SU686733A1 - Способ получени моноклонального иммуноглобулина - Google Patents

Description

I

Изобретение относитс  к области медицины , в частности к иммунологии, и может быть использовано дл  приготовлени  препаратов иммуноглобулина высокой степени очистки.

Известен способ получени  моноклонального иммуноглобулина путем культивировани  плазмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуцента из культуральной жидкости и очистки целевого продукта 1.

По известному способу опухоль извлекают из организма животного, освобождают от стромальных элементов, раздел ют на мелкие фрагменты (пор дка 1 ммЗ). Полученную массу промывают изотоническим солевым раствором, помешают в мецленно вращающийс  культиватор, добавл ют среду, содержащую U -аминокислоты , 0,5% овальбумина, набор витаминов, пенициллин, канамицин в стандартном растворе Хэнкса. На 100 ,мл среды внос т 5О-150 мг опухолевой массы. Увеличение концентрации плазмоцитомной

2

Claims (3)

1. массы приводит к быстрой гибели клеток, Культуру фрагментов солидной плазмаци- ТОМЫ инкубируют Б течение 24-48 час при 37°С. После окончани  процесса культивировани  клеточную массу удал ют путем центрифухгировани  при 18000 в течение 2О мин. Супернатант, свободный от клеточных элементов, диализуют дл  освобождени  от низкомолекул рных продуктов: аминокислот, витаминов и солей. Раствор лиофильно высушивают к расвор ют сухой остаток в О,1 мл физиолог ческого раствора. Полученный образец содержит многоканальный иммуноглобулин , ова ьбумин и продукты распавшихс  клеток. Выход моноклонального иммуноглобулина определ ют аналитическими м&тодами , например методом радиоиммуноэлектрофореза , чувствительность которого составл ет 1 мкг, причем при использовании 0,1 мл концентрата общее содержание моноклонального иммуноглобулина в исходной среде не превьциает нескольких микрограммов. 36 ОсновЕ1ЫМ недостатком известного способа  вл етс  низкий выход моноклоiiam Horo иммуноглобулина. Длительное культивирование фрагментов солидной опухоли требует внесени  в ереду поддерживающих белков сыворотки кро ви, например овальбумина, что требует при выделении целевого продукта сложной и многократной очистки от сывороточных белков. Механическое разрушение солидиой опухоли до ее фрагментов сопровожда етс  гибелью части клеток. В культуре из разрушенных клеток выдел ютс  про теолитические энзимы, которые перевари вают часть секретируемого иммуноглобу- лика. Это сопровождаетс  уменьшением выхода и снижением качества специфического белка - иммуноглобулина. Кроме того, культивирование клеток или фраг- ментов плазмацитомы невозможно в обыч нььх микробиологических средах без добав лени  поддержщгаюших белков и витаминов . Внесение последних усложн ет технику получени  моноклокал1эных иммуг оглобулинов , а также делает ее дороже, Пелью изобретени   вл етс  увеличе™ ние выхода и повышение иммунохимической чистоты препарата.. Это достигаетс  тем, Ч7го при предла гаемом способе получени  моноклоналького иммуноглобулина путем культивировани  ,гиазмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуцента из культуральной жидкости и очистки целево го продукта плазмопитом вместе с фиброзной капсулой и предлезкад1ими ткан ми культивируют Б услови х аэрации в течение час. Способ осуществл ют слеод ощим образом . Дл  получени  моноклонального имму- ноглобулина используют культуру цельной солидной опухоли (плазмоцитома), выде ленной вместе с о, эугкающей ее фиброзной капсулой и цредлежашим участком ткани. В качестве ггатательной среды используют обычную микробиологическую среду, например среду 199.. Опухоль ИЕ кубируют в среде в течение 6-8 час при и в услоБИ 1х аэрации карбогеном и затем удал ют. , В среде остаютс  иммуноглобулины ил их полипептидные цепи, при этом выход целевого продукта составл ет 12О-15Ом иммуноглобулина или ЗО--4О мг свободных полипептидных цепей при инкубадии 6 г солидной плазмоцитомы. Пример JL Мышиные солидные плазмоцитомы линии МОРС-21 и MOPG 406 , секретирующие иммуноглобулин классов Q- и А соответственно размером 2x2 см (около 4-6 г весом) осторожно вылущивают из ткани животного вместе с фиброзной капсулой и прилейшщим участком брюшины и промывают в физиологическом растворе. Опухоль помещают в сосуд5 содержащий 10О мл среды 199. . Культуру аэрируют пропусканием газовой смеси карбогена (95% кислорода и 5% углекислого газа) и через час культивировани  ткань извлекают и перенос т в свежий объем исходной микробиологи ческой среды. Процедуру культивировани  опухоли повтор ют раза. Затем культуральную среду центрифугируют при 10000 в течение 10 мин дл  удалени  мелких фрагментов ткани и клеток. Прозрач 1ый раствор среды содержит чистый иммуноглобулин. Дл  освобождени  целе вого продукта от аминокислот образец под- вергают ионообменной хроматографии на ДЕ-52 целлюлозе в градиенте концентрации фосфатного буфера 0,.16 М (рН 8Д), Иммуноглобулин элюируют в виде остроконечного пика в соответствующем ему значении мол рной концентрации буферного раствора. Образцы иммуноглобулина анализиру ют электрофорезом в 7,.ном полиакри;{амидгюм гене и иммуноэлектрофорезом. Имлмуноглобулин дает гомо1 кный пик в полиакриламидном геле и образует одну дугу преципитации при иммуноэлектрофорезе . Таким образом, получен 1ый образец иммуноглобулина иммунохимически и физически чистый. Выход иммуноглобулина 150 мг из 6 г опухоли. Перед упаковкой образцов препараты иммуноглобулина диализуют в течение 12. час против 500 об. дистиллированной воды и диофильно высушивают. Готовый продукт запаршают в ампулы и в таком виде хран т. Пример
2. 2. Солидную опухоль, продуцирующую D А (dgVlg типа) МОРС-315, выдел ют с предлежащей тканью и помешают в микробиологический культйваторо Затем с помощью перистальтического насоса создают непрерывное протекание .среды 199 со скоростью 100 мл за 6 час. Количество опухолевого материала в этом случае составл ет 4-6 г. Выход моноклонашэного иммуноглобулина в вытекающей среде за 24 час 500-600 мг. Дальнейшую очистку и анализ провод т обычным способом. По иммунохимнческим и физическим свойствам препарат соответствует моноклональному иммуноглобулину . Пример
3. 3. Солидную опухоль весом 4-6 г, продуцирующую свободные легкие К-депи иммуноглобулина линии МОРС-41, выдел ют совместно с предлежащей брюшиной и фиброзной капсулой, промывают физиологическим раствором к помещают в сосуд, содержащий 100 мл среды 199. Культуру аэрируют газовой смесью карбогена в течение 6-8 час. Ткань извлекают и перенос т в свежий питательный раствор дл  повторного куль тивировани , Культуральную среду фильтруют на бумажном фильтре Ватман-4 или любом другом с соответствующим ему размером пор. Прозрачный фильтрат содержит чистые К-цепи. Дл  освобождени  от ингредиентов среды раствор подвергают хрома тографии на ДЕ-целлюлозе. Свободные легкие К-цепи элюируют в виде одного компонента. Количественный выход целевого продукта - около 30 мг. По иммунохимическим свойствам данный белок соответствует К-цеп м. Возможно многократное, например 2раза , использование того же материала, при этом количественный выход измен етс  незначительно, -В случае промьплленного производств иммуноглобулина культивирование опухоли целесообразно проводить в обтекающей солидную плазмоцитому среде. Предлагаемый способ получени  моноклонального иммуноглобулина по сравнению с известным способом повышает вььход и иммунохимическую чистоту препарата . Препарат моноклонального иммуноглобулина , получаемый по предлагаемому способу, необходим дл  использовани  в экспериментальной и клинической медицине дл  диагностики миеломы и иммунодефитных Состо ний. Препарат может найти спрос как в нашей стране, так и за рубежом . Формула изобретени  Способ попучени  моноклонального иммуноглобулина путем культивировани  плазмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуцента из куль- туральной жидкости и очистки целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью увеличени  выхода и повышени  иммунохимической чистоты препарата , плазмоцитом вместе с фиброзной капсулой и предлежащими ткан ми культивируют в услови х аэрации в течение 6-8 час. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1 CeCEuEor TmmunoEogy 1973, № 2, с, 26,1-26,1L