミコン・コーポレーシコン
、マサチューセッツ＋、　［ｌ５Ａ）を用いて’ｌｌｌ
に濃縮□した。

２１の濃縮液をさらに限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０
）を装着した限外濾過装置（アミコン、スタンダードセ
ル５２型）を用い窒素ガスにより４ｋｇ／ｃ／の圧力を
かけて濾過した。濾過膜上部に残った５　ｍｌｌの濃縮
液を採油した。

このようにして得た上清をＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム
（ＬＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、　Ｓｗｅｄｅｎ、１．６
Ｘ９０ｃｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラムはあら
かじめＰＢＳ（ホスフェート・バソファーセイライン、
０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフェート・バッフ
ァー。

ＰＨ７，０）で平衡化した。濃縮上清をＰＢＳで溶出し
、溶出液を５　ｍｊ２ずつ分取し、分取液のＢＣＤＦ活
性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有する分画は分子量１５
．０００から３０，０００に相当するフラクションにＢ
−ＢＣＤＦが含まれていることがわかった。ゲル濾過カ
ラムは次の分子量マーカーで検定した。ブルーデキスト
ラン２０００　（ファルマシア・ファインケミカルス、
スウェーデン）２ｘ１０６．フェリチン４．５Ｘ１０５
１アルドラーゼ１．５８Ｘ１０５．オブアルブミン４．
５Ｘ１０’ｌキモトリプシノーゲン２．５Ｘ１０’１チ
トクロームＣ１，１７Ｘ　１０’。

また、Ｂ−ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、１００
゜倍容の２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，３
）に対し４℃で１夜透析した。

次にクロマトフオーカシングを行った。

クロマトフオーカシング ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフイーで分画れ、集め
られ、透析されたＢ−ＢＣ叶両分をあらかじめ２５ｍＭ
ピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，３）で平衡化したＭ
ｏｎｏ　Ｐカラム（ファルマシア・ファインケミカルス
、スウェーデン）に通した。このカラムを１０ｎｌの２
５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液で洗った後、塩酸でｐＨ
４，５に調製した４０ｍｊ！の１７１０希釈ポリバツフ
アー７４　（ファルマシア・ファインケミカルス、スウ
ェーデン）で溶出した。カラム操作はファースト・プロ
ティン・リキッド・クロマトグラフィー、　ＦＰＬＣ（
ファルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）を
用い、流速は毎分１　ｍβで行なった。溶出液を１　ｍ
ｅずつ分取し、ＢＣＤＦ活性とｐ）ｌを測定した。ＢＣ
ＤＦ活性はｐＨ５〜５．５の位置に溶出された。

ＢＣＤＦ活性を持つフラクションを集め、２０ｍＭビス
・トリス−プロパン塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に透析し
た。

Ｍｏｎｏ　Ｑ陰イオン交換カラムクロマトグラフィー上
述の透析した活性フラクションを２０ｍＭビス・トリス
−プロパン塩酸緩衝液（ａｌｌ　７．０　）で平衡化し
たＭｏｎｏ　Ｑカラム（ファルマシア・ファインケミカ
ルス、スウェーデン）に通した。このカラムを１０ｍｊ
ｌ！の２０ｍＭビス・トリス−プロパン塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で洗った後、２０ｍ＃の２０ｍＭビス・トリ
ス−プロパン塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対し２０ｍ１
の１．０Ｍ食塩を含む２０ｍＭビス・トリス−プロパン
塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）を直線的濃度勾配により加え
て溶出した。Ｍｏｎｏ　Ｑカラムの操作はファルマシア
Ｆ、ＰＬＣ装置を用い、流速は毎分１　ｍｌｌで行なっ
た。溶出液を１　ｍ７！ずつ分取し、ＢＣＤＦ活性を測
定した。ＢＣＤＦ活性は約７５ｍＭ食塩を含むフラクシ
ョンに検出された。

ハ　　０口　　２　　パ　　　　　　−　　　ロ　　　
　　−上述の活性フラクションをＨＣＡカラムＡ７６１
０（φ７．５ｍｍＸ１０ａｍ　　三弁醍圧化学）に通し
、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５，６）で溶出させた。

溶出速度は１ｍｌ／ｗｉｎ、塩濃度は５ｍＭから３００
ｍＭまで３０分かけて直線的に増加させ、さらに１０分
間３００　ｍＭで溶出させた。

ＢＣＤＦ活性画分を回収し、次にＨＰＬＣによるゲル濾
過を行った。

上述のＢＣＤＦ活性画分を濃縮し、ＴＳＫ−８Ｗ２００
０（東洋曹達）２本を連結したカラムにかけ、ＰＢＳで
溶出した。ＢＣＤＦ活性は分子量２０．０００のフラク
ションに含まれていた。活性画分を回収し、再度同じ条
件にてＴＳＫ−３Ｗ２　、ＯＯＯカラムにかけ、ＰＢＳ
で溶出した。ＢＣＤＦ活性画分を回収し、次に逆相カラ
ムによる精製を行なった。

入ら ゛　　　　　　−口　　　　　　　−−上述の１３ＣＤ
Ｆ活性画分をハイボアーＣ４逆相ＨＰＬＣカラム（バイ
オラッド）にかけ、０．１％ＴＦＡ中のアセトナトリル
濃度を０から６０％まで直線的に増加させて、溶出させ
た。溶出速度１．５　ｔｓｌ／　ｗｉｎの条件でＢＣＤ
Ｆ活性は、リテンション・タイム３４−３５分の画分に
回収された。

この画分を精製Ｂ−ＢＣＤＦ標品とした。

Ｉ　　　　、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−一ソデイウム・ドデシル・サルフエイト・ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動（５Ｏ３−ＰＡＣＥ）精製
Ｂ−ＢＣＤＦ溶液の５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。

Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ、　」ｕ、６
８０．（１９７０））に示された方法で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行なった。１％ＳＯ３中１２％ポリアクリルアミド
ゲルを用いた。　５ｗ１ｔｚｅｒらの方法（＾ｎａ１．
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＪＪＩ、２３１（１９７９））にし
たがいシルバーステイニング法を用いてタンパク質を検
出した。その結果、分子量２０　、ＯＯＯの位置にただ
１本のタンパク質のバンドが検出された。

以上の結果より、上述の精ｆＪＩＢ−ＢＣＤＦ標品は単
一物と判断される。

爽ｍ　　アミノ酸シークエンス 凍結乾燥したＢ−ＢＣＤＦ標品５μｇを２０ｐ１の５０
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐ　Ｈ８，０）、２ｍＭＣ
ａＣ１２バツフアーに溶解し、５００ｎｇのＴＰＣＫ処
理したトリプシンを加え、３７℃・２０時間反応させＢ
−ＢＣＤＦをフラグメント化した。

反応液を逆相クロマトグラフィー用カラム（ｃｈｅｍｃ
ｏｓｏｒｄ　００Ｓ−Ｈ４，６Ｘ　７５　ａｍ）を用い
たＩ（ＰＬＯにかけ、流速１　ｍｌ／　ｒＢｉｎで、１
％ＴＦＡ中のアセトニトリル濃度０から６０％まで６０
分かけて直線的に増加させ、フラグメントを分ｍ溶出し
た。

各ピーク部分の溶出液を凍結乾燥し、ブリティン・シー
クエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｃ
ｏ、）に導入した。

アミノ酸配列の決定は、ｊ、Ｂｔｏｌ、ｃ：ｈｅｍ、、
Ｊ、２６５〜２７５　（１９５１）に記載されている方
法により行なった。

アミノ酸配列を確認出来たフラグメントとアミノ酸配列
を記す。

フラグメント　Ｔ−１２ Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｉ−Ｌ
ｙｓフラグメント　τ−１８ Ｐｈｅ−＾１ａ−Ｌｅｕ−１１ｓ−τｈｒ−Ｔｒｐ−１
１ｅ−Ｇｌｙ−１１１ｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ
−Ｌｅｕ−（ｌＩｎ−ＸＸは未確認アミノ酸 フラグメント　Ｔ−１０ Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓフラグメント　τ−１１

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＢ細胞により生産され分子量１５０００〜３
   ００００、等電点５．０〜５．５でかつＢ細胞分化因子
   活性が１８０００Ｕ／ＯＤ＿２＿８＿０以上である蛋白
   標品
2. （２）下記のアミノ酸配列 I を内部に有する特許請求
   の範囲第（１）項記載の蛋白標品 アミノ酸配列 I ：Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　
   Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ
3. （３）下記のアミノ酸配列IIを内部に有する特許請求の
   範囲第（１）項記載の蛋白標品 アミノ酸配列II：Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔ
   ｈｒ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　ＧｌｙＧｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ
   　Ｓｅｒ　Ｘ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｘ（但し、Ｘは未確認
   アミノ酸）
4. （４）下記のアミノ酸配列IIIを内部に有する特許請求
   の範囲第（１）項記載の蛋白標品 アミノ酸配列III：Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　
   Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ
5. （５）下記のアミノ酸配列IVを内部に有する特許請求の
   範囲第（１）項記載の蛋白標品 アミノ酸配列IV：Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓ
   ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ