TW570801B - Osteoclastgenic inhibitory agent - Google Patents

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570801 A7 __五、發明説明彳) 發明之背景資料 發明領域 本發明關於一種蝕骨細胞增生抑制劑，其含有間白素 —1 8 ( inter leukin-18，此後簡寫爲 '、I L 一 其功能性同等物。 8 或 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 先前技藝的敘述 骨母細胞的骨形成 康的活體內是維持良好 骨組織取代時，不會改 持在正常狀態。此現象 色，如將血鈣濃度控制 失，特別是當骨吸收程 病和其他疾病可能被誘 活體內骨吸收作用完整 明更是受到極大關注。 然而，蝕骨細胞形 已發現間白素1是做爲 這是因爲和活體內各種 被啓動者和抑制者之間 ，從科學和臨床觀點來 生抑制劑。 作用和蝕骨細胞的骨吸收作用在健 的平衡。使得當舊的骨組織被新的 變原來的骨頭形狀，而將骨組織保 在維持活體恆定性上扮演一重要角 在一想要的範圍之內。一旦平衡喪 度超過骨形成程度時，骨頭相關疾 發。因此，基於科學和臨床意義。 機制的闡明，特別是蝕骨細胞的闡 成的機制仍未完整地被闡明，即使 啓動者和間白素4是做爲抑制者。 現象一樣’蝕骨細胞的形成作用是 緊密且複雜的關係所控制。基於此 看’亟欲建立一有效的蝕骨細胞增 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4- 項

570801 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明έ ) 本發明的槪要 本發明的目標是提供一新型和有效的蝕骨細胞增生抑 制劑。爲了解決本目標，本發明者致力硏究於在免疫系統 中做爲溝通傳達物質的其中一種組織介素一 I L - 1 8。 它可誘導對於免疫活性細胞而言是一重要生物活性物質的 干擾素—7' ( interferon-7"，此後縮寫爲〜I FN — 7〃 ） ，和顆粒性白血球/巨噬細胞群刺激因子（granulocyte/ma crophage colony-stimulating factor，此後縮寫爲、、G Με S F 〃） 的製造 ，和 增進細 胞毒性 和誘導 殺死細 胞的形 成。I L 一 1 8被描述爲干擾素一 r誘發因子的報導請參 閱Haruki OKAMURA發表於日本專利公開公報編號2 7， 1 8 9 1 9 6 和 1 9 3，0 9 8/9 6，和 Nature，Vol.378. Νο·6552，ρρ.88-9 1 ( 1 995)，然後依照 Shimpei USHIO et al.， the Journal of Immunology，Vol.l56，ρρ·4274-4279(1996)的 提議稱爲I L — 18。 本發明者發現一特殊基因，具有抑制體外的鈾骨細胞 從蝕骨細胞前驅細胞形成的能力，並且可專一性地在源自 於老鼠骨髓瘤的基質細胞中大量表現。他們進一步詳細分 析顯示（i )可編碼I L 一 18的基因包含SEQ ID N 〇 : 7做爲一核心序列，（i i ) I L 一 1 8和其功 能性同等物可有效抑制蝕骨細胞生成，和（i i i )此抑 制作用主要是由I L — 1 8誘發和產生的GM- C S F的 作用。 基於這些發現，本發明者藉由含有I L - 1 8或其功 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :裝·

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -5- 570801 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明4 ) 能性同等物做爲有效成份的蝕骨細胞增生抑制劑而達成了 本發明的目標。 附圖的簡要敘述 第1圖顯I重組DNA— p KG F HH 2的結構。 第2圖顯示重組DNA— pCSH I G I F/MUT 3 5的結構。 第3圖顯示重組DNA — pCSH I G I F/MUT 4 2的結構。 第4圖顯不重組DNA - p B GH u G F的結構。 第5圖顯示重組D N A - p K G F Μ Η 2的結構。 在這些圖中，KGFHH2 cDNA意指可編碼如 本發明 IL— 18 的 cDNA; IGIF/MUT35 意 指可編碼如本發明I L _ 1 8的D N A ; I G I F / MUT42意指可編碼如本發明IL一18的DNA; H u I G I F意指可編碼如本發明I L — 1 8的染色體 DNA ； KGFMH2 c D Ν Α意指可編編如本發明 IL 一 18的cDNA; 5S意指5S核糖體RNA的基 因；Ptac意指tac啓動子；rrnBTlT2意指 核糖體R Ν A操縱子的終止區域；A m p R意指抗氨苄青 黴素基因；pBR3 2 2 or i意指大腸桿菌複製起始點 ;C Μ V意指細胞巨大性病毒；I F N s s意指可編碼人 類干擾素α a 2 b亞型的訊號胜肱的核苷酸序列。 請 先 閱 讀 背 I& 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6 - 570801 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明$ ) 代半胱胺酸的不同胺基酸並不限定於任何種類，只要含有 不同胺基酸取代的胺基酸序列所形成的多胜肽具有誘發免 疫活性細胞在存在或不存在適當輔因子下，製造I F N - r的活性，如含有S E Q ID N〇s : 1 ，2和4做 爲一致性部分胺基酸序列的野生型多胜肽，和穩定性明顯 高於野生型多胜肽。不同的胺基酸包括絲胺酸，蘇胺酸， 丙胺酸，纈胺酸，亮胺酸，異亮胺酸，組織胺酸，酪胺酸 ，苯丙胺酸，白胺酸和甲流胺酸，其中最適宜的胺基酸是 絲胺酸或丙胺酸。含有S E Q ID N〇s · 1 ，2和 4做爲一致的部分胺基酸序列且其中一或更多個半胱胺酸 被不同胺基酸取代的胺基酸序列具體實例是含有S E Q ID NO 6或7的野生型多胜肽。SEQ ID N 0 :6含有的半胱胺酸分別位於從N端算起第38，68， 76和127位置。SEQ ID N〇：7含有的半胱 胺酸分別位於從N端算起第7，7 5和1 2 5位置。這些 多胜肽包括含有SEQ ID N〇s:20—26任一 胺基酸序列的多胜肽，其係源自於含S E Q ID N 0 :6的野生型多胜肽；含有SEQ ID NO 27或 2 8胺基酸序列的多胜肽，其係源自於含S E Q ID N〇：7胺基酸序列的野生型多胜肽，和含有源自於 S E Q ID N〇s ·· 2 0 — 2 8任一胺基酸序列，藉 由添加，去除和/或取代一或更多個胺基酸於和/或除了 半胱胺酸已被取代的位置且保留想要的生物活性和穩定性 的多胜肽。 ''一或更多個胺基酸〃意指利用一般方法如位 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -8 - 570801 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明$ ) 置直接突變法可通常加入，去除或取代的胺基酸數目。含 有s E Q ID N〇S : 2 0 — 2 8任一序列的多胜肽 所擁有的穩定性和生物活性明顯高於野生型多胜肽。 本發明中所指的功能性同等物進一步包括I L - 1 8 的糖化多胜肽和以上的多胜肽。任何一種的I L — 1 8和 其功能性同等物，在本發明中，二者都包括且意指爲、、 I L 一 1 8 〃 ，除非有特別說明，都可爲本發明所使用而 不論其來源，它們的製備係從天然來源如細胞培養分離和 使用重組D N A技術及胜肽合成法進行人工合成。 以經濟觀點，使用重組D N A技術方法較有利。一般 而言’將可編碼I L 一 1 8的D N A送入源自於微生物， 植物和動物的適當宿主以形成轉型物，然後以一般方式在 營養培養基內培養轉型物，並且使用純化組織介素的一般 方式純化培養物將可獲得到所想要的I L - 1 8。如以上 的任何一種D N A都可使用，只要它們含有可編碼I L 一 1 8的D N A，並且基於本蝕骨細胞增生抑制劑所使用的 目的或所使用的重組D N A技術而可適宜地被篩選。例如 ，由本發明申請者在日本專利公開公報編號 193，098/96，231，5 98/96 和 2 7，1 8 9 / 9 6所發表製造I L — 1 8的詳細方法， 其係培養已送入可編碼老鼠或人類I L 一 1 8的c DNA 的轉型微生物；和由本發明申請者在日本專利公開公報編 號1 8 5，3 0 5 / 9 6所發表製造人類I L — 1 8的詳 細方法，其係培養已送入可編碼人類I L - 1 8的染色體 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -9 - 570801 A7 B7 五、發明説明ΐ ) D Ν Α的轉型動物細胞。本發明申請者在日本專利公開公 報編號2 0 ，9 0 6 / 9 7發表詳細製造I L 一 1 8的方 法，其係培養已送入可編碼人類I L - 1 8功能性同等物 的D N A的轉型動物細胞。 以上所提的重組D N A技術具有經濟優點，但決定於 所使用的宿主和D N A，因此所獲得的I L 一 1 8可能與 活體內製造的I L - 1 8在物化特性和功能上有所不同。 由本發明申請者發表的日本專利公開公報編號 6 7，4 3 4 / 9 6係使用已建立的人類細胞株做爲天然 來源製備I L — 1 8，和本發明申請者於曰本專利公開公 報編號2 1 3 ，2 6 7 / 9 6發表的使用間白素一 1 /3 — 轉換酶製備I L 一 1 8。這些I L 一 1 8製備物具有與活 體中製造的I L 一 1 8相同或相等的物化特性和功能，並 且產率是稍爲較低。然而，此種I L 一 1 8具有一優點是 :當它們做爲藥物投予溫血動物（包括人類）時，它具有 較小的副作用。當使用本發明申請者於日本專利公開公報 編號2 3 1 ，5 9 8 / 9 6所發表的使用專一性抗I L 一 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 8單株抗體純化方法，可以較少的勞力和花費得到相當 高純度的I L — 1 8。 本蝕骨細胞增生抑制劑所含有的上述I L - 1 8係包 括具有抑制蝕骨細胞於活體內和活體外生成的任何種類和 型式的I L - 1 8。本試劑有利於做爲動動細胞培養基的 成份，它具有令人滿意地抑制蝕骨細胞形成，維持，增生 ，和/或分化所想要的細胞；做爲骨頭相關治療試劑篩選 -10- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570801 Α7 Β7 五、發明説明$ ) 套組的組成份；骨質吸收調節試劑；和做爲蝕骨細胞相關 疾病的試劑。骨質吸收調節試劑包括醫藥和健康食品，它 們具有抑制活體內蝕骨細胞增生的活性，控制骨質吸收至 正常狀態，和改善不利的身體狀況如相當無意義的關節痛 。做爲蝕骨細胞相關疾病之用的試劑包括用以預防和/或 治療因過度蝕骨細胞生成和/或其功能造成疾病的藥物。 此種疾病例子是高鈣血症，蝕骨細胞瘤，B e h c e t氏 徵候群，骨肉瘤，關節病，慢性風濕性關節炎，骨炎變形 ，原發性甲狀腺官能過旺症，骨質稀少和骨質疏鬆症。本 試劑通常配製成液體，糊膏或固體型式，其含有 0 · 000002_100w/w%IL — 18，宜爲 0 · 0 0 0 2 — 0 · 5 w /w %，而不同型式的試劑主要 決定於試劑的種類和被治療的疾病。 本蝕骨細胞增生抑制劑可以只含I L - 1 8或是由 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 L - 1 8和一或更多種其他成份組成的組成物。其他成 份例如媒介物，賦形物，稀釋劑，佐劑，抗生素，和蛋白 質如血淸白蛋白和明膠做爲安定劑；醣類如葡萄糖，麥芽 糖，麥芽三糖，麥芽四糖，海藻糖，蔗糖，異麥芽糖，乳 糖，6 α葡萄基麥芽糖，D(t喃葡糖基庶糖，宮殿糖palatinose ，乳蔗糖，植物蜜糖，寡果糖，寡半乳糖，蘑菇多醣，糊精 ，支鏈澱粉，和糖醇包括山梨醇，麥芽糖醇，乳糖醇和麥 芽糖三醇；主要由磷酸鹽或檸檬酸鹽組成的緩衝液；和還 原劑如2 -氫硫基乙醇，二硫代蘇糖醇，和還原穀胱甘肽 ;和選擇性地生物活性物質如干擾素- α，干擾素-沒， -11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570801 A7 B7 五、發明説明$ ) 干擾素一 r ，間白素一 2 ，間白素一 3 ，間白素一 6 ，間 白素一12 ，TNF-α ， INF —冷，GM—CSF ， 軀體介素，促生長因子，胰島素相似生長因子， 異丙黃酮（ipriflavone )，副甲狀腺荷爾蒙（parathyroid hormone，PTH )，炔諾酮，G Μ — C S F，雌激素，黃體 酮，氯地孕酮醋酸鹽，降血銘素，白消安，ancitabine ， 阿糖胞嘧啶，尿嘧啶二酮，四氫呋喃甲基尿嘧啶二酮，氨 甲蝶呤，維生素D 2，活性維生素D， krestin®或多醣類 K，L —天冬醯胺酶，和0K — 432或picibanil® ;和鈣 鹽如乳酸鈣，氯化鈣，單氫磷酸鈣，和L -鈣L -天冬醯 酸鹽。當使用做爲投予溫血動物（包括人類）的試劑時， 即做爲蝕骨細胞相關疾病之用的試劑，本試劑宜配製成組 成物型式，即與以上的一或更多種生理可接受物質適當地 結合。 本蝕骨細胞增生抑制劑包括以單位劑量型式使用的藥 物，做爲投予至溫血動物（包括人類）之用。 '、單位劑量 型式〃意指含有的I L - 1 8量適合做爲每日劑量或量達 到四倍整數或達到1 / 4 0倍劑量，和於物質上分離並酉己 製成適合做爲前述投予作用的型式。此種配方實例是注身寸 液，液體，粉末，顆粒，錠劑，膠囊，片劑，洗眼藥’噴 霧劑和栓劑。 本試劑做爲一蝕骨細胞增生抑制劑，可有效治療和預 防蝕骨細胞相關疾病，且與口服和非經腸道投予方式無關 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -12 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •I裝· 訂 570801 ΑΊ _ _ Β7 五、發明説明<〇 ) 依照病人疾病的徴後群和種類，本試劑投予的方式可 以是Q服，經皮，皮下，肌肉或經靜脈，每一劑量約 〇 · 5//g — l〇〇mg，宜爲每次il — 18劑量約爲 2eg — l〇mg，一天2 — 6倍量或一星期2 - 10倍 做爲^~天至一*年之用。 參考以下的實驗，如本發明的I L 一 1 8的製備，物 化特性和生物活性都有所描述：

實驗：L 人類I L 一 1 8的製備 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 根據由本發明申請者在日本專利公開·公報編號2 3 1 ，5 9 8/9 6所提出的方法製備含有可編碼人類I L 一 1 8的cDNA的可自主複製的重組DNA -p K G F Η Η 2。以雙去氧核糖核苷酸定序法分析重組 DNA的結果顯示：含有SEQ ID NO : 8鹼基序 列的KGFHH2 cDNA是連接在Ta c啓動子— Ptac的下游（見第1圖），重組DNA — PKGFHH2含有SEQ ID N〇si — 5的胺基 酸序列；這些胺基酸序列是分別由S E Q ID N〇·· 8 中的核苷酸 46 — 63，88 — 105，400— · 420，151 — 165 和 214 - 228 所編碼。 根據日本專利公開公報編號2 3 1，5 9 8 / 9 6的 方法，將重組D N A — p K G F Η Η 2送入大腸桿菌 -13- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） 570801 ΑΊ ____ Β7 五、發明説明彳1 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Υ1090菌株—ATCC 37197，然後培養此菌 株。產生的多胜肽以免疫親和層析法純化以得到純度至少 9 5 %的純化人類I L — 1 8，產率約2 5 m g 培養 物。根據由本發明申請者在日本專利公開公報編號 1 9 3，0 9 8 / 9 6所提出的方法，分析純化的人類 I L - 1 8的生物活性和物化特性後顯示：當我們利用一 般方法從健康捐贈者體內收集淋巴球，然後在含有純化的 人類I L 一 1 8狀況下培養人類淋巴球，I FN - r的產 生是決定於I L - 1 8的濃度。此確認了以淋巴球做爲免 疫活性細胞，I L 一 1 8具有誘導I F N - r製造的活性 0 根據 U.K.Laemmli 在 Nature, vol. 227, pp.680-685(1 970) 所報導的方法，將I L — 1 8置於S D S — P A G E，在 相當於18 ，500 土 3 ，000道耳頓位置的主要帶具 有一 I F N - r誘導活性。利用一般色譜凝焦法測定I L —1 8 的 P I 爲 4 · 9 土 1 · 0。使用 Applied Biosystems， Inc.,Foster City,USA ^ 、、PROTEIN SEQUENCER MODEL 47 3A"裝置顯示 IL— 18 具有 SEQ ID N 0 ： 9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Q E s 至 接 連 酸 胺 硫。 甲端-N 即的 ， 歹 列序 序酸 酸基 基胺 胺 8 的：

〇 N D 2 驗 備 製 的 8 i L I 類 人 7 6 號 編 r>又 幸 公 開 公 利 專 本 曰 在 者 請 甲 明 發 本 由 據 根 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570801 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明彳2 ) 4 3 4 / 9 6所提出的方法，將源自於具有急性單核白血 球白血病的男性的人類單核白血球細胞株一 Τ Η P - 1細 胞（A T C C TIB 2 Ο 2 )接種於新生倉鼠的背部 皮下組織，然後飼養倉鼠三週。將生長於每一雙倉鼠皮下 組織’與一個約1 5 g重的腫瘤塊萃取，均勻散布於培養 基並使其破裂。從破裂細胞得到的多胜肽以免疫親和層析 法純化，每隻倉鼠可得到約5 Ο n g純化的人類I L 一 18° 相同地，利用曰本專利公開公報編號6 7，4 3 4 / 9 6的方法分析純化的人類I L - 1 8的生物活性和物化 特性後顯示：當我們利用一般方法從健康捐贈者體內收集 淋E球，然後在含有不同濃度的人類I L - 1 8狀況下培 養人類淋巴球，會造成IL — 18劑量依賴的I FN - 7 製造。此顯示以淋巴球做爲免疫活性細胞，人類I L -1 8具有誘發I F N — r製造的生物活性。根據U . K. Laemmli 在 N a t u r e，vo I · 2 2 7，p p . 6 8 0-6 8 5 (1 9 7 0)所幸g 導的方 法，將純化的人類I L 一 1 8置於含2 w / v %二硫代蘇 糖醇做爲還原劑的S D S - P A G E，我們發現在相當於 1 8 0 0 0 — 1 9 5 0 0道耳頓位置的主要帶具有一 I F N - r製造誘導活性。根據日本專利公開公報編號 6 7，4 3 4 / 9 6所刊載的胜肽圖，將人類I L 一 1 8 以購自 Sigma Chemical Company，Missouri，USA 的梭菌肽 酶B處理以得到多胜肽片段，然後將此片段置於使用 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan 的、、ODS-120T"管柱 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 15 - 570801 A7 B7 五、發明説明t3 ) 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 的高成形液體色譜法（high-performance liquid chromato graphy, HPLC )進行分級分離，並且從N端分析片段的胺 基酸序列。其結果顯示於S E Q ID N 0 s : 1 0 — 1 3的胺基酸序列。這些胺基酸序列與S E Q ID N〇：6 中的胺基酸 148 — 157 ，1 — 13 ，45 — 5 8和8 0 — 9 6完全相符合。此資料顯示在實驗2得到 的人類IL 一 18具有SEQ ID NO: 6的胺基酸 序列和S E Q ID N〇s : 1 — 5的所有部分胺基酸 序列。 實驗3 功能性同等物的製備 根據由本發明申請者在日本專利公開公報編號2 0， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 9 0 6/9 7所提出的方法，製備一含有可編碼人類I L 一 1 8的功能性同等物D N A的可自主複製的重組D N A —PCSHIGIF/MUT35 ，其中在 SEQ ID N〇：6中的半胱胺酸3 8 ，6 8和7 6分別以絲胺酸 ，絲胺酸和丙胺酸取代。以雙去氧核糖核苷酸定序重組 D N A的結果顯示在第2圖。在此重組D N A中，具有 SEQ ID N〇：14 的 DNA IGIF/MUT 3 5以相同讀錄框構連接至可編碼人類干擾素- α， a 2 b亞型的訊號胜肽的鹼基序列（如Κ. He n co et a I.， Journal of Molecular Biology,vol. 185, pp.227-260(1 985 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570801 A7 B7 五、發明説明彳4 ) )報導）的下游，並且在更下游有一做爲蛋白質合成之用的 終止密碼。如S E Q ID N〇：1 4所示，由重組 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} D N A編碼的胺基酸序列相當於s E Q ID N 0 ： 6 ’其中SEQ ID 1^〇：6中的半胱胺酸38，68 和7 6分別以絲胺酸，絲胺酸和丙胺酸取代。重組D N A 含有一可編碼SEQ ID NOs : 1 — 4所有胺基酸 序列和S E Q ID N〇：5胺基酸序列的核苷酸，其 中S E Q ID N〇：5中的半胱胺酸5以丙胺酸取代 。這些胺基酸序列分別由S E Q ID N 0 : 1 4中的 核苷酸46-63，88—105，400— 4 2 0，1 5 1 — 1 6 5 和 2 1 4 — 2 2 8 所編碼。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 根據由本發明申請者在日本專利公開公報編號2 0， 9 0 6 / 9 7所提出的方法，將重組D N A -PCSHIGIF/MUT35送入源自於經SV40轉 型的非洲綠猴腎臟細胞株C〇S — 1細胞（A T C C c R L 1 6 5 0 )，然後培養該轉型細胞。培養物中所 產生的多胜肽以免疫親和色譜法純化以得到一純化的人類 I L 一 1 8功能性同等物，其產率約4 0 n g / m /培養 物，根據日本專利公開公報編號2 0，9 0 6 / 9 7的方 法，分析純化的功能性同等物的生物活性和物化特性後顯 示：當我們在含有不同濃度純化的人類I L - 1 8功能性 同等物條件下培養源自於人類急性骨髓性白血病細胞株 KG— 1 細胞（ATCC CCL246) ，IFN— r 的製造是決定於I L 一 1 8濃度。此顯示了以K G - 1細 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570801 Α7 , Β7 五、發明説明彳5 ) 胞做爲免疫活性細胞，I L 一 1 8具有誘導I F N — r製 造的生物活性。根據U.K.Laemmli在Nature，vol.227，pp.680-685 ( 1 970)所報導的方法，將純化的功能性同等物置，於含 2 w/ v %二硫化蘇糖醇做爲還原劑的S D S - P A G E ，我們發現在相當於18，000 - 19，500道耳頓 位置的主要帶具有一誘導I F N - r製造的活性。使用 Applied Biosystems，Inc.’Foster City，USA 的、、PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A 〃裝置進行胺基酸序列--般分析 顯示：功能性同等物N端區域具有S E Q ID N〇： 1 5的胺基酸序列，其相當於S E Q ID N 0 ： 1 4 中N端區域的胺基酸序列。 實驗4 功能性同等物的製備 根據由本發明申請者在日本專利公開公報編號2 0 ’ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 9 0 6 / 9 7所提出的方法製備一含有可編碼人類I L 一 1 8的功能性同等物D N A的可自主複製的重組D N A -pCSHIGIF/MUT 42，其中在 SEQ ID N〇：6中的半胱胺酸38 ，68 ，76和127分別 以絲胺酸，絲胺酸，丙胺酸和絲胺酸取代。以雙去氧核糖 核苷酸定序重組D N A的結果顯示在第3圖。在此重組 DNA中，具有SEQ ID N〇：16的DNA I G I F / M U T 4 2以相同讀錄框構連接至可編碼人類 -18- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 570801 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明彳6 ) 干擾素—α a 2 b亞型的訊號胜肽的鹼基序列（如K.Henco et al.,Journal of Molecular Biology,vol. 1 85,pp.227-260( 1985)報導）的下游，並且在更下游有一做爲蛋白質合成之 用的終止密碼。如S E Q ID N〇：1 6所示，由重 組D N A編碼的胺基酸序列相當於S E Q ID N〇·· 6’其中SEQ ID N〇：6中的半胱胺酸 3 8 ’ 6 8，7 6和1 2 7分別以絲胺酸，絲胺酸，丙胺 酸和絲胺酸取代。重組D N A含有一可編碼S E Q ID N〇s:l — 4所有胺基酸序列和SEQ ID N 0 :5胺基酸序列的核苷酸，其中SEQ ID NO :5 中的半胱胺酸5以丙胺酸取代。這些胺基酸序列分別由 SEQ ID N〇：16中的核苷酸46 — 63，88 -105 ’ 400- 420，151-165 和 214- 2 2 8所編碼。 根據由本發明申請者在日本專利公開公報編號2 0， 9 0 6 / 9 7所提出的方法，將重組D N A -PCSH I G I F/MUT42 送入 COS—1 細胞，然 後培養此細胞。培養物中所產生的多胜肽以免疫親和色譜 法純化以得到一純化的人類I L - 1 8功能性同等物，其 產率約2 0 n g / m〖培養物。根據日本專利公開公報編 號2 0，9 0 6 / 9 7的方法，分析純化的功能性同等物 的生物活性和物化特性後顯示：當我們在含有不同濃度的 純化功能性同等物條件下培養K G - 1細胞，I F N - 7 的製造是決定於功能性同等物劑量。此顯示了以K G — 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -19- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 570801 A7 ___ B7 五、發明説明彳7 ) 細胞做爲免疫活性細胞，功能性同等物具有誘導I F N -r製造的生物活性。根據U.K.Laemmli在Nature，vol.227，pp • 680-685 ( 1 970)所報導的方法，將純化的功能性同等物置於 含2w/v%二硫代蘇糖醇做爲還原劑的S d S -PAGE，我們發現在相當於18，000 — 19，5 0 0道耳頓位置的主要帶具有一誘導IFN— r 製造的活性。使用 Applied Biosystems，Inc.，Foster City， USA 白勺 vv PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A "裝置進行 胺基酸序列分析顯示：功能性同等物N端區域具有 S E Q ID N〇：1 5的胺基酸序列，其完全相同於 S E Q ID N〇：1 6中N端區域的胺基酸序列。 實驗5 人類I L — 1 8製備 根據由本發明申請者日本專利公開公報編號1 8 5， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 3 0 5 / 9 6所提出的方法製備含有可編碼人類I l 一 1 8的染色體DNA的可自主複製的重組DnA — p B G H u G F。以雙去氧核糖核苷酸定序法分析重組 DNA的結果顯示：可編碼人類I L 一 1 8的染色體 DNA，即具有 SEQ ID NO :17 的 DNA H u I G I F是利用Hind III 限制酶連接至限制酶作用 位置的下游。如S E Q ID N〇·· 1 7所示，染色體 DNA Hu IGIF由11 ，464bp組成，其中表 -20- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570801 A7 B7 五、發明説明彳8 ) 現序列被四個位於核苷酸8 3 - 1 4 5 3，1 4 6 6 — 4848，4984 - 6317 和 6452- 11224 的插入序列分成未連續的結構。排除這些插入序列的剩餘 核苷酸序列中，從5 >端算起的核苷酸3 - 1 1 4 4 3部 分可編碼人類I L — 1 8前驅物，並且核苷酸4 8 6 6 -4 9 8 3部分可編碼一活性的人類I L 一 1 8。染色體 DNA含有可編碼SEQ ID NO s : 1 — 5的核苷 酸序列；這些胺基酸分別由S E Q ID N〇：1 7中 的核苷酸 491 1 — 4928，4953 — 4970， 11372 - 11392，6350 — 6364 和 6 4 1 3 — 6 4 2 7 所編碼。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 根據日本專利公開公報編號1 8 5 · 3 0 5 / 9 6的 方法，將重組DNA— pBGHuGF送入源自於中國倉 鼠卵巢的細胞株C Η〇一K 1細胞（A T C C C C L 6 1)，然後培養此細胞。將培養物上淸液與從Τ Η P -1細胞培養物製得的細胞破裂物上淸液接觸以製造一多胜 肽，然後使用免疫親和色譜法純化可得到純化的人類I L 一 1 8，其產率約1 5 m g / ^培養物。根據日本專利公 開公報編號1 8 5 ，3 0 5 / 9 6所提出的方法，分析多 胜肽的生物活性和物化特性後顯示：當我們從健康捐贈者 體內收集淋巴球，然後在含有不同濃度的人類I L - 1 8 條件下培養淋巴球，所產生的I F N - τ決定於純化的人 類I L - 1 8濃度。此顯示了以淋巴球做爲免疫活性細胞 ，人類I L 一 1 8具有誘導I F N - 7製造的生物活性。 -21 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570801 A7 --- B7 五、發明説明彳9 ) 根據 U.K.Laemmli 在 Nature,νο1·227，ρρ.680-685( 1 970)所報導 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的方法，將純化的人類I L 一 1 8置於含2 w / ν %二硫 代穌糖醇做爲還原劑的S D S - P A G Ε ,我們發現在相 當於1 8 0 0 0 - 1 9 5 0 0道耳頓位置的主要帶具有一 誘導I F N - r製造的活性。人類I L 一 1 8的N端區域 含有S E Q ID N〇：1 5的胺基酸序列，其完全相 同於做爲活性的IL— 18的SEQ ID NO: 17 中的N端區域的胺基酸序列。 實驗6 老鼠I L — 1 8的製備 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 在一 0 · 5以反應試管中加入8// /的25mM氯化 鎂，的 10XPCR 緩衝液，的 25mM dNTP混合物，1//夕2 · 5單位/ 的t a Q · D N A聚合酶，1 n g的重組D N A (此重組D N A可編 碼老鼠IL— 18，具有SEQ ID NO :18的核 苷酸序列和S E Q ID N 0 : 7的胺基酸序列·，並且 根據日本專利公開公報編號2 7，1 8 9 / 9 6的方法從 一噬菌體D N A菌落製備），和適量的分別具有5 / 一

ATAGAATTCAAATGAACTTTGGCCG ACTTCACTG--3 >和5 / -ATAAAGCTT

CTAACTTTGATGTAAGTT-3 一核脊酸序 列的感應鏈和對感應鏈引子（此引子係根據接近S E Q I紙用中國國家標準（CNS ) A4規格(210'乂 297公麓~1 -22 - 570801 A7 _ B7 五、發明説明) 1 D N 0 : 7的N和C端的胺基酸序列以化學法合成） ’並且以消毒過的蒸餾水調整此混合物溶液體積爲1 〇〇 # I。然後將得到的此溶液進行p c R，其設定如下： 9 4 °C 1分鐘，4 3 °C 1分鐘和7 2 °C 1分鐘，進行三次 循環；然後9 4。(： 1分鐘，6 0 °C 1分鐘和7 2 t 1分鐘 ’進行4 0次循環。 將由P C R反應得到的產物和'' pCR-Scdpt SK( + )〃 ( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

一種由 Stratagene Cloning Systems，California，USA 商業化 的質體載體），依照一般方式使用D N A連接酶將其連接 在一起成爲重組DNA，然後送入由Stratagene Cloning Sy stems，California, USA商業化的大腸桿菌株'' X L — 1 Blue MRF，kan〃 ，以得到一轉型物。將轉型物接種於含 50//g/ml氨苄青黴素的L 一培養物（pH7 · 2) ，於3 7 t振盪培養1 8小時。離心此培養物以得到增殖 的轉型物，然後以傳統的鹼- S D S方法處理而分離出重 組D N A。取一部分分離得到的重組D N A以雙去氧核糖 核苷酸定序法分析。其結果顯示，此重組D N A含有 S E Q ID N〇：1 8序列，此序列在5 > —和3 / 一端分別有E c 〇 R I和H i n d I I I限制酶作用位置 ，和一含有甲硫胺酸密碼子做爲起始多胜肽合成的D N A 和一做爲終止多胜肽合成的T A G密碼子，其分別位於 SEQ ID NO: 18胺基酸序列的N —端之前和C 一端之後。重組DNA含有SEQ ID N〇s:1— 5的核苷酸序列。這些胺基酸序列是由S E Q ID -23- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570801 A7 ___ B7 五、發明説明έι ) Ν〇 : 18中的核苷酸46 — 63，85- !〇2，394-414，1 48 - 162 和 211 - 2 2 5所編碼。 將剩餘的重組D Ν Α部分以E c 〇 R I和 H i n d I I I限制酶切斷。取〇 · 1 // g的E c 〇 R I — Hind III D Ν A片段和已事先經過限制酶處 理的 l〇ng pkk223 — 3 質體載體（爲 Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，Sweden 商品），利用 D N A 連接套組DNA LIGATION KIT VER 2 "(爲 Taka ra Shuzo Co·，Ltd.，Tokyo，Japan 商品），於 1 6 °C 反應 3 0 分鐘，而得到一可自主複製的重組DNA — pKGFMH 2。使用勝任細胞法，將大腸桿菌γ 1 〇 9 0菌株（ ATCC 37197)以重組 DNA— pKGFMH2 轉型，然後把形成的轉型物一 k G FMH 2接種至含5 〇 //g/mJ氨苄青黴素的L —培養物（pH7 · 2)，於 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 3 7 C振Μ培養1 8小時。將培養物離心以收集增殖的轉 型物，然後取部分的轉型物以傳統的S D S -鹼方法萃耳又 重組DNA—pKGFMH2。再使用雙去氧核糖核脊酸 定序法分析重組D Ν Α。其結果顯示：在重組D Ν A — PKGFMH2中，含有SEQ ID 1^〇：18核苔 酸序列的kGFMH2 cDNA是連接至Ta c啓動子 的下游（第5圖）。 氨苄青黴素加至已經過滅菌消毒的L -培養物（p H 7.2)，使其濃度爲50//g/ml ，冷卻至37°C， -24- (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570801 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明έ2 ) 並以轉型物K G F Μ Η 2接種’然後於3 7 °C培養1 8小 時。取1 8 /新鮮製備的相同培養基於2 0 i發酵瓶，如 上進行相似的滅菌工作，與氨苄青黴素混合，冷卻至3 7 °C，並以上述得到1 v / v %種子培養物接種，然後在 3 7 °C振盪培養8小時。把形成的培養物進行離心’以收 集培養的細胞，然後懸浮於含1 5 0 m Μ氯化鈉，1 6 m Μ氫磷酸二鈉和4 m Μ二氫磷酸鈉的混合物溶液（ρ Η 7.3)，利用超音波使細胞破裂，並離心去除細胞破裂 物，產生約2 I的上淸液。 於2 /上淸液中加入含硫酸鉈的1 0 m Μ磷酸鹽緩衝 劑（ρ Η 7 · 3 )使其達至4 0 %銨飽和度。形成的沉澱 物以離心去除，上淸液與硫酸銨混合使其達到8 5 %銨飽 和度，然後於4 °C靜置1 8小時，於8 0 0 0 r p m離心 3 0分鐘以得到新形成的沉澱物。將得到的沉澱物溶解於 含1 · 5 Μ硫酸銨的1 〇 m Μ磷酸鹽緩衝液（ρ Η 6 · 6 )，使其總體積約1 3 0 0 ，過濾此溶液，然後灌注於 塡充 800m£、' PHENYL SEPHAROSE C L - 6 8 r/ ( 一種由 Pharmacia LKB Biotechnology AB， Uppsala，Sueden製造的凝膠）的管柱，再以新鮮製備相同 的緩衝液淸洗管柱，並以存在於1 0 m Μ磷酸鹽緩衝液（ Ρ Η 6 . 6 )從1 · 5 Μ降至〇 Μ的硫酸銨直線梯度緩衝 液，以SV (空間速度，space velocity) 1 · 5注入管柱 。將在1 Μ硫酸銨附近沖提出來的沖提物收集合倂，以膜 過濾物進行濃縮，再以1 0 m Μ磷酸鹽緩衝液（ρ η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） nr · ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 570801 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明) δ · 5 )於4 °C透析1 8小時。將經過透析的溶液置於塡 充 5 5 m / 、、D E A E — 5 pw/r ( — 種由 Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala, Sweden 製造的凝膠），且事 先以1 0 m M磷酸鹽緩衝液（p Η 6 · 5 )平衡的管柱。 此管柱以新鮮製備的相同緩衝液進行沖洗，注入存在於 1 0 m Μ磷酸鹽緩衝液（p Η 6 · 5 )氯化鈉濃度從〇Μ 增至0 · 5 Μ的直線梯度緩衝液，其S V爲5 · 5，然後 收集在0 . 2 Μ氯化鈉附近沖提出來的沖提物。之後把沖 提物合倂並以上述相似方法進行濃縮，使成9 ，再以 P B S ( phusphate buffered saline，磷酸鹽緩衝性鹽水） 於4 °C對濃縮物進行透析1 8小時，然後將透析液置於塡 充、、SUPERDEX 751 一種由 Phavmacia LKB Biotechnolo gy AB，Uppsala, Sueden製造的凝膠），且事以以新鮮製備 相同的P B S平衡的管柱。以新鮮製備的P B S注入管柱 ，並收集且I F N - r誘導活性的部分，並且將收集的部 分合倂，再以膜過濾物濃縮而得到純化的老鼠I L - 1 8 ，其產率約爲3 5 0 // g 培養液。 如曰本專利公開公報編號2 7，1 8 9 / 9 6所發表 的方法，分析純化的老鼠I L - 1 8的生物活性和物化特 性後顯示：當我們以一般方式收集老鼠脾臟細胞，並於不 同濃度的老鼠I L - 1 8條件下培養該細胞，會造成 I FN - r的製造決定於老鼠I L 一 1 8的濃度。此顯示 以脾臟細胞做爲免疫活性細胞，老鼠I L - 1 8具有誘導 I F N — r 製造的活性。根據 U.K.Laemmli 在 Nature，vol. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·裝' 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 570801 A7 B7 五、發明説明έ4 ) 2 2 7，P P · 6 8 0 - 6 8 5 ( 1 9 7 0)所報導的方法，將純化的人類I L — 1 8置於非還原狀態下的S D S〜p a G E，我們發現在 相當於1 8 0 0 0 — 1 9 5 0 0道耳頓位置的主要帶具有 一誘導I F N — r製造的活性，老鼠I L 一 χ 8的N端區 域含有S E Q ID N〇：1 9的胺基酸序列，其相當 於S E Q ID N〇：1 8的N端區域。 參考實驗7 :如本發明的I L 一 1 8的生物活性將更 詳細描述，和實驗8描述I L 一 1 8的細胞毒性： 生物活件 實驗7 _ 1 GM-CSF製造的誘導作用 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 使用一肝素化的針筒，從健康自願者的身上收集血液 並以不含血淸的PRMI 1640培養基（pH7 . 4 )稀釋二倍。將稀釋液置於離心管ficoll並離心，然後將收 集到的淋巴球以添加1 0 v / v %胎牛血淸的R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基（Ρ Η 7 · 4 )淸洗，並懸浮於新鮮製備 的相同培養基內，使細胞密度爲1 X 1 0 6細胞/W，然後 將細胞懸浮液分置於每個孔爲2 m£的1 2孔微盤內。 使用添加1 0 v / v %胎牛血淸的R Ρ Μ I 1 6 4 0 培養基（Ρ Η 7 · 4 )，將利用實驗1方法獲得的I L — 1 8製備物製備成含1 A g / 溶液，然後將此溶液分置 -27- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570801 Α7 ___ Β7 ___ 五、發明説明) 於以上的微盤內，每孔內20 — 200//，。然後每孔再 加入1 0 // i添加5 0 0 £ / m£刀豆球蛋白Α的新鮮製 備相同緩衝液，再於3 7 t：，5 v / v % C〇2培養箱內反 應4 8小時。經過完全培養過程，每一孔取〇 . 1 上淸 液做爲樣品，利用一般酵素免疫法測量G Μ - C S F含量 。相同地，將不含I L 一 1 8的培養系統做爲控制組，並 以以上相同地方方式處理。結果顯示於第1表： 第1表 IL-18*(nm)__GM-CSF 產率（pg / 2 ) 〇_5j_0___ 0.7 2150 2.8_3050__ 5.6_3950_ 註：符號a * 〃意指I L — 1 8添加至含有2 · 5 // g / 刀豆球蛋白A的培養系統 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第1表結果顯示以淋巴球做爲免疫活性細胞，當在含 有刀豆球蛋白A做爲輔因子與I L 一 1 8接觸時，GM — C S F的製造決定於I L 一 1 8的濃度。它也確認了，藉 由實驗2 — 5方法獲得的所有I L 一 1 8製備物和其功會g 性同等物可誘導G Μ - C S F的製造，即使如上述單獨地 使用。將利用實驗6方法獲得的I L 一 1 8製備物根據實 驗7 - 1方法進行試驗，除了以從老鼠製備取得的脾細胞 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐) .28 - 57〇8〇1 A7 B7 i、發明説明έ6 ) 取代實驗中的人類淋巴球，我們發現I L - 1 8製備物也 會誘導GM— CSF的製造。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 2 田胞生成作用的抑制作用 7-2 ( a ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 如 T.J.Martin 和 L.W.Ng 於 Tournal of Cellular Biochemi stry，v〇i.56，pp.357-366( 1 994)報導，將源自於造血幹細胞的 蝕骨細胞前驅者細胞與造骨細胞或骨髓基質相接觸，對於 蝕骨細胞前驅者細胞分化成成熟蝕骨細胞被認爲是必需的 。如 G.D.Roodman 於 Endocrine Reviews，νο1·17，Νο·4，ρρ·308 -3 32( 1 996)描述，蝕骨細胞一般被確認具有多核細胞特徵， 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartaric acid-resistant acid phosphatase ， 此後 縮寫成 、 T R A Ρ 〃） 活性 ，和一 降鈣血 素接受 體。如 Nobuyuki UDAGAWA 等人於 Journal of Experimental Medicine, vol. 182，ρρ·146 1 - 1 468( 1 995)報導，在一造骨細 胞和骨髓細胞共同培養系統，這些細胞對一些因子如1 α ，2 5 —二羥維素D 3，前列腺素Ε 2，腎上腺皮質素， 間白素1 ，間白素6和間白素1 1具有反應而形成蝕骨細 胞相似細胞（osteoclast-like cells，此後可能縮寫爲〜 〇C L 〃 ）。形成的〇C L具有在活性內蝕骨細胞的特徵 。因此，共同培養系統可將活體內蝕骨細胞形成的過程完 善地在活體外中反應出來。使用此系統，對於蝕骨細胞形 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570801 A7 B7 五、發明説明会7 經濟部中央標準局員工消費合作社印f 成和蝕骨細胞增生抑制劑的實驗可以實行。 使用以上的共同培養系統，我們對如本發明的I L - 1 8的蝕骨細胞增生抑制活性進行硏究。本實驗中所使用 的造骨細胞係使用一般方式製備。將新生老鼠的顱頂以 0 · lw/v% 膠原蛋白酶（Worthington Biochemical Co.，Free fold, Australia 製的商品）和 0 · 2w/v% dispase 酶(Godo Shusei Co., Ltd., Tokyo, Japan 製的商品 )處理。利用一般方式從成熟老鼠製備骨髓細胞。將 2 X 1 0 4細胞的造骨細胞初級細胞培養物和5 X 1 0 5細 胞的骨髓細胞共同培養於，每一孔含0 · 4 m£添加1 〇 v / v %胎牛血淸的α - Μ E Μ培養基（此後在實驗7 - 2 皆命名爲 ''培養基〃）的4 8孔微盤，於3 7 °C，5 ν / v % C〇2培養箱中反應7天，此組爲陰性控制組。陽性控 制組則與陰性控制組相似，將二種細胞共同培養，除了培 養於含1 0_81 α，2 5 —二羥維生素D3 ( WaK〇 Pure Chemicals, Tokyo，Japan製造的商品）和1 〇-7M前列腺 素 E 2 ( Sigma Chemical Company, Missouri，USA 製造的商 品）的其他孔內。將上述的二種細胞共同培養於與陽性控 制組相似環境，除了將其培養於含1 0 ~ 8 1 α，2 5 -二 經維生素 D 3 ( Wako Pure Chemicals, Tokyo，Japan 製造的 商品）和 1 0_7 前列腺素 E 2 ( Sigma Chemical Company， Missouri，USA製造的商品）和依照實驗6製造的I L 一 18製備物，0 · 01 — 10ng/mU農度的其他孔內。 在每一共同培養系統，每一孔內的培養基在開始培養後的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -30 - 570801 A7 B7 五、發明説明如） 第三天，都以新鮮的相同培養基取代。如Nobuyuki UDAGA WA 於 Journal of Experimental Medicine，νο1·182，ρρ·1461· 1 468 ( 1 995)，的方法，基於T R A P活性，細胞在開始培養 後的第六天都被固定和染色，然後計算每一孔內染色的細 胞（此後稱爲、T R A P -陽性細胞〃）。整個實驗7 -2過程，每一共同培養系統都在相同條件下，進行相同四 個孔實驗，並且計算每一系統每一孔的T R A P —陽性細 胞的平均値。結果在第2圖： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 第2表 IL-18(ng/m£) 蝕骨細胞增生生成 每孔內TRAP —陽 因子* 1 性細胞數目*2 0 2 0 + 110 0.01 + 114 0.1 + 111 0.5 + 106 1 + 63 2 + 29 一 4 + 12 8 + 2 __ 10 + 2 — 註：* 1 :符號、、+ 〃和、、一 〃分別顯示共同培養系統含有和 -31 - 本、，，氏張尺度適用中國國家榡準（CNS ) M規格（mX297公羡） 570801 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 _五、發明説明如） 不含有1 0 8 Μ 1 α ’ 2 5 —二經維生素D 3和 1 0 — 7前列腺素Ε 2。 *2:它顯示在相同條件下從相同四個孔培養所獲得的資 料平均値。 如第2表所示，T R A Ρ -陽性細胞的生成現象並未 在陰性控制組中觀察到，但在陽性控制組則有明顯生成現 象。在共同培養系統，即陽性控制組額外添加I L - 1 8 ，T R A P -陽性細胞生成的抑制決定於I L 一 1 8的濃 度，並且最大的抑制作用，即程度相同於陰性控制組，是 在每m£含有8 n g或更多I L 一 1 8條件下。這些資料強 烈地顯示I L 一 1 8具有明顯抑制活體外D C L形成的活 性和也抑制蝕骨細胞形成。 實驗7 — 2 ( b ) 如前所述，它確認了在實驗7 - 2的共同培養系統中 ’存在的因子可誘導蝕骨細胞相似細胞的生成。因此，在 實驗7 - 2 ( b )，我們將硏究是否在實驗7 - 2 ( a ) 觀察到的I L - 1 8對蝕骨細胞生成作用的抑制活性是專 一於一些因子或不是；蝕骨細胞相似細胞是依照實驗7 -2 ( a )陰性控制組所使用的相同方式培養，除了使用添 力口 1 0 · 8 Μ 1 α ，2 5 —二羥維生素 D 3 ; 1 0 - 7 Μ前列腺素Ε 2，2 0 0 n g / 副甲狀腺荷爾蒙，1 0 0 n g / 間白素1或2 〇 n g/J間白素1 1的培養基。 這些培養系統是做爲陽性控制組。相同地，細胞利用陽性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -32 - 570801

7 B 五、發明説明6ο ) 控制組所使用的相同方法培養於其他孔內，除了使用含有 1 0 n g /J利用實驗6方法獲得的I L 一 1 8製備物， 此外加入如上述任何一種相同濃度的因子。經過完整的細 胞培養，計算每一孔中T R A P -陽性細胞，其數目如實 驗7 - 2 ( a )相同地做比較。結果顯示於第3表： 第3表 蝕骨細胞生成因子* 1 濃度） IL-18*2 每孔內TRAP-陽性 細胞數目* 3 D 3 ( l〇-8M ) _ 94 + 3 PGE2(10.7M) • 77 + 3 PTH(200ng/m£ ) - 63 + 3 IL-1l(100ng/m£) - 84 + 3 IL-l(20ng/m£ ) - 71 + 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 註：*l:D3，PEG2，PTH，IL-ll和IL·l分別爲lα，25·二羥維生 素D3,前列腺素E2,副甲狀腺荷爾蒙，間白素-11和間白素_ 1，將它們加到孔內使其濃度如括號中所示。 *2:符號："和分別代表加入I L — 1 8至每一 孔內使其濃度爲1 0 n g / 和不加入。 -33 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） 570801 A7 B7 五、發明説明幻) *3:它顯示在相同條件下從相同四個孔培養所獲得的資料 平均値。 如第3表所示，在每一陽性控制組都可觀察到明顯的 T R A P —陽性細胞生成；但在含有I L — 1 8時，生成 作用幾乎完全被抑制。此強烈顯示I L - 1 8具有廣泛和 一般的抑制蝕骨細胞生成活性，且與蝕骨細胞生成相關因 子無關連。 實驗7 — 2 (c) 本實驗的目的是硏究：是否在實驗7 - 2 (a)和7 一 2 ( b )中，經由I L 一 1 8的蝕骨細胞增生抑制作用 是由於I L 一 1 8誘導的GM— CSF作用而造成的。使 用實驗7 — 2 ( a )應用的共同培養系統進行陽性和陰性 控制組實驗。其他孔內則依照陽性控制組的相似方法，將 造骨細胞和骨髓細胞共同培養，除了使用與陽性控制組中 相同濃度的1 α，2 5 —二羥維生素D 3和前列腺素E 2， 並添加（i ) 1 0#g/m£抗老鼠GM— CSF多株抗體 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 (R & D Systems，Minnesota, USA 製造的商品），（i i )10ng/mM衣實驗6方法製得的IL 一 18，（i i i) (ii)加上10//g/m£抗老鼠多株抗體，（iv )0 · lng/m£ 老鼠 GM— CSF (R&DSystems，Min nesota，USA製造的商品）或（v ) ，（ i v )，加上1 0 μ g/m£抗老鼠GM - C S F多株抗體。經過完整培養， 計算每一孔內T R A P —陽性細胞，並且依照實驗7 — 2 -34 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 7〇8〇i A7 B7 發明説明& ) (b )相似法進行比較。結果顯示於第4表，其中符號'、 妾'"V 〃表不共同培養系統內所使用的系統，而非控 制系統。

土咅賛系蝕骨細胞 IL-18*3 GM-CSF*4抗-GM- 統* I 增生因子 *2 CSF抗體*5 每一孔內TRAP - 陽性細胞數目*6

N

P

+ v + v {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) + + + 122 112 + + + 111 + + + + 106 註：* 1:其中 N " 至、、 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 P 〃分別代表陰性和陽性控制組， 相當於所使用的5種共同培養系統。 * 2:其中、' + ”代表，1 α，2 5 —二羥維生素D 3和前 列腺素Ε 2分別加至孔內，其濃度分別爲1 〇 - 8 μ和 1 Q 7 μ，而、一 〃代表未加入這些化合物。 3:符號··、、+ 〃代表加入I l — 1 8於每一孔內，使其濃 度爲10ng/m£，、、— 〃代表未加入il— 18。 符號、、+ 〃代表加入g Μ — C S F於每一孔內，使其 濃度爲0 · 1 ng/m£，、、— 〃代表未加入GM — 和 v 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -35 - 570801 A7 B7 —— _____________________ 五、發明説明幻） c s F。 *5 :符號、、+ 〃代表加入抗—G Μ - C S F多株抗體於每 〜孔內，其濃度爲1 0 // g / m£， ''一 〃代表未加入 抗GM—CSF多株抗體。 如第4表所示，T R A P -陽性細胞的生成幾乎完全 被1 L 一 1 8抑制，如共同培養系統（i i )，但此抑制 #用完全被加入的抗-老鼠多株抗體所抑制，如共同培養 系統（i i i )。老鼠G Μ _ C S F具有相似於I L 一 1 8的抑制T R A P -陽性細胞生成的活性，如共同培養 系統（i v )，和此抑制作用幾乎完全被加入的抗一老鼠 G Μ〜c S F多株抗體所抑制，如共同培養系統（v )。 單獨使用抗—老鼠G Μ - C S F多株抗體對於T R A Ρ — 陽性細胞的生成並無影響，如共同培養系統（i )。這些 資料強烈地顯示由I L - 1 8造成的蝕骨細胞增生抑制作 用是由於I L 一 18誘導的GM— CSF的作用而致。 實驗8 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 急性毒性試驗 將8週大的老鼠依照經皮、口腔或腹腔內注射法方式 ，投予依照實驗1 一 6方法獲得的I L 一 1 8製備物。這 些結果顯示：這些I L - 1 8製備物對於老鼠來說，其 LD5。約爲lmg/k g或更多，並且與投予途徑無關。 這資料顯示I L 一 1 8可倂入於一般溫血動物（包括人類 -36- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570801 A7 _ B7 __ 五、發明説明k ) )的製藥中且不會造成嚴重的副作用。 如 Nikkei Biotechnology Annual Report 1996， ρρ·498-499(1995)所描述〔由 Nikkei BP Publisher，Tokyo, Japan( 1995)出版〕，I L — 18 —誘導的GM— CSF並未在日 本進行臨床上使用，但在美國和歐洲已應用於臨床上。這 事貫可能顯不：事實上I L - 1 8並無嚴重的副作用。适 些事實顯示：如本發明的蝕骨細胞增生抑制劑可連續地投 予一般溫血動物（包括人類）以誘導蝕骨細胞形成，並且 對與蝕骨細胞相關的疾病具有令人滿意的治療和/或預防 效果，且不造成嚴重的副作用。 下列的實施例將描述如本發明的蝕骨細胞增生抑制劑 實施例1 液體 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將利用實驗1 一 6方法製備得到的I L 一 1 8製備物 溶解於含有1 w / v %人類血淸白蛋白（做爲安定劑）的 生理食鹽水內，使其濃度爲每毫升含2mg I L — 1 8的 溶液。然後使用一般的膜過濾方式將此溶液消毒。 此液體具有令人滿意的安定性’並且可任意地使用做 爲細胞培養成份，和做爲調節骨質吸收，和飩骨細胞相關 疾病之用的注射液，眼藥水或洗鼻藥試劑’以治療和/或 預防高鈣血症’蝕骨細胞瘤’骨質疏鬆症等。 -37- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570801 A7 B7 五、發明説明έ5 ίΜΜ2

劑 試I 燥I 乾I L 的 I 劑 的定 到安 得爲 法做 方膠 6 明 _ 化 1 純 驗96 實V 由 \ 經W m 含 ο於 5 解 將溶 物 備 製rn£ 8 ο τ—Ιο 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 生理食鹽水內。然後利用一般膜過濾方式把此溶液進行消 毒，再均分於1 的小瓶內，冷凍乾燥，和以蓋子封瓶。 此產品具有令人滿意的安定性，並且可任意地使用做 爲細胞培養成份，和做爲調節骨質吸收和蝕骨細胞相關疾 病之用的乾性注射液試劑，以治療和/或預防高鈣血症， 蝕骨細胞瘤、骨質疏鬆症等。 實施例3 乾燥試劑 將5 0 m g經由實驗1 一 6方法得到的I L 一 1 8製 備物溶解於含1 w / v %海藻糖做爲安定劑的1 0 0 m£生 理食鹽水內。然後利用一般膜過濾方式把此溶液進行消毒 ，再均分於1 小瓶內，冷凍乾燥，和以蓋子封瓶。 此產品具有令人滿意的安定性，並且可任意地使用做 爲細胞培養成份，和做爲調節骨質吸收和蝕骨細胞相關疾 病之用的乾性注射液試劑，以治療和/或預防高錦血症’ 蝕骨細胞瘤，骨質疏鬆症等。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 570801 A7 B7 五、發明説明έ6 ) 4 將、、HIVIS WAK〇 GEI^lOC，（ 一種由 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.，Tokyo，Japan 製造的竣乙燒聚合 物產品）和高純度海藻糖溶解於消毒過的蒸餾水，使其濃 度分別爲1 · 4 w /w %和2 · 0 w /w %，然後將此溶 液與由實驗1 一 6方法製得的I L 一 1 8製備物混合至均 質化，並調整p Η : 7 · 2。每g的糊膏產品含有約1 m g I L — 1 8製備物。 所製得的每一個產品都具有令人滿意的塗敷能力和安 定性，並且可任意地使用做爲調節骨質吸收和蝕骨細胞相 關疾病之用的軟膏試劑，以治療和/或預防高鈣血症，蝕 骨細胞瘤，骨質疏鬆症等。 實施例5 經濟部中央標率局員工消費合作社印繁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 錠劑 將、、FINETOSE®"(—種由 Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama, Japan 製造的無水結晶 α —麥 芽糖粉末產品），和由實驗1 一 6方法製得的I L 一 1 8 製備物，和L U Μ I N 〃或1 — 1 > 一 1 〃 —三庚基— 1 1 一 喹啉基（4 ) · 4 · 4 一 penthamethinchyno 花青 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） 570801 B7 ----—__—----- 五、發明説明) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 苷—1，1 〃 一二j〇dide混合至均質化。利用一般製造錠 劑方法將此混合物製成錠劑。每一顆錠劑約爲2 0 0 m g ’其內含大約2mg的I L 一 1 8製備物和2mg的 L U Μ I N。 此產品具有令人滿意的吞嚥特性，安定性和活化細胞 的活性，並且可任意地使用做爲調節骨質吸收和飩骨細胞 相關疾病之用的錠劑試劑，以治療和/或預防高鈣血症， 蝕骨細胞瘤，骨質疏鬆症等。 如上述，如本發明的蝕骨細胞增生抑制劑可有效抑制 蝕骨細胞形成，因此，此試劑可任意地使用做爲細胞培養 成份和做爲調節骨質吸收和蝕骨細胞相關疾病之用的試劑 ，以治療和/或預防高鈣血症，蝕骨細胞瘤，骨質疏鬆症 等。 因此具有這些有益活性和功能的本發明對於此領域來 說是一有意義的發明。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此所描述的是本發明的較佳具體實例，而我們都了解 ，我們可以做各種不同的修飾，所有的此種修飾都將涵蓋 於附加的申請專利.範圍，並落於本發明的真正精神和目標 之內。 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 2W公釐） 570801 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明h ) (l)SEQ ID N〇：l的資料 (i )序列特徵： (A )長度：6個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (v ) 片段種類：內部片段 (xi)序列描述：SEQ ID NO :1: Asn Asp Gin Val Leu Phe 1 5 (2 ) S E Q ID N〇： 2的資料 (i )序列特徵 . (A )長度：6個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (1 i )分子種類：內部片段 (X i )序列描述·· S E Q ID N 〇·· 2 ·· Phe Glu Asp Met Thr Asp 1 5 (3 ) S E Q ID N〇：3的資料 (/ )序列特徵 (A )長度：7個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (v ) 片段種類：內部片段 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -41 - 570801 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印^ 五、發明説明&9 ) (xi)序列描述：SEQ ID NO :3: Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys 1 5 (4 ) S E Q ID N〇：4的資料 (i )序列特徵 (A )長度：5個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：內部片段 (xi)序列描述：SEQ ID NO :4: Met Tyr Lys Asp Ser 1 5 (5 ) S E Q ID N〇：5的資料 (i )序列特徵 (A )長度：5個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：內部片段 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 ： 5 · Ser Thr Leu Ser Cys 1 5 (6 ) S E Q ID N〇：6的資料 (i )序列特徵 (A )長度：1 5 7個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本I) 衣·

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -42- 570801 A7 B7 五、發明説明i^O ) (D )拓S美學·直線 (i i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SE(3 ID N〇：6:

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gin Val Leu Phe 工le Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 工le Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys 工le Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp 工le lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser 工le Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .€衣· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (7 ) S E Q ID NO :7 的資料 (i )序列特徵 (A) 長度：157個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (l i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SEQ ID N〇：7: Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val 工le Arg Asn 工le Asn 15 10 15 Asp Gin Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gin Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp 工le Asp Gin Ser Ala Ser Glu Pro Gin Thr Arg Leu lie lie 35 40 45 Tyr Met: Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys lie lie 65 70 75 80 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -43- 570801 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明幻）

Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn lie Asp Asp lie Gin Ser 85 90 95

Asp Leu 工le Phe Phe Gin Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110

Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gin Lys Glu 115 120 125

Asp Asp Ala Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140

Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gin Ser 145 150 155 (8 ) S E Q ID N〇：8的資料 (i)序列特徵 (A)長度：471個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股：雙鏈 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：c D N A (v i )來源 (A )有機體：人 (G )細胞種類：肝 (i X )特性

(A )名稱/關鍵：主胜肽 (B )位置：1 · · · · 4 7 1 (C )確認方法：E (xi)序列描述SEQ ID N〇：8: TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn 15 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96

Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp

20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -44- 570801 A7 B7 五、發明説明必 )

Met Thr ΑΤΑ lie TCT Ser 65 ATT lie AGT Ser 50 GTG Val TCC Ser

Asp 35 ATG Met AAG Lys TTT Phe

Ser Asp Cys Arg AGT GAC ATC Ser Asp lie ATG Met AAA Lys GGG Gly 145 CAA TTT Gin Phe 115 GAG AGA Glu Arg 130 GAT AGA Asp Arg TAT Tyr TGT Cys AAG Lys ATA lie 100 GAA Glu GAC Asp TCT Ser AAA Lys GAG Glu GAA Glu 85 TTC Phe TCT Ser CTT Leu ATA lie GAT Asp AAA Lys 70 ATG Met TTT Phe TCA Ser TTT Phe ATG Met 150 AGC Ser 55 ATT lie AAT Asn CAG Gin TCA Ser AAA Lys 135 TTC Phe

Asp Asn 40 CAG CCT Gin Pro TCA ACT Ser Thr CCT CCT Pro Pro AGA Arg TAC Tyr 120 CTC Leu AGT Ser 105 GAA Glu ATT lie

Ala Pro Arg ACT GTT Thr Val AGA Arg CTC Leu GAT Asp 90 GTC Val GGA Gly TTG Leu CAA Gin GGT Gly TCC Ser 75 AAC Asn CCA Pro TAC Tyr AAA Lys AAC Asn 155 ATG Met 60 TGT Cys ATC lie GGA Gly TTT Phe

Lys 140 GAA Glu

Thr lie Phe lie 45 GCT GTA ACT ATC Ala Val Thr lie GAG Glu AAG Lys CAT His CTA Leu 125 GAG Glu GAC Asp AAC AAA Asn Lys GAT Asp GAT Asp 110 GCT Ala ACA Thr 95 AAT Asn TGT Cys ATT lie 80 AAA Lys AAG Lys GAA Glu 192 240 請先 閱讀背 之 注 288 項再填 336 f本頁 384 一 GAT GAA TTG Asp Glu Leu 432 471 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁

9 ) s E Q ID N〇：9的資料 (i )序列特徵 (A )長度：1 1個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (v )片段種類：N端片段 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -45- 57〇8〇i

五、 發明説明43

Met Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser 1 5 l〇 0 ) S E Q ID N〇：l〇的資料 (i )序列特徵 (A )長度：1 0個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (v ) 片段種類：C端片段 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 ： 1 〇

Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 1 5 i〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (1 1 ) SEQ ID N〇：11 的資料 (i )序列特徵 (A )長度：1 3個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (v ) 片段種類：N端片段 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 ： 1 1 ：

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg 15 10 (12) SEQ ID N〇：12 的資料 (i )序列特徵 (A )長度·· 1 4個胺基酸

、1T ,— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46- 570801 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Μ Β7五、發明説明44 ) (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (v ) 片段種類：內部片段 (xi)序列描述：SEQ ID NO :12: Thr lie Phe lie lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg 1 5 10 (13) SEQ ID N〇：13 的資料 (i )序列特徵 (A )長度：1 7個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (1 i )分子種類：胜肽 (v )片段種類：內部片段 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 ： 1 3 · lie 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 1 5 l〇 15 (14) SEQ ID N〇：14 的資料 (i )序列特徵 (A)長度：471個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股：雙股 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：c D N A (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 47- 570801 A7 B7 五、發明説明“5

i X )特性： (A )名稱/關鍵：主胜肽 (B)位置：1...47 (C )確認方法：S X i )序列描述：S E Q

D NO： 14· TAC Tyr 1 GAC Asp ATG Met ΑΤΑ lie TCT Ser 65 ATT lie AGT Ser ATG Met AAA Lys GGG Gly 145 TTT Phe CAA Gin ACT Thr AGT Ser 50 GTG Val TCC Ser GAC Asp CAA Gin GAG Glu 130 GAT Asp GGC AAG Gly Lys GTT Val GAT Asp 35 ATG Met CTC Leu 20 TCT Ser TAT Tyr CTT GAA TCT AAA Leu Glu Ser Lys 5 TTC ATT GAC CAA Phe 工le Asp Gin GAC TCT Asp Ser AAA GAT Lys Asp AAG TCT Lys Ser TTT AAG Phe Lys ATC lie TTT Phe 115 AGA Arg ATA lie 100 GAA Glu GAC Asp GAG Glu GAA Glu 85 TTC Phe AAA Lys 70 ATG Met TTT Phe AGA Arg AGC Ser 55 ATT lie GAT Asp 40 CAG Gin TCA Ser AAT CCT Asn Pro CAG AGA Gin Arg AGA TCT Arg Ser TCT TCA Ser Ser CTT TTT Leu Phe ATA ATG 工le Met 150 TCA Ser AAA Lys 135 TTC Phe TAC Tyr 120 CTC Leu ACT Thr TTA Leu GGA Gly 25 AAT Asn CCT Pro ACT Thr CCT Pro AGT Ser 105 GAA Glu ATT lie GTT Val TCA Ser 10 AAT Asn GCA Ala AGA Arg CTC Leu GAT Asp 90 GTC Val GGA Gly TTG Leu CAA Gin GTC Val CGG Arg CCC Pro GGT Gly TCC Ser 75 AAC Asn CCA Pro TAC Tyr AAA Lys AAC Asn 155 ATA lie CCT Pro CGG Arg ATG Met 60 GCT Ala ATC lie GGA Gly TTT Phe AAA Lys 140 GAA Glu AGA AAT Arg Asn CTA Leu ACC Thr 45 GCT Ala GAG Glu AAG Lys CAT His CTA Leu 125 GAG Glu GAC Asp TTT Phe 30 ATA lie GTA Val TTG AAT Leu Asn 15 GAA GAT Glu Asp TTT ATT Phe lie ACT ATC Thr lie AAC AAA Asn Lys GAT Asp GAT Asp 110 GCT Ala ACA Thr 95 AAT Asn TGT Cys ATT lie 80 AAA Lys AAG Lys GAA Glu GAT GAA TTG Asp Glu Leu 48 96 144 192 240 288 336 384 432 471 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

、1T 經 濟 部 中 標 準 局 員 工. 消 費 合 作 社 印 製 (15) S E Q ID (i )序列特徵 N〇：1 5的資料 (A )長度 (B )種類 1 0個胺基酸 胺基酸 (D )拓蹼學：直線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -48- 570801 A7 B7 五、發明説明46 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (i i )分子種類：胜肽 (V ) 片段種類：N端片段 (xi)序列描述：SEQ ID NO :15:

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser 1 5 l〇 (16) SEQ ID N〇：16 的資料 (1 )序列特徵 (A)長度：47 1個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股：雙股 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：c D N A (i X )特性

(A )名稱/關鍵：主胜肽 (B )位置：1 · . · 4 7 1 (C )確認方法：S (xi)序列描述：SEQ ID NO:16: 經滴部中央標準局員工消費合作社印製 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） 經濟部中央標牟局員工消費合作社印繁 570801 A7 B7 五、發明説明) TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG ΑΑΤ 48

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96

Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TCT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144

Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 工le Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60 TCT GTG AAG TCT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC GCT GAG AAC AAA ATT 240

Ser Val Lys Ser Glu Lys 工le Ser Thr Leu Ser Ala Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 lie Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336

Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys

100 105 llO ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TCT GAA 384

Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432

Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu 工le Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC · 471

Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155 (17) S E Q ID N 〇：1 7 的資料 (i )序列特徵 (A)長度：1 1464個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股：雙股 (D )拓蹼學：直線 (ii)分子種類：基因DNA (v i )來源·· (A )有機體：人 (G )細胞種類：胎盤 (i X )特性： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .€衣.

I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -50- 570801 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明48 ) (A )名稱/關鍵 (B )位置 (C )確認方法 (A )名稱/關鍵 (B )位置 (C )確認方法 (A )名稱/關鍵 (B )位置 (C )確認方法 (A )名稱/關鍵 (B )位置 (C )確認方法 (A )名稱/關鍵 (B )位置 (C )確認方法 (A )名稱/關鍵 (B )位置 (C )確認方法 (A )名稱/關鍵 (B )位置 (C )確認方法 (A )名稱/關鍵 (B )位置 (C )確認方法

：5 ^ U T R :1..3 :E :前導胜肽 :4 · . 8 2 :S :插入序列 ：8 3 . . . 1 4 5 3 :E :前導胜肽 :1 4 5 4 ——1 4 6 5 :S :插入序列 :1466. · .4 8 4 8 :E :前導胜肽 :4849. . .4 8 6 5 :S :主胜肽 :4866. . .4 9 8 3 :S :插入序列 :4984. . .6 3 1 7 :E (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -51 570801 A7 B7 五、發明説明49 ) (A )名稱/關鍵：主胜肽 (B)位置 ：6318···6451

(C )確認方法 ：S (A )名稱/關鍵：插入序列 (B)位置 ：6452···11224 (C )確認方法 ：Ε (A )名稱/關鍵：主胜肽 (B)位置 ：11225··· 11443

(C )確認方法 ：S

(A )名稱/關鍵：3 / U T R (B)位置 ：11444···11464 (C )確認方法 ：Ε (xi)序列描述 SEQ ID NO :17: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣

、1T 經濟部中央標率局員工消費合作社印繁

AAG ATG GCT GCT GAA CCA GTA GAA GAC AAT TGC ATC AAC TTT GTG GCA Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys 工le Asn Phe Val Ala-35 -30 -25 ATG AAA TTT ATT GAC AAT ACG CTT TAC TTT ATA G GTAAGG CTAATGCCAT Met Lys Phe 工le Asp Asn Thr Leu Tyr Phe 工le Ala-20 -15 -10 AGAACAAATA CCAGGTTCAG ATAAATCTAT TCAATTAGAA AAGATGTTGT GAGGTGAACT ATTAAGTGAC TCTTTGTGTC ACCAAATTTC ACTGTAATAT TAATGGCTCT TAAAAAAATA GTGGACCTCT AGAAATTAAC CACAACATGT CCAAGGTCTC AGCACCTTGT CACACCACGT GTCCTGGCAC TTTAATCAGC AGTAGCTCAC TCTCCAGTTG GCAGTAAGTG CACATCATGA 8 4 8 9 8 8 8 8 5 17 3 12 2 3 •Γ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -52- 570801 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

A7 ______B7五、發明説明έ〇 ) AAATCCCAGT TTTCATGGGA AAATCCCAGT TTTCATTGGA TTTCCATGGG AAAAATCCCA GTACAAAACT GGGTGCATTC AGGAAATACA ATTTCCCAAA GCAAATTGGC AAATTATGTA AGAGATTCTC TAAATTTAGA GTTCCGTGAA TTACACCATT TTATGTAAAT ATGTTTGACA AGTAAAAATT GATTCTTTTT TTTTTTTTCT GTTGCCCAGG CTGGAGTGCA GTGGCACAAT CTCTGCTCAC TGCAACCTCC ACCTCCTGGG TTCAAGCAAT TCTCCTGCCT CAGCCTTCTG AGTAGCTGGG ACTACAGGTG CATCCCGCCA TGCCTGGCTA ATTTTTGGGT ATTTTTACTA GAGACAGGGT TTTGGCATGT TGTCCAGGCT GGTCTTGGAC TCCTGATCTC AGATGATCCT CCTGGCTCGG GCTCCCAAAG TGCTGGGATT ACAGGCATGA ACCACCACAC ATGGCCTAAA AATTGATTCT TATGATTAAT CTCCTGTGAA CAATTTGGCT TCATTTGAAA GTTTGCCTTC ATTTGAAACC TTCATTTAAA AGCCTGAGCA ACAAAGTGAG ACCCCATCTC TACAAAAAAC TGCAAAATAT CCTGTGGACA CCTCCTACCT TCTGTGGAGG CTGAAGCAGG AGGATCACTT GAGCCTAGGA ATTTGAGCCT GCAGTGAGCT ATGATCCCAC CCCTACACTC CAGCCTGCAT GACAGTAGAC CCTGACACAC ACACACAAAA AAAAACCTTC ATAAAAAATT ATTAGTTGAC TTTTCTTAGG TGACTTTCCG TTTAAGCAAT AAATTTAAAA GTAAAATCTC TAATTTTAGA AAATTTATTT TTAGTTACAT ATTGAAATTT TTAAACCCTA GGTTTAAGTT TTATGTCTAA ATTACCTGAG AACACACTAA GTCTGATAAG CTTCATTTTA TGGGCCTTTT GGATGATTAT ATAATATTCT GATGAAAGCC AAGACAGACC CTTAAACCAT AAAAATAGGA GTTCGAGAAA GAGGAGTAGC AAAAGTAAAA GCTAGAATGA GATTGAATTC TGAGTCGAAA TACAAAATTT TACATATTCT GTTTCTCTCT TTTTCCCCCT CTTAG CT GAA GAT GAT G GTAAA Ala Glu Asp Asp Glu —10 GTAGAAATGA ATTTATTTTT CTTTGCAAAC TAAGTATCTG CTTGAGACAC ATCTATCTCA CCATTGTCAG CTGAGGAAAA AAAAAAATGG TTCTCATGCT ACCAATCTGC CTTCAAAGAA ATGTGGACTC AGTAGCACAG CTTTGGAATG AAGATGATCA TAAGAGATAC AAAGAAGAAC CTCTAGCAAA AGATGCTTCT CTATGCCTTA AAAAATTCTC CAGCTCTTAG AATCTACAAA ATAGACTTTG CCTGTTTCAT TGGTCCTAAG ATTAGCATGA AGCCATGGAT TCTGTTGTAG GGGGAGCGTT GCATAGGAAA AAGGGATTGA AGCATTAGAA TTGTCCAAAA TCAGTAACAC CTCCTCTCAG AAATGCTTTG GGAAGAAGCC TGGAAGGTTC CGGGTTGGTG GTGGGGTGGG GCAGAAAATT CTGGAAGTAG AGGAGATAGG AATGGGTGGG GCAAGAAGAC CACATTCAGA GGCCAAAAGC TGAAAGAAAC CATGGCATTT ATGATGAATT CAGGGTAATT CAGAATGGAA GTAGAGTAGG AGTAGGAGAC TGGTGAGAGG AGCTAGAGTG ATAAACAGGG TGTAGAGCAA GACGTTCTCT CACCCCAAGA TGTGAAATTT GGACTTTATC TTGGAGATAA TAGGGTTAAT TAAGCACAAT ATGTATTAGC TAGGGTAAAG ATTAGTTTGT TGTAACAAAG ACATCCAAAG ATACAGTAGC TGAATAAGAT AGAGAATTTT TCTCTCAAAG AAAGTCTAAG TAGGCAGCTC AGAAGTAGTA TGGCTGGAAG CAACCTGATG ATATTGGGAC CCCCAACCTT CTTCAGTCTT GTACCCATCA TCCCCTAGTT GTTGATCTCA CTCACATAGT TGAAAATCAT CATACTTCCT GGGTTCATAT CCCAGTTATC AAGAAAGGGT CAAGAGAAGT CAGGCTCATT CCTTTCAAAG ACTCTAATTG GAAGTTAAAC ACATCAATCC CCCTCATATT CCATTGACTA GAATTTAATC ACATGGCCAC ACCAAGTGCA AGGAAATCTG GAAAATATAA TCTTTATTCC AGGTAGCCAT ATGACTCTTT AAAATTCAGA AATAATATAT TTTTAAAATA TCATTCTGGC TTTGGTATAA AGAATTGATG GTGTGGGGTG AGGAGGCCAA AATTAAGGGT TGAGAGCCTA TTATTTTAGT TATTACAAGA AATGATGGTG TCATGAATTA AGGTAGACAT AGGGGAGTGC TGATGAGGAG CTGTGAATGG ATTTTAGAAA CACTTGAGAG AATCAATAGG ACATGATTTA GGGTTGGATT TGGAAAGGAG AAGAAAGTAG AAAAGATGAT GCCTACATTT TTCACTTAGG CAATTTGTAC CATTCAGTGA AATAGGGAAC ACAGGAGGAA GAGCAGGTTT TGGTGTATAC AAAGAGGAGG ATGGATGACG CATTTCGTTT TGGATCTGAG ATGTCTGTGG AACGTCCTAG TGGAGATGTC CACAAACTCT TCTACATGTG GTTCTGAGTT CAGGACACAG ATTTGGGCTG GAGATAGAGA TATTGTAGGC TTATACATAG AAATGGCATT TGAATCTATA GAGATAAAAA GACACATCAG AGGAAATGTG TAAAGTGAGA GAGGAAAAGC CAAGTACTGT GCTGGGGGGA ATACCTACAT TTAAAGGATG CAGTAGAAAG AAGCTAATAA ACAACAGAGA GCAGACTAAC CAAAAGGGGA GAAGAAAAAC CAAGAGAATT CCACCGACTC CCAGGAGAGC ATTTCAAGAT TGAGGGGATA GGTGTTGTGT TGAATTTTGC AGCCTTGAGA ATCAAGGGCC AGAACACAGC TTTTAGATTT AGCAACAAGG AGTTTGGTGA TCTCAGTGAA AGCAGCTTGA TGGTGAAATG GAGGCAGAGG CAGATTGCAA TGAGTGAAAC AGTGAATGGG AAGTGAAGAA ATGATACAGA TAATTCTTGC TAAAAGCTTG GCTGTTAAAA GGAGGAGAGA AACAAGACTA GCTGCAAAGT GAGATTGGGT TGATGGAGCA GTTTTAAATC TCAAAATAAA GAGCTTTGTG CTTTTTTGAT TATGAAAATA 398 458 518 578 638 698 758 818 878 938 998 1058 1118 8 8 8 8 8 7 3 9 5 1 12 2 3 4 11X11 1470 1530 1590 1650 1710 1770 1830 1890 1950 2010 2070 2130 2190 2250 2310 2370 2430 2490 2550 2610 2670 2730 2790 2850 2910 2970 3030 3090 3150 3210 3270 3330 3390 3450 3510 3570 請kj 閱 讀 背 意 事 項 再 % 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -53- 570801 A7 B7 五、發明説明h 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ATGTGTTAAT TGTAACTAAT TGAGGCAATG AAAAAAGATA ATAAAAACCA CCCAGAAATA ATGATAGCTA CCATTTTGAT TCTATGTATA TATACAGACA CAGAAATGCT TATATTTTTA CCTAAGCTGC TTTTTCTAGT TAGTGATATA TATGGACATC TGCAGTTATA TTAAGTTCAT GATATTTCAC AATAAGGGCA AATCAATTCT TAATTGGTGA ATGTTTGTTT CCAGTTTGTT CATAAGCATT CCTGTACACC AATGTTCACA CATTTGTCTG CCCAGGAGGT AGAATTGCTG GGTTGATAGA AGAGAAAGGA CAGTAGAGGG TACATGCCGA GCACAAATGG GATCAGCCCT TCTCATTTCC CCTTGGGACA AAAGGGAGAG AGGCAATAAC TGTACGTGGA GTAGCAGGAA ATCATTTGCT GAAAATGAAA GTCCTGAAGA GAGCAAAGAA AATTTGAAAT TGCGGCTATC AACTGGAAAA CAAAAGAAGT ATTGACAATT GGTATGCTTG CTTGTGCCAT TGTTCACCAG CAGCACTCAG CAGCCAAGTT ACAAATAAGT TAGGGATTTA ATATCCTGGC CAAATGGTAG CAGCTGCACA GGGAAGGAAG GGAAGACGGG AAGAGGTTAG GAGACTGGAA GATGTTGTGA TATTTAAGAA CACATAGAGT ACTAGAAGGG TAAGAGACCG GTCAGAAAGT AGGCTATTTG GAGTAGTTCT GAATGGTAAC AAGAAATTGA GTGTGCCTTT TAGGCAACTT TATTGTAGCT ACTTCTGGAA CAGAAGATTG CTAAAATATA TAGCATACTT ATTTGTCAAT TAACAAAGAA ATTTAATGTT TATTGTAG AA AAC CTG GAA TCA GAT Glu Asn Leu Glu Ser Asp -5 GTC ATA AGA AAT TTG AAT Val lie Arg Asn Leu Asn 15 CGG CCT CTA TTT GAA GAT lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 25 30 TGT AGA G GTATTTTTT TTAATTCGCA AACATAGAAA Cys Arg Asp 40 TTCTGTTTTA CTGCTTACAT TGTTCCGTGC TAGTCCCAAT GAGTGACAAT AATTTCACTT ACAGGAAACT TTATAAGGCA TAAAAAATTG GATACAATAA GACATTGCTA GGGGTCATGC ATCACCAATC CCTTTATTGT GATTGCATTA ACTGTTTAAA AATCCCTGCT TGTTACAGCT GAAAATGCTG ATAGTTTACC GTAATCCTAG CTACTTGGGA GGCTCAAGCA GGAGGATTGC CTGTAGTACA CTGTGATCGT ACCTGTGAAT AGCCACTGCA AGACCTTGTC TCTAAAATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAC AAGTCTACTG TGCCTTCCAA AACATGAATT CCAAATATCA AGTGAATGTG CATTCTTTAA AAATACTGAA TACTTACCTT TATTTAGCAT TTAAAAGTTA AAAACAATCT TTTAGAATTC AAAGTTGCAG CGTGTGTGTT GTAATACACA TTAAACTGTG ATGCAGTTTC ACTCTGTCAC CCAGGCTGAA GTGCAGTGCA CTCACTACAA CCTCCACCTC CCACGTTCAA GCGATTCTCA GTGGGATTAC AGGCATGCAC CACTTACACC CGGCTAATTT GGGTTTCACC ATGTTGGCCA GGCTGGTCTC AAACCCCTAA TCAGCCTCCC AAACAAACAA ACAACCCCAC AGTTTAATAT CAACTTTTAT GAGTATTTTA ATGATATAGA TTATAAAAGG CTGGGATTAC AGGCATGAGC CACTGTGCCA GGCCTGAACT CCAGCTGTAC ATAGTCTCCT GCAGACTGGC CAAGTCTCAA GGACTATCCT TTGGTTAAAT TTCCGCAAAT GTTCCTGTGC TTCTCATTTA TTATATTTAT TTCAG AT AAT GCA CCC Asp Asn Ala Pro

GAA TCT AAA TTA TCA Glu Ser Lys Leu Ser 10 ATT GAC CAA GGA AAT

ATAATATGAA AGATAAAAAT ACAATATTTC TACACTCCTT TTAAAAGGGA TTGTACTATA TCTCCATGGC AACGAGTAAT TATCTTTGCC CTTTTTATTT GTTGTTATTA ACAATGTTCC ATTTTTTCTT CAGGATAAAA TGATTGCCAA ATTAAAGCTT AGATACCAGA AATGGCACTT TGTGCTGCCA GAGTTAAATT ACAGAGATGA TGTTGTAGAG AGCTATGGAA GAGAGTGCTG TAATGGCACC GATTTGAACG TGGAGTTTTG TAGCAGAAAG ACAAAATGAA CTCTGAGATC ATAGGAAATA CAAGAGTCAG TGGAGTAAAA GTGTAAGAAA AAGTTAACAC TTCAGAGGCA GAGAGTAGGT TAAAAAACAA TCATTAATAG TTTTAGAAAA ACTATGTATT TTTAAATGAG TAC TTT GGC AAG CTT Tyr Phe Gly Lys Leu 1 5 GAC CAA GTT CTC TTC Asp Gin Val Leu Phe 20 ATG ACT GAT TCT GAC Met Thr Asp Ser Asp 35 TGACTAGCTA CTTCTTCCCA CCTCAGATGA AAAGTCACAG TCCACGTTTT TTAGTTGGGG CTCTCTGAGC CTGCCTTTGA ACCTCTATAG TTGGATGCTT AGGTGTGGTG GCATCTATCT TTGAGGCCAG GACTTTGAGG CTCCAGCCTG GGTGATATAC CTTAGGAAAG GAAATTGATC AAGTTAGGCT GAGTTGAAGC AACATATATT TTAAATATTT ATATCTTTAA AATACTCAAA GGGTTGTTTG TTTGTTTGAG GTGCAGTGGT GTGATCTCGG TGCCTCAGTC TCCCGAGTAG TTGTATTTTT AGTAGAGCTG CCTCAAGTGA TCTGCCTGCC GTGTTACAAC ACACATGCTG TTGTTTTTAA CTTTTAAATG GTGTTTTTAA AAATGTCTGA AGTGGGAACA GGTGTATTAA AAGAATTCTT CTAACTAGAG CGG ACC ATA TTT ATT Arg Thr lie Phe lie oooooooooooooooooooooo 3951739517395173951738 6678899011223445567788 3333333444444444444444 4928 4976 5032 5092 5152 5212 5272 5332 5392 5452 5512 5572 5632 5692 5752 5812 5872 5932 5992 6052 6112 6172 6232 6292 6343 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T -. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -54- 570801 A7 B7 五、發明説明匕

40 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT 工le Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly 50 55 GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Thr Leu Ser 70 75 TCC TTT AAG GTAAG ACTGAGCCTT ACTTTGTTTT Ser Phe Lys TTATTTCTAA TGTTAATATA TTTTGTCTAG AACAGAAATA ATTATCAAAC TCTTTACCTA GAGGAGATAC AACACTTGTT TAATAATGTA GAATACATAT TGAGTTCTGC TATGAAGAAT TATGATAATA TTTTAATCCC 經 濟 部 中 央 標 準 局 員 工 消 t 合 作 社 印

TCT Ser 65 ATT lie ATATAATTAG AAATATAACA CAAATATCCT CAGACCAACC AAAGTGAATA CTTACTAAAA CTGAGCCTGT CACAGGGGAA ACAATCAGTC TTTATACAAA TAACATGTGA CTTTCCAGAA ATTTCTACAC CTTTGTAAAT CTTAGCCTAA GTCTTAGACA CAAGCTTCAG CTTCCAGTTG TAATCTAATT GAATAAAAGT TATGAGATCA GCTGTAAAAG AAAGTATTTC TGGCCTCTAC TTTTTCTCTA TCTCTATTTC CTCCATTATT GTTAGATAAA AGTAAGAGTA GCCAGGGATG CTTACAAATT TGAAGACTCT TTTTGAGTGG AGATTTGCCA CCCACTGAAA GACAGTTAGG ATATGACCTT GAGAAAAAAG CCACTCTAAA ATATAATCCA GCCCCCAGAC AAATCCCTCA GCTATCTCCC AATTTGGAGT CCCCATTCTA GACCTGACAG GCATAAGAGG CCTGGGATGG AAGGGTAGGG TGGAAAGGGT AACATAATTA GAAGGGAAGG AGATGGCCAA GCTCAAGCTA AGCTGCAGAG GCAGATTCAG AAACTGGGAT AAGTCCGAAC AGGGAGACTG GTGAAAATGT TAAGAAGATG GAAATAATGC GGCAAATCCA TATTTGGGGG AGCCTGAAGT TTATTCAATT AAAGAATGTG GCTGGGCGTG GTGGCTCACA CCTGTAATCC GGGGGCGGAT CACCTGAAGT CAGGAGTTCA AGACCAGCCT ATCTCTACTA AAAATACAAA ATTAGCTGGG CGTGGTGGCA CTCGGGAGGC TGAGGCAGGA GAATCTTTTG AACCCGGGAG AGATCGTGCC ATTGCACTCC AGCCTGGGCA ACAAGAGCAA AAAAAAAAAG TGAAATTAAC CAAAGGCATT AGCTTAATAA GGGCGGGGGG TGGCTGGAAG AGATCTGTGT AAATGAGGGA CAGCATCATA GCAAATCTGC TTCTGGAAGG AACTCAATAA GAGAGTGAGG GGTGGACTAG GACCAGTTTT AGCCCTTGTC CTAATAAGGA TCTTAGCAGT GGTTATAAAA GTGGCCTAGG CAGGCCAGGC ACAGTGGCTC ATGCCTATAA TCCCAGCACT TCTCACTTGA GATCAGGAGT TCAAGACCAG CCTGGCCAGC CTAAAAAAAA TACAAAAATT AGCCAGGCAT GGTGGCATGC GTGAGCCTGA GGCAGAAGAA TCGCTTGAAA CCAGGAGGTG TCGCACCACT GCACTCCAGC CTGGGCGACA GAATGAGACT GATACAACAG GCTACCCTTA TGTGCTCACC TTTCACTGTT TATAAAGTTC TTTGGTCAAG AACCTTGACA ACACTAAGAG CTGTTTCATA TATATACATA TACATGTATA TCCCTCAGAC TTTCCAGTGC ACTTGGGAGA CAGATTCAAC CCCTTCTGAT GTAAAAAAAA TGGAGCACTC AAGTTTCACC AGGTGGGGCT AAGGTCATTG GGATTGCTTT CACATCCATT TGCTATGTAC GTGGTCAACA TCAAAACTAG GAAAGCTACT GCCCAAGGAT ATGTGCAATA AGTGTGATTA AAGAGATTGC CTGTTCTACC ACTGTAACTT TCTTTTTTTC TTTTTTTCTT TTTTTCTTTT

45 ATG GCT GTA ACT ATC Met Ala Val Thr lie 60 TGT GAG AAC AAA ATT Cys Glu Asn Lys lie 80 CAATCATGTT AATATAATCA 6391 6439 6496

AGCCAGGTAT CTATTATTTT AGACTGAGCC TTCCATGTCA CCACCCAGTC ACTTGGTAGG AACAGATACA TTCAGGTGAC

CTGTCAGAGT TGGCCAGGGT TCCCTGGATT CCTTTCCCCT

AGTAATGTAA ACAAGAAGCA TTGTGATAAT TTATGACCTG GTGAGTTATA GAAGCTAATT TAGTTGTTTT ATGTATGTTA TAATGCTATA TTATTCTCCA CCACAATTAA GGCAATGCTT ATAAATATCC AGTGAAGGTA AGTAAGAACA TCCAACCAGA GCAGCTTAGT TAAGCATGCT TGTGGGATAG CTACAGGTGG TTGGCACTTA TTGATGGCCC CAGCACTTTG GACCAACATG TATGCCTGTA GCAGAGGTTG AACTCGGTCT TTTAATACTG ATCTGACATT ATATTAGTTG TTTAATCCCT TTCTAGATAA TTGGGAGGGC ATGGCGATAC ACCTGTAATC TAGGCTGCAG TTGTCTCAAA GATTACTAGC GGATTTGCTT TATGTATCTA TGTTAGGTCA AAAAAAAAAA TTCCAAGTTG CTTCCCTATG GTCCTTACCT TATCCACACT TTTTTGAAAC

TTAGAAAACT GAGAACCATT GATGGTTTTT CATCTCCTGA CATTTAAGAA ATCCTTCTAT GTTGCTGATC TTTTTAATGT ATTATCTTCA TTATTATTCT CTATAGCTAC CAGAGGAGAA GCTTTCATGC CCAAGGGGCA GTGCATATGC GTGCCACCCC TATCAAAATA GTTACTGAAC AGGAAAACTC ATTCTTGTTG GTAGGAACTG TTTTAAATAA GGAGGCCGAG GAGAAACCCC ATCCCAGCTA CGATGAGCCT CAAAAAAAAA TTTTTAAGTA TAAGCTTCAT GAGGGGGGGA TTTCCTGCCA TAAGATACAA AAGGCGAGTG TCTGTCTCTA CCAGCTACTC TGAGCTGAGA AAAAGAAAAA TATAAAGTCC TGAGAGGTTA TATCCAGGCT ATATCAACTT GAAAGAAATC GGGGTTCTCC ATGGCTGGGA CTATTCTGAA CTCGCTTTCA GGAGTCTCGC 66666666666666666666666666666666666666666666666 51739517395173951739517395173951739517395173951 56677899001223345566788990112234455677889001123 66666666777777777777777778888888888888888999999 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T __ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -55- 570801 A7 B7 五、發明説明) TCTGTCGCCC AGGCTAGAGT GCAGTGGCAC GATCTCAGCT CACTGCAAGC TCTGCCTCCC GGGTTCACGC CATTCTCCTG CCTCACCCTC CCAAGCAGCT GGGACTACAG GCGCCTGCCA CCATGCCCAG CTAATTTTTT GTATTTTTAG TAGAGACGGG GTTTCACCGT GTTAGCCAGG ATGGTCTCGA TCTCCTGAAC TTGTGATCCG CCCGCCTCAG CCTCCCAAAG TGCTGGGATT ACAGGCGTGA GCCATCGCAC CCGGCTCAAC TGTAACTTTC TATACTGGTT CATCTTCCCC TGTAATGTTA CTAGAGCTTT TGAAGTTTTG GCTATGGATT ATTTCTCATT TATACATTAG ATTTCAGATT AGTTCCAAAT TGATGCCCAC AGCTTAGGGT CTCTTCCTAA ATTGTATATT GTAGACAGCT GCAGAAGTGG GTGCCAATAG GGGAACTAGT TTATACTTTC ATCAACTTAG GACCCACACT TGTTGATAAA GAACAAAGGT CAAGAGTTAT GACTACTGAT TCCACAACTG ATTGAGAAGT TGGAGATAAC CCCGTGACCT CTGCCATCCA GAGTCTTTCA GGCATCTTTG AAGGATGAAG AAATGCTATT TTAATTTTGG AGGTTTCTCT ATCAGTGCTT AGGATCATGG GAATCTGTGC TGCCATGAGG CCAAAATTAA GTCCAAAACA TCTACTGGTT CCAGGATTAA CATGGAAGAA CCTTAGGTGG TGCCCACATG TTCTGATCCA TCCTGCAAAA TAGACATGCT GCACTAACAG GAAAAGTGCA GGCAGCACTA CCAGTTGGAT AACCTGCAAG ATTATAGTTT CAAGTAATCT AACCATTTCT CACAAGGCCC TATTCTGTGA CTGAAACATA CAAGAATCTG CATTTGGCCT TCTAAGGCAG GGCCCAGCCA AGGAGACCAT ATTCAGGACA GAAATTCAAG ACTACTATGG AACTGGAGTG CTTGGCAGGG AAGACAGAGT CAAGGACTGC CAACTGAGCC AATACAGCAG GCTTACACAG GAACCCAGGG CCTAGCCCTA CAACAATTAT TGGGTCTATT CACTGTAAGT TTTAATTTCA GGCTCCACTG AAAGAGTAAG CTAAGATTCC TGGCACTTTC TGTCTCTCTC ACAGTTGGCT CAGAAATGAG AACTGGTCAG GCCAGGCATG GTGGCTTACA CCTGGAATCC CAGCACTTTG GGAGGCCGAA GTGGGAGGGT CACTTGAGGC CAGGAGTTCA GGACCAGCTT AGGCAACAAA GTGAGATACC CCCTGACCCC TTCTCTACAA AAATAAATTT TAAAAATTAG CCAAATGTGG TGGTGTATAC TTACAGTCCC AGCTACTCAG GAGGCTGAGG CAGGGGGATT GCTTGAGCCC AGGAATTCAA GGCTGCAGTG AGCTATGATT TCACCACTGC ACTTCTGGCT GGGCAACAGA GCGAGACCCT GTCTCAAAGC AAAAAGAAAA AGAAACTAGA ACTAGCCTAA GTTTGTGGGA GGAGGTCATC ATCGTCTTTA GCCGTGAATG GTTATTATAG AGGACAGAAA TTGACATTAG CCCAAAAAGC TTGTGGTCTT TGCTGGAACT CTACTTAATC TTGAGCAAAT GTGGACACCA CTCAATGGGA GAGGAGAGAA GTAAGCTGTT TGATGTATAG GGGAAAACTA GAGGCCTGGA ACTGAATATG CATCCCATGA CAGGGAGAAT AGGAGATTCG GAGTTAAGAA GGAGAGGAGG TCAGTACTGC TGTTCAGAGA TTTTTTTTAT GTAACTCTTG AGAAGCAAAA CTACTTTTGT TCTGTTTGGT AATATACTTC AAAACAAACT TCATATATTC AAATTGTTCA TGTCCTGAAA TAATTAGGTA ATGTTTTTTT CTCTATAG GAA ATG AAT Glu Met Asn 85 CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG Pro Pro Asp Asn 工le Lys Asp Thr Lys Ser Asp lie lie Phe Phe Glu 90 95 100 AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser 105 110 115 TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys 125 130 135 TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser 工le Met Phe 140 145 150 CAA AAC GAA GAC TAGCTATTAA AATTTCATGC C Gin Asn Glu Asp 155 員 工 9376 9436 9496 9556 9616 9676 9736 9796 9856 9916 9976 10036 10096 10156 10216 10276 10336 10396 10456 10516 10576 10636 10696 10756 10816 10876 10936 10996 11056 11116 11176 11233 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 % 訂 § CTC ATT 霖 Leu lie t 矣 ACT GTT 標 Thr Val 率 合 作 社 印 製 11281 11329 11377 11425 11464

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -56- 570801 A7 B7 N 0 ： 1 8 五、發明説明) (1 8 ) S E Q ID N〇：18 的資料 (i )序列特徵 (A)長度：47 1個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股：雙股 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：對應於mDNA之cDNA (v i )來源： (A )有機體：老鼠 (G )細胞種類：肝 (i X )特性：

(A )名稱/關鍵：主胜肽 (B )位置：1 · · · 4 7 1 (C )確認方法：S (X i )序列描述：S E Q ID (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

、1T 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 AAC Asn 1 GAC Asp ACT Thr TAC Tyr GTG Val 65 TCC Ser TTT GGC CGA Phe Gly Arg CAA Gin GAT Asp ATG Met 50 AAG Lys GTT Val ATT lie 35 TAC Tyr CTC Leu 20 GAT Asp AAA Lys GAT AGT Asp Ser TTT GAG GAA Phe Glu Glu GAT CTC ATA TTC Asp Leu lie Phe 100 CTT Leu 5 TTC Phe CAA Gin GAC Asp AAA Lys ATG Met 85 TTT Phe CAC His GTT Val AGT Ser AGT Ser ATG Met 70 GAT Asp CAG Gin TGT Cys GAC Asp GCC Ala GAA Glu 55 TCT Ser CCA Pro AAA Lys ACA ACC Thr Thr AAA Lys AGT Ser 40 GTA Val AGA Arg 25 GAA Glu AGA Arg ACC CTC Thr Leu CCT GAA Pro Glu CGT GTT Arg Val 105 GCA Ala 10 CAG Gin CCC Pro GGA Gly TCC Ser AAT Asn 90 CCA Pro GTA Val CCT Pro CAG Gin CTG Leu TGT Cys 75 ATT lie GGA Gly ATA CGG AAT 工le Arg Asn GTG TTC Val Phe ACC Thr GCT Ala 60 AAG Lys AGA Arg 45 GTG Val AAC Asn GAG Glu 30 CTG Leu ACC Thr AAG Lys ATA lie 15 GAT Asp ATA lie CTC Leu ATC lie GAT GAT ATA CAA Asp Asp lie Gin 95 CAC AAC AAG ATG His Asn Lys Met: 110 AAT Asn ATG Met ATA lie TCT Ser ATT lie 80 AGT Ser GAG Glu 48 96 144 192 240 288 336 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -57- 570801 A7 B7 五、發明説明fc5·) TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384

Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gin Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432

Asp Asp Ala Phe Lys Leu 工le Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471

Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gin Ser 145 150 155 (19) S E Q ID N〇：19 的資料 (i )序列特徵 (A )長度：9個胺基酸 (B)種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i)分子種類：胜肽 (v ) 片段種類：N端片段 (X i )序列描述·· S E Q ID N 0 ： 1 9 ·*

Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr 1 5 (20) S E Q ID N〇：20 的資料 (i )序列特徵 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

(A )長度：1 5 7個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO :20: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -58- 570801 A7 B7 五、發明説明έ6 Tyr Phe Gly Lys 1 Asp Gin Val Leu 20 Met Thr Asp Ser 35 工le Ser Met Tyr 50 Ser Val Lys Ser 65 lie Ser Phe Lys Ser Asp 工le lie 100 Met Gin Phe Glu 115 Lys Glu Arg Asp 130 Gly Asp Arg Ser 145

Leu 5 Phe Asp Lys Glu Glu 85 Phe Ser Leu lie

Glu lie Cys Asp Lys 70 Met Phe Ser Phe Met 150

Ser Asp Arg Ser 55 lie Asn Gin Ser Lys 135 Phe

Lys Gin Asp 40 Gin Ser Pro Arg Tyr 120 Leu Thr

Leu Ser Val 10 Asn Arg

Gly 25 Asn Pro Thr Pro Ser 105 Glu lie Val

Ala Pro Arg Gly Leu Ser 75 Asp Asn 90 Val Pro Gly Tyr Leu Lys Gin Asn 155 lie Pro Arg Met 60 Cys lie Gly Phe Lys 140 Glu

Arg Leu Thr 45 Ala Glu Lys His Leu 125 Glu Asp

Asn Leu Asn 15 Glu Asp

Phe 30 lie Val Asn Asp Asp 110 Ala Asp

Phe lie Thr lie Lys lie 80 Thr Lys 95 Asn Lys Cys Glu Glu Leu (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .€衣· D N〇：2 1的資料 2 1 ) S E Q (i )序列特徵 (A )長度： (B )種類 (D )拓蹼 (i i ) 分子 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 ： 2 :1 5 7個胺基酸 :胺基酸 學：直線 種類：胜肽 訂 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製

Tyr Phe Gly Lys Leu 1 5 Asp Gin Val Leu Phe 20 Met Thr Asp Ser Asp 35 工le Ser Met Tyr Lys 50 Ser Val Lys Ser Glu 65 lie Ser Phe Lys Glu 85 Ser Asp lie lie Phe 100 Met Gin Phe Glu Ser 115 Lys Glu Arg Asp Leu 130 Gly Asp Arg Ser lie —145 ϋ氏張尺度適用中國國家標準（CNS

Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn 10 15 工le Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 25 30 Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 40 45 Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 55 60 Lys 工le Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 70 75 80 Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 90 95 Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 105 110 Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 120 125 Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 135 140 Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 150 155 )A4規格（210X297公釐） _ 59 _ 570801 A7 B7 五、發明説明έ7 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 (22) S E Q ID NO :22 的資料 (i )序列特徵 (A)長度：157個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SEQ ID N〇：22: Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工 le Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60 Ser Val Lys Ser GlU-Lys lie Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lya_Ile 65 70 75 — 80 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp 工le lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155 (23) S E Q ID N〇：23 的資料 (1 )序列特徵 (A)長度：157個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 ： 2 3 * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

、1T 辞 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X 297公釐） -60- 570801 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明έ8 )

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn 15 10 15

Asp Gin Val Leu Phe 工le Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30

Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 工le Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60

Ser Val Lys Ser Glu Lys lie Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 lie Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95

Ser Asp 工le lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110

Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125

Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu 工le Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140

Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155 (24) S E Q ID NO :24 的資料 (i )序列特徵 (A )長度：1 5 7個胺基酸 (B)種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SEQ ID N〇：24:

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 —

Asp Gin Val Leu Phe 工le Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30

Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60

Ser Val Lys Ser Glu Lys lie Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95

Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110

Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125

Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140

Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155_ $紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X；297公釐） ^61 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 570801 A7 B7 五、發明説明b ) (25) S E Q ID NO :25 的資料 (i )序列特徵 (A)長度：157個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i，i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 25:

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn 15 10 15

Asp Gin Val Leu Phe 工le Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30

Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 工le Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60

Ser Val Lys Ser Glu Lys 工le Ser Thr Leu Ser Ala Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95

Ser Asp 工le lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110

Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125

Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140

Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155 (26) SEQ ID NO :26 的資料 (i )序列特徵 (A )長度：1 5 7個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SEQ ID N〇：26: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T •I. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） · 62 - 570801 A7 B7 五、發明説明έο

Tyr 1 Asp Met lie Ser 65 lie Ser Met Lys

Phe Gly Lys Leu 5 Gin Val Leu Phe 20 Thr Asp Ser Asp 35 Ser Met Tyr Lys 50 Val Lys Ser Glu

Glu Ser Lys Leu 工le Asp Ser Arg

Asp Ser 55 Lys lie 70 Met Asn

Gin Gly 25 Asp Asn 40 Gin Pro

Ser Phe Lys Glu 85 Asp lie 工le Phe Phe Gin 100 Gin Phe Glu Ser Ser Ser 115 Glu Arg Asp Leu Phe Lys

Ser Thr Pro Pro Arg Ser 105 Tyr Glu 120 Leu lie

Ser 10 Asn Ala Arg Leu Asp 90 Val Gly Leu

Val Arg Pro Gly Ser 75 Asn Pro Tyr Lys 工le Arg Asn Pro Arg

Gly 145 130 Asp Arg Ser lie 135 Met Phe 150

Thr Val Gin

Asn 155

Met 60 Ala lie Gly Phe Lys 140 Glu

Leu Phe 30 Thr lie 45 Ala Val

Glu Asn Lys Asp His Asp 110 Leu Ala 125 Glu Asp Asp

Leu Asn 15 Glu Asp Phe lie Thr lie Lys lie 80 Thr Lys 95 Asn Lys Ser Glu Glu Leu (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 2 7 ) S E Q ID N〇：27的資料 (i )序列特徵 (A )長度：1 (B )種類：胺基 (D )拓蹼學：直 (i i )分子種類： 7個胺基酸 酸 線 胜肽 、\各

X

序列描述：S E Q 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印繁

Asn Phe Gly Arg Leu His Ala 1 5 Asp Gin Val Leu Phe Val Asp 20 Thr Asp lie Asp Gin Ser Ala 35 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu 50 55 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser 65 70 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro 85 Asp Leu lie Phe Phe Gin Lys 100 Phe Glu Ser Ser LeU Tyr Glu 115 Asp Asp Ala Phe Lys Leu lie 130 135 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu 145 150

Thr Thr Ala 10 Lys Arg Gin 25 Ser Glu Pro 40 Val Arg Gly Thr Leu Ser Pro Glu Asn 90 Arg Val Pro 105 Gly His Phe 120 Leu Lys Lys Thr Asn Leu D N〇： Val 工le Arg Pro Val Phe Gin Thr Arg 45 Leu Ala Val 60 Cys Lys Asn 75 工le Asp Asp Gly His Asn Leu Ala Cys 125 Lys Asp Glu 140 His Gin Ser 155 2 1' Asn lie Asn 15 Glu Asp Met 30 Leu lie lie Thr Leu Ser Lys lie lie 80 lie Gin Ser 95 Lys Met Glu 110 Gin Lys Glu Asn Gly Asp 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -63- 570801 A7 B7 五、發明説明έι ) (28) s E Q ID NO :28 的資料 (i )序列特徵 (A)長度：157個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (i i )分子種類：胜肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO :28:

Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val 工le Arg Asn lie Asn 15 10 15

Asp Gin Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gin Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30

Thr Asp 工le Asp Gin Ser Ala Ser Glu Pro Gin Thr Arg Leu lie lie 35 40 45

Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60

Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys 工le lie 65 70 75 80

Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn lie Asp Asp lie Gin Ser 85 90 95

Asp Leu 工le Phe Phe Gin Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110

Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Ser Gin Lys Glu 115 120 125

Asp Asp Ala Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140

Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gin Ser 145 150 155 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .€衣· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -64 -

Claims (1)

1. 57080Γ a 修正補充

   六、申請專利範圍 第87102640號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國92年3月4日修正 1 . 一種蝕骨細胞增生抑制劑，其包含具有SEQ ID No； 6或7之胺基酸序列的間白素—18(IL-18)或其功能性同 等物，該功能性同等物係上述之2個胺基酸序列的1或多 個半胱胺酸殘基係由其他之胺基酸殘基取代。 SEQ ID NO: 6: Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie Arg Asn Leu Asn 1 .5 . . . 10 15 Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 ^ 40 45 lie Ser Met; Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 ▲ 70 7 5 80 lie Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys Θ5 90 95 Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met: Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tvr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 1.30 135 140 Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 145 150 155 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） 570801 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 r h T r 1 r y a 5 e T V 6 s p e s h A p p s 5 s y4 A LI spa y s 1 CAA sir i a e H V s u e n e h 1 L 5PG 9 υ p r e o s A L 2 A y 1 e Ti 0 Tx c m mj i · ( i G V I 3 TAG I s 1 A > e-nptseuu pmir h 1 s e o y h e l 52 35e pl·G A M.5L p L G A 1 s 5 c/ mj i M yelhoehe L s G PIS p M r p υ e rsally sllliela;a r υ e o r e p ste u s e s y e 5 h e y h A L M8PL L p l· J ( ί 1 ( — M 1 5 e ry-1 13Je G 5 s p L G 11 L r o h 5 T 1 s r t p n ^ ^ eleo s 1 y e I T Μ 7AG L( rsr lro h y e o a h r T L s 4 V T p g you r 1 2 e A GIL r h T Ion a r 1 V p G a η o 1 o lr A 1 G p r 9 υ h r 5 1 T A 2 G e a V r h T 9 υ υ 15s s n r el a o i y s A L G V 1 H L A υ e L y τα G 9 G L r n o e s u e s ο r h ye s A 9 p p L L 1 o y s A 6 L p s A s e y5 1 c 7 I s a i 1 HA y u 1 e po n s 4 1 A 1 G s s 5 y i 5 L HI nuur s 1 oeh A G 3 L T 9 0 9 1 r h r 5 a A p A 4 V s e son n y 1 yl1 s L'IL'r-I GA η p n s 5 υ s s s Y-2 1 AA A c 1 G r e s ntereruup S β 1eloell s AΜI s I 8 s G G A epe. uentsy 15s 1e1 15ey 1 I 1 A 1 L I G ^ M L G (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印^ Phe Glu Asp Met Thr Asp 1 5 2 ·如申請專利範圍第1項之抑制劑，其中該IL·1 8包 括SEQ ID N0:1、2及3之胺基酸序列以作爲部份胺基酸 序列。 SEQ ID NO： 1· Λ3Π asp Gin val Leu Phe • SEQ ID NO: 2: SEQ ID NO： 3： Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys 1 5 如申請專利範圍第1項之抑制劑，其中該IL-1 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS〉A4規格（2】0X297公釐） -2 - 570801 ABCD 六、申請專利範圍 包括SEQ ID NO: 4和5之胺基酸序列以作爲部份胺基酸 序列。 SEQ ID NO: 4: Met Tyr Lys Asp Ser 1 5 SEQ ID NO: 5: Ser Thr Leu Ser Cys 1 5 4 ·如申請專利範圍第1項之抑制劑，其中該I_ L 一 1 8是人類來源。 5 .如申請專利範圍第1項之抑制劑，其係蝕骨細胞 相關疾病之治療劑。 6 ·如申請專利範圍第1項之抑制劑，其含有蛋白質 、緩衝劑或醣類以作爲安定劑。 7 ·如申請專利範圍第1項之抑制劑，其係爲液體、 糊膏或固體之型式。 8 .如申請專利範圍第1項之抑制劑，其含有 0·000002-100w/w%的該IL一18。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝* 訂 錄 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公嫠） -3-