KR19980071708A - 용골(溶骨)세포 형성 억제제 - Google Patents

용골(溶骨)세포 형성 억제제 Download PDF

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Abstract

인터로이킨-18 및/또는 그 기능성 균등물을 함유하는 용골세포(溶骨細胞; osteoclast) 형성 억제제를 제공한다.
이 억제제는 세포 배양을 위한 첨가성분으로서, 그리고 뼈흡수 조절 및 용골세포 관련 각종 질환에 있어서 과칼슘혈증, 파골세포종, 골다공증 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약으로서 유용하다.

Description

용골(溶骨)세포 형성 억제제
본 발명은 인터로이킨-18(이하, 간단히 IL-18이라 함) 또는 그 기능성 균등물을 함유한 용골세포(osteoclast) 형성 억제제에 관한 것이다. 조골(造骨)세포(osteoblast)의 뼈 형성 및 용골세포의 뼈 흡수(resorption)는 건강한 생체에서는 그 균형이 양호하게 취해지고 있으므로 뼈 조직을 정상적인 상태로 유지하는 한편, 노후화된 뼈 조직은 원래의 뼈 형상을 바꾸지 않고 새로운 뼈로 교체되고 있다. 이러한 현상은 뼈의 칼슘농도를 소요의 범위내로 제어하는 등의 생체의 동적(動的) 평형(homeostasis)을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있다. 일단 균형을 잃게 되면, 특히 뼈 흡수 레벨이 뼈 형성 레벨을 초과할 때는 뼈 관련 각종 질환 및 기타 질환을 유발하게 된다. 따라서 생체에서의 뼈 흡수에 대한 전반적인 메카니즘의 해명, 특히 용골세포에 대한 해명은 그 과학적인 중요성과 임상적인 중요성으로 인해 크게 각광을 받고 있다.
그러나, 프로모우터로서의 인터로이킨 1과 인히비터(inhibitor)로서의 인터로이킨 4가 발견되었다 하더라도 용골세포 형성 메카니즘에 대해서는 아직까지 완전히 해명되어 있지 않다. 그 이유는 생체에서의 각종 현상과 마찬가지로 생체에서의 용골세포 형성은 프로모우터와 인히비터 사이의 밀접하고도 복잡한 관계에 의해 제어되고 있기 때문이다. 이러한 사실에 근거하여 과학적이며 임상학적인 관점에서 효과적인 용골세포 형성 억제제의 확립이 크게 기대되고 있다.
본 발명의 과제는 신규의 효과적인 용골세포 억제제를 제공함에 있다.
도 1은 재조합 DNA pKGFHH2의 구조도.
도 2는 재조합 DNA pCSHIGIF/MUT35의 구조도.
도 3은 재조합 DNA pCSHIGIF/MUT42의 구조도.
도 4는 재조합 DNA pBGHuGF의 구조도.
도 5는 재조합 DNA pKGFMH2의 구조도.
*도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
KGFHH2 cDNA : 본 발명에 의한 IL-18을 코우드하는 cDNA.
IGIF/MUT35 : 본 발명에 의한 IL-18을 코우드하는 DNA.
IGIF/MUT42 : 본 발명에 의한 IL-18을 코우드하는 DNA.
HuIGIF : 본 발명에 의한 IL-18을 코우드하는 염색체 DNA.
KGFMH2 cDNA : 본 발명에 의한 IL-18을 코우드하는 cDNA.
5S : 5S 염색체 RNA의 유전자.
Ptac : tac 프로모우터.
rrnBT1T2 : 염색체 RNA 오페론의 종결 영역.
AmpR : 앰피실린 내성 유전자.
pBR322ori : 대장균의 복제 기원.
CMV : 사이토메갈로바이러스 프로모우터.
IFNss : 인간 인터페론-α의 서브타입 α2b에 대한 시그날 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 배열.
상기 과제를 해결하고자 본 발명자들은 면역담당 세포의 중요한 생리활성 물질인 인터페론-γ(이하, 간단히 IFN-γ라 함) 및 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(이하, 간단히 GM-CSF라 함)의 산생을 유도하고 세포 장해성을 증강하며 킬러 세포 생성을 유도하는 면역계에서의 정보전달 물질인 사이카토인의 일종인 IL-18에 대하여 예의 연구를 한 결과, IL-18은, Haruki OKAMURA가 일본국 특허공개 제27,189/96호 및 제193,098/96호와 문헌 [Nature, Vol.378, No.6,552, pp.88∼91 (1995)]에서 보고한 바와 같이 인터페론-γ-유도인자로서 기재되어 있고, Shimpei USHIO등이 문헌 [The Journal of Immunology, Vol.156, pp.4,274∼4,279 (1996)]에서 제안한 바에 따라 IL-18로 불리우고 있다는 것을 알았다.
본 발명자들은 용골세포 전구세포로부터 생체외에서 용골세포 형성을 억제할 수 있는 특수한 유전자가 마우스 골수종 유래의 기질세포(stroma cell)중에서 특이하게 다량 발현됨을 발견하여, 더욱 상세히 분석한 결과 (가) 유전자는 핵심 배열로서 배열표의 배열번호 7에 나온 배열을 가진 IL-18을 코우드하며, (나) IL-18 및 그 기능성 균등물은 용골세포 형성을 효과적으로 억제하고, (다) 그 억제는 IL-18에 의해 유도되어 산생된 GM-CSF의 작용에 주로 기인하고 있음이 판명되었다.
이들 사실에 근거하여 본 발명자들은 유효성분으로서 IL-18 또는 그 기능성 균등물을 함유한 용골세포 형성 억제제에 의하여 본 발명의 과제를 해결하였다.
본 발명은 유효성분으로서 IL-18 또는 그 기능성 균등물을 함유한 용골세포 형성 억제제에 관한 것이다. 본 발명에서 말하는 IL-18이라 함은 그 기원과 급원과는 관계없이 위에 나온 성질을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 예컨대, 본 발명에서 사용되는 IL-18은 내부 부분 아미노산 배열로서 배열표의 배열번호 1, 배열번호 2 및 배열번호 3과 배열번호 4 및 5의 아미노산 배열을 포함하고, 전반적으로 배열표의 배열번호 6 또는 7의 아미노산 배열을 포함한다. 본 발명에서 말하는 기능성 균등물(들)이라 함은 (1) IL-18의 아미노산 배열에서의 아미노산 하나 이상이 기타 아미노산으로 치환된 것들, (나) 아미노산 하나 이상이 IL-18의 아미노산 배열의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가 된 것들, (다) 아미노산 하나 이상이 IL-18의 아미노산 배열의 내부 부위속에 삽입된 것들, (라) IL-18의 아미노산 배열의 N 말단 및/또는 C 말단 영역의 아미노산 하나 이상이 결실된 것들, 및 (마) IL-18의 아미노산 배열의 내부영역의 아미노산 하나 이상이 결실된 것들을 포함한다. IL-18의 본래의 성질중에서 IL-18에 의해 용골세포 형성 성질을 실질적으로 상실하지 아니하는 범위내에서 이들 모든 개변(modification)이 가능하다. 이들 기능성 균등물의 예에 대해서는 본 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제20,906/97호 명세서에서의 그 상세한 아미노산 배열, 즉 면역담당 세포에 의해 인터페론-γ의 산생을 유도할 수 있고, 배열표의 배열번호 1, 2 및 4에 나온 각각의 동감성 배열을 그대로 두고 시스테인 하나 이상이 기타의 아미노산(들)로 치환된 아미노산 배열 또는 치환된 시스테인의 것들을 제외하고 동감성 배열의 것들을 포함하는 부위 하나 이상에서 아미노산 하나 이상이 부가, 제거 및/또는 치환된 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드와 더불어 기재되어 있다. 시스테인을 치환하는 기타의 아미노산은, 기타의 아미노산으로 치환된 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드가 배열표의 배열번호 1, 2 및 4를 동감성 부분 아미노산 배열로서 가진 야생형 폴리펩티드와 같이 적당한 보인자(cofactor) 존재하 또는 부재하에 면역담당 세포에서 IFN-γ의 산생을 유도하는 활성을 나타내고, 또한 야생형 폴리펩티드 보다 유의하게 높은 안정성을 나타내는 것이면, 그 종류에 특히 한정되지 않는다. 기타의 아미노산으로서는 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 히스티딘, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있는데, 이들 중에서 가장 바람직한 아미노산은 세린 또는 알라닌이다. 동감성 부분 아미노산 배열로서 배열표의 배열번호 1, 2 및 4를 가지며, 시스테인 하나 이상이 기타의 아미노산(들)로 치환되는 아미노산 배열의 예는 배열표의 배열번호 6 또는 7을 가진 야생형 폴리펩티드이다. 배열표의 배열번호 6은 N 말단으로부터 제38번째, 제68번째, 제76번째 및 제127번째 위치에 시스테인을 가지며, 배열표의 배열번호 7은 제7번째, 제75번째 및 제125번째 위치에 시스테인을 가진다. 이들 폴리펩티드는 배열표의 배열번호 6을 가진 야생형 폴리펩티드에서 유래하며 배열표의 배열번호 20∼26중의 어느 하나의 아미노산 배열을 가진 것들, 배열표의 배열번호 7에 나온 아미노산 배열을 가진 야생형 폴리펩티드에서 유래하며 배열표의 배열번호 27 또는 28에 나온 아미노산 배열을 가진 것들 및 소요의 생리활성 및 안정성을 유지하면서 시스테인이 치환된 위치를 제외한 위치에 대해 아미노산 하나 이상이 부가, 제거 및/또는 치환된 배열표의 배열번호 20∼28중의 어느 하나에서 유래하는 아미노산 배열을 가진 것들을 포함한다. 아미노산 하나 이상이라 함은 부위특정 변이 유발법등의 종래의 방법에 의해 통상적으로 부가, 제거 또는 치환할 수 있는 수의 아미노산을 의미한다. 배열표의 배열번호 20∼28중의 어느 하나를 가진 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드 보다 안정성과 생리활성이 유의하게 높다.
본 발명에서 말하는 기능성 균등물에는 IL-18의 글리코실화 폴리펩티드 및 상기한 폴리펩티드를 포함한다. 이들 IL-18과 그 기능성 균등물은 모두 본 발명에서 별달리 명시하지 않는 한 IL-18이라 하는데, 이들 중 어느 하나라도 그 기원과는 관계없이 본 발명에서 사용할 수 있다. 즉, 세포 배양물 등의 천연의 급원으로부터 분리하여 제조한 것들이어도 좋고 재조합 DNA기술 및 펩티드 합성법을 이용하여 인위적으로 합성한 것들이어도 좋다.
경제적인 관점에서 재조합 DNA기술을 이용하는 방법이 유리하게 이용된다. 일반적으로 미생물, 동식물 유래의 적당한 숙주속에 IL-18을 코우드하는 DNA를 삽입하여 형질 전환체를 생성시키고, 이 형질 전환제를 통상의 방법으로 영양배지에서 배양한 후, 사이토카인 정제에 사용되는 통상적인 방법으로 배양물을 정제함으로써 소요의 IL-18을 얻을 수 있다. IL-18을 코우드하는 DNA를 함유하고 있는 한 어떠한 DNA라도 상기한 DNA로서 사용할 수 있고, 본 발명의 용골세포 형성 억제제의 사용목적 또는 사용된 재조합 DNA 기술에 따라 DNA를 적절히 선택할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허공개 제193,098/96호, 제231,598/96호 및 제27,189/96호에는 마우스 또는 인간 IL-18을 코우드하는 cDNA를 포함한 DNA를 도입한 형질 전환 미생물을 배양하여 IL-18을 제조하는 방법에 대해 상세히 개시되어 있고, 또한 본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제185,305/96호 명세서에는 인간 IL-18을 코우드하는 염색체 DNA를 포함하는 도입된 DNA를 가진 형질 전환된 동물세포를 배양함으로써 인간 IL-18을 코우드하는 IL-18의 제조방법에 대해 상세히 개시되어 있다. 본 발명과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제20,906/97호 명세서에는 인간 IL-18의 기능성 균등물을 코우드하는 DNA를 포함하는 도입된 DNA를 가진 형질 전환된 동물세포를 배양함으로써 IL-18을 제조하는 방법에 대해 상세히 개시되어 있다.
상기한 재조합 DNA 기술은 경제적인 잇점은 있으나, 사용된 숙주와 DNA 배열에 따라 수득한 IL-18은 생성된 IL-18과는 다소 다른 이화학적 성질과 생체내에서의 기능을 가진다. 본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제67,434/96호 명세서에는 천연 급원으로서 인간 주화세포를 사용하는 IL-18의 제조방법이 상세히 개시되어 있고, 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제213,267/96호 명세서에는 인터로이킨-1β-변환효소를 사용하는 제조방법이 상세히 개시되어 있다. 이들 제조방법으로 제조된 IL-18은 생성된 IL-18의 이화학적 성질 및 생체내에서의 기능과 실질적으로 동일한 것으로 추정할 수 있고, 그 수율은 다소 낮다. 그러나 이러한 IL-18은 인간을 비롯한 온혈동물 일반에게 투여하는 의약품으로서 사용할 경우 거의 부작용이 없다는 장점을 가지고 있다. 본 발명과 동일한 특허출원인에 의한 일본국 특허출원 제231,598/96호 명세서에 개시된 바와 같이 IL-18에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 정제방법을 적용하면 비교적 고순도의 IL-18을 최소한의 노력(努力)과 코스트로 제조할 수 있다.
상기한 IL-18을 함유한 본 발명의 용골세포 형성 억제제는 생체 내외에서 용골세포 형성을 억제하는 것이라면 유용한 어떠한 종류 및 형태라도 포함한다. 본 발명의 용골세포 형성 억제제는 동물세포용 배지에서 용골세포 형성을 양호하게 억제하고 소요의 세포를 양호하게 유지, 증식 및/또는 분화하는 성분으로서 유리하게 사용할 수 있으며, 또한 뼈와 관련된 치료제의 스크리닝 키트의 성분으로서, 뼈 흡수 조절제로서, 그리고 용골세포 관련 각종 질환제로서 유리하게 사용할 수 있다. 뼈 흡수 조절제로서는 생체내에서 용골세포 형성 억제작용을 나타내고 뼈 흡수를 정상상태로 조절하며 비교적 덜 위험한 관절통 등의 바람직하지 아니한 신체 상태를 개선하는 의약 및 건강식품을 포함한다. 용골세포 관련 각종 질환제로서는 과잉의 용골세포 형성 및/또는 그 기능에 기인한 각종 질환을 예방 및/또는 치료하는데 사용되는 의약을 포함한다. 이러한 질환의 예로서는 과칼슘혈증 파골세포종, 베체트(Bechet) 증후군, 골육종, 관절증, 만성 류머티스 관절염, 변형성 골염, 원발성 갑상선 기능 항진증, 음경골증 및 골다공증 등을 들 수 있다. 질환 치료제의 종류와 치료대상이되는 질환에 따라 다르겠지만 본 발명의 억제제는 통상적으로 IL-18을 0.000002∼100w/w%, 바람직하게는 0.0002∼0.5w/w%함유시킨 액제, 페이스트제 또는 고형제 등으로 제제화한다.
본 발명의 용골세포 형성 억제제는 IL-18 단독이어도 좋고, IL-18과 더불어 기타 첨가성분 한가지 이상, 즉 담체, 부형제, 희석제, 보조제, 항생제, 단백질(예:혈청 알부민), 안정제로서의 젤라틴, 당류[예:글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 트레할로오스, 수크로오스, 이소말토오스, 락토오스, 파노오스, 에를로오스, 팔라티노오스, 락토수크로오스, 라피노오스, 프룩토올리고당, 갈락토올리고당, 렌티난, 덱스트린, 풀룰란 및 당알코올(예:소르비톨, 말티톨, 락티톨, 말토트리이톨], 인산염 또는 시트르산 염을 주성분으로 하는 완충제, 환원제(예:2-메르캅토에탄올, 디티오드레이톨, 환원 글루타티온), 임의의 생리활성 물질[예:인터페론-α, 인터페론-β, 인테페론-γ, 인터로이킨-2, 인터로이킨-3, 인터로이킨-6, 인터로이킨-12, TNF-α, TNF-β, GM-CSF, 에스트로젠, 프로제스테론, 클로르마디논 아세테이트, 칼시톤토닌, 소마토카인, 소마토메딘, 인슐린 유사 생장 인자, 이프리플라본, 부갑상선 호르몬(PTH), 노르에티스테론, 부술판, 안시타빈, 시타라빈, 플루오로우라실, 테트라히드로푸르푸릴 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 비타민 D2, 활성 비타민 D, 크레스틴 혹은 다당 K, L-아스파라키나아제, OK-432 혹은 피시바닐] 및 칼슘염(예:락트산 칼슘, 염화 칼슘, 인산 1수소 칼슘, L-아스파르트산 L-칼슘)을 1종이상 함유한 조성물로 하여도 좋다. 이것을 인간을 비롯한 온혈동물 일반에게 투여하기 위한 용골세포 관련 질환제로서 사용할 경우, 본 발명의 억제제를 위에 나온 생리학적으로 허용되는 물질 1종 이상과 적절히 조합하여 조성물로 제제화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 용골세포 형성 억제제는 인간을 비롯한 온혈동물 일반에게 투여하기 위한 단위 제형의 의약을 포함한다. 단위 제형이라 함은 IL-18을 1일 투여량에 적합한 양으로 함유하거나 이 투여량의 정수배(4배까지) 혹은 약수배(1/40배 까지)의 양으로 함유하며 처방된 투여에 적합한 물리적으로 분리된 제형을 의미한다. 이러한 제형의 예로서는 주사제, 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 트로치제, 점안제, 점비제, 좌제 등이 있다.
본 발명의 용골세포 형성 억제제는 경구투여 및 비경구 투여와는 관계없이 용골세포 관련 각종 질환을 효과적으로 치료·예방한다. 환자의 질환의 종류와 증상에 따라 달라지나 본 발명의 용골세포 형성 억제제는 IL-18을 1회당 약 0.5㎍∼약 100mg, 바람직하게는 약 2㎍∼10mg의 투여량으로 하여 1일에 2∼6배 혹은 1주에 2∼10배를 1일 내지 1년 동안 환자에게 경구, 경피, 피하, 근육 또는 정매내에 투여할 수 있다.
이하, 실험에 의해 본 발명의 IL-18의 제조방법, 이화학적 성질 및 생리활성에 대해 설명한다.
실험 1: 인간 IL-18의 제조
본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허 공개 제231,598/96호에 기재된 방법에 따라 인간 IL-18을 코우드하는 cDNA에 결합된 자율복제 가능한 재조합 DNA pKGFHH2를 제조하였다. 디데옥시리보뉴클레오티드 배열분석 결과, 도 1에 나온 바와 같이 재조합 DNA KGFHH2에 있어서 배열표의 배열번호 8에 나온 염기 배열을 가진 cDNA가 Ptac(Tac 프로모우터)의 하류에 연결되어 있음이 판명되었다. 이 재조합 DNA pKGFHH2는 배열표의 배열번호 1 내지 5에 나온 아미노산 배열을 가지고 있었다. 이들 아미노산 배열은 배열표의 배열번호 8에서의 뉴클레오티드 46-63, 88-105, 400-420, 151-165 및 214-228에 의해 각각 코우드되었다.
일본국 특허 공개 제231,598/96호에 기재된 방법에 따라 재조합 DNA pKGFHH2를 대장균 Y1090주 (ATCC 37197)에 도입하고 이 균주를 배양하였다. 생성된 폴리펩티드를 면역 친화성 크로마토그래피로 정제하여 순도가 95% 이상인 정제 인간 IL-18을 배양물 1리터당 약 25mg의 수득량으로 얻었다. 본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허 공개 제193,098/96호에 기재된 방법에 따라 정제 인간 IL-18의 생리활성과 이화학적 성질을 다음과 같이 분석하였다. 즉, 건강한 공여자로부터 통상의 방법으로 채취한 인간 임파구를 정제 인간 IL-18의 존재하에 배양할 때, IL-18의 농도에 따라 IFN-γ의 산생을 관찰함으로써 IL-18은 면역담당 세포로서의 임파구에 의하여 IFN-γ의 산생을 유도하는 작용이 있음을 확인하였다. 문헌 [U. K. Laemmli in Nature, Vol.227, pp.680∼685 (1970)]에 보고된 방법에 준하여 정제 IL-18을 SDS-PAGE로 처리하여 18,500 ± 3,000 달톤에 상당한 위치에서 IFN-γ 유도활성을 가진 주밴드를 얻었다. 통상적인 크로마토포커싱법으로 측정한 이 IL-18의 등전점 (pI)은 4.9 ± 1.0이었다. PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A (미합중국의 Applied Biosystems사제의 장치)를 사용한 통상적인 분석에 의하여 IL-18은 배열표의 배열번호 9에 나온 아미노산 배열, 즉 배열표의 배열번호 8에 있어서 메티오닌 잔기가 N 말단에 연결된 아미노산 배열을 가지고 있음이 판명되었다.
실험 2: 인간 IL-18의 제조
본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제67,434/96호 명세서에 기재된 방법에 따라 급성 단구성 백혈병을 가진 남성 환자 유래의 인간 단구 세포 인 THP-1 세포 (ATCC TIB 202)를 갖 태어난 햄스터의 등쪽 피하조직에 각각 접종한 다음 3주 동안 사육하였다. 각각의 햄스터의 피하 조직에 생긴 중량 종양 덩어리를 약 15g씩 적출하여 매체중에 분산시켜 파쇄하였다. 세포 파쇄물로부터 얻은 폴리펩티드를 면역 친화성 크로마토그래피로 정제하여 정제 인간 IL-18을 한마리당 약 50ng의 수득량으로 얻었다.
마찬가지로 일본국 특허출원 제67,434/96호 명세서에 기재된 방법에 따라 정제 인간 IL-18의 생리활성 및 이화학적 성질을 다음과 같이 분석,측정하였다. 즉, 통상의 방법으로 건강한 공여자로부터 채취한 인간 임파구를 각기 상이한 농도의 인간 IL-18의 존재하에 배양하여 IL-18 투여량에 따라 IFN-γ를 산생시켰다. 인간 IL-18은 면역담당 세포로서의 임파구에 의하여 IFN-γ의 산생을 유도하는 생리활성을 가지고 있음이 판명되었다. 문헌 [U. K. Laemmli in Nature, Vol.227, pp.680∼685 (1970)] 에 보고된 방법에 준하여 정제 인간 IL-18을 2w/v% 디티오드레이톨을 환원제로 사용하는 SDS-PAGE로 처리하여 18,000 - 19,500 달톤에 상당한 위치에서 IFN-γ 산생 유도활성을 가진 주밴드를 얻었다. 일본국 특허출원 제67,434/96호 명세서에 기재된 펩티드 맵에 따라 인간 IL-18을 미합중국의 Sigma Chemical사 판매의 클로스트리페인(clostripain)으로 처리하여 폴리펩티드 단편을 얻은 다음, 이들 단편을 ODS-120T (일본국의 Tosoh사 판매의 칼럼)을 사용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)로 처리하여 분획하고, N 말단으로부터의 각 단편의 아미노산 배열을 분석한 결과, 배열표의 배열번호 10 내지 13에 나온 아미노산 배열을 확인하였다. 이들 아미노산 배열은 배열표의 배열번호 6에 나온 아미노산 148-157, 1-13, 45-58, 및 80-96과 완전히 일치하였다. 이들 데이타로부터 실험 2에서 얻은 인간 IL-18은 배열표의 배열번호 6에 나온 아미노산 배열을 가지고 있으며 배열표의 배열번호 5에 나온 부분 아미노산 배열을 모두 가지고 있음을 알 수 있다.
실험 3: 기능성 균등물의 제조
본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제20,906/97호 명세서에 기재된 방법에 따라 자율복제 가능한 재조합 DNA pCSHIGIF/MUT35를 제조하고, 이것을 배열표의 배열번호 6에 나온 시스테인 38, 68 및 76을 각각 세린, 세린 및 알라닌으로 치환한 인간 IL-18의 기능성 균등물을 코우드하는 DNA에 연결하였다. 디데옥시리보뉴클레오티드 배열 분석의 결과, 도 2에 나온 바와 같이 재조합 DNA에 있어서 배열표의 배열번호 14를 가진 DNA IGIF/MUT35는 문헌 [K. Henco et al., in Journal of Molecular Biology, Vol.185, pp.227∼260 (1985)]에 보고된 바와 같이 동일한 해독 프레임내에서의 인간 인터페론-α의 서브타입 α2b의 시그날 펩티드를 코우드하는 염기 배열의 하류에 연결되어 있고, 더 하류에는 단백질 합성을 위한 정지 코돈을 가지고 있음이 판명되었다. 배열표의 배열번호 14에 병기한 바와 같이 재조합 DNA에 의하여 코우드된 아미노산 배열은 배열표의 배열번호 6에 나온 시스테인 38, 68 및 76이 각각 세린, 세린 및 알라닌으로 치환된 배열표의 배열번호 6에 상응한 것이었다. 재조합 DNA에는 배열표의 배열번호 1 내지 4에 나온 모든 아미노산 배열과 배열표의 배열번호 5에서의 아미노산 5인 시스테인이 알라닌으로 치환된 배열표의 배열번호 5에 나온 아미노산 배열을 코우드하는 뉴클레오티드를 함유하고 있었다. 이들 아미노산 배열은 배열표의 배열번호 14에서의 뉴클레오티드 46-63, 88-105, 400-420, 151-165 및 214-228에 의하여 각각 코우드되어 있었다.
본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제20,906/97호 명세서에 기재된 방법에 따라 재조합 DNA pCSHIGIF/MUT35를 SV40 형질 전환 아프리칸 그린 몽키(green monkey) 유래의 주화세포인 COS-1 세포 (ATCC CRL 1650)속에 도입한 다음, 형질 전환 세포를 배양하였다. 배양물중의 산생된 폴리펩티드를 면역 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제하여 인간 IL-18의 정제된 기능성 균등물을 배양물 1㎖당 약 40ng의 수득량으로 얻었다. 일본국 특허출원 제20,906/97호 명세서에 기재된 방법에 따라 정제 기능성 균등물의 생리활성 및 이화학적 성질을 다음과 같이 분석,측정하였다. 즉, 인간 급성 골수성 백혈병 유래의 주화세포인 KG-1 세포 (ATCC CCL 246)를 각기 상이한 농도의 인간 IL-18의 정제된 기능성 균등물 존재하에 배양하여 IL-18의 농도에 따른 IFN-γ의 산생을 관찰한 결과, IL-18은 면역담당 세포로서의 KG-1 세포에 의하여 IFN-γ의 산생을 유도하는 생리활성을 가지고 있음이 판명되었다. 문헌 [U. K. Laemmli in Nature, Vol.227, pp.680∼685 (1970)]에 보고된 방법에 준하여 정제된 기능성 균등물을 환원제로서의 2w/v% 디티오드레이톨 존재하에 SDS-PAGE로 처리하여 18,000 - 19,500 달톤에 상당한 위치에서 IFN-γ 산생 유도활성을 가진 주밴드를 얻었다. PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A (미합중국의 Applied Biosystems사제의 장치)를 사용한 통상적인 분석에 의하여 기능성 균등물의 N 말단 영역은 배열표의 배열번호 14에 병기한 바와 같이 N 말단 영역의 아미노산 배열에 상응한 배열표의 배열번호 15에 나온 아미노산 배열을 가지고 있음이 판명되었다.
실험 4: 기능성 균등물의 제조
본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제20,906/97호 명세서에 기재된 방법에 따라 자율복제 가능한 재조합 DNA pCSHIGIF/MUT42를 제조하고, 이것을 배열표의 배열번호 6에 나온 시스테인 38, 68, 76 및 127을 각각 세린, 세린, 알라닌 및 세린으로 치환한 인간 IL-18의 기능성 균등물을 코우드하는 DNA에 연결하였다. 디데옥시리보뉴클레오티드 배열 분석의 결과, 도 3에 나온 바와 같이 재조합 DNA에 있어서 배열표의 배열번호 16에 나온 DNA IGIF/MUT42는 문헌 [K. Henco et al., in Journal of Molecular Biology, Vol.185, pp.227∼260 (1985)]에 보고된 바와 같이 동일한 해독 프레임내에서의 인간 인터페론-α의 서브타입 α2b의 시그날 펩티드를 코우드하는 염기 배열의 하류에 연결되어 있고, 더 하류에는 단백질 합성을 위한 정지 코돈을 가지고 있음이 판명되었다. 배열표의 배열번호 16에 병기한 바와 같이 재조합 DNA에 의하여 코우드된 아미노산 배열은 배열표의 배열번호 6에 나온 시스테인 38, 68, 76 및 127이 각각 세린, 세린, 알라닌 및 세린으로 치환된 배열표의 배열번호 6에 상응한 것이었다. 재조합 DNA에는 배열표의 배열번호 1 내지 4에 나온 모든 아미노산 배열과 배열표의 배열번호 5에서의 시스테인 5가 알라닌으로 치환된 배열표의 배열번호 5에 나온 아미노산 배열을 코우드하는 뉴클레오티드 배열을 함유하고 있었다. 이들 아미노산 배열은 배열표의 배열번호 16에서의 뉴클레오티드 46-63, 88-105, 400-420, 151-165 및 214-228에 의하여 각각 코우드되어 있었다.
본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제 20,906/97호 명세서에 기재된 방법에 따라 재조합 DNA pCSHIGIF/MUT42를 COS-1 세포속에 도입한 다음, 이 세포를 배양하였다. 배양물중의 산생된 폴리펩티드를 면역 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제하여 인간 IL-18의 정제된 기능성 균등물을 배양물 1㎖당 약 20ng의 수득량으로 얻었다. 일본국 특허출원 제20,906/97호 명세서에 기재된 방법에 따라 정제 기능성 균등물의 생리활성 및 이화학적 성질을 다음과 같이 분석,측정하였다. 즉, KG-1 세포를 각기 상이한 농도의 정제된 기능성 균등물 존재하에 배양하여 투여량에 따른 IFN-γ의 산생을 관찰한 결과, 기능성 균등물은 면역담당 세포로서의 KG-1 세포에 의하여 IFN-γ의 산생을 유도하는 생리활성을 가지고 있음이 판명되었다. 문헌 [U. K. Laemmli in Nature, Vol.227, pp.680∼685 (1970)]에 보고된 방법에 준하여 정제된 기능성 균등물을 환원제로서의 2w/v% 디티오드레이톨 존재하에 SDS-PAGE로 처리하여 18,000 - 19,500 달톤에 상당한 위치에서 IFN-γ 산생 유도활성을 가진 주밴드를 얻었다. PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A (미합중국의 Applied Biosystems사제의 장치)를 사용한 통상적인 분석에 의하여 기능성 균등물의 N 말단 영역은 배열표의 배열번호 16에 병기한 바와 같이 N 말단 영역의 아미노산 배열에 완전히 상응한 배열표의 배열번호 15에 나온 아미노산 배열을 가지고 있음이 판명되었다.
실험 5: 기능성 균등물의 제조
본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제185,305/96호 명세서에 기재된 방법에 따라 인간 IL-18을 코우드하는 염색체 DNA에 연결된 자율복제 가능한 재조합 DNA pBGHuGF를 얻었다. 디데옥시리보뉴클레오티드 배열 분석의 결과, 도 4에 나온 바와 같이 재조합 DNA에 있어서 인간 IL-18을 코우드하는 염색체 DNA, 즉 배열표의 배열번호 17에 나온 배열을 가진 DNA HuIGIF는 제한효소 Hind III에 의하여 제한부위의 하류에 연결되어 있음이 판명되었다. 배열표의 배열번호 17에 나온 바와 같이 염색체 DNA HuIGIF는 뉴클레오티드 83-1,453, 1,466-4,848, 4,984-6,317, 및 6,452-11,224에 위치하는 4개의 인트론(intron)에 의하여 엑슨 (exon)이 단편화된 11,464bp로 구성되어 있다. 이들 인트론을 제외한 나머지 뉴클레오티드 배열중에서 5' 말단으로부터 3-11,443의 뉴클레오티드는 인간 IL-18의 전구체를 코우드하는 부분이고, 4,866-4,983의 뉴클레오티드는 활성 인간 IL-18을 코우드하는 부분이다. 염색체 DNA는 배열표의 배열번호 1 내지 5를 코우드하는 뉴클레오티드 배열을 가지고 있는데, 이들 아미노산 배열은 배열표의 배열번호 17에서의 뉴클레오티드 4,911-4,928, 4,953-4,970, 11,372-11,392, 6,350-6,364 및 6,413-6,427에 의하여 각각 코우드된 것이다.
일본국 특허출원 제185,305/96호 명세서에 기재된 방법에 따라 중국 햄스터 난소 유래의 주화세포인 CHO-K1 세포(ATCC CCL 61)속에 재조합 DNA pBGHuGF를 도입한 다음 이들 세포를 배양하였다. 배양 상청액을 THP-1 세포 배양물로부터 제조한 세포 파쇄물의 상청액과 접촉시켜 폴리펩티드를 얻은 다음, 면역 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제함으로써 정제된 인간 IL-18을 배양물 1리터당 약 15mg의 수득량으로 얻었다. 일본국 특허출원 제185,305/96호 명세서에 기재된 방법에 따라 이 폴리펩티드의 생리활성 및 이화학적 성질을 다음과 같이 분석,측정하였다. 즉, 건강한 공여자로부터 채취한 인간 임파구를 인간 IL-18의 각기 상이한 농도에서 배양하여 정제 인간 IL-18 농도에 따라 IFN-γ를 산생시킨 결과, 인간 IL-18은 면역담당 세포로서의 임파구에 의하여 IFN-γ의 산생을 유도하는 생리활성을 가지고 있음이 판명되었다. 문헌 [U. K. Laemmli in Nature, Vol.227, pp.680∼685 (1970)]에 보고된 방법에 준하여 정제된 인간 IL-18을 환원제로서의 2w/v% 디티오드레이톨 존재하에 SDS-PAGE로 처리하여 18,000 - 19,500 달톤에 상당한 위치에서 IFN-γ 산생 유도활성을 가진 주밴드를 얻었다. 인간 IL-18의 N 말단 영역은 활성 IL-18에 대한 배열표의 배열번호 17에 나온 N 말단 영역에서의 아미노산 배열에 완전히 상응한 배열표의 배열번호 15에 나온 아미노산 배열을 가지고 있었다.
실험 6: 마우스 IL-18의 제조
0.5ml 용량의 반응관에 25mM 염화 마그네슘 8㎕, 10 × PCR 완충액 10㎕, 25mM dNTP mix 1㎕, 25단위/㎕의 amplitaq DNA 폴리메라아제 1㎕, 일본국 특허 공개 제27,189/96호 공보에 기재된 방법에 따라 파아지 DNA 클론으로부터 제조한 배열표의 배열번호 18의 뉴클레오티드 배열과 배열표의 배열번호 7에 나온 아미노산 배열을 가진 마우스 IL-18을 코우드하는 재조합 DNA 1ng, 및 배열표의 배열번호 7에 나온 N 말단 및 C 말단쪽에 인접한 아미노산 배열에 근거하여 화학합성한 뉴클레오티드 배열 5'-ATAGAATTCAAATGAACTTTGGCCGACTTCACTG-3'을 가진 센스 프라이머와 뉴클레오티드 배열 5'-ATAAAGCTTCTAACTTTGATGTAAGTT-3'를 가진 안티센스 프라이머를 각각 적당량을 가하고, 이 혼합액을 멸균 증류수로 체적 100㎕로 하였다. 이 용액을 통상의 방법으로 94℃에서 1분간, 43℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 실시하는 연속 인큐베이션을 3사이클 한 다음, 다시 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 실시하는 연속 인큐베이션을 40사이클하는 PCR 반응을 시켰다.
이 PCR반응에 의하여 제조한 생성물과 pCR-Script SK (+) (미합중국의 Stratagene Cloning Systems사 판매의 플라스미드 벡터)을 통상의 방법으로 DNA 리가아제를 함께 사용하여 재조합 DNA에 연결한 다음, XL-1 Blue MRF'Kan (미합중국의 Stratagene Cloning Systems사 판매의 대장균주)에 도입하여 형질 전환체를 얻었다. 이 형질 전환체를 50㎍/ml 앰피실린을 함유한 L-broth (pH 7.2)에 접종한 다음, 37℃에서 18시간 동안 진탕조건하에 배양하였다. 배양물을 원심분리하여 증식된 형질 전환체를 얻은 후, 통상적인 알칼리-SDS법으로 처리하여 재조합 DNA를 분리하였다. 분리한 재조합 DNA의 일부를 디데옥시리보뉴클레오티드 배열 분석법으로 분석한 결과, 재조합 DNA는 배열표의 배열번호 18에 나온 5' 말단 및 3' 말단에서 각각 Eco RI 및 Hind III의 제한부위를 가지고 있었고, 배열표의 배열번호 18에 병기한 바와 같이 아미노산 배열의 N 말단 및 C 말단의 바로 앞과 바로 뒤에 위치한 폴리펩티드 합성을 개시하는 메티오닌 코돈 및 폴리펩티드 합성을 종료하는 TAG 콘돈을 가진 DNA가 존재함을 판명하였다. 이 재조합 DNA는 배열표의 배열번호 1 내지 5에 나온 뉴클레오티드 배열을 가지고 있었다. 이들 아미노산 배열은 배열표의 배열번호 18에 나온 뉴클레오티드 46-63, 85-102, 394-414, 148-162 및 211-225에 의하여 코우드된 것이다.
이 재조합 DNA의 나머지 부분을 통상의 방법으로 Eco RI 및 Hind III의 제한효소로 절단하고, DNA LIGATION KIT VER 2 (일본국의 Takara Schuzo사 판매의 DNA ligation kit)을 사용하여 얻은 Eco RI-Hind III DNA 단편 0.1㎍과 제한효소로 전단해둔 pKK223-3 (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology사 판매의 플라스미드 벡터) 10ng을 16℃에서 30분간 인큐베이트하여 연결함으로써 자율복제 가능한 재조합 DNA pKGFMH2를 얻었다. 컴피턴트 셀법을 사용하여 재조합 DNA pKGFMH2로써 대장균 Y1090주 (ATCC 37197)를 형질 전환하고 수득한 형질 전환체 KGFMH2를 50㎍/ml 앰피실린 함유의 L-브로드 (pH 7.2)에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 진탕배양하였다. 배양물을 원심분리하여 증식된 형질 전환체를 채취한 다음, 이 형질 전환체의 일부에 통상적인 SDS-알칼리법을 적용하여 재조합 DNA pKGFMH2를 추출하였다. 디데옥시리보뉴클레오티드 배열분석을 한 결과, 도 5에 나온 바와 같이 배열표의 배열번호 18에 나온 뉴클레오티드 배열을 가진 KGFMH2 cDNA는 재조합 DNA pKGFMH2에서의 Tac 프로모우터의 하류에 연결되어 있음이 판명되었다.
오토클레이브 처리하여 멸균처리된 L-브로드 (pH 7.2)에 농도가 50㎍/ml되도록 앰피실린을 가하고 37℃로 냉각하여, 여기에 형질 전환체 KGFMH2를 접종한 다음, 37℃에서 18시간 배양하였다. 20리터 용량의 자아 퍼멘터(jar fermenter)에 상기와 동일한 신선한 배지를 18리터 넣고, 위와 마찬가지로 멸균처리한 다음, 여기에 앰피실린을 가하여 37℃로 냉각한 후 여기에 위에서 얻은 종배양물 1v/v%을 접종하고 37℃에서 8시간 통기교반 배양하였다. 수득한 배양물을 원심분리하여 배양된 세포를 채취한 다음 150mM 염화 나트륨, 16mM 인산수소 2나트륨 및 4mM 인산 2수소 나트륨을 함유한 혼합액 (pH 7.3) 중에 부유시키고 초음파 파쇄한 후 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거함으로써 상청액 약 2리터를 얻었다.
상청액 약 2리터에 황산 암모늄을 함유한 10mM 인산 완충액 (pH 7.3)을 40% 암모늄 포화도가 되도록 가하고, 생성한 침전을 원심분리하여 제거하였다. 상청액에 85% 암모늄 포화도가 되도록 황산 암모늄을 혼합하고 4℃에서 18시간 정치한 후 약 8,000rpm에서 30분간 원심분리하여 새로 생성된 침전을 얻었다. 수득한 침전을 1.5M 황산 암모늄을 함유한 10mM 인산 완충액 (pH 6.6)중에 총체적 약 1,300ml되도록 용해하고, 이 용액을 여과하여 PHENYL SEPHAROSE CL-6B (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology사 판매의 겔)을 약 800ml 충전한 칼럼에 부하한 후 칼럼을 상기와 동일한 신선한 완충액으로 세정하고 이 칼럼에 10mM 인산 완충액 (pH 6.6) 중에서 1.5M로부터 0M까지 감소하는 황산 암모늄의 직선 기울기 완충액을 SV (공간속도) 1.5에서 부하하였다. 황산 암모늄 농도 1M 부근에서 용출하는 획분을 채취하고 멤브레인 필터를 사용하여 농축한 후 10mM 인산 완충액 (pH 6.5)에 대하여 4℃에서 18시간 투석하였다. 투석액을 10mM 인산 완충액 (pH 6.5)으로 평형화해둔 DEAE-5PW (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology사 판매의 겔)을 약 55ml 충전한 칼럼에 부하하였다. 이 칼럼을 상기와 동일한 신선한 완충액으로 세정하고 이 칼럼에 10mM 인산 완충액 (pH 6.5)중에서 0M로부터 0.5M까지 증가하는 염화 나트륨의 직선 기울기 완충액을 SV 5.5에서 부하한 다음, 염화 나트륨 농도 0.2M 부근에서 용출하는 획분을 채취하였다. 그 후, 이들 획분을 한데 모아 위와 마찬가지로 농축하여 약 9ml가 되도록 한 후, PBS (인산 완충 식염수)에 대하여 4℃에서 18시간 투석하고, 이 투석액을 동일한 신선한 PBS로 평형화해둔 SUPERDEX 75 (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology사 판매의 겔)을 충전한 칼럼에 부하하였다. 이 칼럼에 상기와 동일한 신선한 PBS를 부하하여 IFN-γ 유도활성을 가진 획분을 채취하여 한데 모아 멤브레인 필터로 농축함으로서 정제 마우스 IL-18을 배양물 1리터당 약 350㎍의 수득량으로 얻었다.
일본국 특허 공개 제27,189/96호에 기재된 방법에 따라 이 정제 마우스 IL-18의 생리활성 및 이화학적 성질을 다음과 같이 분석,측정하였다. 즉, 통상의 방법으로터 채취한 마우스 비장 세포를 각기 상이한 마우스 IL-18의 농도에서 배양하여 마우스 IL-18의 농도에 따라 IFN-γ를 산생시킨 결과, 마우스 IL-18은 면역담당 세포로서의 비장 세포에 의하여 IFN-γ의 산생을 유도하는 활성을 가지고 있음이 판명되었다. 문헌 [U. K. Laemmli in Nature, Vol.227, pp.680∼685 (1970)] 에 보고된 방법에 준하여 정제된 인간 IL-18을 비환원성 조건하에서 SDS-PAGE 처리하여 19,000 ± 5,000 달톤에 상당한 위치에서 IFN-γ 유도활성을 가진 주밴드를 얻었다. 마우스 IL-18의 N 말단 영역은 배열표의 배열번호 18의 N 말단 영역에 상응한 배열표의 배열번호 19에 나온 아미노산 배열을 가지고 있었다.
실험 7에서는 본 발명에 의한 IL-18의 생리활성에 대하여 상세히 설명하고 실험 8에서는 IL-18의 세포 장해성에 대하여 설명한다.
실험 7: 생리활성
실험 7-1: GM-CSF 산생 유도
헤파린가 시린지(heparinized syringe)를 사용하여 건강한 지원자로부터 혈액을 채취하여 혈청 무함유의 RPMI 1640 배지 (pH 7.4)로써 2배로 희석하였다. 희석물을 피콜(ficoll)위에 피복하여 원심처리하고, 임파구를 회수하여 10v/v% 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 (pH 7.4)로 세정한 후, 동일한 신선한 배지중에 세포밀도 1 × 106개/ml되도록 부유시킨 다음, 12웰 마이크로플레이트에 세포 부유액을 각 웰당 2ml씩 나누어 넣었다.
10v/v% 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 (pH 7.4)를 사용하고, 실험 1의 방법으로 얻은 IL-18을 1㎍/ml 용액으로 제조한 다음, 상기한 마이크로플레이트에 각 웰당 20∼200㎕씩 나누어 넣었다. 이 마이크로플레이트에 다시 콘카나발린 A를 500㎕/ml 보충한 동일한 완충액을 각 웰당 10㎕씩 가한 다음, 5v/v% CO2인큐베이터에서 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양 완료후 각 웰의 상청액을 0.1ml씩 채취하여 통상적인 효소면역 시험법으로 GM-CSF 함량을 측정하였다. 이와 병행하여 IL-18 무함유의 배양계를 대조로 하여 위와 마찬가지로 처리하였다. 이들 데이타는 표 1에 나와 있다.
IL-18*(nM) GM-CSF 수득량(pg/ml)
0 510
0.7 2,150
2.8 3,050
5.6 3,950
(주) 부호 *는 콘카나발린 A 2.5㎍/ml 존재하에 배양계에 IL-18을 첨가한 것을 의미함.
표 1에 나온 결과로부터 면역담당 세포로서의 임파구는 보인자로서의 콘카나발린 A의 존재하에 IL-18과 접촉했을 경우, IL-18의 농도에 따라 GM-CSF를 산생하였음을 알 수 있다. 또한, 실험 2 내지 5의 방법으로 얻은 IL-18 및 그 기능성 균등물 모두가 위와 마찬가지로 단독으로 사용하더라도 GM-CSF 산생을 유도하였음을 확인하였다. 실험 6의 방법으로 제조한 IL-18에 대하여, 본 실험에서 사용한 인간 임파구 대신에 통상의 방법으로 마우스로부터 제조한 비장 세포를 사용한 것 외에는 실험 7-1의 방법에 따라 시험한 결과, IL-18 역시 GM-CSF 산생을 유도하였음이 판명되었다.
실험 7-2: 용골세포 형성 억제
실험 7-2(a)
문헌 [T. J. Martin and K. W. Ng in Journal of Cellular Biochemistry, Vol.56, pp.357∼366 (1994)]에 보고된 바와 같이 조혈성 간세포(幹細胞) 유래의 용골세포성 전구체 세포에 조골(造骨)세포 또는 골수 기질(stroma)을 접촉시켜 일반적으로 용골세포성 전구체 세포를 성숙형 용골세포로 분화시키는 것이 필요하다고 생각된다. 문헌 [G. D. Roodman in Endocrine Reviews, Vol.17, No.4, pp.308∼332 (1996)]에 기재된 바와 같이 용골세포는 다핵(多核)세포의 특징을 가지고 있고 타르타르산 내성 산성 포스파타아제(이하, 간단히 TRAP라 함) 활성과 칼시토닌 수용체를 가지고 있는 것으로 널리 인식되어 있다. 문헌 [Nobuyuki UDAGAWA et al., in Journal of Experimental Medicine, Vol.182, pp.1,461∼1,468 (1995)]에 보고된 조골세포와 골수세포로 된 공배양계에 있어서 이들 세포는 1α,25-디히드록시비타민 D3, 프로스태그란딘 E2, 부신피질 호르몬, 인터로이킨 1, 인터로이킨 6 및 인터로이킨 11 등의 각종 인자에 작용하여 용골세포 유사세포(osteoclast-like cells)(이하, 간단히 OCL라 함)를 형성한다. 형성된 OCL은 생체내에서의 용골세포의 특징을 가지므로 공배양계는 생체내에서의 용골세포 형성 과정을 생체외에서도 잘 반영한다. 이 계를 사용하여 용골세포 형성 및 용골세포 형성 억제제에 대한 실험을 할 수 있다.
본 발명에 의한 IL-18의 용골세포 형성 억제 활성에 대해서는 상기한 공배양계를 사용하여 조사하였다. 이 실험에서 사용된 조골세포는 통상의 방법으로 갖 태어난 마우스 두개관(calvaria)을 0.1w/v% 콜라게나아제(오스트랠리아국의 Worthington Biochemical사 판매) 및 0.2w/v% 디스파아제(dispase)(일본국의 Godo Shusei사 판매)로 처리하여 제조하였다. 골수세포는 통상의 방법으로 성숙한 마우스로부터 제조하였다. 음성 대조로서는 1차 세포 배양물중의 조골세포 2 × 104개와 골수세포 5 × 105개를, 10v/v% 소태아 혈청이 보충된 α-MEM배지 (이하, 실험 4-2에서는 배지라 함)를 0.4ml/웰씩 함유한 48웰 마이크로플레이트의 각 웰에서 37℃에서 7일 동안 5v/v% CO2인큐베이터중에서 공배양하였다. 양성대조로서는 상기한 두가지 종류의 세포를 1α,25-디히드록시비타민 D3(일본국의 Wako Pure Chemicals사 판매)를 10-8M 및 프로스태그란딘 E2(미합중국의 Sigma Chemical사 판매)를 10-7M 함유하는 다른 웰에서 배양한 것 이외는 음성대조에서와 마찬가지로 공배양하였다. 상기한 두가지 종류의 세포를, 양성대조에서 사용된 것과 동일한 농도로 1α,25-디히드록시비타민 D3(일본국의 Wako Pure Chemicals사 판매) 및 프로스태그란딘 E2(미합중국의 Sigma Chemical사 판매)를 함유하고, 그리고 실험 6의 방법으로 제조한 IL-18을 농도 0.01∼10ng/ml로 함유한 다른 웰에서 배양한 것 외에는 양성대조에서와 마찬가지로 공배양하였다. 각각의 공배양계에 있어서 각 웰에서의 배지를 각각의 배양 개시후 3일째에 공배양계에 있어서 사용된 것과 동일한 신선한 배지로 교체하였다. 문헌 [Nobuyuki UDAGAWA in Journal of Experimental Medicine, Vol.182, pp.1,461∼1,468 (1995)]에 기재된 방법에 따라 각각의 배양 개시후 6일째의 세포를 TRAP 활성에 근거하여 고정화하고 염색한 다음, 각 웰에서의 염색된 세포(이하, 간단히 TRAP-양성세포라 함)의 수를 구하였다. 실험 4-2에 있어서 각각의 공배양계에 대하여 동일 조건하의 4개조의 웰을 만들어 각 계에 있어서의 각 웰당의 TRAP-양성 세포의 평균값을 계산하였다. 그 결과는 표 2에 나와 있다.
IL-18(ng/ml) 용골세포 형성인자*1 각 웰당의 TRAP-양성세포의 수*2
0 － 2
0 ＋ 110
0.01 ＋ 114
0.1 ＋ 111
0.5 ＋ 106
1 ＋ 63
2 ＋ 29
4 ＋ 12
8 ＋ 2
10 ＋ 2
(주)*1 : 부호 ＋ 및 －은 각각 10-8M 1α,25-디히드록시 비타민 D3및 10-7M 프로스태그란딘 E2함유 및 무함유의 공배양계를 나타냄.
*2 : 동일 조건하에서 배양시킨 4개조의 웰의 데이터의 평균값을 나타냄.
표 2에 나온 바와 같이 음성대조에서는 TRAP-양성세포의 형성이 실질적으로 관찰되지 않았으나 양성대조에서는 명확한 형성이 관찰되고 있다. 공배양계, 즉 IL-18을 추가로 보충한 양성대조에 있어서 IL-18의 농도에 따라 TRAP-양성세포의 형성이 억제되었고, 최대억제, 즉 음성대조에서의 경우와 동일한 정도의 레벨은 8ng/ml 또는 그 이상의 IL-18에서 나타나고 있다. 이들 데이타로부터 IL-18은 생체외에서의 확실한 OCL형성 억제 활성을 가지며 용골세포 형성도 억제함을 명확히 알 수 있다.
실험 7-2(b)
이상 설명한 바와 같이 실험 7-2에서 사용된 공배양계에서의 용골세포 유사 세포의 형성을 유도하는 인자들이 존재함을 확인하였다. 따라서 본 실험 7-2(b)에서는 실험 7-2(a)에서 관찰된 용골세포 형성에 대한 IL-18의 억제활성이 몇가지 인자에 대해 특이적인가의 여부에 대해 조사하였다. 즉, 10-8M 1α,25-디히드록시비타민 D3, 10-7M 프로스캐그란딘 E2, 200ng/ml 부갑상선 호르몬, 100ng/ml 인터로이킨 1 또는 20ng/ml 인터로이킨 11을 보충한 배지를 사용한 것외에는 실험 7-2(a)에서의 음성대조에서 사용한 것과 동일한 방법으로 용골세포 유사 세포를 배양하였다. 이들 배양계는 양성대조용의 것으로 하였다. 이와 병행하여 동일한 농도의 상기한 인자들중의 어느 한가지에 추가하여 실험 6의 방법으로 얻은 IL-18을 10ng/ml함유한 배지를 사용한 외에는 양성대조에서 사용한 것과 동일한 방법으로 다른 웰중에서 세포를 배양하였다. 배양 종료후에 각 웰에서의 TRAP-양성세포의 수를 구하여 실험 7-2(a)에서와 마찬가지로 그 수를 비교하였다. 그 결과는 표 3에 나와 있다.
용골세포 형성인자*1 IL-18*2 각 웰당 TRAP-양성세포의 수*3
D3(10-8M) － 94
＋ 3
PGE2(10-7M) － 77
＋ 3
PTH (200ng/ml) － 63
＋ 3
IL-11 (100ng/ml) － 84
＋ 3
IL-1 (20ng/ml) － 71
＋ 3
(주)*1 : D3, PGE2, PTH, IL-11 및 IL-1은 각각 괄호 속에 나타낸 각각의 작은 농도가 되도록 각 웰에 첨가된 1α,25-디히드록시비타민 D3, 프로스태그란딘 E2, 부갑상선 호르몬, 인터로이킨-11 및 인터로이킨-1을 나타냄.
*2 : 부호 +는 농도 10ng/ml가 되도록 IL-18을 웰에 참가한 것을 의미하고, 부호 -는 IL-18을 첨가하지 않았음을 의미함.
*3 : 동일한 조건하에서 배양된 4개조의 웰의 데이타의 평균값을 나타냄.
표 3에 나온 바와 같이 각각의 양성대조에서는 TRAP-양성세포의 명확한 형성이 관찰되었으나, IL-18 존재하에서는 그 형성이 거의 완벽하게 억제되었다. 이것은 IL-18이 용골세포 형성 관련 인자들과는 관계없이 광범위하고도 전반적인 용골세포 형성 억제활성을 가지고 있다는 것을 강력히 시사하는 것이다.
실험 7-2(C)
실험 7-2(a) 및 7-2(b)에서 확인된 IL-18에 의한 용골세포 형성 억제가 IL-18에 의해 유도된 GM-CSF의 작용에 기인한 것인가의 여부에 대하여 조사하였다. 양성대조와 음성대조에 있어서 실험 7-2(a)에서 사용된 것과 동일한 공배양계를 사용하였다. 다른 웰을 사용하고, 양성대조에서 사용된 것과 동일한 농도의 1α,25-디히드록시비타민 D3와 프로스태그란딘 E2를 보충하고, 또한 (i) 항(抗)마우스 GM-CSF 폴리클로날 항체(미합중국의 RD Systems사 판매)를 10㎍/ml, (ii) 실험 6의 방법으로 얻은 IL-18을 10ng/ml, (iii) 상기 (ii)에 더하여 10㎍/ml의 항마우스 폴리클로날 항체, (iv) 마우스 GM-CSF(미합중국의 RD Systems사 판매)를 0.1ng/ml, 또는 (v) 상기 (iv)에 더하여 항마우스 GM-CSF 폴리클로날 항체 10㎍/ml을 보충한 배지를 사용한 이외는 양성대조에서 사용한 방법과 마찬가지로 하여 조골세포와 골수세포의 공배양계를 배양하였다. 배양 종료후, 각 웰의 TRAP-양성세포의 수를 구하여 실험 7-2(a)에서와 마찬가지로 그 수를 비교하였다. 표 4에 나온 데이타에 있어서 부호 i내지 v는 대조계 이외의 공배양계에 사용된 것들과 일치한다.
배양계*1 용골세포형성인자*2 IL-18*3 GM-CSF*4 항-GM-CSF항체*5 각 웰당 TRAP-양성세포의 수*6
N － － － － 3
P ＋ － － － 122
i ＋ － － ＋ 112
ii ＋ ＋ － － 3
iii ＋ ＋ － ＋ 111
iv ＋ － ＋ － 4
v ＋ － ＋ ＋ 106
(주)*1 : 부호 N 및 P는 각각 음성대조 및 양성대조를 나타내고, 부호 i내지 v는 사용된 다섯가지 공배양계에서의 것들과 대응함.
*2 : 부호 +는 각각 농도 10-8M 및 10-7M이 되도록 1α,25-디히드록시비타민 D3와 프로스태그란딘 E2를 각각 웰에 첨가한 것을 의미하고, 부호 -는 이들 화합물을 첨가하지 않았음을 의미함.
*3 : 부호 +는 농도 10ng/ml가 되도록 IL-18을 웰에 첨가하였음을 의미하고, 부호 -는 IL-18을 첨가하지 않았음을 의미함.
*4 : 부호 +는 농도 0.1ng/ml가 되도록 GM-CSF를 웰에 첨가하였음을 의미하고, 부호 -는 GM-CSF를 첨가하지 않았음을 의미함.
*5 : 부호 +는 농도 10㎍/ml가 되도록 항 GM-CSF 폴리클로날 항체를 웰에 첨가하였음을 의미하고, 부호 -는 폴리클로날 항체를 첨가하지 않았음을 의미함.
표 4에 나온 바와 같이 TRAP-양성세포의 형성은 IL-18에 의해 거의 완전히 억제되었으나 [공배양계 (ii) 참조], 항마우스 폴리클로날 항체의 첨가에 의해서는 억제는 거의 완전히 저해되고 있다 [공배양계 (iii) 참조]. 마우스 GM-CSF는 IL-18과 유사한 TRAP-양성세포 형성 억제활성을 나타내고 [공배양계 (iv) 참조], 항마우스 GM-CSF 폴리클로날 항체의 첨가에 의해서는 억제는 거의 완전히 저해되고 있다[공배양계 (v) 참조]. 항마우스 GM-CSF 폴리클로날 항체만을 사용하면 TRAP-양성세포의 형성에 전혀 영향을 주지 않았다 [공배양계 (i) 참조]. 이들 데이타는 IL-18에 의한 용골세포 형성 억제는 IL-18에 의해 유도된 GM-CSF의 작용에 기인한 것이라는 것을 강력히 시사하고 있다.
실험 8: 급성 독성 시험
실험 1 내지 6의 방법으로 얻는 IL-18중의 한가지를 8주령의 마우스를 사용하여 통상의 방법으로 경피주사, 경구투여 또는 복강내 투여한 결과, 투여경로와는 관계없이 이들 IL-18은 마우스에 있어서 LD50이 약 1mg/kg 이상이었다. 이들 데이타는 IL-18을 인간을 비롯한 온혈동물을 위한 심각한 부작용을 일으키지 않는 의약품으로서 함유시킬 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.
문헌 [Nikkei Biotechnology Annual Report 1996, pp.498∼499 (1995), published by Nikkei BP Publisher, Tokyo, Japan (1995)]에 기재된 바와 같이 IL-18에 의해 유도된 GM-CSF는 아직까지 일본국내에서 임상적으로 사용되지 않았지만 미합중국과 유럽에서는 임상적으로 적용되고 있다. 이 사실은 IL-18이 실질적으로 심각한 부작용이 전혀 없다는 것을 말하는 것이다. 또한 이들 사실로부터 본 발명에 의한 용골세포 형성 억제제를 인간을 비롯한 일반적인 온혈동물에게 계속투여하여 용골세포 형성을 유도하여 심각한 부작용을 유발함이 없이 용골세포 관련 각종 질환에 대해 양호한 치료 및/또는 예방효과를 발휘할 수 있음을 알 수 있다.
아래의 각 실시예에서 본 발명의 용골세포 형성 억제효과에 대해 설명한다.
실시예 1: 액제
안정제로서 1w/v% 인간 혈청 알부민을 함유한 생리 식염수에 실험 1 내지 6의 방법으로 얻은 IL-18 한가지를 농도 2mg/ml되도록 용해한 후, 수득한 용액을 통상의 방법으로 멤브레인 여과에 의하여 멸균하여 액제를 얻었다.
이 액제는 안정성이 우수하며 세포 배양의 첨가성분으로서, 또한 뼈흡수 조절 및 용골세포 관련 각종 질환에 있어서 과칼슘혈증, 파골세포종, 골다공증 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 주사제, 점안제 또는 점비제 등으로서 유용하다.
실시예 2: 건조 주사제
안정제로서 1w/v% 정제 젤라틴을 함유한 생리 식염수 100ml에 실험 1 내지 6의 방법으로 얻은 IL-18 한가지를 50mg 용해한 후, 통상의 방법으로 멤브레인 여과에 의하여 멸균하고 바이알병에 1ml씩 나누어 넣고 동결건조한 후 캡으로 밀봉하였다.
이 제품은 안정성이 우수하며 세포 배양의 첨가성분으로서, 또한 뼈흡수 조절 및 용골세포 관련 각종 질환에 있어서 과칼슘혈증, 파골세포종, 골다공증 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 건조 주사제로서 유용하다.
실시예 3: 건조 주사제
안정제로서 1w/v% 트레할로오스를 함유한 생리 식염수 100ml에 실험 1 내지 6의 방법으로 얻은 IL-18 한가지를 50mg 용해한 후, 통상의 방법으로 멤브레인 여과에 의하여 멸균하고 바이알병에 1ml씩 나누어 넣고 동결건조한 후 캡으로 밀봉하였다.
이 제품은 안정성이 우수하며 세포 배양의 첨가성분으로서, 또한 뼈흡수 조절 및 용골세포 관련 각종 질환에 있어서 과칼슘혈증, 파골세포종, 골다공증 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 건조 주사제로서 유용하다.
실시예 4: 연고제
멸균 증류수에 HIVIS WAKO GEL 104 (일본국의 Wako Pure Chemical Industries사 판매의 카르복시비닐폴리머) 및 고순도 트레할로오스를 각각 농도 1.4w/w% 및 2.0w/w%되도록 용해하고, 이 용액에 실험 1 내지 6의 방법으로 얻은 IL-18 한가지를 균일히 혼합한 다음, pH 7.2로 조정하여 제품 1g당 IL-18을 약 1mg 함유하는 페이스트를 얻었다.
이렇게 하여 제조한 제품 각각은 퍼짐성과 안정성이 우수하며 뼈흡수 조절 및 용골세포 관련 각종 질환에 있어서 과칼슘혈증, 파골세포종, 골다공증 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 연고제로서 유용하다.
실시예 5: 정제
FINETOSE (일본국의 林原생물화학연구소 판매의 무수결정 α-말토오스 분말)에 실험 1 내지 6의 방법으로 얻은 IL-18 한가지와 LUMIN [즉, 균일히 혼합하고, 수득되는 혼합물을 종래의 방법으로 타정하여 제품 1정 (약 200mg) 당 IL-18 한가지와 LUMIN을 각각 약 2mg 함유하는 정제를 얻었다.
섭취성, 안정성이 우수하고 세포 부활 작용도 가진 이 제품은 뼈흡수 조절 및 용골세포 관련 각종 질환에 있어서 과칼슘혈증, 파골세포종, 골다공증 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 정제로서 유용하다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명에 의한 용골세포 형성 억제제는 용골세포 형성을 효과적으로 억제하므로 이 억제제를 세포 배양의 첨가성분으로서, 또한 뼈흡수 조절 및 용골세포 관련 각종 질환에 있어서 과칼슘혈증, 파골세포종, 골다공증 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약으로서 유용하다.
따라서 이러한 유용한 활성과 기능을 가진 본 발명은 이 분야에 크게 기여할 수 있는 의의가 있는 발명이다.
배 열 표
(1) 배열번호 (SEQ ID NO:) 1의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 6 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : 중간부 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 1 :
Asn Asp Gln Val Leu Phe
1 5
(2) 배열번호 (SEQ ID NO:) 2의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 6 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 중간부 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 2 :
Phe Glu Asp Met Thr Asp
1 5
(3) 배열번호 (SEQ ID NO:) 3의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 7 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : 중간부 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 3 :
Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys
1 5
(4) 배열번호 (SEQ ID NO:) 4의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 5 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 중간부 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 4 :
Met Tyr Lys Asp Ser
1 5
(5) 배열번호 (SEQ ID NO:) 5의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 5 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 중간부 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 5 :
Ser Thr Leu Ser Cys
1 5
(6) 배열번호 (SEQ ID NO:) 6의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 6 :
(7) 배열번호 (SEQ ID NO:) 7의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 7 :
(8) 배열번호 (SEQ ID NO:) 8의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 배열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 생물명 : 인간
(G) 세포의 종류 : 간장
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재 위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 8 :
(9) 배열번호 (SEQ ID NO:) 9의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 11 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : N 말단 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 9 :
(10) 배열번호 (SEQ ID NO:) 10의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 10 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : C 말단 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 10 :
(11) 배열번호 (SEQ ID NO:) 11의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 13 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : N 말단 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 11 :
(12) 배열번호 (SEQ ID NO:) 12의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 14 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : 중간부 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 12 :
(13) 배열번호 (SEQ ID NO:) 13의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 17 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : 중간부 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 13 :
(14) 배열번호 (SEQ ID NO:) 14의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 배열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재 위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 14 :
(15) 배열번호 (SEQ ID NO:) 15의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 10 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : N 말단 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 15 :
(16) 배열번호 (SEQ ID NO:) 16의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 배열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재 위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 16 :
(17) 배열번호 (SEQ ID NO:) 17의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 11464 염기쌍
(B) 배열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : genomic DNA
(vi) 기원 :
(A) 생물명 : 인간
(G) 세포의 종류 : 태반
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : 5' UTR
(B) 존재 위치 : 1..3
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(A) 특징을 나타내는 기호 : leader peptide
(B) 존재 위치 : 4..82
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : intron
(B) 존재 위치 : 83..1453
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(A) 특징을 나타내는 기호 : leader peptide
(B) 존재 위치 : 1454..1465
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : intron
(B) 존재 위치 : 1466..4848
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(A) 특징을 나타내는 기호 : leader peptide
(B) 존재 위치 : 4849..4865
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재 위치 : 4866..4983
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : intron
(B) 존재 위치 : 4984..6317
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재 위치 : 6318..6451
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : intron
(B) 존재 위치 : 6452..11224
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재 위치 : 11225..11443
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : 3' UTR
(B) 존재 위치 : 11444..11464
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 17 :
(18) 배열번호 (SEQ ID NO:) 18의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 배열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : cDNA to mRNA
(vi) 기원 :
(A) 생물명 : 마우스
(G) 세포의 종류 : 간장
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재 위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 18 :
(19) 배열번호 (SEQ ID NO:) 19의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 9 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(v) 단편형 : N 말단 단편
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 19 :
(20) 배열번호 (SEQ ID NO:) 20의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 20 :
(21) 배열번호 (SEQ ID NO:) 21의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 21 :
(22) 배열번호 (SEQ ID NO:) 22의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 22 :
(23) 배열번호 (SEQ ID NO:) 23의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 23 :
(24) 배열번호 (SEQ ID NO:) 24의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 24 :
(25) 배열번호 (SEQ ID NO:) 25의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 25 :
[원문 56 페이지 위쪽]
(26) 배열번호 (SEQ ID NO:) 26의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 26 :
(27) 배열번호 (SEQ ID NO:) 27의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 27 :
(28) 배열번호 (SEQ ID NO:) 28의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 배열의 길이 : 157 아미노산
(B) 배열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 배열의 종류 : 펩티드
(xi) 배열번호 (SEQ ID NO:) 28 :

Claims (11)

  1. 인터로이킨-18 또는 그 기능성 균등물을 함유하는 용골세포 형성 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인터로이킨-18은 부분 아미노산 배열로서 배열표의 배열번호 1, 2 및 3에 나온 아미노산 배열을 포함하는 억제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인터로이킨-18은 부분 아미노산 배열로서 배열표의 배열번호 4 및 5에 나온 아미노산 배열을 포함하는 억제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인터로이킨-18은 배열표의 배열번호 6에 나온 아미노산 배열을 포함하는 억제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인터로이킨-18은 인간 기원의 것인 억제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인터로이킨-18은 배열표의 배열번호 7에 나온 아미노산 배열을 포함하는 억제제.
  7. 제1항에 있어서, 억제제가 용골세포 관련 각종 질환의 치료제인 억제제.
  8. 제1항에 있어서, 안정제로서 단백질, 완충제 또는 당질을 함유하는 억제제.
  9. 제1항에 있어서, 억제제가 액상, 페이스트상 또는 고상인 억제제.
  10. 제1항에 있어서, 상기 인터로이킨-18을 0.000002∼100w/w% 함유하는 억제제.
  11. 제1항의 억제제를 용골세포 관련 질환을 가진 환자에게 1회당 약 0.5㎍ 내지 100mg의 투여량으로 하여 1일 2배 내지 6배 또는 1주 2배 내지 10배를 1일 내지 1년간 투여하는 용골세포 관련 질환의 치료 및/또는 예방방법.
KR1019980005963A 1997-02-25 1998-02-25 파골(破骨)세포 형성 억제제 KR100520723B1 (ko)

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