JPS62278979A - 動物細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は動物細胞の培養方法に関する。

〔従来の技術〕

近年、本来動物生体内で産生されその場で機能する生理
活性物質、例えば各種の抗体、インターフェロン、線維
素溶解酵素活性化因子、リンホカイン類等を動物細胞、
例えばハイブリドーマの培養によって生産、回収し、こ
れを医薬等として使用することが可能になりつつある。

このような目的で動物細胞を培養する場合、動物細胞が
培地中で安定に生長（増殖）することが必要である。

従来、動物細胞は血清を含有する培地（血清培地）を用
いなければ培養することができなかった。しかしながら
血清中には各種のホルモン、ビタミン、アミノ酸、蛋白
質等多種多様の物質が含まれており、しかもそれらの含
有量も変動するため、安定した品質の血清標品を得るこ
とができなかった。

このため、安定に動物細胞を培養することが困難であっ
た。又、血清中に含まれる各種の成分と目的生産物との
物性が近似している場合、目的生産物を培地から純粋に
分離することが困難であった。

さらに、血清を安価に大量に入手することは困難である
ため、血清培地を用いて目的の有用物質を経済的に大量
に生産することが困難であった。

このため、血清培地を使用しないで動物細胞を培養する
方法の開発、特に血清に代る培地添加物の開発が望まれ
ている。従来から動物細胞生長（増殖）促進因子の検索
が広範囲に行われており、例えばインスリン、トランス
フェリン、エタノールアミンなどが知られている。本発
明者等は先に、植物由来の血清代替物としてシネココノ
カス属藻類の抽出物が有効であることを見出した（特願
昭５９−４１９９６号）。しかしながら、血清代替物と
して有効な植物由来の化合物は知られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、植物由来の化合物を血清を全部又は一
部代替する動物細胞増殖促進剤として使用して、動物細
胞を培養する方法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段） 本発明者等は、植物由来の化合物を広範囲にスクリーニ
ングした結果、フィコシアニンが動物細胞増殖効果を有
するという全く新しい知見を得、この知見に基いて本発
明を完成した。

従って、本発明は細胞増殖促進物質としてフィコシアニ
ンを含有する培地に動物細胞を培養することを特徴とす
る動物細胞の培養方法を提供するものである。

〔具体的な説明〕

本発明の方法に使用する培地には動物細胞増殖促進物質
としてフィコシアニンを添加する。フィコシアニンは既
知物質であり、藍藻、紅藻、及びクリプト環の藻体内に
見出される青色色素蛋白質である。本発明において使用
するフィコシアニンが由来する藻類の具体的な種類は特
に限定されない。また、フィコシアニンの調製方法及び
精製の程度も特に限定されない。すなわち、市販のフィ
コシアニンをそのまま使用してもよく、又は藻類を培養
して、その藻体から調製してもよい。フィコシアニンの
調製に当っては、例えば、藻類を培養して藻体を採取し
、これを適当な手段、例えば超音波処理により破砕して
抽出し、この抽出液を透析して非透析画分を得る。次に
この両分をゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフィー
によりさらに精製してフィコシアニンを得る。

本発明の方法においては、動物細胞の培養に常用されて
いる基礎培地、例えばＩ？ＰＭｌ　１６４０　、ＤＭＥ
（ダルベコ改変イーグル培地）、Ｉｌａｍ−Ｆ１２．１
９９　、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ　、ＢＧＪｂ、これら
の混合培地等を使用することができる。これらの培地に
は所望により小量の血清を加えることもできる。

動物細胞の培養におけるフィコシアニンの培地中濃度は
、基礎培地の種類、培養する動物細胞の種類、培養の目
的等により異るがおよそ１〜５００ｐｇ／ｍ１、好まし
くは２０〜３００　ｐ　ｇ　／　ｍｌである。

培養の条件としては、動物細胞の培養に通常用いられる
条件を用いることができる。例えば３７℃にて５％ＣＯ
２雰囲気下で良好な培養結果が得られる。

本発明の方法によれば、骨髄腫細胞株、Ｔリンパ球系細
胞株、Ｂ　ＩＪンパ球系細胞株等、ヒト及びその他の動
物の種々の細胞を培養することができる。

〔発明の効果〕

本発明の方法により、従来血′清を含む培地でなければ
培養が困デ「であった動物細胞を、血・清の全部又は大
部分をフィコシアニンで代替した培地で増殖させること
ができる。この培地は従来の血清培地のようなロフト毎
に性状にばらつきのある成分をほとんど含んでいないた
め、常に一定の性状のものが再現性よく調製できる。ま
た、本発明の方法により動物細胞を培養した後、培地か
ら目的生産物を回収・精製することが容易である。

次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。

実見炎上 ＲＰＭＩ　１６４０　、ＤＭＥ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）及びＩ
（ａｍ　Ｆ−１２を２：１：１で混合した完全合成培地
１？ＯＦに１０％ＦＣ５（ウシ胎児血清）を加えた培地
にＲＰＭＩ　８２２６（ヒト−骨髄腫細胞）を培養し、
この培養細胞をＩＩＤＦ培地で洗浄して血清成分を除去
した。

ＲＤＦ培地に２６〜２６０　ｐ　ｇ　／　ｍｌの最４’
％　？ａ度になるように市販フィコシアニン添加した培
地２ｒｎ！！を２ｍＩ！容の培養用シャーレに入れ、こ
れに前記の細胞を約５Ｘ１０’細胞／ｍｌとなるように
接種した。これを５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて４日
間培養した後、細胞数をセルカウンターにより計測した
。この細胞数を接種時の細胞数に対する比として第１図
に示す。

図から明らかなように、フィコシアニン蛋白質の添加ｆ
ｆ１２６μｇ　／　ｍｌ　〜２６０ｔｒｇ／ｍｌの濃度
範囲においては添加量に依存して細胞数が約２〜４倍以
上に増加した。

これに対してフィコシアニンを添加しないＲＤＩ’壇地
に同じ細胞を接種した場合、第１図に示すように細胞の
増加は全（認められなかった。

失生拠ｌ 藍藻シネココッカス・エロンガラス （ハ」旦０巴μ匹旦！Ｌ旦切Ａ１す四り−を常法に従っ
て培養し、細胞を冷水中に超音波処理して破砕し、遠心
分離して抽出液を得た。この抽出液をＰＢｓ　（リン酸
緩衝化生理食塩水）に対して透析し、非透析画分を得、
これをゲル濾過（セファロースＢ４、室温）、及びイオ
ン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セファロースＣ
Ｌ　−６Ｂ、室温）により分画してフィコシアニン画分
を得た。

この両分を用いて実施例１と同様の方法で培養を行った
。但し前記画分を、蛋白￥ｔ’１Ｍ度が２２．５μｇ　
／　ｍ　ｊ！〜９０．０μｇ７ｍｆｔとなるように添加
した。

この濃度範囲において、濃度に依存して細胞数が３〜４
倍に増加した（第１図）。

去見炭１ ヒトーＴリンパ球系細胞株（ＭｏＨ−４）　、及びヒト
ーＢリンパ球系細胞株（＋１Ｏ−３２３）を用いて実施
例１と同様にして培養を行い、同様の細胞増殖効果を得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、動物細胞に対するフィコシアニンの細胞増殖
効果を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、細胞増殖促進物質としてフィコシアニンを含有する
   培地に動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞の
   培養方法。