JPS63126897A - 免疫抑制因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト細胞由来の新規な免疫抑制因子に関する
。

〔従来の技術〕

ヒトＴ細胞により種々の免疫調節性因子（リンホカイン
ともいう）が産生されること、また、これらの免疫調節
性因子の中でも、免疫反応を負の方向へ導く免疫抑制活
性を有する因子が存在することが知られている。

ヒトＴ細胞由来の免疫抑制因子として、たとえばシュナ
ソパ−（Ｓｃｈｎａｐｅｒ）らは、ヒト牌細胞（特に、
ＯＫＴ　８抗原陽性サプレツサーＴ細胞）をコンカナバ
リンＡで刺激することによって、その培養上清中に、ポ
ークライードマイトジェンで刺激されたヒ）Ｂ細胞のポ
リクローナル抗体産生を抑制する活性を有する因子（Ｓ
ｏｌｕｂｌｅ　ｉｍｓ＋ｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕ
ｐｐｒｅｓｓｏｒ：５ＩＲ３）が産生されることを報告
している（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３２巻、２４２
９頁、１９８４年）。こ（７）ＳＩＲＳ因子は分子量１
１０，０００〜１５０．０００　テ、ｐ）（３処理で失
活し、過酸化水素などの酸化剤により活性化され、２−
メルカプトエタノールなどの還元剤により不活性化され
る。

グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）　らは、コンカナバリンＡで
刺激されたヒト末梢血リンパ球から、フィトヘマグルチ
ニン刺激によるヒトＴ細胞の幼若化反応を抑制する活性
を有する因子（Ｓｏｌｕｂｌｅ　ｉｍｍｕｎｅ　５ｕｐ
ｐ−ｒｅｓｓｏｒ　５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｏｆ　Ｔ
　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：５ＩＳＳ−
Ｔ）およびポークライードマイトジェン刺激によるヒ）
Ｂ細胞のポリクローナル抗体産生を抑制する因子（Ｓｏ
ｌｕｂｌｅ　ｉｍｍｕｎｅ　５ｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　５
ｕｐｅｒ−ｎａｔａｎｔ　ｏｆ　Ｂ　ｃｅｌｌ　ｉｍｍ
ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：５Ｉ
ＳＳ−８）が産生されることを報告している。５１５３
−Ｔ因子は、分子量が３０．０００〜４５．０００で、
その活性はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの添加によ
って阻害サレ、一方、５ＩＳＳ−８因子は、分子量６０
．０００〜ｓｏ、ｏｏｏで、その活性がＬ−ラムノース
添加によって阻害されることが明らかにされている（Ｊ
。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２６巻、１１８５頁、１９８１年
）。

また、ヒト正常Ｔ細胞ばかりでなく、種々のＴ細胞性白
血病などのＴ細胞株からも免疫反応を抑制する活性を有
する因子が産生されることが報告されている。たとえば
、ヒト白血病細胞由来の因子として、キャサリン（Ｃａ
ｔｈａｒｉｎｅ）らは、６−チオグアニン耐性のヒトＴ
細胞性白血病細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭからサプレッサーＴ
ｌ１ｌ胞を活性化する因子（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ−ａ
ｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ：５ＡＰ）が産生さ
れることを報告している（Ｊ、　Ｉｍｓ＋ｕｎｏ１．１
３４巻、３１５５頁、１９８５年）。また、サントリ（
Ｓａｎｔｏｌ＋）　らは、ヒトＴ細胞性白血病細胞であ
るＣＣＲＦ−ＣＥＭ、　ＨＵＴ−７８などから、ヒト白
血病細胞自身の分裂増殖を抑制する因子（Ｔ　］ｅｕｋ
ｅ＋＋＋１ａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ
ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ：ＴＬＳＬ）が産生されているこ
とを見い出した（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６３巻
、１８頁、１９８６年）。

さらに、ハーゼイ（Ｈｅｒｓｅｙ）らは、黒色腫細胞か
らＴ細胞によるインターロイキン２の産生を特異的に抑
制し、分子量が４４，０００および７　、０００である
因子が産生されることを見い出しており（Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、。

１３１巻、２８３７頁、１９８３年）、また、ホンタナ
（Ｆｏｎ　ｔａｎａ）らによって、ヒト神経膠芽細胞腫
細胞からインターロイキン２依存性Ｔ細胞の増殖を抑制
する分子量９７．０００の因子が産生されることが報告
されている（Ｊ、　Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．＋　１３２巻、
１８３７頁、１９８４年）。

さらに、橋本らは、ヒト末梢血リンパ球をＣｏｎ＾で刺
激した場合、種々の細胞のＤＮＡ合成を抑制する因子（
Ｓｔｉ＋ｗｕｌａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｄｅｒｉｖｅ
ｄ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：５ＴＩＦ
）が産生されることを見い出している。この５ＴＩＦは
、分子量４５．０００〜６５，０００、等電点４．５〜
５．５のタンパク性因子であり、その産生細胞は０にＴ
８抗原陽性サプレッサーＴ細胞であることが明らかにさ
れている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

以上のように、種々の活性化ヒトＴ細胞由来の免疫抑制
因子の存在が多数報告されているが、はとんどの場合、
それらの分子性状、アミノ酸組成、アミノ酸配列などを
知るに足る充分量が単離精製されておらず、しかも、こ
れらの因子の作用機序の解明も充分されていないのが現
状である。そこで、当分野においてさらに有効な生理活
性因子の検索が続けられている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、これらの実情に鑑み、鋭意研究を重ねた
結果、ヒトＴ細胞株から新規な免疫抑制因子が高濃度で
産生されることを見い出し、本発明を完成するに至った
。

即ち、本発明は、ヒ）Ｔ細胞株に由来し、以下の性質に
よって特徴づけられる新規な免疫抑制因子に関する。

（１）分子量がゲル濾過にて４５　、０００〜６５，０
００および１５０．０００〜２００．０００であり、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて約３１，０
００である、（２）等電点が４．６〜４．８である、（
３）　　ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑ陰イオン交換クロマト
グラフィーにて食塩濃度０．３１〜０．３２　Ｍで溶出
される、（４）　　固定化コンカナバリンＡセファロー
スおよびブルーセファロースに非吸着性である、（５）
デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、パパイ
ン、過ヨウ素酸に非感受性で、トリプシン、α−キモト
リプシン、プロナーゼに感受性である、 ＋６１　　ｐＨ２〜ｌＯで安定である、（７）４℃にて
長期間安定であり、５６°Ｃおよび９０℃、３０分間の
熱処理にて部分失活する、（８）２−メルカプトエタノ
ール、レバミゾール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、α−メチル−Ｄ
−マンノシド、Ｌ−アルギニンまたはＬ−オルニチンに
より活性が阻害されない、 （９）　　抗体産生を抑制する、 α〔リンパ球の幼若化反応を抑制する ａｎ　　細胞分裂増殖抑制作用を示す、および（２）構
成アミノ酸およびその含有量（モル％）が、アスパラギ
ン（アスパラギン酸を含む）９．０モル％、スレオニン
４．７モル％、セリン８．５モル％、グルタミン（グル
タミン酸を含む）１３．１モル％、グリシン１６．９モ
ル％、アラニン１０．４モル％、バリン５．２モル％、
メチオニン１．１モル％、イソロイシン３．５モル％、
ロイシン７．３モル％、チロシン２．３モル％、フェニ
ルアラニン４．２モル％、リジン５．８モル％、ヒスチ
ジン２．２モル％、アルギニン３．７モル％、プロリン
２．３モル％、１／２シスチンく１モル％およ、びトリ
プトファンく１モル％である。

本発明の免疫抑制因子の産生細胞としては、ヒトＴ細胞
株、特°にヒトＴ細胞性白血病細胞などが使用される。

具体的には、培養株化されたヒトＴ細胞性白血病細胞で
、マイコプラズマに感染していないもの、たとえばＭＯ
ＬＴ　４、ＭＯＬＴ　３、ＣＣＲＦ−１１ｓＢ２　、Ｃ
ＣＲＦ−ＣＥＭ　（アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）などにより入手可能〕などが
用いられる。

本発明の免疫抑制因子はこれらの細胞をマイトジェンに
て刺激するか、または無刺激にて　１ｎｖｉｔｒｏの培
養またはｉｎ　ｖｉｖｏでの増殖を行なうことにより産
生される。マイトジェンとしては、本発明の免疫抑制因
子を誘導し得るものであればいずれでもよく、たとえば
コンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ＾）、フィトヘマグルチニ
ン（ＰＨＡ）　、ポークライードマイトジェン（ＰＷＭ
）のようなレクチン、１２−０−テトラデカノイルホル
ボール−１３−アセテート、ホルボール−１２，１３−
ジデカノエートおよびホルボール−１２，１３−ジベン
ゾエートなどのホルボールエステル類、または同種抗原
が挙げられ、これらを単独または組み合わせて使用する
ことができる。

本発明の免疫抑制因子を産生ずるためには、各種動物の
血清（好ましくは牛胎児血清）またはそれらの熱不活化
物を含有するか、あるいはそれらを含まない各種動物細
胞の生育可能な通常培地（たとえば、ＲＰＭＩ　１６４
０培地、イーグルＭＥＭ培地、ダルベツコ変法イーグ／
Ｌ７ＭＥＭ培地）中で増殖させるｉｎ　ｖｉｔｒｏの培
養方法やヌードマウスやヌードラットなどの腫瘍細胞の
移植可能な温血動物に上記の細胞を移植し、その体内で
増殖させるｉｎ　ｖｉｖ。

での増殖方法が用いられ得る。本発明の免疫抑制因子は
、これら細胞の培養上清や腹水などから実質上、無限に
取得することができる。

このようにして産生された本発明の免疫抑制因子は、一
般に蛋白質の分離に用いられている塩析、遠心分離、透
析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、クロマ
トフオーカシング、電気泳動法、限外濾過および凍結乾
燥などの常法を任意に組み合わせて適用することにより
精製することができる。

本発明の好ましい産生、単離および精製方法は次の通り
である。すなわち、ヒトＴ細胞性白血病細胞を無刺激ま
たはマイトジェンで刺激し、これを動物細胞が生育可能
な培地中で培養する。得られた培養上清を限外濾過また
は塩析などの方法で濃縮した後、分子量１０，０００〜
２５０．０００の物質の分離に適した担体を用いるゲル
濾過を行なう。こうして得られた本発明の免疫抑制因子
を含有する活性画分を四級アンモニウム基またはジエチ
ルアミノエチル基などの陰イオン交換基を有する担体を
用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで、たとえば、
食塩の直線的濃度勾配により溶出を行ない、さらにポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの電気泳動法により泳動後、
ゲルを切り出し、溶出を行なうことにより、単一バンド
にまで精製することができる。

また、分取用等電点電気泳動、またはクロマトフオーカ
シングを行なうことによっても精製することができる。

本発明の免疫抑制因子は、分取用等電点電気泳動を行な
うことにより、ｐ　Ｈ４，６〜４．８の両分に得ること
ができ、さらに固定化コンカナバリンＡセファロースあ
るいはブルーセファロースを用いたアフィニティークロ
マトグラフィーにより精製することもできる。

このようにして精製された本発明の免疫抑制因子は、凍
結乾燥状態などで保存するのが好ましい。

【作　　用〕

本発明の免疫抑制因子は、上記に示されるような諸性質
を有し、従来のヒト細胞由来免疫抑制因子とは異なる新
規なものである。

免疫抑制因子の活性測定に当っては、マウス、ラットま
たはヒトのリンパ球を用いた種々の免疫反応を用いるこ
とができる。たとえば、コンカナバリンＡ、フィトヘマ
グルチニンＡ１ボータウイードマイトジェンなどのマイ
トジェンを用いたリンパ球幼若化反応〔アドラー（Ａｄ
ｌｅｒ、Ｗ、Ｉｌ、）ら、Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１３１巻、１０４９頁、１９７０
年〕や同種リンパ球混合反応（同種ＭＬＲ）（ダットン
（Ｄｕｔｔｏｎ＋Ｒ，Ｗ、）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ
ｄ、　１２２＠、７５９頁、１９６５年〕またはリンパ
球、特にＢ細胞による抗体産生などを指標とすることが
できる。すなわち、マイトジェンまたは腫瘍組織適合抗
原などの抗原によりリンパ球が刺激されると、リンパ球
特にＴ細胞のＤＮＡ合成が促進され、細胞分裂するよう
になる、いわゆるリンパ球の幼若化反応が誘導されるこ
とが知られている。このリンパ球の幼若化反応を測定す
る方法としては、ＤＮＡ合成および細胞分裂の指標とし
て３Ｈ−チミジンの細胞内への取り込みを測定する方法
が一般的に用いられている。したがって免疫抑制因子の
活性は、種々のリンパ球幼若化反応（マイトジェン反応
、同種ＭＬＲなど）による３Ｈ−チミジン取り込み上昇
を抑制する活性として測定することができる。

また、抗原またはマイトジェンで刺激活性化されたＢ細
胞による抗体（イムノグロブリン＾、　Ｄ、　ＩＩ！。

Ｇ、Ｍなど）産生を抑制する活性としても評価すること
ができる。

一方、近年、マイトジェン反応、同種ＭＬＲなどによる
Ｔ細胞の分裂増殖は、インターロイキン２などのＴ細胞
由来可溶性因子（リンホカイン）によって媒介されてい
ることが明らかとされた〔モーガン（Ｍｏｒｇａｎ、　
Ｄ、＾、）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　１９３頁、１００７
頁、１９７６年〕。このような免疫反応を調節する因子
としては、インターロイキン１．２．３もしくは４、コ
ロニー刺激因子、インターフェロンγまたはリンホトキ
シンなど多数が見い出されている。したがって、このよ
うな因子によるリンパ球の幼若化反応または機能の誘導
を抑制する活性としても免疫抑制因子の活性を評価する
ことができる。

本発明の免疫抑制因子は、以下の実験例からも明らかな
ように、これらの評価系においてすぐれた免疫抑制活性
を示した。

以上のことから、本発明の免疫抑制因子は、骨髄、腎、
心臓などの異種または同種移植をうけた患者の移植拒絶
反応を抑制するために用い得るばかりでなく、全身性エ
リトマト−デス、リューマチ性関節炎などの自己免疫患
者、アレルギーまたはリンパ球増殖異常に基づく患者の
予防または治療に応用することができる。また、本因子
は広く、医学、薬学の分野における試薬などとしても用
いることが可能である。

本発明の免疫抑制因子を医薬として用いる場合には、通
常の製剤技術にしたがって、製剤化することができ、た
とえば、原体を担体、賦形剤、希釈剤などと混和して、
散剤、錠剤、カプセル剤、注射剤などの型で提供され得
る。また、凍結乾燥させても使用し得る。

〔実施例〕

以下、実施例および実験例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例および実験例によっ
て何ら限定されるものではない。

なお、本発明の免疫抑制因子は以下の実施例などにおい
て適用されているように、ラット骨髄細胞の３Ｈ−チミ
ジン取り込み抑制を指標として探索した。その方法は次
の通りである。

活性測定法二ラット骨髄細胞の３Ｈ−チミジン取り込み
抑制 培養容器として９６穴マイクロテストプレート（コーニ
ング社製）を使用し、１０％熱不活化牛脂児血清を含む
ＲＰＭＩ　１６４０培地を用い調整したラット骨髄細胞
懸濁液（５Ｘ１０’個／ｍｌ）　０．１　ｍｌと、希釈
試料０．１ｍｌを混合し、５％炭酸ガス含有空気中３７
℃で１２時間培養した。次いで、３Ｈ−チミジン（比活
性５　Ｃｉ／ｍ＋＊ｏｌ　、アマジャム社製）を０．５
μＣｉ／ウエルの濃度で添加し、さらに４時′　　間培
養後、セルハーベスタ−を用いてグラスファイバーフィ
ルターにて細胞を収集した。細胞内の残存放射活性をト
ルエンシンチレータ−を用い、液体シンチレーションカ
ウンターにより測定し、次の式から、３Ｈ−チミジン取
り込みの抑制率を算出し、本免疫抑制因子の活性の指標
として表わした。

一以下余白一 力価は試料の希釈度と抑制率を正規確立紙などにプロッ
トし、５０％の３Ｈ−チミジン取り込み抑制率を与える
希釈度を求め、単位（Ｕ）で表示することができる。

実施例１ ヒトＴ細胞性白血病細胞として、ＭＯＬＴ　４、ＭＯＬ
Ｔ３　、ＣＣＲＦ−ＨＳＯ３またはＣＣＲＦ−ＣＥＭを
、ヒトＢ細胞性白血病細胞としてＲＰＭＩ　１７８８を
用いて、これらの各細胞をｌθ％熱不活化牛脂児血清、
硫酸カナマイシン６０μｇ　／ｍｌ、　Ｎ　−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸
１０ｍＭ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、０．１％炭酸水素ナ
トリウムを含むＲＰＭＩ　１６４０培地にて培養し、各
培養上清の免疫抑制活性をラット骨髄細胞を用いた３Ｈ
−チミジンの取り込み抑制を指標にして測定した。

その結果、ＭＯＬＴ　４およびＣＣＩＩＦ−ＨＳＯ２の
培養土清に強い免疫抑制活性が検出され、ＣＣＲＦ−Ｃ
ＥＭ細胞の培養上清にも弱いながら活性が認められた。

一方、ヒトＢ細胞性白血病細胞で、リンホトキシン産生
株として知られているＲＰ１１７８８の培養上清には、
活性は全く認められなかった。なお、本実施例中で用い
られたヒト培養細胞株はすべてマイコプラズマの感染は
認められなかった。

次いで、ＭＯＬＴ　４またはＣＣＲＦ−ＨＳＢ２細胞を
限界希釈法によってクローン化することにより、免疫抑
制因子高産生クローンを得た。その中でも特に高度生の
クローンとしてＭＯＬＴ　４クローンＩＥ９が得られ、
以下の実施例においても用いた。

ＭＯＬＴ　４クローンＩＥ９に関して、免疫抑制因子産
生の条件検討を行なった。その結果、ＭＯＬＴ　４クロ
ーンＩＥ９を無刺激で、無血清ＲＰＭＩ　１６４０培地
を用いて、１０″個／■ｌの細胞濃度で、５％炭酸ガス
含有空気中、３７℃で培養することによって７２時間後
に免疫抑制因子の産生が最大となった。一方、ＭＯＬＴ
　４クローンＩＥ９を上記の条件でコンカナバリンＡ（
シグマ社製）１０Ｍｇ／ｍｌで刺激した場合には、刺激
後１２時間で免疫抑制因子の産生が最高値に達した。

実施例２ ヒトＴ細胞白血病細胞ＭＯＬＴ　４またはＭＯＬＴ　４
クローンＩＥ９を無刺激で、無血清ＲＰＭＩ　１６４０
培地を用いて、１０’個／ｍｌの細胞濃度で５％炭酸ガ
ス含有空気中、３７℃、７２時間培養した。その後、遠
心により細胞を除去して得られた培養上清をホローファ
イバー（アミコン社製）などを用いて限外濾過し、約百
分の一量に濃縮する。このようにして得られた濃縮培養
上清（この段階のものを濃縮培養上清という）は、そこ
に含まれる免疫抑制因子の活性を、ラット骨髄細胞を用
いて測定した後、精製に用いた。

セファクリルＳ−２００カラム（１，４Ｘ９０Ｃｎｔ）
またはＦＰＬＣ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラム（ＨＲ
１０／３０５（いずれもファルマシア社製）を用い、リ
ン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）にてゲル濾過を行な
った。標準蛋白質（ファルマシア社製：リボヌクレアー
ゼＡ１キモトリプシノーゲンＡ１オブアルプミン、牛血
清アルブミン）を用いて分子量の検量線を作製し、ゲル
濾過により得られた各両分について分子量を測定した。

第１図に示したように、ラット骨髄細胞を用いた活性評
価により、本発明の免疫抑制因子の活性ピークはオブア
ルプミンと牛血清アルブミンの間および、牛血清アルブ
ミンより前の二画分に溶出され、分子量は４５，０００
〜６５，０００および１５０．０００〜２００、０００
であった。

ゲル濾過により得られた活性画分を限外濾過により濃縮
した後、トリス−塩酸緩衝液（トリスヒドロキシアミノ
メタン３０ａ＋Ｍ、ｐ　Ｈ８，０）で−晩透析し、５０
０μＪをＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑ陰イオン交換クロマト
グラフィー（ファルマシア社製）により分画を行なった
。ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑカラム（ＨＲ５１５）は、ま
ずトリス−塩酸緩衝液で平衡化しておき、試料添加後、
流速１ｍｌ／分で、トリス−塩酸緩衝液３ｍｌで溶出さ
せ、さらに引き続いて０〜１Ｍ食塩による直線的濃度勾
配（１０ａ＋１）を１０分間で形成させ溶出させた。各
１ｏ１１の両分を分取し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７，４）で−晩透析後、ラット骨髄細胞を用いた活性評
価を行なったところ、第２図に示したように活性は食塩
濃度０．５５〜０．７５Ｍの溶出画分に認められた（こ
の段階のものを部分精製品という）。

さらに、ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑ陰イオン交換クロマト
グラフィーにより得られた、本発明の免疫抑制因子の活
性画分を限外濾過濃縮後、トリス−塩酸緩衝液（トリス
ヒドロキシアミノメタン３０＋Ｍ、ｐＨ８，０）で−晩
透析し、再度、ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑ陰イオン交換ク
ロマトグラフィーにより分画を行なった。

ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑカラムは、０．３〜０．５　Ｍ
食塩による直線的濃度勾配（４０ａ＋１）を４０分間で
形成させ溶出を行なった。各ＩＩ＋ｌｌの両分を分取し
、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）で−晩透析後、
ラット骨髄細胞を用いた活性評価を行なった結果、活性
は食塩濃度０．３１〜０．３２Ｍの溶出画分に認められ
（第３図）、本発明の免疫抑制因子の比活性は約１０’
Ｕ／ｍｌであり、培養上清に比し、精製度は約５８００
倍となり、活性収率は約３０％であった（この段階のも
のを高度精製標品という）。

実施例３ 実施例２の高度精製標品を４％ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）　、４％２−メルカプトエタノールおよび５
０％グリセリンを含むトリス−塩酸緩衝液（トリスヒド
ロキシアミノメタン４０ｍＭ　　、ｐ　Ｈ６，８）と３
＝１の割合で混合し、９０℃で３分間熱処理を行なった
。次に、試料調整用の厚み’１ｍｍ、長さ１１ｃｍ、巾
１４ｃｓａの１０％ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−
ポリアクリルアミド平板ゲルをレームリ−（Ｌａｅｍｍ
ｌｉ）らの方法（Ｎａｔｕｒｅ＋２２７巻、６８０頁、
１９７０年）に準じてゲル作製装置（アト−株式会社製
、Ａ　Ｅ−６２００およびＡＥ−６２１Ｏ型ゲル作製装
置）を用いて作製した。平板ゲルに試料約６００μｌを
付与し、電気泳動は２０ｍＡの定電圧で行なった。泳動
終了後、２ｍｍ間隔でゲルの切り出しを行ない、各ゲル
片をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）１．０ａ＋１
に浸漬して４℃で２４時間抽出を行なった。抽出後、パ
スツールピペットにて抽出液を回収し、リン酸緩衝生理
食塩水（ｐＨ７，４）で洗浄を行なって、各２．５ｍｌ
ずつの抽出液を取得した。得られた抽出画分中、分子量
約３１　、０００の染色バンドに本発明の免疫抑制因子
の活性が認められた（第４図）。

合計４回のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない、本発明の免疫抑制因子は単一染色バンドとして
回収されたので、限外濾過膜（ＹＭ−１０，アミコン社
製）を用いて、脱塩を行なった後、アミノ酸分析用試料
とした。

試料を減圧シール下、６規定塩酸（４％チオグリコール
酸含有）で１１０℃、２２時間加水分解を行ない、高速
アミノ酸分析計（日立８３５型）を用いてアミノ酸組成
（モル％）を測定した。その結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表 以上のことから、本発明の免疫抑制因子は分子量がゲル
濾過にて４５，０００〜６５．０００および１５０．０
００〜２００．０００であり、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にて約３１，０００であるタンパク性
因子であり、これらのことから２蓋体（ｈｏｍｏｄ　ｉ
ｍｅｒ）とｒ、ア、すナーＬ士名！ケ全企１、アｈ露１
．得スこ入力曵云嗟された。

実施例４ 実施例２の濃縮培養上清を、脱イオン水で一晩透析した
後、ウルトロデンクス（ＬＫＢ社製）　４ｇ１アンホラ
イン（ＬＫＢ社製、ｐＨ３，５〜１０）５ｍｌおよび脱
イオン水を混合し、約１００ｍ１のゲルを作製し、１８
ワツト定電力で６〜８時間、４℃にて等電点電気泳動を
行なった。泳動終了後、直ちにゲルを３０画分に分画し
、それぞれの画分のｐＨを測定した後、脱イオン水を用
いてゲルからタンパク質の溶出を行なった。さらにリン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）で−晩透析した後、ラ
ット骨髄細胞を用いた活性評価を行なったところ、第５
図に示したように、活性はｐ　Ｈ４，６〜４．８の画分
に認められた。

また、実施例２の部分精製品をビスートリスーイミノニ
酢酸緩衝液〔２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，
２′、２１−ニトリロトリエタノール、２５ｍＭ、ｐＨ
７，１）に−晩透析した後、ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｐカ
ラムを用いたクロマトフオーカシングに供した。開始緩
衝液としては、ビスートリスーイミノニ酢酸緩衝液（２
５ｍＭ、ｐＨ７，１）を、溶出緩衝液としては１０％ポ
リバッファー７４（ファルマシア社製）を含むイミノニ
酢酸水溶液（ｐ　Ｈ４，０）を用いた。溶出は流速１　
ｍｌ／分で、４５分間で行ない、各２１の両分を得た。

それぞれの両分のｐＨを測定した後、リン酸緩衝生理食
塩水（ｐＨ７，４）で−晩透析し、ラット骨髄細胞を用
いた活性評価を行なったところ、本発明の免疫抑制因子
の活性はｐ　Ｈ４，６〜４．８の両分に認められ（第６
図）、等電点電気泳動の結果と一致した。

実施例５ 実施例２の部分精製品を、固定化コンカナバリンＡセフ
ァロース４Ｂカラム（ファルマシア社製：１．４Ｘ５ｃ
ｍ）を用いアフィニティークロマトグラフィーを行なっ
た。溶出は最初リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）５
０＋１を用いて行ない、コンカナバリンＡセファロース
非吸着性画分を得た。

次に、０．２Ｍ　　α−メチル−Ｄ−マンノシドを含む
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）５０ｍｌを用いて
溶出を行ない、コンカナバリンＡセファロース吸着性画
分を得た。各両分について、リン酸緩衝生理食塩水（ｐ
Ｈ７，４＞で−晩透析した後、ラット骨髄細胞を用いた
活性評価により、第７図に示したように、免疫抑制活性
はコンカナバリンＡ非吸着性の両分に認められた。

また、実施例２の濃縮培養上清を、ブルーセファロース
ＣＬ６Ｂカラム（ファルマシア社製：１．４Ｘ１０ｃｍ
）を用い、アフィニティークロマトグラフィーを行なっ
た。ブルーセファロースＣＬ６Ｂカラムは、あらかじめ
トリス−塩酸緩衝液（トリスヒドロキシアミノメタン３
０ｍＭ５ｐＨ８）で平衡化しておき、試料添加後、まず
、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で溶出させ、ブルーセ
ファロース非吸着性画分２５ｍ１を得た。続いて０〜１
Ｍ食塩の直線的濃度勾配により溶出させ、各５ｍ１Ｏ画
分をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）で−晩透析後
、ラット骨髄細胞を用いる活性評価を行なった。その結
果、第８図に示すように、免疫抑制活性はブルーセファ
ロース非吸着性の両分に認められた。

実施例６ 実施例２の部分精製品について、デオキシリボヌクレア
ーゼ１　　（ＤＮａｓｅ　Ｉ）、リボヌクレアーゼＡ（
ＲＮａｓｅ　Ａ）　、トリプシン、α−キモトリプシン
、プロナーゼ、パパイン、過ヨウ素酸処理による影響、
熱およびｐＨ安定性について検討した。

本発明の免疫抑制因子にＤＮａｓｅ　Ｉ　、ＲＮａｓｅ
　Ａ　ｓトリプシン、α−キモトリプシン、プロナーゼ
、パパイン（シグマ社製）を５０μｇ／＋＋＋１または
２００μｇ／ｍｌの濃度で加え、３７℃で３時間処理し
、ラット骨髄細胞を用い活性評価を行なった。

また、過ヨウ素酸処理においては、メタ過ヨウ素酸ナト
リウム（和光紬薬社製）５ｍＭを添加し、冷暗所で３時
間放置し、処理終了時に、シｇ糖り％重量／容量を添加
し３０分間放置する。さらにリン酸緩衝生理食塩水（ｐ
Ｈ７，４）で−晩透析し、ラット骨髄細胞を用いて活性
評価を行なった。

その結果、第９図に示すように、本発明の免疫抑制因子
はＤＮａｓｅ　Ｉ　５ＲＮａｓｅ＾、パパイン処理およ
び過ヨウ素酸処理には非感受性であるが、トリプシン５
０μｇ　／ｌｓ　１　ｓα−キモトリプシン２００μｓ
／ｍｌおよびプロナーゼ５０μｇ／ｍｌの処理には感受
性であった。

また、本発明の免疫抑制因子は、ｐＨ２〜１０の範囲で
安定であるが、５６℃および９０℃で、３０分間の熱処
理によって部分失活した。

実施例７ １０−’Ｍ　　２−メルカプトエタノール、５μｇ／ｌ
１ｌｌレバミゾール、５０ｍＭ　　Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミン、５０ｍＭ　　Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラク
トサミン、５０ｍＭ　　α−メチル−Ｄ−マンノシド、
１０ｍＭＬ−アルギニン、または１０ｍＭ　　Ｌ−オル
ニチンを添加した場合のラット骨髄細胞による本発明の
免疫抑制因子の活性評価を行なったところ、いずれの物
質によっても本発明の免疫抑制因子の活性は阻害されな
かった。

なお、本発明の免疫抑制因子は、２−メルカプトエタノ
ール、レバミゾールによって、その活性が阻害されない
ことから既知のヒト免疫抑制因子である５ＩＲ３因子と
は差別化され、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−
アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、α−メチル−Ｄ−マン
ノシドによって活性が阻害されないことから５ＩＳＳ−
７因子とも差別化され、さらに、Ｌ−アルギニンおよび
Ｌ−オルニチンによって活性が阻害されないことからア
ルギナーゼとも異なる。

また、部分精製された本発明の免疫抑制因子はリンホト
キシン、腫瘍検死因子に高感受性のマウスＬ９２９細胞
に対して細胞障害性を全く示さず、また、抗ウィルス活
性、インターロイキン２依存性Ｔ細胞株の分裂増殖活性
、および骨髄細胞の分裂増殖およびコロニー形成刺激活
性を全（示さなかった。

以上の結果から明らかなように、本発明の免疫抑制因子
は従来のリンホカインとは異なる新規な免疫抑制因子で
ある。

実験例 本発明の免疫抑制因子の生物活性について、以下の通り
実験を行なった。なお、実験例中ｒｓＥＭ」は標準偏差
を意味する。

ｍ土：マイトジェンによって誘導されるヒト末梢血リン
パ球のＩｇＭ抗体産生に対 する抑制効果 比重遠心法によって得られたヒト末梢血リンパ球を１０
％熱不活化牛脂児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地に
て５Ｘ１０’個／ｍｌに調整し、ポークライードマイト
ジェン（ＰＷＭ、１／ｌ　Ｇ　Ｏ希釈）またはスタフィ
ロコッカス・アウレウス・コラワン１　　（ＳＡＣｌｏ
、００３％）を添加した。この細胞浮遊液１００μｌを
あらかじめ本発明の免疫抑制因子５０Ｕ／ｍｌを含む試
料１００μｌを入れた９６穴平底マイクロテストプレー
トの各ウェルに加えた。３７℃、５％炭酸ガス条件下で
７日間培養した後、培養上清を回収しその上清中に含ま
れるイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）量をエンザイム・リ
ンクド・イムノソルベント・アッセイ　（ＥＬＩＳ＾）
により定量した。その結果を試料を添加しない場合の１
ｇＭ産生量を対照とした抑制率として第１表に示す。

第　　　１　　　表 （Ｕ／　ｎ１１） ＳＡＣ５０１５７±１９２．４ １ＪＪＪ［＝ヒト末梢血リンパ球の自発的ＩｇＧ抗体産
生に対する抑制効果 ヒト末梢血リンパ球を１０％熱不活化牛脂児血清を含む
ＲＰ旧１６４０培地にて５ＸＩＯ’個／１に８１Ｋ１Ｍ
　ｌ　　Ｊ−ｖＭ６＋ｎｌｌ＆＋８ｆｆ）’ｔ＆：１７
ｋ　１　６八、、　ａ　Ｌ　−Ｊ−５ｈ　Ｒ１１ｔＴ＋
免疫抑制因子を含む試料１００μｌを９６穴平底マイク
ロテストプレートの各ウェル中で混合し、未刺激で７日
間、３７℃、５％炭酸ガス条件下で培養した。培養上清
を回収し、その上滑中に含まれるイムノグロブリンＧ（
ＩｇＧ）量をＥＬＩＳＡ法により定量した。その結果を
試料添加しない場合のＩｇＧ産生量を対照とした抑制率
として第２表に示す。

第　　　２　　　表 （Ｕ／　ｍｌ） ０２８７±７　− ２５　１８７±５２　　３４．８ ５０　　Ｌｏｔ±５３　　６４．８ 第２表から明らかなように、本発明の免疫抑制因子は、
同因子を含まない対照と比べて、ヒト末梢血リンパ球に
よる自発的ＩｇＧ抗体産生を濃度依存的に抑制した。

実験例３：ヒｌ−Ｂ細胞性白血病細胞株の抗体産生に対
する抑制効果 ヒトＢ細胞性白血病細胞株のうち、ＩｇＧを産生ずるこ
とが明らかなＣＣ１？Ｆ−５ＲおよびＲＰ旧８２２６、
またＩｇＭを産生ずることが明らがなＲＰＭＩ　１７８
Ｂを用いて、これらの抗体産生に対する本発明の免疫抑
制因子の効果について検討した。上記細胞はすべて１０
％熱不活化牛脂児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地に
てｌＸｌ０’個／曽１に調整した。この細胞浮遊液１０
０μｌと免疫抑制因子を含む試料１００μｌとを９６穴
平底マイクロテストプレートの各ウェル中で混合し、３
７℃、５％炭酸ガス条件下で７２時間培養した。その培
養中に含まれるＩｇＧ、ＩｇＭＩをそれぞれＥＬＩＳＡ
法により測定した。その結果を第３表に示す。表中、力
７コ内の数字は試料未添加の場合のＩｇＧまたは１ｇＭ
産生量を対照とした際の抑制率を示す。

一以下余白一 第　　　３　　　表 第３表から明らかなように、本発明の免疫抑制因子は同
因子を含まない対照と比して、ＣＣＲＦ−３ＢおよびＲ
ＰＭＩ　８２２６によるＩｇＧ産生、さらにＲＰ門１１
７８８による１ｇＭ産生を濃度依存的に抑制した。

叉Ｕ土：マウス同種リンパ球混合反応（Ｍ　Ｌ　Ｒ）の
抑制効、果 マウス同種ＭＬＲは、反応細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウ
ス（Ｈ−２’）の肺細胞を、刺激細胞としてＣ５７ＢＬ
／６マウスの肺細胞をマイトマイシンＣ処理したものを
用い、等比で混合培養することによって行なった。

反応細胞の調整は、以下の方法で行なった。５〜６週齢
の雄性Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスより肺臓を摘出し
、５％熱不活化牛脂児血清を添加したＲＰＭＴ１６４０
培地（硫酸カナマイシン６ｏμｇ／ｌＩｌ、Ｌ−グルタ
ミン２ｍＭ、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ
’−２−エタンスルホネー）１０ｍ　Ｍ　ｓ　００１％
炭酸水素ナトリウム含有）を用いて肺細胞の単細胞浮遊
液を得た。溶血処理後、ｌｏ−４Ｍ２−メルカプトエタ
ノールおよび２０％熱不活化牛脂児血清を含むＲＰＭＩ
　１６４０培地を用いて、１０’個／　ｍｌに調製し、
反応細胞浮遊液として用いた。

刺激細胞の調製は以下の方法で行なった。５〜６週齢の
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスから肺臓を摘出し、ＲＰＭＩ
　１６４０培地を用いて肺細胞の単細胞浮遊液を得た。

溶血処理後、４０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで３７
℃、６０分間の処理を行なった。

３回洗浄後、１０−’Ｍ２−メルカプトエタノールおよ
び２０％熱不活化牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０培
地を用いて１０７個／＋ａｌに調整し、刺激細胞浮遊液
として用いた。

上述した方法により調製した反応細胞浮遊液５０μｌと
刺激細胞浮遊液５０ｐｌおよび免疫抑制因子を含む試料
１００μｌとを９６穴マイクロテストプレートに加え、
３７℃で５％炭酸ガス条件下で４日間培養を行なった。

培養終了後に、３Ｈ−チミジン０．５μＣｉ／ウエルを
添加し、４時間培養後、セルハーベスタ−にて細胞を収
集し、細胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレー
ションカウンターにて測定し、マウス同種ＭＬＲのリン
パ球幼若化の指標とした。

マウス同種ＭＬＲに対する本発明の免疫抑制因子の抑制
活性は、以下の式により抑制率を算出し、評価した。

−以下余白一 その結果を第４表に示す。

一以下余白一 第４表から明らかなように、本発明の免疫抑制因子はマ
ウス同種ＭＬＲにおけるリンパ球幼若化反応を濃度依存
的に抑制する。

大狼■工：マイトジエン刺激によるヒト末梢血リンパ球
幼若化反応の抑制効果 （１）　　コンカナバリンＡ刺激によるヒト末梢血リン
パ球幼若化反応に対する効果の試験は以下の方法で行な
った。比重遠心法によって得られたヒト末梢血リンパ球
を１０％熱不活化牛脂児血清を含むＲＰＭｌ　１６４０
培地にて５×１０−個／ｍｌに調整し、コンカナバリン
Ａを添加した。この細胞浮遊液１００μｌをあらかじめ
本発明の免疫抑制因子を含む試料１００μｉを入れてお
いた９６穴平底マイクロテストプレートの各ウェルに加
えた（ヒト末梢血リンパ球の数は５Ｘ１０’個／ウェル
である）。

３７℃、５％炭酸ガス条件下で７２時間培養した後、３
Ｈ−チミジン０．５μＣｉ／ウエルを加え、同条件下で
さらに４時間培養した。培養終了後、セルハーベスタ−
を用いて細胞を回収し、細胞内に取り込まれた放射活性
を液体シンチレーションカウンターにて測定し、ヒト末
梢血リンパ球幼若化の指標とした。その結果を第５表に
示す。

第　　　５　　　表 試 無添加　　　　　　　　　１６３６±５２２−Ｃｏｎ＾
単独　　−２６１７５±４８６８　　　−し ２５１３６４±２０５９４．８ 第５表から明らかなように本発明の免疫抑制因子は、同
因子を含まない対照に比して、コンカナバリンＡ　（Ｃ
ｏｎ　Ａ）によって誘導される３Ｈ−チミジンの取り込
みを９０％以上抑制した。

（２）　　ＰＷＭまたはＳＡＣ刺激によるヒト末梢血リ
ンパ球幼若化反応に対する効果の試験は、以下の方法で
行なった。実験例５（１）と同様に調製されたヒト末梢
血リンパ球にホークライードマイトジェン（ＰＷＭ、１
／１００希釈）またはスタフィロコッカス・アウレウス
・コラワンＩ　　（ＳＡＣ。

０．００３％）を添加した。この細胞浮遊液１００μｌ
をあらかじめ免疫抑制因子を含む試料１００μｉを入れ
ておいた９６穴平底マイクロテストプレートの各ウェル
に加えた。３７℃、５％炭酸ガス条件下で４８時間また
は９６時間培養した後、３Ｈ−チミジン０．５μＣ４／
ウエルを添加し、さらに４時間培養した。培養終了後、
セルハーベスタ−を用いて細胞を回収し、細胞内に取り
込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターに
て測定し、ヒト末梢血リンパ球幼若化の指標とした。そ
の結果を第６表に示す。

一以下余白一 １１１Ｌ：コロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）によって誘導
されるマウス骨髄細胞の３Ｈ−チ ミジン取り込みおよびコロニー形成に 対する抑制効果 （１１コロニー刺激因子（ＣＳＦ）によって誘導される
マウス骨髄細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果
の試験は、以下の方法で行なった。

Ｃ３Ｈ／　Ｈｅ　Ｎマウス（雄性、８〜１２週齢）の大
腿骨から得た骨髄細胞を１０％熱不活化牛脂児血清を含
むＲＰＭｌ　１６４０培地にて２．５Ｘ１０’個／＋＋
＋’ｌに調整した後、マウス顆粒球−マクロファージ・
コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ、ゲンザイム社製）を
１０またはｌ　ＯＯＵ／ｍｌ添加した。この細胞浮遊液
１００μｌをあらかじめ本発明の免疫抑制因子５０Ｕ／
ｍｌを含む試料１００μｌを入れておいた９６穴平底マ
イクロテストプレートの各ウェルに加えた（マウス骨髄
細胞数は２．５Ｘ１０’個／ウェルである）。３７℃、
５％炭酸ガス条件下で、１６または３９時間培養させた
後、３１１−チミジン０．５μＣｉ／ウエルを加え、さ
らに４時間培養した。培養終了後、セルハーベスタ−を
用いて細胞を回収して、細胞内に取り込まれた放射活性
を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その
結果を第７表に示す。表中、カッコ内は抑制率（％）を
示す。

−以下余白一 第７表から明らかなように、本発明の免疫抑制因子は、
本因子を含まない対照と比して、コロニー刺激因子（Ｃ
ＳＦ）未添加の３Ｈ−チミジン取り込みを抑制するのみ
ならず、コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）１０または１００
Ｕ／ｎ＋１によって誘導される３Ｈ−チミジン取り込み
の上昇も強く抑制した。

（２）　　コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）によって誘導さ
れるマウス骨髄細胞のコロニー形成に対する効果の試験
は以下の方法で行なった。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（雄性
、８〜１２週齢）の大腿骨から得た骨髄細胞を０．８８
％メチルセルロース、２０％馬血清、コロニー刺激因子
（Ｃ３Ｆ）含有試料としてのし細胞培養上清５％および
本発明の免疫抑制因子２０Ｕ／＋ｍｌを含むＭＥＭ−２
培地にて１×ｌＯＳ個／ｍｌ／　３５　ｍプラスチック
・ディツシュに調整し、３７℃、５％炭酸ガス条件下で
７日間培養した後のコロニー形成数を計測し、その結果
を第８表に示す。

一以下余白一 第　　　８　　　表 ０８７±４− ２０２３±１　７３．６ 第８表から明らかなように、本発明の免疫抑制因子は、
コロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）によるマウス骨髄細胞の
コロニー形成を強く抑制した。

ｌＬ［：インターロイキン２　（ＩＬ−２）によって誘
導されるＩＬ−２依存性マウス 細胞株（ＣＴＬＬ−２）の’Ｉ（−チミジン取り込みに
対する抑制効果 ＩＬ−２依存性マウス細胞株ＣＴＬＬ−２を１０％牛脂
児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地にてｌＸｌ０−個
／ｍｌに調整し、次いで組換えヒトインターロイキン２
　（ｒ　−ｈ　Ｉ　Ｌ　−２）　２．７０／ｍｌを添加
した。

この細胞浮遊液１００μｌをあらかじめ、本発明の免疫
抑制因子を含む試料１００μＣを入れておいた９６穴平
底マイクロテストプレートの各ウェルに加えた。３７℃
、５％炭酸ガス条件下で２０時間培養した後、３Ｈ−チ
ミジン０．５μＣｉ／ウエルを加え、さらに同条件下で
４時間培養した。培養終了後、セルハーベスタ−を用い
て細胞を回収し、細胞内に取り込まれた放射活性を液体
シンチレーションカウンターを用いて償１定した。その
結果を第９表に示す。

第　　　９　　　表 （Ｕ／ｍｌ）　（ｃｐＩＩｌ±ＳＥＭ）２．７　２００
２８０６±６２３８１．９第９表から明らかなように、
本発明の免疫抑制因子は、ＣＴＬＬ−２をＩＬ−２２，
７０／ｍｌで処理した際の３Ｈ−チミジン取り込みを抑
制した。

大肱勇工：ヒトＢ細胞性白血病細胞株ＲＰＭＩ　１７８
８のリンホトキシン（ＬＴ）産生に対す る抑制効果 ＲＰ１１７８８細胞を１０％熱不活化牛脂児血清を含む
ＲＰＭＩ　１６４０培地にてＩ　Ｘ　１０’個／ｍｌに
調整し、この細胞浮遊液１００μｌと免疫抑制因子を含
む試料１００μｌとを９６穴平底マイクロテストプレー
トの各ウェル中にて混合し、３７℃、５％炭酸ガス条件
下で７２時間培養した。その培養上清のＬ９２９細胞に
対する細胞障害活性をＲＰＭ１１７８８細胞のＬＴ産生
量の指標とした。その結果を第１０表に示す。

第１Ｏ表 （Ｕ／ｍｌ）　　（Ｕ／ｍｌ）　　（％）２５　　　９
０　６１．７ 第１０表から明らかなように、本発明の免疫抑制因子は
、ＲＰＭＩ　１７８８細胞によるＬＴ産生を濃度依存的
に抑制した。

ＬＬ！！ｉ＝種々の培養腫瘍細胞の細胞増殖に対する抑
制効果 血球系細胞由来の種々の培養腫瘍細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ
。

ＣＣＲＦ−ＨＳＢ２．　ＭＯＬＴ　４．　［９３７，Ｋ
５６２．　ＨＬ−６０，ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉをそ
れぞれ１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地
にて２×１０Ｓ個／　ｍｌに調整した。

この細胞浮遊液５０μｉをあらかじめ本発明の免疫抑制
因子（５００／ｍｌ）を含む試料５０μｌを入れておい
た９６穴平底マイクロテストプレートの各ウェルに加え
た。３７℃、５％炭炭酸酸ガス件下で７２時間培養した
後、生細胞とインキュベートした際、ミトコンドリアの
サクシネートデヒドロゲナーゼと反応し、暗青色のホル
マザン−プロダクトを生じることが報告されている　（
Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ＋　６５巻、　ｓｓ
真、　１９８３年）３−（４，５−ジメチルチアゾール
−２−イル）　−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブ
ロマイド（ＭＴＴ。

５　ａｔ／ｎ＋１）　　１０　ｐ　Ｉｔを加えた。３７
℃、５％炭酸ガス条件下で４時間反応させ、ホルマザン
の結晶を形成させた後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム
を含む０．０１規定塩酸溶液１００μｌを結晶溶解のた
めに加え、３７℃で一晩放置し反応させた。

反応終了後、各ウェルの上清１００μｌを吸光度測定用
マイクロテストプレートに移し、マイクロテストプレー
ト用分光光度針を用いて、６６０ｎｍを対照とした際の
５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

各培養腫瘍細胞に対する増殖抑制活性を以下の式に従っ
て算出し、増殖抑制率として表示した結果を第１１表に
示す。

一以下余白一 第　　　１１　　　表 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ　　５０６±４３３３±７３４．２０
９３７　５７５±６２５９±５５４．９に５６２　４３
５±３３６２±９１６．８ＨＬ−６０６４９±１１　３
８６±１４０．５Ｒａｊｉ　　３６２±１　１００±１
７２．４Ｄａｕｄｉ　　６８７±１０　１９５±１１７
１．２第１１表から明らかなように、本発明の免疫抑制
因子は、リンパ球由来細胞を含む種々の血球系細胞由来
の培養腫瘍細胞の増殖を抑制した。

大肱五上工：ヒトＢ細胞性白血病細胞株ＣＣＲＦ−５Ｂ
の増殖および抗体産生に対する抑制 効果 ＣＣＲＰ−ＳＢ細胞を用いて、本発明の免疫抑制因子の
増殖抑制および抗体産生の経時変化を検討した。

本発明の免疫抑制因子２５Ｕ／ｍｌを培養開始時にＣＣ
ＲＦ−３Ｂ細胞に添加し、２４．４８．７２時間後の細
胞増殖および抗体産生をそれぞれＭＴＴを用いた色素法
およびＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により測定した。

その結果を第１２表に示す。

第　　１２　表 （％）　　（％） ７２時間　　　８３．４　　　　　９６．０第１２表か
ら明らかなように、本発明の免疫抑制因子は、２４時間
目では増殖抑制活性は約２６％と弱く、また、抗体産生
抑制も全く認められなかったが、７２時間目では増殖抑
制率も約８３％で、抗体産生も９６％抑制されることが
明らかとなった。従って、本発明の免疫抑制因子は、腫
瘍壊死因子、リンホトキシンなどの細胞障害性因子とは
明らかに異なり、細胞障害活性よりはむしろ、細胞分裂
抑制作用により免疫抑制活性を示すことが示唆された。

〔発明の効果〕

上述した実施例および実験例を含む明細書の記載を通じ
て明らかにしたように、本発明の新規な免疫抑制因子は
すぐれた免疫抑制作用を示し、医薬として、または試薬
として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＦＰＬＣ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラムを
用いたゲル濾過による溶出パターンを、 第２図は、ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑカラムを用いた陰イ
オン交換クロマトグラフィーで、０〜１Ｍ食塩の直線的
濃度勾配による溶出パターンを、 第３図は、ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑカラムを用いた陰イ
オン交換クロマトグラフィーで、０．３〜０．５Ｍ食塩
の直線的濃度勾配による溶出パターンを、第４図は、本
発明の免疫抑制因子の高度精製標品のＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動の泳動パターンを、 第５図は、本発明の免疫抑制因子を含む濃縮培養上清の
分取用等電点電気泳動による泳動パターンを、 第６図は、本発明の免疫抑制因子の部分精製品のＦＰＬ
Ｃ−Ｍｏｎｏ　Ｐカラムを用いたクロマトフオーカシン
グのン容出パターンを、 第７図は、固定化コンカナバリンＡセファロースアフィ
ニティークロマトグラフィーの結果を、第８図は、ブル
ーセファロースＣＬ６Ｂを用いたアフィニティークロマ
トグラフィーの溶出パターンを、 第９図は、本発明の免疫抑制因子の各種酵素および過ヨ
ウ素酸に対する感受性をそれぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記（１）〜（１２）の性質を有する免疫抑制因子（１
   ）分子量がゲル濾過にて４５，０００〜６５，０００お
   よび１５０，０００〜２００，０００であり、ＳＤＳ−
   ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて約３１，０００で
   ある、（２）等電点が４．６〜４．８である、 （３）ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ　Ｑ陰イオン交換クロマトグ
   ラフィーにて食塩濃度０．３１〜０．３２Ｍで溶出され
   る、（４）固定化コンカナバリンＡセファロースおよび
   ブルーセファロースに非吸着性である、 （５）デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、
   パパイン、過ヨウ素酸に非感受性で、トリプシン、α−
   キモトリプシン、プロナーゼに感受性である、 （６）ｐＨ２〜１０で安定である、 （７）４℃にて長期間安定であり、５６℃および９０℃
   、３０分間の熱処理にて部分失活する、（８）２−メル
   カプトエタノール、レバミゾール、Ｎ−アセチル−Ｄ−
   グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、α
   −メチル−Ｄ−マンノシド、Ｌ−アルギニンまたはＬ−
   オルニチンにより活性が阻害されない、 （９）抗体産生を抑制する、 （１０）リンパ球の幼若化反応を抑制する、（１１）細
   胞分裂増殖抑制作用を示す、および（１２）構成アミノ
   酸およびその含有量（モル％）がアスパラギン（アスパ
   ラギン酸を含む）９．０モル％、スレオニン４．７モル
   ％、セリン８．５モル％、グルタミン（グルタミン酸を
   含む）１３．１モル％、グリシン１６．９モル％、アラ
   ニン１０．４モル％、バリン５．２モル％、メチオニン
   １．１モル％、イソロイシン３．５モル％、ロイシン７
   ．３モル％、チロシン２．３モル％、フェニルアラニン
   ４．２モル％、リジン５．８モル％、ヒスチジン２．２
   モル％、アルギニン３．７モル％、プロリン２．３モル
   ％、１／２シスチン＜１モル％およびトリプトファン＜
   １モル％である。