JPH0534952B2 - - Google Patents
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- JPH0534952B2 JPH0534952B2 JP61122214A JP12221486A JPH0534952B2 JP H0534952 B2 JPH0534952 B2 JP H0534952B2 JP 61122214 A JP61122214 A JP 61122214A JP 12221486 A JP12221486 A JP 12221486A JP H0534952 B2 JPH0534952 B2 JP H0534952B2
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Description
産業上の利用分野
本発明は、低密度からの動物細胞の増殖を可能
とする因子に関するものである。 従来の技術及び発明が解決しようとする問題点
血清地を用いた場合においても、細胞を低密度で
培養すると細胞が死滅することが多い。例えばヒ
ト−ヒトハイブリドーマHB4C5〔H.Mura kami，
et al.：In Vitro cellular and deue lopmental
bicloqy 21，593−396（1985）〕、ヒトリンパ芽球
様細胞株HO−323〔H.Ohashi，et al.：Cell.Biol.
Int.Rep.10(2)，77−84（1986）〕の亜株であるHO
−323−３、ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞
株CCRF−CEM等の細胞は、104細胞／ml以下で
植え込み培養した場合には死滅する。更に細胞に
よる物質生産を行う場合においては無血清培養が
望ましいが、この場合にはより顕著にこの死滅現
象がおこる。またハイブリドーマ及び遺伝子導入
した細胞の作製又は初代培養における標的細胞の
樹立においては、細胞が非常に少ない状態からで
も増殖してくることが必要である。 しかし現在までこのような低密度からの細胞増
殖を可能とする因子が見いだされておらず、細胞
培養に限界があつた。例えばヒト又はウシ血清ア
ルブミン〔S.Nilausen：J.Cell.Physiol.96，１−
14（1978），I.Yamane，et al.：Cell Bi ol.Int.
Rep.3，515−523（1979）〕、ラクトフエリン〔S.
Hashizume，et al.：Biochim.Biophys.
Acta763，377−382（1983）〕、トランスフエリン
〔D.Barnes，etal.：Cell22，469−655（1980）〕、
インシユリン〔G.O.Gey，et al.：J.Am.Med.
Assoc.82，160−169（1924）〕、エタノールアミン
〔H.Murakami，et al.：Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 79，1158−1162（1982）〕セレニウム〔W.L.
Mckeehan，et al.：Proc.Natl.Acad.Sci.
USA73，2023−2027（1976）〕、Ｔ細胞成長因子
〔D.A.Morgan，et al.：Science193，1007−1008
（1976）〕、Ｂ細胞成長因子〔M.Ho ward，et
al.：J.Exp.Med.155，914−923（1982）〕コロニー
形成刺激因子〔D.H.Pluz nik，et al.：J.Cell.
Comp.Physiol.66，319−324（1965）〕等にはこの
ような増殖活性が認められなかつた。 この発明は、このような問題点を解決しようと
して行われたものである。 問題点を解決するための手段 本発明者らは動物細胞の低密度からの増殖を可
能とする因子を得る目的で広く自然界を検索した
結果、ヒト血漿中にこの目的に適合する因子が存
在することを見いだし、これに基づいて本発明を
完成するに至つた。 本発明の因子はヒト血漿中に広く存在し、Ａ、
Ｂ、AB及びＯ型のいずれの血液型の血漿中にも
存在する。しかし血漿を細胞培養用培地に直接添
加した場合にはゲル化が生ずる。軟寒天培養のよ
うにゲル化が生じてもよい場合もあるが、液体培
養においてはゲル化が細胞の取り扱いを難しくす
る。従つて液体培養に用いるためには、少なくと
もCa2+処理した血漿を用いる。Ca2+処理は、ヒ
ト血漿に終濃度で100mMになるように塩化カル
シウムを添加し、室温で30分間撹拌し生じたフイ
ブリンを遠心分離で除去することにより行うこと
ができる。 本因子は硫酸アンモニウム分画、ゲル濾過及び
クロマトフオーカシングにより精製が可能であ
る。硫酸アンモニウム分画は０−40％飽和硫酸ア
ンモニウム画分を得るように行う。ゲル濾過は
Sep hacrylS−300（フアルマシア）、Sephadex
Ｇ−150（フアルマシア）等の樹脂を用い、カラム
クロマトグラフイーにより行うことができる。ま
た、クロマトフオーカシング（フアルマシア）は
PH７〜４、PH８〜５等のPH範囲のPHグラジエント
により行うことができる。このような精製法によ
り本因子は約100倍精製することができる。 本因子の分子量はゲル濾過により求めたところ
約15万であつた。等電点はクロマトフオーカシン
グの結果からPH6.5付近にある。また、本因子は
90℃、５分間の熱処理により失活し、低温又は凍
結保存により失活する不安定な性質を有してい
た。 本因子画分を添加する培地としては、通常用い
られている血清培地又は無血清培地を使用するこ
とができる。例えば、血清培地としては10％牛胎
児血清添加基本合成培地を用いる。基本合成培地
としてはRPMI1640培地、Dulbecco′s Modified
Eagle培地（DME）等を用いることができる。
また無血清培地としてはインシユリン、トランス
フエリン、エタノールアミン及びセレニウム添加
基本合成培地（ITES培地）〔H.Mura kami，et
al.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，1158−1162
（1982）〕ITES培地のトランスフエリンのかわり
にラクトフエリンを用いたILES培地〔S.
Hashizume，et al.：Biochim.Biophys.
Acta763，377−382（1983）〕等を使用することが
できる。無血清培養用の基本合成培地としては、
DME培地及びHam′sF−12培地を１：１で混合
したSFFD培地又はRPMI1640培地、DME培地及
びHam′s Ｆ−12培地を２：１：１で混合した
RDF培地等を用いる これらの血清培地及び無血清培地に本因子画分
を添加し細胞培養を行う。Ca2+処理した血漿を
用いる場合には、１mg／ml程度のタンパク濃度に
なるように添加し、またクロマトフオーカシング
画分を用いる場合には100μg／mlになるように添
加する。 本因子添加培地を用い種々の動物細胞の培養が
可能であり、例えばヒトＢ−リンパ球細胞、ヒト
Ｔ−リンパ球細胞、ヒト−ヒトハイブリドーマ等
である。 発明の効果 本因子を通常用いられている血清培地又は無血
清培地に添加することにより、１個からでもリン
パ球、ハイブリドーマ等の動物細胞を増殖させる
ことが可能となつた。ハイブリドーマの限界希釈
法によるクローニングを行つたところ、フイーダ
ー細胞を用いることなく90％以上の確率で１個か
ら細胞を増殖させることができた。 リンパ球、ハイブリドーマ等を用いコロニー形
成率を調べたところ、本因子を添加した場合に
は、無添加に比べ100倍以上形成率が上昇した。
また凍結した細胞を培養する場合等において、ほ
とんどの細胞が死滅することがある。このような
場合にも本因子を添加することにより増殖させる
ことができた。 ハイブリドーマの作製に本因子を用いることに
より、その出現率を数倍上げることができた。従
つて本因子をハイブリドーマ及び遺伝子導入した
細胞の作製又は初代培養における標的細胞の樹立
に応用することにより、より高率により効果的に
細胞を得ることが可能となると考えられる。 次に実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 １ ヒトＢリンパ芽球様細胞株HO−323−３、ヒ
ト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞株CCRF−
CEM（CEM）及びヒト−ヒトハイブリドーマ
HB4C5に対するCa2+添加処理した３人のヒト血
漿の増殖活性を調べた（第１表）。培地としては
10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地を用
い、細胞を１×104細胞／mlで接種した（以下の
実施例についても同様に行つた）。３日間の培養
により、ヒト血漿を添加しなかつた場合にはいず
れの細胞株も死滅した。一方、ヒト血漿を添加し
た場合には良好な細胞増殖が認められた。また、
その活性に個体差が認められないことから、本因
子はヒト血漿中に広く分布していると考えられ
る。その他の血清アルブミン、ラクトフエリン等
の生長因子はヒト血漿のような増殖活性は認めら
れなかつた。
とする因子に関するものである。 従来の技術及び発明が解決しようとする問題点
血清地を用いた場合においても、細胞を低密度で
培養すると細胞が死滅することが多い。例えばヒ
ト−ヒトハイブリドーマHB4C5〔H.Mura kami，
et al.：In Vitro cellular and deue lopmental
bicloqy 21，593−396（1985）〕、ヒトリンパ芽球
様細胞株HO−323〔H.Ohashi，et al.：Cell.Biol.
Int.Rep.10(2)，77−84（1986）〕の亜株であるHO
−323−３、ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞
株CCRF−CEM等の細胞は、104細胞／ml以下で
植え込み培養した場合には死滅する。更に細胞に
よる物質生産を行う場合においては無血清培養が
望ましいが、この場合にはより顕著にこの死滅現
象がおこる。またハイブリドーマ及び遺伝子導入
した細胞の作製又は初代培養における標的細胞の
樹立においては、細胞が非常に少ない状態からで
も増殖してくることが必要である。 しかし現在までこのような低密度からの細胞増
殖を可能とする因子が見いだされておらず、細胞
培養に限界があつた。例えばヒト又はウシ血清ア
ルブミン〔S.Nilausen：J.Cell.Physiol.96，１−
14（1978），I.Yamane，et al.：Cell Bi ol.Int.
Rep.3，515−523（1979）〕、ラクトフエリン〔S.
Hashizume，et al.：Biochim.Biophys.
Acta763，377−382（1983）〕、トランスフエリン
〔D.Barnes，etal.：Cell22，469−655（1980）〕、
インシユリン〔G.O.Gey，et al.：J.Am.Med.
Assoc.82，160−169（1924）〕、エタノールアミン
〔H.Murakami，et al.：Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 79，1158−1162（1982）〕セレニウム〔W.L.
Mckeehan，et al.：Proc.Natl.Acad.Sci.
USA73，2023−2027（1976）〕、Ｔ細胞成長因子
〔D.A.Morgan，et al.：Science193，1007−1008
（1976）〕、Ｂ細胞成長因子〔M.Ho ward，et
al.：J.Exp.Med.155，914−923（1982）〕コロニー
形成刺激因子〔D.H.Pluz nik，et al.：J.Cell.
Comp.Physiol.66，319−324（1965）〕等にはこの
ような増殖活性が認められなかつた。 この発明は、このような問題点を解決しようと
して行われたものである。 問題点を解決するための手段 本発明者らは動物細胞の低密度からの増殖を可
能とする因子を得る目的で広く自然界を検索した
結果、ヒト血漿中にこの目的に適合する因子が存
在することを見いだし、これに基づいて本発明を
完成するに至つた。 本発明の因子はヒト血漿中に広く存在し、Ａ、
Ｂ、AB及びＯ型のいずれの血液型の血漿中にも
存在する。しかし血漿を細胞培養用培地に直接添
加した場合にはゲル化が生ずる。軟寒天培養のよ
うにゲル化が生じてもよい場合もあるが、液体培
養においてはゲル化が細胞の取り扱いを難しくす
る。従つて液体培養に用いるためには、少なくと
もCa2+処理した血漿を用いる。Ca2+処理は、ヒ
ト血漿に終濃度で100mMになるように塩化カル
シウムを添加し、室温で30分間撹拌し生じたフイ
ブリンを遠心分離で除去することにより行うこと
ができる。 本因子は硫酸アンモニウム分画、ゲル濾過及び
クロマトフオーカシングにより精製が可能であ
る。硫酸アンモニウム分画は０−40％飽和硫酸ア
ンモニウム画分を得るように行う。ゲル濾過は
Sep hacrylS−300（フアルマシア）、Sephadex
Ｇ−150（フアルマシア）等の樹脂を用い、カラム
クロマトグラフイーにより行うことができる。ま
た、クロマトフオーカシング（フアルマシア）は
PH７〜４、PH８〜５等のPH範囲のPHグラジエント
により行うことができる。このような精製法によ
り本因子は約100倍精製することができる。 本因子の分子量はゲル濾過により求めたところ
約15万であつた。等電点はクロマトフオーカシン
グの結果からPH6.5付近にある。また、本因子は
90℃、５分間の熱処理により失活し、低温又は凍
結保存により失活する不安定な性質を有してい
た。 本因子画分を添加する培地としては、通常用い
られている血清培地又は無血清培地を使用するこ
とができる。例えば、血清培地としては10％牛胎
児血清添加基本合成培地を用いる。基本合成培地
としてはRPMI1640培地、Dulbecco′s Modified
Eagle培地（DME）等を用いることができる。
また無血清培地としてはインシユリン、トランス
フエリン、エタノールアミン及びセレニウム添加
基本合成培地（ITES培地）〔H.Mura kami，et
al.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，1158−1162
（1982）〕ITES培地のトランスフエリンのかわり
にラクトフエリンを用いたILES培地〔S.
Hashizume，et al.：Biochim.Biophys.
Acta763，377−382（1983）〕等を使用することが
できる。無血清培養用の基本合成培地としては、
DME培地及びHam′sF−12培地を１：１で混合
したSFFD培地又はRPMI1640培地、DME培地及
びHam′s Ｆ−12培地を２：１：１で混合した
RDF培地等を用いる これらの血清培地及び無血清培地に本因子画分
を添加し細胞培養を行う。Ca2+処理した血漿を
用いる場合には、１mg／ml程度のタンパク濃度に
なるように添加し、またクロマトフオーカシング
画分を用いる場合には100μg／mlになるように添
加する。 本因子添加培地を用い種々の動物細胞の培養が
可能であり、例えばヒトＢ−リンパ球細胞、ヒト
Ｔ−リンパ球細胞、ヒト−ヒトハイブリドーマ等
である。 発明の効果 本因子を通常用いられている血清培地又は無血
清培地に添加することにより、１個からでもリン
パ球、ハイブリドーマ等の動物細胞を増殖させる
ことが可能となつた。ハイブリドーマの限界希釈
法によるクローニングを行つたところ、フイーダ
ー細胞を用いることなく90％以上の確率で１個か
ら細胞を増殖させることができた。 リンパ球、ハイブリドーマ等を用いコロニー形
成率を調べたところ、本因子を添加した場合に
は、無添加に比べ100倍以上形成率が上昇した。
また凍結した細胞を培養する場合等において、ほ
とんどの細胞が死滅することがある。このような
場合にも本因子を添加することにより増殖させる
ことができた。 ハイブリドーマの作製に本因子を用いることに
より、その出現率を数倍上げることができた。従
つて本因子をハイブリドーマ及び遺伝子導入した
細胞の作製又は初代培養における標的細胞の樹立
に応用することにより、より高率により効果的に
細胞を得ることが可能となると考えられる。 次に実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 １ ヒトＢリンパ芽球様細胞株HO−323−３、ヒ
ト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞株CCRF−
CEM（CEM）及びヒト−ヒトハイブリドーマ
HB4C5に対するCa2+添加処理した３人のヒト血
漿の増殖活性を調べた（第１表）。培地としては
10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地を用
い、細胞を１×104細胞／mlで接種した（以下の
実施例についても同様に行つた）。３日間の培養
により、ヒト血漿を添加しなかつた場合にはいず
れの細胞株も死滅した。一方、ヒト血漿を添加し
た場合には良好な細胞増殖が認められた。また、
その活性に個体差が認められないことから、本因
子はヒト血漿中に広く分布していると考えられ
る。その他の血清アルブミン、ラクトフエリン等
の生長因子はヒト血漿のような増殖活性は認めら
れなかつた。
【表】
実施例 ２
HO−323−３細胞を用いコロニー形成率に対
するCa2+添加処理したヒト血漿の影響を調べた
（第２表）。軟寒天培養は通常の方法により行つ
た。血漿を添加しなかつた場合には1500個の細胞
を接種しても２個のコロニーしか得られなかつ
た。一方、血漿を添加した場合には15個の細胞を
接種するだけで９個のコロニーが得られた。従つ
てヒト血漿中の因子はコロニー形成率をも上げる
活性をもつていると考えられる。
するCa2+添加処理したヒト血漿の影響を調べた
（第２表）。軟寒天培養は通常の方法により行つ
た。血漿を添加しなかつた場合には1500個の細胞
を接種しても２個のコロニーしか得られなかつ
た。一方、血漿を添加した場合には15個の細胞を
接種するだけで９個のコロニーが得られた。従つ
てヒト血漿中の因子はコロニー形成率をも上げる
活性をもつていると考えられる。
【表】
実施例 ３
無血清培地を用い、実施例１と同様に血漿の影
響を調べた。無血清培地としては、インシユリン
（5μg／ml）ラクトフエリン（25μg／ml）、エタノ
ールアミン（20μM）及びセレニウム（2.5nM）
添加RPMI1640培地を用いた。実施例１の血清培
地を用いた場合と同様、３日間の培養により、ヒ
ト血漿を添加しなかつた場合にはいずれの細胞株
も死滅した。一方、ヒト血漿を添加した場合には
良好な細胞増殖が認められた。
響を調べた。無血清培地としては、インシユリン
（5μg／ml）ラクトフエリン（25μg／ml）、エタノ
ールアミン（20μM）及びセレニウム（2.5nM）
添加RPMI1640培地を用いた。実施例１の血清培
地を用いた場合と同様、３日間の培養により、ヒ
ト血漿を添加しなかつた場合にはいずれの細胞株
も死滅した。一方、ヒト血漿を添加した場合には
良好な細胞増殖が認められた。
【表】
実施例 ４
本因子の精製を次のように行つた。
ヒト血漿（50ml）に終濃度100mMになるよう
にCa2+を添加し、室温で30分間撹拌することに
よりフイブリノーゲンを除去した。フイブリノー
ゲンを除去した上清（45ml）に硫酸アンモニウム
を添加し０〜40％飽和硫酸アンモニウム沈殿画分
を得た。沈殿を４mlのリン酸緩衝化生理食塩水
（PBS）に溶解し、Sephacryl Ｓ−300カラム
（1.2×100cm）クラマトグラフイーにかけた。そ
の溶出パターンを第１図に示した。１フランクシ
ヨン当り1.8mlずつ集めた。２番目のピークに活
性が認められ、本因子はCa2+添加処理した血漿
の約30倍に精製された。この溶出パターンから本
因子の分子量は約15万であつた。増殖活性をもつ
23〜26番のフラクシヨン（Ｓ−300画分）を集め、
これを25mMイミダゾール−塩酸緩衝液（PH7.4）
に対し透析した後、PH７〜４のクロマトフオーカ
シング（１×20cmカラム）にかけた。その溶出パ
ターンを第２図に示した。280nmでの吸光度のピ
ークごとにフラクシヨンを集め、Ａ〜Ｅの５つの
画分に分けた。これらの画分について増殖活性を
測定した結果、Ｃ画分にのみ活性が認められた。
このステツプにより、本因子は更に約３倍精製さ
れた。このクロマトフオーカシングの結果から本
因子の等電点はPH6.5と考えられる。
にCa2+を添加し、室温で30分間撹拌することに
よりフイブリノーゲンを除去した。フイブリノー
ゲンを除去した上清（45ml）に硫酸アンモニウム
を添加し０〜40％飽和硫酸アンモニウム沈殿画分
を得た。沈殿を４mlのリン酸緩衝化生理食塩水
（PBS）に溶解し、Sephacryl Ｓ−300カラム
（1.2×100cm）クラマトグラフイーにかけた。そ
の溶出パターンを第１図に示した。１フランクシ
ヨン当り1.8mlずつ集めた。２番目のピークに活
性が認められ、本因子はCa2+添加処理した血漿
の約30倍に精製された。この溶出パターンから本
因子の分子量は約15万であつた。増殖活性をもつ
23〜26番のフラクシヨン（Ｓ−300画分）を集め、
これを25mMイミダゾール−塩酸緩衝液（PH7.4）
に対し透析した後、PH７〜４のクロマトフオーカ
シング（１×20cmカラム）にかけた。その溶出パ
ターンを第２図に示した。280nmでの吸光度のピ
ークごとにフラクシヨンを集め、Ａ〜Ｅの５つの
画分に分けた。これらの画分について増殖活性を
測定した結果、Ｃ画分にのみ活性が認められた。
このステツプにより、本因子は更に約３倍精製さ
れた。このクロマトフオーカシングの結果から本
因子の等電点はPH6.5と考えられる。
第１図は、実施例４の硫酸アンモニウム画分の
Sephacryl Ｓ−300カラムクロマトグラフイー
で、その溶出パターンを示すグラフである。第２
図は、実施例４のＳ−300画分のクロマトフオー
カシングで、その溶出パターンを示すグラフであ
る。
Sephacryl Ｓ−300カラムクロマトグラフイー
で、その溶出パターンを示すグラフである。第２
図は、実施例４のＳ−300画分のクロマトフオー
カシングで、その溶出パターンを示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトの血漿中に広く存在し、以下の性質を有
する細胞増殖因子。 (a) 動物細胞を１個からでも増殖させる活性を有
する。 (b) 動物細胞のコロニー形成を高める活性を有す
る。 (c) 分子量約15万の物質である。 (d) PH6.5付近に等電点を有する。 (e) 90℃、５分間の熱処理により失活する。 (f) 低温又は凍結保存により失活する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61122214A JPS62278980A (ja) | 1986-05-29 | 1986-05-29 | 細胞増殖因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61122214A JPS62278980A (ja) | 1986-05-29 | 1986-05-29 | 細胞増殖因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62278980A JPS62278980A (ja) | 1987-12-03 |
| JPH0534952B2 true JPH0534952B2 (ja) | 1993-05-25 |
Family
ID=14830379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61122214A Granted JPS62278980A (ja) | 1986-05-29 | 1986-05-29 | 細胞増殖因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62278980A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018089928A1 (en) | 2016-11-11 | 2018-05-17 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Human plasma-like medium |
-
1986
- 1986-05-29 JP JP61122214A patent/JPS62278980A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62278980A (ja) | 1987-12-03 |
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