JP3147414B2 - インターロイキン−６の産生法 - Google Patents
インターロイキン−６の産生法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生産性の高いインター
ロイキン−６の産生法に関する。
ロイキン−６の産生法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６
と略す）は、Ｂリンパ球分化因子、インターフェロンβ
２、２６Ｋ蛋白、ハイブリドーマ／プラズマサイトーマ
増殖因子、あるいは肝細胞刺激因子などとよばれていた
サイトカインの統一名である。ＩＬ−６は、Ｔ細胞、Ｂ
細胞、マクロファージ、線維芽細胞、血管内皮細胞など
の細胞株により恒常的に、あるいは種々の刺激により産
生される。
と略す）は、Ｂリンパ球分化因子、インターフェロンβ
２、２６Ｋ蛋白、ハイブリドーマ／プラズマサイトーマ
増殖因子、あるいは肝細胞刺激因子などとよばれていた
サイトカインの統一名である。ＩＬ−６は、Ｔ細胞、Ｂ
細胞、マクロファージ、線維芽細胞、血管内皮細胞など
の細胞株により恒常的に、あるいは種々の刺激により産
生される。
【０００３】ＩＬ−６は、活性化されたＢ細胞に対し、
抗体産生細胞への分化を誘導する。Ｔ細胞に対してはマ
イトジェン刺激を受けたＴ細胞にインターロイキン−２
（ＩＬ−２）産生を誘導したり、ある種のＴ細胞株や胸
腺細胞にＩＬ−２レセプターを誘導する。造血細胞に対
してはＩＬ−３存在下でＩＬ−６が造血幹細胞の増殖を
相乗的に誘導する。また、最近、ＩＬ−６はトロンボポ
エチンとしての作用を有していることが報告されてい
る。この様にＩＬ−６は、多くの生理活性を有してお
り、臨床への応用が期待されている。
抗体産生細胞への分化を誘導する。Ｔ細胞に対してはマ
イトジェン刺激を受けたＴ細胞にインターロイキン−２
（ＩＬ−２）産生を誘導したり、ある種のＴ細胞株や胸
腺細胞にＩＬ−２レセプターを誘導する。造血細胞に対
してはＩＬ−３存在下でＩＬ−６が造血幹細胞の増殖を
相乗的に誘導する。また、最近、ＩＬ−６はトロンボポ
エチンとしての作用を有していることが報告されてい
る。この様にＩＬ−６は、多くの生理活性を有してお
り、臨床への応用が期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】現在ＩＬ−６は、主に
遺伝子組換え体で産生され提供されている。しかし、遺
伝子組換え大腸菌で産生される物は、糖鎖を有していな
い。また、遺伝子組換えＣＨＯ細胞で産生される物は、
糖鎖構造が天然の物と異なる可能性がある。糖鎖構造の
差異は、生理活性や体内動態に影響すると考えられる。
天然型ＩＬ−６の生理活性や体内動態などの性質を臨床
応用するには、天然型ＩＬ−６の大量生産が必要であ
る。
遺伝子組換え体で産生され提供されている。しかし、遺
伝子組換え大腸菌で産生される物は、糖鎖を有していな
い。また、遺伝子組換えＣＨＯ細胞で産生される物は、
糖鎖構造が天然の物と異なる可能性がある。糖鎖構造の
差異は、生理活性や体内動態に影響すると考えられる。
天然型ＩＬ−６の生理活性や体内動態などの性質を臨床
応用するには、天然型ＩＬ−６の大量生産が必要であ
る。
【０００５】一方、天然型ＩＬ−６は、通常、ＩＬ−６
産生細胞を培養することにより、あるいはさらに誘発剤
で誘発させることにより産生させることができる。ま
た、誘発剤を用いて細胞を刺激した後、産生を一層増強
せしめるためにベラパミル、シクロヘキシミド、アクチ
ノマイシンＤなどの代謝阻害剤で細胞を処理する方法
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.,１４４，４２４２−４２４８
（１９９０））も知られている。しかしながら、これら
従来の方法では天然型ＩＬ−６を高収率で産生すること
ができない。本発明の目的は、臨床応用のために天然型
ＩＬ−６を大量に提供することにある。
産生細胞を培養することにより、あるいはさらに誘発剤
で誘発させることにより産生させることができる。ま
た、誘発剤を用いて細胞を刺激した後、産生を一層増強
せしめるためにベラパミル、シクロヘキシミド、アクチ
ノマイシンＤなどの代謝阻害剤で細胞を処理する方法
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.,１４４，４２４２−４２４８
（１９９０））も知られている。しかしながら、これら
従来の方法では天然型ＩＬ−６を高収率で産生すること
ができない。本発明の目的は、臨床応用のために天然型
ＩＬ−６を大量に提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、哺乳動物
培養細胞由来のＩＬ−６を大量に生産させる方法とし
て、細胞処理方法に着目し鋭意検討を重ねてきた。その
結果、高単位のＩＬ−６を安定して産生させる方法を提
供することができた。すなわち本発明は、ＩＬ−６産生
細胞を培養し、ＤＮＡ合成阻害剤で該細胞を処理するこ
とを特徴とするインターロイキン−６の産生方法であ
る。本発明によれば、天然型ＩＬ−６を高収率で生産す
ることができる。
培養細胞由来のＩＬ−６を大量に生産させる方法とし
て、細胞処理方法に着目し鋭意検討を重ねてきた。その
結果、高単位のＩＬ−６を安定して産生させる方法を提
供することができた。すなわち本発明は、ＩＬ−６産生
細胞を培養し、ＤＮＡ合成阻害剤で該細胞を処理するこ
とを特徴とするインターロイキン−６の産生方法であ
る。本発明によれば、天然型ＩＬ−６を高収率で生産す
ることができる。
【０００７】ＩＬ−６はさまざまな細胞により恒常的
に、あるいは種々の刺激により産生される。本発明のＩ
Ｌ−６産生細胞としては、ＩＬ−６産生能を有するもの
であれば、特に限定されないが、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、マクロファージ、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨肉
腫細胞、肺癌細胞、腎癌細胞などの細胞あるいは株化細
胞が挙げられる。本発明の方法は、誘発剤の刺激により
ＩＬ−６を産生する細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、線
維芽細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞、腎癌細胞など）を使
用する場合に特に効果のある方法である。
に、あるいは種々の刺激により産生される。本発明のＩ
Ｌ−６産生細胞としては、ＩＬ−６産生能を有するもの
であれば、特に限定されないが、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、マクロファージ、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨肉
腫細胞、肺癌細胞、腎癌細胞などの細胞あるいは株化細
胞が挙げられる。本発明の方法は、誘発剤の刺激により
ＩＬ−６を産生する細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、線
維芽細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞、腎癌細胞など）を使
用する場合に特に効果のある方法である。
【０００８】ＩＬ−６産生細胞を、ルー瓶やローラー
瓶、スピナーフラスコ、またはマイクロキャリアービー
ズや中空糸またはゲル固定化培養法により培養する。培
地組成、血清濃度等は、培養すべき細胞の種類、細胞濃
度等に応じて適当に選ばれる。培養中、適宜培地交換を
行い、数日間〜２０日間培養する。細胞がコンフルエン
トになるまで培養を続ける。増殖した細胞は、誘発剤で
処理するに先立ち低単位のサイトカインと数時間から２
日間インキュベートすることが好ましい。使用するサイ
トカインは、インターフェロン−βが好ましい。
瓶、スピナーフラスコ、またはマイクロキャリアービー
ズや中空糸またはゲル固定化培養法により培養する。培
地組成、血清濃度等は、培養すべき細胞の種類、細胞濃
度等に応じて適当に選ばれる。培養中、適宜培地交換を
行い、数日間〜２０日間培養する。細胞がコンフルエン
トになるまで培養を続ける。増殖した細胞は、誘発剤で
処理するに先立ち低単位のサイトカインと数時間から２
日間インキュベートすることが好ましい。使用するサイ
トカインは、インターフェロン−βが好ましい。
【０００９】その後増殖した細胞を各種ＩＬ−６誘発剤
で処理する。ＩＬ−６産生細胞を誘発剤で処理しＩＬ−
６を産生させる方法としては、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌ
ｙ（Ｃ）などの合成ＲＮＡもしくは天然型ＲＮＡ等の誘
発剤、あるいはＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ−βなどのサ
イトカイン、あるいはＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β等の増殖因
子、あるいはＰＭＡ、ＰＨＡ、リポポリサッカライドや
コレラ毒素などを用いて誘発させる方法が用いられる
（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，７３１（１９８７））。誘
発剤としては、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）が特に
好ましく用いられる。
で処理する。ＩＬ−６産生細胞を誘発剤で処理しＩＬ−
６を産生させる方法としては、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌ
ｙ（Ｃ）などの合成ＲＮＡもしくは天然型ＲＮＡ等の誘
発剤、あるいはＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ−βなどのサ
イトカイン、あるいはＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β等の増殖因
子、あるいはＰＭＡ、ＰＨＡ、リポポリサッカライドや
コレラ毒素などを用いて誘発させる方法が用いられる
（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，７３１（１９８７））。誘
発剤としては、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）が特に
好ましく用いられる。
【００１０】ＤＮＡ合成阻害剤の添加は、誘発剤添加前
２日以内、または誘発剤添加と同時、または誘発剤添加
後２日以内に行う。ＩＬ−６産生細胞として、血管内皮
細胞、マクロファージなどの誘発剤を必要としない細胞
を使用する場合は、該細胞を培養し細胞がコンフルエン
トになった段階で添加する。ＤＮＡ合成阻害剤として
は、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、マイトマイ
シンＣ、ポルフィロマイシン、ブレオマイシン、サルコ
マイシン、マクロモマイシン、あるいは５−ＦＵなどが
使用できる。なかでもマイトマイシンＣが特に好まし
い。使用濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範
囲が好ましい。さらに好ましくは、１０〜１００ｎｇ／
ｍｌの範囲である。その後、さらに数日間インキュベー
トしＩＬ−６を産生させる。この方法は、既知の処理方
法と比べＩＬ−６の生産性が高い。
２日以内、または誘発剤添加と同時、または誘発剤添加
後２日以内に行う。ＩＬ−６産生細胞として、血管内皮
細胞、マクロファージなどの誘発剤を必要としない細胞
を使用する場合は、該細胞を培養し細胞がコンフルエン
トになった段階で添加する。ＤＮＡ合成阻害剤として
は、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、マイトマイ
シンＣ、ポルフィロマイシン、ブレオマイシン、サルコ
マイシン、マクロモマイシン、あるいは５−ＦＵなどが
使用できる。なかでもマイトマイシンＣが特に好まし
い。使用濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範
囲が好ましい。さらに好ましくは、１０〜１００ｎｇ／
ｍｌの範囲である。その後、さらに数日間インキュベー
トしＩＬ−６を産生させる。この方法は、既知の処理方
法と比べＩＬ−６の生産性が高い。
【００１１】本発明で用いる培地は、通常のものが使用
できる。細胞に適した培地を、適宜選択することが好ま
しい。
できる。細胞に適した培地を、適宜選択することが好ま
しい。
【００１２】
【実施例】以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、これらにより本発明が限定されるものではない。 実施例 １ 胎児牛血清５％を含むイーグルＭＥＭに、ヒト線維芽細
胞を約１×１０５個／ｍｌの割合で接種し、２４穴マイ
クロプレートに１穴当たり２ｍｌ蒔き３７℃、５％ＣＯ
２濃度インキュベータ内で４日間培養した。途中、３日
目に培地交換を行った。４日目に、インターフェロン−
β１００国際単位／ｍｌ、カルボキシルメチルセルロー
スを含む、イーグルＭＥＭ培地と交換し、３７℃、５％
ＣＯ２濃度で２４時間インキュベートした。次に、ｐｏ
ｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）を１μｇ／ｍｌ加え、次い
で各種のＩＬ−６産生増強剤を加えさらに３７℃、５％
ＣＯ２濃度下で５日間培養した。ＩＬ−６産生増強剤と
しては、マイトマイシンＣ（０．０５μｇ／ｍｌ）、シ
クロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）、アクチノマイシン
Ｄ（４μｇ／ｍｌ）、ベラパミル（１００μｇ／ｍｌ）
を用いた。シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤの場
合は、添加後各々４時間、１時間後に培地交換により除
去した。最終的に産生されたＩＬ−６の量は、抗ＩＬ−
６抗体（Ｎ．Ｉｄａら、Biochem. Biophys. Res.Commu
n.，１６５，７２８−７３４，（１９８９））を用いた
酵素抗体法で測定した。結果は、表１に示す。
るが、これらにより本発明が限定されるものではない。 実施例 １ 胎児牛血清５％を含むイーグルＭＥＭに、ヒト線維芽細
胞を約１×１０５個／ｍｌの割合で接種し、２４穴マイ
クロプレートに１穴当たり２ｍｌ蒔き３７℃、５％ＣＯ
２濃度インキュベータ内で４日間培養した。途中、３日
目に培地交換を行った。４日目に、インターフェロン−
β１００国際単位／ｍｌ、カルボキシルメチルセルロー
スを含む、イーグルＭＥＭ培地と交換し、３７℃、５％
ＣＯ２濃度で２４時間インキュベートした。次に、ｐｏ
ｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）を１μｇ／ｍｌ加え、次い
で各種のＩＬ−６産生増強剤を加えさらに３７℃、５％
ＣＯ２濃度下で５日間培養した。ＩＬ−６産生増強剤と
しては、マイトマイシンＣ（０．０５μｇ／ｍｌ）、シ
クロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）、アクチノマイシン
Ｄ（４μｇ／ｍｌ）、ベラパミル（１００μｇ／ｍｌ）
を用いた。シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤの場
合は、添加後各々４時間、１時間後に培地交換により除
去した。最終的に産生されたＩＬ−６の量は、抗ＩＬ−
６抗体（Ｎ．Ｉｄａら、Biochem. Biophys. Res.Commu
n.，１６５，７２８−７３４，（１９８９））を用いた
酵素抗体法で測定した。結果は、表１に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】実施例２ ヒト骨肉腫由来ＭＧ−６３細胞（Antimicrob. Ag. Chem
other., 12,11(1977))を、培養面積１５０cm2 の培養フ
ラスコ（コーニング社）４本を用い、５％ウシ胎児血清
を含むイーグルＭＥＭ培地中で増殖させた。コンフルエ
ントに増殖した細胞を０．３W/V%の“Ｃｙｔｏｄｅｘ
１”（ファルマシア社）を用いたマイクロキャリー培養
系に移し、１日おきに培地交換を繰り返し、マイクロキ
ャリアー上にコンフルエントに増殖させた。増殖した細
胞（１．２×１０6 /ml)に５０ng/ml のマイトマイシン
ＣをＰｏｌｙＩ／Ｃ刺激を行なう４８時間前に添加し
た。２４時間前に１００ＩＵ/ml のインターフェロンβ
のプライミングを行ない、１０μg/mlのＰｏｌｙＩ／Ｃ
処理を２時間行なって５％ＣＯ2 のインキュベーター中
で５日間培養した。ＰｏｌｙＩ／Ｃを除去してから、
１、２、３および５か目の培養上清を抜き出し、Ｉｄａ
らの方法に従いＩＬ−６産生量を測定した。結果を図１
に示す。
other., 12,11(1977))を、培養面積１５０cm2 の培養フ
ラスコ（コーニング社）４本を用い、５％ウシ胎児血清
を含むイーグルＭＥＭ培地中で増殖させた。コンフルエ
ントに増殖した細胞を０．３W/V%の“Ｃｙｔｏｄｅｘ
１”（ファルマシア社）を用いたマイクロキャリー培養
系に移し、１日おきに培地交換を繰り返し、マイクロキ
ャリアー上にコンフルエントに増殖させた。増殖した細
胞（１．２×１０6 /ml)に５０ng/ml のマイトマイシン
ＣをＰｏｌｙＩ／Ｃ刺激を行なう４８時間前に添加し
た。２４時間前に１００ＩＵ/ml のインターフェロンβ
のプライミングを行ない、１０μg/mlのＰｏｌｙＩ／Ｃ
処理を２時間行なって５％ＣＯ2 のインキュベーター中
で５日間培養した。ＰｏｌｙＩ／Ｃを除去してから、
１、２、３および５か目の培養上清を抜き出し、Ｉｄａ
らの方法に従いＩＬ−６産生量を測定した。結果を図１
に示す。
【００１５】
【発明の効果】本発明によれば、医薬としての応用が期
待される天然型ＩＬ−６を、高収率で産生することがで
きる。
待される天然型ＩＬ−６を、高収率で産生することがで
きる。
【図１】実施例２のＩＬ−６産生に及ぼすマイトマイシ
ンＣの影響を示す。
ンＣの影響を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−308234（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−98685（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、線維芽
細胞、および血管内皮細胞の細胞株から選ばれるインタ
ーロイキン−６産生細胞をコンフルエントになるまで培
養し、ＤＮＡ合成阻害剤で該細胞を処理することを特徴
とするインターロイキン−６の産生法。 - 【請求項２】インターロイキン−６産生細胞を誘発剤で
処理することを特徴とする請求項１記載のインターロイ
キン−６の産生法。 - 【請求項３】ＤＮＡ合成阻害剤を誘発剤添加前２日以
内、誘発剤添加と同時、または誘発剤添加後２日以内に
添加することを特徴とする請求項２記載のインターロイ
キン−６の産生法。 - 【請求項４】ＤＮＡ合成阻害剤がマイトマイシンＡ、マ
イトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシ
ン、ブレオマイシン、サルコマイシン、マムロモマイシ
ン、または５−ＦＵである請求項１〜３記載のインター
ロイキン−６の産生方法。 - 【請求項５】誘発剤がｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ
（Ｃ）、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ−β、ＰＤＧＦ、Ｔ
ＧＦ−β、ＰＭＡ、ＰＨＡ、リポポリサッカライド、ま
たはコレラ毒素である請求項２〜４記載のインターロイ
キン−６の産生法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18248791A JP3147414B2 (ja) | 1990-07-25 | 1991-07-23 | インターロイキン−６の産生法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19648090 | 1990-07-25 | ||
| JP2-196480 | 1990-07-25 | ||
| JP18248791A JP3147414B2 (ja) | 1990-07-25 | 1991-07-23 | インターロイキン−６の産生法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176787A JPH05176787A (ja) | 1993-07-20 |
| JP3147414B2 true JP3147414B2 (ja) | 2001-03-19 |
Family
ID=26501274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18248791A Expired - Fee Related JP3147414B2 (ja) | 1990-07-25 | 1991-07-23 | インターロイキン−６の産生法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3147414B2 (ja) |
-
1991
- 1991-07-23 JP JP18248791A patent/JP3147414B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05176787A (ja) | 1993-07-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |