KR940003650B1 - 흉선 간질-유래 t세포 성장인자 및 그의 제조방법 - Google Patents

흉선 간질-유래 t세포 성장인자 및 그의 제조방법 Download PDF

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요시또시 가즈오
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Description

흉선 간질-유래 T세포 성장인자 및 그의 제조방법
제1도는 TSCF 배양 SN에 의한 9-16Th 클론의 증식을 나타낸다.
제2도는 TSCF 배양 SN에서의 TSTGF의 기(phase)-의존성 생산을 나타낸다.
제3도는 각종 림포카인 또는 모노카인이 9-16Th 클론의 증식을 자극하는 능력을 나타낸다.
제4도는 항-IL2 수용기 또는 항-IL4 항체가 Th 클론의 TSTGF-, IL2-, 또는 IL4-유도 증식에 미치는 효과를 나타낸다.
제5도는 DEAE-세파셀 컬럼으로 부터의 TSTGF 활성의 용출 형태를 나타낸다.
제6도는 크로마토포커싱으로 부터의 TSTGF 활성의 용출 형태를 나타낸다.
제7도는 부분 정제 및 농축된 TSTGF 시료에 의한 TSTGF 활성의 투여량 응답 곡선을 나타낸다.
제8도는 세파크릴 S-200컬럼 크로마토그래피에 의한 TSTGF의 분자량 측정 결과를 나타낸다.
제9도는 SDS-PAGE의 분자량 측정 결과를 나타낸다.
제10도는 L3T4+및/또는 Lyt 2+세포 제거후 성인 흉선 세포의 플로우 마이크로플루오로메트리(Flowmicrofluormetry(FMF)) 분석을 나타낸다.
제11도는 L3T4-Lyt2-흉선 세포에 대한 TSTGF의 투여량 의존성 성장-촉진 효과를 나타낸다.
제12도는 항-IL2 수용기 또는 항-IL4 항체가 TSTGF+PMA에 의해 유도된 이중 음성 흉선 세포의 증식을 억제하지 못함을 나타낸다.
제13도는 이중 음성 흉선 세포의 성장 촉진에 대한 TSTGF+IL1의 상승 효과를 나타낸다.
제14도는(TSTGF+IL1) 및 IL2 또는 IL4의 조합으로 이중 음성 흉선 세포의 증식이 증강됨을 나타낸다.
제15도는 L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 성인 흉선 세포의 분리를 나타낸다.
본 발명은 흉선 간질-유래 T세포 성장 인자(이하 TSTGF) 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
흉선 간질은 T세포계의 전구체가 면역 적합 말초 T임파 세포로 적절히 발달되는데 필수적인 미소환경임이 입증되어 있다(Phisiol. Rev. 47 : 437, 1967, Cancer Res. 28 : 21, 1968, Ann. N.Y.Acad.Sci.249 : 493, 1975, Immunol. Rev. 42 : 138, 1978, J.Immunol, 123 : 984, 1979). 흉선 간질은 모두 흉선에서 T세포계의 분화 및/또는 증식에 관하여는 최소한 세가지 성분 : 섬유 아세포-유사세포, 상피 세포-유사 세포 및 대식 세포- 유사 세포로 이루어져 있다(J.Reti-culoendothel. Sci. 26 : 385, 1979, J. Immunol. 124 : 1433, 1980, Nature 287 : 44, 1980, J. Immunol. 134 : 2155, 1985, Thymus 2 : 193, 1981). 사실상, 흉선 간질 조직의 일차 외식은 혼합 임파세포 반응내에서 식물성 혈구응집소 자극하에 미성숙 흉선 세포를 대응 세포로 성숙시키는 효과를 갖을 수 있다고 보고되어 있다(J. Exp. Med. 136 : 1483, 1972, J. Immunol. 121 : 1861, 1978).
흉선 간질은 세포 접촉을 포함하는 과정을 통해서뿐만 아니라, 액소성 인자에 의해 조정되는 과정을 통해서도 기능적으로 미성숙한 흉선 세포에 그 효과를 나타낼 수 있다. 사실상, 흉선 간질 성분에서 유래된 다양한 가용성 조정기가 미성숙 흉선 세포의 성숙, 세포 표면에서의 마커 항원의 형질 발현 및 증식 응답에서의 반응에 영향을 미친다고 보고 되어 있다(Thumus 1 : 163, 1979, Prog. Allergy 21 : 342, 1976, In Biological Responses in Cancer, Vol. I, E. Mihick, ed, Pleum. New York, P. 219, 1982). 특히, 흉선 자체의 일차 외식 배양 상층액(SN)에 존재하는 이런 종류의 인자에 대해 보고 되어 있다(Kruisbeek et al., J. Immunol. 125 : 995, 1980 ; Eur. J. Immunol. 7 : 375, 1977 ; J. Immunol. 123 : 984 1979). 흉선 간질에서 유래된 것으로 여겨지는 이 가용성 인자는 흉선 간질 조직의 배양 외식에서 얻어진 상층액에서 또한 수득된다. 그러나, 순수한 세포주-배양의 결핍으로 정확한 세포 기원 및 이 인자의 정확한 능력에 관한 해석은 복잡하다. 그러므로, 흉선 간질의 일부 성분의 기능을 확실히 밝히기 위해서는, 인자의 표적으로서 각종 클로닝 T 세포주를 이용하고 또한 흉선 간질로부터 순수하게 배양된 세포주를 구축할 필요가 있다. 이것은 하기 실험을 상세히 수행할 수 있도록 해준다. 이런 연구 맥락으로서, 글림세트 등(Glimcheret al., J. Immunol. 17 : 1, 1983) 및 비어드슬레이(Beardsley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 6005, 1983)는 최근에 SV 40 및 표피 성장 인자(EGF)를 사용하여 증식 능력이 부여된 흉선 상피 세포주 또는 클로닝 T 세포주에 의해 T세포를 킬러 T세포로 유도할 수 있는 인자를 생산할 수 있다고 보고하였다. 그러나, 이런 보고에서, 상기 인자의 정확한 물리화학적 특성은 아직 명백하지 않다. 본 발명가들은 최근 우리가 구축한 흉선 간질-유래 세포주(TSCF)가 대응하는 항원 및 IL2 없이도 항원-특이적 및 인터류킨(IL)2- 의존성 T세포클론의 증식을 유도할 수 있는 새로운 특성을 갖는 인자를 생산함을 밝혔다. 이러한 새로운 특성을 갖는 인자는 아직까지 보고되지 않았었다.
즉, 본 발명가들에 의해 구축된 섬유 아세포 형태의 흉선 간질 세포주(TSCF)는 각종 T세포 클론의 증식을 유도할 수 있는 인자를 생산함이 밝혀졌다. 또한, 상기 인자는 인터류킨(IL) 1, 2, 3, 4, 5 및 6과는 완전히 다르고, 또한, 인터페론을 포함하는 공지 시토카인과는 기능면에서 다름이 명백해졌다. 게다가, 이 인자는 또한, 흉선 간질 세포의 일차 외식으로 생산됨이 증명되었다. 그러므로, 본 발명은 새로운 특성을 갖는 흉선 간질-유래 T세포 성장 인자 및 그의 제조방법을 제공한다.
이제까지 각종 시토카인 모노카인은 T세포 성장인자로 개발되어 왔으며 임상 치료에 적용되어 왔다. 그러나, 처음에 예상했던것같은 많은 효과는 얻지 못하여서 현재 다른 T세포 성장 인자의 발견이 시급히 요청되고 있다. 이런 상황하에서 신규 특성을 갖는 T세포 성장 인자의 출현은 T세포 성장 인자의 임상 적용에서 새로운 발전을 가능케 하고 면역결핍증의 치료를 시도하는 약제, 각종 감염 및 암에서의 면역 응답의 인위적 강화뿐만 아니라 골수 복구(reconstruction) 후 T임파 세포의 재생 촉진에 기여할 것이다.
제1도는 TSCF 배양 SN에 의한 9-16 Th 클론의 증식을 나타낸다. 9-16 Th크론(1×104세포/웰)을 배양 SN(25%)의 존재하(●) 또는 부재하(○)에서 96-웰 평판 마이크로플레이트내에서 배양한다. 배양한지 수일 수에, 세포를 [3H] 티미딘(TdR)로 7시간 동안 펄스시킨 후 회수한다. 세포 DNA에 혼합된 방사능을 평균[3H] 취입량 및 삼중 배양/군의 S.E.로 표시한다.
제2도는 TSCF 배양 SN에서의 TSTGF의 기(phase)-의존성생산을 나타낸다. TSCF 세포(6×103)를 24-웰 배양 플레이트내에서 이중 웰/군으로 배양하고, TSCF 세포 또는 배양 SN을 제시된 날에 각군의 한 웰로부터 회수한다. TSCF 세포수를 세고(Δ-Δ) 배양 SN 내의 TSTGF 활성을 9-16Th 클론의 성장 지지능력에 대해 분석한다(●-●), TSCF 자체에 의한 [AH]TdR의 취입량은 각군에서 다른 배양 웰로 부터의 세포를 사용하여 결정한다(○-○).
제3도는 각종 림포카인 또는 모노카인이 9-16Th 클론의 증식을 자극하는 능력을 나타낸다. 9-16Th클론 세포(1×104/웰)을 96-웰 평판 마이크로플레이트에서 2일 동안 림포카인, 모노카인 또는 인터페론의 연속 희석액과 배양한다. 도면중 괄호안의 값은 각종 제조할 물질의 최대 농도를 나타낸다. 최대농도-시료로 부터의 측정물질의 희석 횟수를 가로측으로 나타낸다.
제4도는 항-IL2 수용기 또는 항-IL4 항체가 Th클론의 TSTGF-, IL2- 또는 IL4-유도 증식에 미치는 효과를 나타낸다. 9-16 Th 클론(1×104세포/웰)을 항-IL2 수용기(7D4) 또는 항-IL4(11B11) 단클론성 항체의 존재하(● 또는 ▲) 또는 부재하(○ 또는 Δ)에 TSCF-SN 또는 rIL2(상층 도면) 또는 TSCF-SN 또는 rIL4(하층 도면)와 함께 배양한다. TSTGF(TSCF-SN), rIL2 및 rIL4의 사용된 최대 농도는 각각 12.5%, 1.25U/ml 및 25U/ml 이다. 항-IL2 수용기(7D4) 또는 항-IL4(11B11) 단클론성 항체를 함유하는 복수의 최종 농도는 1 : 200 또는 1 : 2000이다.
제5도는 DEAE-세파셀 컬럼으로 부터의 TSTGF 활성의 용출 형태를 나타낸다. 약 1ℓ의 TSCF 배양 SN을 25mM이 미다졸-HCl 완충액(pH 7.5)으로 투석시키고 동일 완충액으로 평형화된 DEAE-세파셀컬럼을 통과시킨다. 시료를 0.08M NaCl을 함유하는 25mM 이미다졸-HCl 완충액(pH 7.5)으로 용출시키고 각각 50ml의 분획을 수집한다. 단백질 농도는 280nm(○---○)에서의 흡광도로 나타낸다. 각분획에서의 TSTGF 활성(●---●)을 실시예에 기술된대로 측정한다. 염 농도는 ---로 나타낸다. 수평선으로 제시된 분획은 다음 정제 단계를 위해 모아서 사용한다.
제6도는 크로마토포커싱으로 부터의 TSTGF 활성의 용출 형태를 나타낸다. DEAE-세파셀 컬럼으로부터 모아진 분획을 25mM 이미다졸-HCl 완충액(pH 7.5)으로 투석하고 PBE 94크로마토포커싱 컬럼에 넣는다. 증류수로 1/9 희석된 파르 마시나 폴리버퍼(Pharmacia Polybuffer) 74(pH 4.0)를 사용하여 pH구배를 만든다. pH 7.5와 4.0사이의 구배를(---)로 나타낸다. 각 4ml 분획을 수집하고 HBSS로 투석한다. 수평선이하 10분획을 부분 정제된 TSTGF 제제로 모은다.
제7도는 부분 정제 및 농축된 TSTGF 시료에 의한 TSTGF 활성의 투여량 응답 곡선을 나타낸다. 크로마토포커싱으로 부터 수득된 부분 정제 시료를 약 100배 농축시킨다. 이 농축된 (●-●) 또는 비농축된(○-○) 시료 또는 rIL2(Δ-Δ)를 9-16Th 세포의 증식 유도 능력에 대해 적정한다. 괄호안의 값은 시료의 최대 농도를 나타낸다.
제8도는 세파크릴 S-200 컬럼 크로마토그래피에 의한 TSTGF의 분자량 측정 결과를 나타낸다. 부분 정제된 TSTGF 시료를 약 100배로 농축하고, 0.5ml 부피로 세파크릴 S-200컬럼에 통과시킨다. 표준 시료의 분자량을 괄호안에 제시한다.
제9도는 SDS-PAGE의 분자량 측정 결과를 나타낸다. 부분 정제된 TSTGF 시료를 약 30배 농축하고, 비환원 조건하에서 12.5% 아크릴아미드로 SDS-PAGE 조작을 행한다. 0.5cm 겔단편으로부터 용출된 각 분획의 TSTGF 활성을 분석한다. 분자량 표준시료 및 그의 분자량을 도면에 제시한다.
제10도는 L3T4+및/또는 LyT2+세포 제거 후 성인 흉선 세포의 플로우 마이크로플루오로메트리(Flow microfluorometry(FMF)) 분석을 나타낸다. 정상 C3H/He 성인(5주됨) 흉선 세포를 쥐 항-L3T4 및 항-Lyt2 항체+보체(C)의 혼합물로 처리한다. 처리된 세포를 상기 항체와 함께 배양하고 세척한 후, 염소항-생쥐 Ig(쥐 Ig와의 교차 반응)으로 전처리한 페트리 디쉬에서 배양한다. 비접착성 세포를 살짝 피펫팅 하여 수집하고 L3T4-Lyt2-분획으로 사용한다.
제11도는 L3T4-LyT2-흉선 세포에 대한 TSTGF의 투여량-의존성 성장-촉진효과를 나타낸다. 이중음성 성인 신호 흉선세포(3×104/웰)을 TSTGF 단독으로 또는 PMA와 함께 다양한 투여량으로 3일 동안 배양한다.
제12도는 항-IL2 수용기 또는 항-IL4 항체가 TSTGF+PMA에 의해 유도된 이중음성 흉선 세포의 증식을 억제하지 못함을 나타낸다. 이중 음성(L3T4-Lyt2-) 흉선 세포(3×104/웰을 TSTGF(20U/ml), rIL2(2U/ml) 또는 rIL4(30U/ml)중 하나와 PMA(10nM)의 부재 또는 존재하에서 3일 동안 배양한다. 항-IL2 수용기(7D4) 또는 항-IL4 항체(11B11)중 하나를 배양액에 가한다. 7D4 또는 11B11 단클론성 항체를 함유하는 복수액의 최종 농도는 1 : 200 또는 1 : 2000이다.
제13도는 이중 음성 흉선 세포의 성장 촉진에 대한 TSTGF+IL1의 상승 효과를 나타낸다. 도면 A : 이중 음성 세포를 TSTGF(20U/ml)+다른 농도의 rIL1α와 함께 3일 동안 배양한다. ●는 TSTGF+PMA의 자극에 의한 이중음성 세포의 증식을 나타낸다. 도면 B : 이중 음성 세포를 TSTGF(20U/ml)+rIL1(2U/ml)와 함께 수일동안 배양한다.
제14도는 (TSTGF+IL1) 및 IL2 또는 IL4의 조합으로 이중 음성 흉선 세포의 증식이 증강됨을 나타낸다. 이중 음성 흉선 세포를 각종 시토카인의 조합으로 3일 동안 자극시킨다.
제15도는 L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 성인 흉선 세포의 분리를 나타낸다. L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 흉선 집단을 보체 처리 및 패닝 단계에서 항 -L3T4 및 Lyt2 항체와 함께 항-T3 항체를 사용하고 패닝을 위한 플레이트 처리에서 염소 항-햄스터 IgG를 가함으로써 제조한다.
최근 본 발명가들에 의해 개발된 클로닝 흉선 간질 세포주 TSCF는 인터류킨(IL)2 및 항원 요구없이 IL2-의존성, 항원-특이적 헬퍼 T세포(Th) 클론 9-16의 증식을 지지한다. 이러한 증식은 또한 상기 흉선 간질 세포주 TSCF의 배양 상층액에서 제조된 인자에 의해 유도된다. 이물질, 즉 흉선 간질 세포-유래 T세포 성장 인자(TSTGF)는 각종 T세포 클론의 증식을 유도할 수 있다. TSTGF에 의해 초래되는 T세포증식 가속 작용은 투여량-의존성이고, T세포 클론의 항원 특이성을 보유하면서 T배양 상층액에서 IL1, IL2, IL3, IL4, Il5 또는 인터페론 활성이 하나도 검출되지 않는다. 9-16Th 클론의 증식이 TSTGF 뿐만 아니라 재조합 IL2 및 IL4에 의해서도 자극되지만 IL1, IL3 또는 인터페론에 의해서는 자극되지 않는다. 그러나, 이 Th 클론의 IL2 또는 IL4에 의한 증식은 각각 항-IL2 수용기 또는 항-IL4 단클론성 항체에 의해 거의 완전히 억제된다. 그러나, 9-16Th 클론의 TSTGF- 유도 증식은 이 항체중 어느것에 의해서도 전혀 영향받지 않는다. 이것은 TSTGF가 T세포성장 활성을 갖는 주요 인자로 제시되는 IL2 및 IL4와는 기능적으로 다르다는 것을 나타낸다. 또한, TSTGF 활성은 흉선 간질의 일차 외식 상층액으로 부터 수득된다. 그러므로, 본 발명에서 언급된 TSTGF는 신규 생리학적 활성 물질이다.
본 발명에서, 클로닝 섬유 아세포성 흉선 간질 세포주의 배양 상층액(SN)내의 T세포 성장인자 TSTGF를 DEAE-세파셀 크로마토그래피 및 PBE 94 크로마토포커싱으로 정제한 결과, 그 특성이 결정되었다. 즉, 원 배양 상층액은 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5 및 인터페론 활성을 전혀 나타내지 않지만 T세포 성장인자(TSTGF) 활성과 더불어 상당량의 IL6 및 클로니-자극 인자(CSF) 활성을 함유한다. 그러나 IL6 및 어떤 형태의 콜로니-자극인자도 TSTGF의 정제 단계에서 검출되지 않는다. 또한 T세포 성장 인자의 크로마토포커싱으로부터 이 인자의 등전점(pI)이 약 6.0임을 알 수 있다. 또한, T세포 성장 활성을 함유하는 시료를 세파크릴 S-200 컬럼 크로마토그래피 및 소듐 도데실 설페이트(SDS)/폴리아크릴아미드 겔 전기영동시키면, T세포 성장 활성은 분자량(m.w.) 약 25,000부근에서 단일 피크로 용출된다. 게다가, 이 T세포 성장 활성은 열처리 및 넓은 pH 범위에서도 상대적으로 안정하지만, 트립신 또는 디티오트레이틀(DTT) 처리로 그 활성이 완전히 손실된다. 이 결과로 부터, TSTGF, 즉 신규흉선 간질-유래 T세포 성장 인자는 분자량이 약 25,000이고 pI는 6.0이며 본래의 분자내에 그 생물학적 활성을 유지하고 나타내는데 필수 불가결한 이황화 결합을 갖는다고 결론지을 수 있다.
본 발명은 하기에서 더 상세히 설명하겠다.
본 발명에서 사용되는 흉선 간질 세포주 TSCF의 수립으로, 어떻게 흉선 간질의 각 성분이 T세포계 임파 세포에 작용하는가 하는 기작에 관한 시험관내 연구를 수행할 수 있게 되었다. 과거에는 미성숙 흉선 세포의 성숙 T세포로의 발달단계에서의 활성 물질을 동정하고 그의 기능을 밝히기 위해 T세포-연관 항원의 세포 표면에 대한 유도 지수(Biomed. Res. 2 : 11, 1981) 및 미토겐에 대한 반응성(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 6005, 1983)을 사용하여 여러가지 시도가 이루어졌다. 그러나, 뚜렷한 결론을 얻지는 못하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 6005, 1983, Scand. J. Immunol. 17 : 1, 1983).
본 발명에서 제시된 활성 물질 TSTGF는 클로닝 흉선 간질 세포주(TSCF) 및 흉선 세포의 일차 외식으로 부터 제조되는데, 각종 T세포 클론의 증식을 가속시킨다. 그것은 이제까지의 시토카인과는 명백히 다른 신규 활성 물질이다. 그러므로, 본 발명에서 TSTGF로 표시된 인자는 T세포의 분화 및 증식에 관계하는 흉선 간질-유래 생리학적 활성 물질중 하나이다.
본 발명의 TSTGF의 성질에 관한 연구에서, TSTGF와 T세포 성장 활성을 갖는 IL2 및 IL4를 포함하는 각종 공지의 림포카인 및 모노카인과의 기능적 차이를 밝히는 것이 특히 중요하다. 하기 세가지 사실로 부터 TSTGF와 이제까지 공지의 림포카인 및 모노카인과의 기능적 차이가 존재함이 명백하다.
첫번째로 인터류킨(IL1, IL2, IL3, IL4 및 IL5) 및 검출 가능 수준의 인터페론 활성(IFN-α, -β, 및 -
Figure kpo00001
)이 TSTGF를 함유하는 TSCF 배양 SN에서 전혀 발견되지 않는다. IL6 및 콜로니-자극 활성을 함유하는 TSCF SN ; 더 강한 대식세포 CSF(M-CSF) 활성을 함유하는 L세포 배양 SN이 어떤 TSTGF 활성도 나타내지 않는 반면에 TSCF SN에서 수득된 콜로니중 90% 이상이 대식 세포 형태이다. 또한, 기술된 계내에서 IL6은 어떤 TSTGF 활성도 전혀 나타내지 않는다. 그러므로, 이중에서 TSTGF 활성은 SN에 오염된 IL6 또는 M-CSF에 의해 조정된 것이 아니다. 두번째로, 9-16Th 클론의 성장은 TSTGF 뿐만 아니라 IL2 및 IL4에 의해 지지되지만, TSTGF에 의해 조정된 성장 촉진은 항-IL2 수용기 또는 항-IL4 단클론성 항체에 의해 영향 받지 않는다. 그러나, 둘중 하나의 항체를 배지에 가함으로써 관련 인터류킨에 의해 유도된 증식은 거의 완전히 억제된다. 세번째로, TSTGF 및 IL2 또는 IL4간의 중요한 차이는 각종 T세포 클론에 대한 그의 분화 효과로 나타내진다. TSTGF는 헬퍼 T세포 클론의 증식을 다양한 정도로 유도하지만, 널리 이용되는 CTLL-2 및 CT6과 같은 각종 CTL 클론의 증식을 지지하지는 못한다. 대조적으로, 모든 또는 몇가지 CTL 클론은 IL2 또는 IL4의 자극에 응답한다. 그러므로, TSTGF가 이제까지 보고된 시토카인과는 기능적으로 다르다는 점이 명백해진다. 또한, TSTGF 는 IL-2에 의해서뿐만 아니라 케라티노사이트-유래 T세포 성장인자(KTGF)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 4451, 1986)에 의해서도 지지되는 HT-2T 세포주의 증식을 지지하지 못한다. 그러므로, TSTGF는 또한, KTGF와도 다르다.
TSTGF가 T세포의 성장을 촉진시키는 작용 기작은 이 인자의 특성을 규정하는데 중요하다. 이 인자가 T세포의 증식을 유도하는 기작으로는 몇가지 가능성이 있다. 그러나, 본 발명에서는 이 몇가지 가능성이 배제된다.
(1) TSTGF에 의해 증식 유도된 9-16Th 클론은 TSTGF 존재하에서는 계속 증식되지만, TSTGF 또는 항원 및 IL2의 부재하에서는 증식될 수 없다. 그러나, 항원(KLH)+1-Ek에 의해 자극될때에는, 클론이 증식하기 시작한다. 결과적으로, TSTGF가 9-16Th 클론의 성장을 유도하는 기작으로, TSTGF가 항원 및 IL2의 부재하에서도 성장할 수 있는 종양 형성 능력을 유도하는 것은 아니다.
(2) 일반적으로, IL2는 T세포의 증식에서 중심적 역할을 한다(Science 224 : 1312, 1984). 최근 연구는 IL4가 또한 몇가지 T세포 아군의 증식을 유도할 수 있음을 나타내준다(J. Exp. Med. 164 : 580, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 5654, 1986, J. Exp. Med. 165 : 157, 1987). 그러므로, TSTGF가 궁극적인 T세포 성장 인자로 작용하는 IL2 또는 IL4중 하나의 생산을 초래하는 T세포내의 시그날 도입을 유도한다(autocrine 기작)는 가능성이 높아졌다. 그러나, 항원(KLH+I-Ek) 또는 TSTGF의 자극후 9-16Th 세포가 증식된 배양액에서 IL2 및 IL4 활성이 검출되지 않았다. 이러한 항체를 배양액에 적정 농도로 가함으로써 외인성 IL2 또는 IL4에 의해 유도된 성장-촉진이 거의 완전히 억제되는 조건하에서 조차 항-IL2 수용기 또는 항-IL4 항체를 배양액에 가하여도 TSTGF-유도 증식에 영향을 주지 않는다. 그러므로, TSTGF는 IL2 또는 IL4의 생산을 유도하지 않고 그 효과를 나타내는 것으로 결론지을 수 있다.
(3) 9-16Th 클론을 TSCF 단층 또는 일차 외식과 함께 배양하면 이 세포는 서로서로 접착된다. 이것은 우리에게 아마도 TSTGF가 흉선 간질 세포와 T세포 클론간의 접착 강화의 일련의 분자적 기작에 관여함을 시사해준다. 일반적으로, 세포-세포 상호작용은 많은 면역학적 작용에 필수적이다(Am. J.Anatomy 170 : 391, 1984, Science 231 : 402, 1986, Immunology Today 4 : 237, 1983, J. Exp. Med. 163 : 247, 1986). 예를들면, 두가지 항원-독립적 경로가 CTL의 그 표적에 대한 접착에 관여한다. 하나는 CTL상의 CD2(T11)항원 및 표적상의 LFA-3항원을 통하는 것이고, 다른 하나는 LFA-1항원(Nature 323 : 262, 1986)을 통하는 것이다. 최근에 인간 흉선 간질 세포주 및 인간 흉선 세포간의 상호 작용은 LFA-3 및 CD2분자에 의해 조정됨이 증명되었다(Clin. Res. 34 : 422, 1986, J. Immunol. 134 : 358, 1987, J. Exp. Med. 165 : 664, 1987, J. Immunol. 138 : 680, 1987). 이러한 상호 작용은 흉선 세포에서 IL2 수용기의 형질 발현을 현저히 증가시키고, IL-2와의 높은 반응성을 초래한다(Clin. Res. 34 : 422, 1986, J. Immunol. 138 : 680, 1987). 그러므로, 흉선에서 T세포계의 성숙은 흉선 세포 및 흉선 간질 세포간의 일련의 복잡한 상호 작용에의 결과인 것 같다.
9-16Th 클론은 TSCF 및 일차 흉선 외식 단층에 접착하기 때문에, 이 접착은 TSCF세포 표면상의 LFA-3 및 T세포상의 CD2-등가분자를 이용하는 것으로 여겨진다. 또한, CD2(T11) 분자자체는 T세포 작용 경로에 관여하는 수응분자중 하나로 공지되어 있다. 그러므로, T세포의 작용은 T3-Ti 분자 복합체 또는 CD2(T11) 분자중 하나에 의해 조정된다고 언급할 수 있다. 전자의 분자는 어떤 외래항원+MHC 복합체를 인지하고 후자는 흉선내 T세포 분화의 초기 단계에 출현하는 T3-Ti 분자에 의해 조정되는 활성화 경로 대신의 다른 활성화 경로에 관여하는 수용 분자인 것으로 여겨진다(J. Immunol. 134 : 330, 1985). 그러므로 흉선 간질 세포 및 Th 세포의 배양액내의 LFA-3 및 CD2(T11)-등가 분자를 이용하는 상호 작용은 T세포 증식에 대한 시그날을 제공한다고 여겨진다. 이러한 T세포의 작용 모델에서 TSCF 세포 표면으로 부터 유리된 가용성 LFA-3 분자가 TSTGF 활성을 나타내는 것으로 여겨진다. 그러나, TSTGF가 CD2(T11)- 등가분자에 대한 리간드로 작용한다는 가설은 다른 T세포 활성 경로에서 CD2(T11)의 역할에 관해 이제까지 얻어진 결과와 적합하지 않다. CD2 분자로 조정되는 T세포 증식은 IL2의 생산 및 방출 및 그외 IL2 수용기에 대한 연속 결합에 관여하는 오토크린 경로를 통하여 일어난다. 그러므로, CD2 분자에 의해 조정된 T세포의 증식은 IL2 수용기에 대한 항체에 의해 차단된다(Cell. 36 : 897, 1984). 대조적으로, 상술한대로, TSTGF는 IL2 수용기가 거의 완전히 차단된 조건하에서도 증식 유도 효과를 나타낸다. 그러므로, TSTGF는 LFA-3 분자 그 자체로 간주되지 않고 T세포의 증식이 LFA-3-CD2 분자가 관여하는 세포성 접착에 의해 초래되는 기작과는 다른 기작을 통해 TSTGF의 효과가 발휘되는 것으로 간주된다.
그러므로, 본 발명에서 TSTGF는 원래 흉선에서 흉선세포와 상호작용하는 흉선 간질 세포에 의해 생산되는 것이 분명하다. 그러므로, 이 인자를 통하여 흉선에서의 T세포는 증식에 대한 시그날을 받는 것으로 여겨진다. 또한, IL-2 및 IL-4가 이 과정에 참여하지 않기 때문에, TSTGF는 흉선 세포상의 기능적 IL2 수용기의 형질 발현전에 골수로부터 흉선으로 이주하는 T세포 전구체의 증식에 기여하는 것으로 추측된다. 사실상, 본 발명가들은 최근에 TSTGF의 생리학적 역할 및 TSTGF가 효과를 발휘하는 기작을 연구하여, 그 결과 TSTGF가 본 명세서에 기재된 T세포 클론이외에도 흉선 T세포의 각종 아군 세포(부분적 미성숙 흉선 세포)의 증식을 유도함이 밝혀졌다.
본 발명의 TSTGF의 물리화학적 특성은 하기의 같이 요약된다 : TSCF 배양 상층액을 DEAE-세파셀 및 PGE 94 컬럼을 사용한 연속 조작으로 분별한다. TSTGF 활성을 함유하는 분획을 모은다. 모아진 시료를 불활성이고 TSCF 배양 상층액의 더 큰 부분을 차지하는 오염 단백질로 부터 분리한다. 그 결과, 특이 활성도는 단백질 기준으로 약 300배 증가한다. 이것을 TSTGF의 부분 정제 제제로 간주한다. TSCF원 상층액은 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5 또는 어떤 검출 가능 수준의 인터페론 활성을 나타내지는 않지만, 상당량의 IL6 및 대식 세포 CSF 활성을 함유한다. 그러나, 부분 정제 제제에는 IL6 및 CSF 활성이 검출되지 않는다. 또한, 부분 정제 TSTGF는 헬퍼 T세포 클론인 HT-2 세포의 증식을 유도할 수 있다고 최근 보고된 GM-CSF와 같은 검출 가능 수준의 어떤 다른 CSF를 함유하지 않는다(J. Immunol. 138 : 4208, 1987, J. Immunol. 138 : 4293, 1987). 이러한 사실로부터, 부분 정제 제제는 하기와 같이 TSTGF의 물리화학적 특성을 결정하는데 사용할 수 있음이 명백하다.
TSTGF의 특성을 하기와 같이 부분 정제 제제를 사용하는 일면의 분석으로부터 결정한다 : (a) 세파크릴 S-200 크로마토그래피 및 SDS-PAGE의 분석에 따라서, 활성 TSTGF 분자량은 약 25000이다(제8도 및 제9도) : (b) 크로마토포커싱으로 측정된 등전점(pI)은 약 6.0이다((제6도) : (C)) 열처리(65℃, 10분)에 대해서도, pH 2.0∼9.0에서도 안정함(표 6) ; (d) 트립신 및 DTT의 처리에 높은 민감성을 나타내는데(표 7), 이 황화 결합이 TSTGF 활성에 중요한 역할을 하고 있음을 의미한다.
또한, 농축 시료를 사용하면, 9-6Th 클론의 최대 증식 자극이 rIL2에서 얻어진 것에 거의 필적하거나 또는 약간 더 크다(제7도)는 사실을 제시해준다. 또한 각종 T세포 클론의 증식 유도 능력이 명백해진 그의 기능적 특성(표 4)에서 알 수 있듯이, TSTGF는 이제까지 T세포 증식에 관해 보고된 각종 인자와 그 특성에 있어서 다르다(J.Immunol. 138 : 4208, 1987, J. Immunol. 138 : 4293, 1987, Immunological Rev. 63 : 173, 1982, Immunological Rev. 78 : 185, 1984, Ann. Rev.Immunol.5 : 429, 1987, Methods in Enzymology 116 : 588, 1985, J.Immunol. 138 : 3314, 1987). 특성에 있어서의 차이는 표 11에 요약된다. 이 사실로부터, TSTGF는 표 11에 기재된 인자를 포함하는 어떤 공지의 시토카인과도 명백히 다른 T세포 성장인자라고 결론내릴 수 있다.
또다른 두드러진 점은 흉선 T임파세포의 성장 촉진에 대한 TSTGF의 생물학적 기능이다. 실제로 TSTGF는 상술한 구축 세포주 뿐만 아니라 신선한 흉선 임파세포에도 작용한다. TSTGF가 흉선 간질-유래 클로닝 세포주(TSCF) 및 흉선 간질의 일차 의식에 의해 생산되기 때문에, TSTGF는 특히 미성숙 흉선 세포에 영향을 미침으로써 흉선 T세포의 분화 및 증식에 기여한다고 추측된다. 그러나, 원 TSCF배양 상층액을 단독으로 혹은 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)와 함께 신선한 임파구형 세포(비장, 임파절 또는 흉선 세포)의 배양액에 가할 때, 어떤 중요한 증식도 유도되지 않는다. 반면에, PMA와 본 발명에서 제조된 정제 TSTGF 제제를 사용한 자극에 의해 14일된 생쥐 태아의 흉선 세포뿐만 아니라 성인 생쥐의 흉선의 미성숙 흉선 세포(L3T4-Lyt-2-)의 증식이 강력하게 유도된다. 이러한 증식 강화는 항-IL4 또는 항-IL2 수용기 항체에 의해 억제되지 않기 때문에, 이것은 IL4 또는 IL2의 생산 및 이용을 포함하는 오토크린 기작을 다시 자극하지 않는다. PMA-등가 생리학적 물질을 자세히 조사하여, IL1은 상기 공동자극 배양액내에서 PMA의 역할을 대신할 수 있고, TSTGF와 조합하여 이중 음성(L3T4-Lyt2-) 미성숙 흉선 세포의 증식 증강을 유도할 수 있음을 밝혔다. 또한 비록 TSTGF+IL2 또는 IL4가 이러한 이중-음성 흉선세포의 성장에 적당한 또는 약한 상승 효과를 나타낼지라도, 그 정도는 TSTGF-IL1에 의해 얻어진 상승 효과와 비교하면 더 약하다. 특히, 두드러진 증식 증강은 IL1+IL4 또는 IL1+IL2에 의해 유도된 증식이 최저 또는 약한 조건하에서 TSTGF, IL1 및 IL2 또는 IL4의 조합으로 유도된다. 또한, 이렇게 강한 증식 증강은 추가로 T3+세포가 제거된 이중 음성 흉선 세포 집단(즉, L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 집단)에서 또한 관찰된다. 이 결과는 각종 시토카인과의 상승 작용에 의한 미성숙 흉선 세포의 증식에서 TSTGF가 중요한 역할을 함을 나타낸다.
최근에 유사한 활성이 IL4에 존재한다고 보고되었다(EMBO J. 6 : 91, 1987). 그러나 상술한대로, 정제된 TSTGF 제제에서 IL4활성이 검출되지 않아, TSTGF는 물리 화학적 특성뿐만 아니라 기능적 특성에서도 IL4와는 뚜렷이 구분된다.
이상을 하기와 같이 요약한다 : 본 발명의 TSTGF는 T세포 성장 활성을 나타내는 어떤 공지의 시토카인과는 명백히 다른 물리 화학적 및 기능적 특징을 갖는 신규 T세포 성장인자이다.
흉선 간질 세포에서 유래된 TSTGF는 흉선으로 이주하는 T임파 세포계의 분화 및 증식에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
덧붙여, 본 발명의 TSTGF가 미성숙 흉선 세포를 포함하는 T세포의 증식을 촉진한다. 그러므로, 본 발명의 TSTGF를 면역 결핍에서 유래된 AIDS와 같은 질병 및 각종 감염 및 악성 종양에 대한 면역 치료에 적용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 주요 약어는 하기와 같다 :
IL = 인터류킨 ; TSTGF=흉선 간질-유래 T세포 성장인자 ; Th=헬퍼 T세포 ; KLH=키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin ; Con A = 콘카나발린 A ; SN = 상층액 ; INF=인터페론 ; TSCE = 상피 세포 형태의 흉선 간질 세포주 ; TSCF = 섬유아세포 형태의 흉선 간질 세포주.
[실시예]
[생쥐]
6∼8주된 암컷 C3H/HeN 및 BALB/c 생쥐를 챨스 리버 래보래토리(Charles River Laboratory, Kanagawa, Japan) 및 시즈오까 익스페리멘탈 애니몰 래보래토리(Shizuoka Experimental Animal Laboratory, Shizuoka, Japan)로부터 각각 구입한다.
[T세포 클론]
세가지 헬퍼 T세포(Th) 클론, 9-16, 8-E 및 8-5(KLH 특이적 I-Ek구속성(9-16)또는 I-Ab구속성(8-E 및 8-5)을 사용한다. 다른 두가지 Th 클론은 자기 반응성 항-I-Ab(GLT2) 및 항-I-Ek(BR2)Th 클론이다. IMP클론은 항-Kk알로-CTL클론이다. 이들 T세포 클론은 기모또 및 페이쓰먼(Kimoto 및 Fathman, J. Exp.Med. 152 : 759, 1980)의 변형방법, 즉 X선-조사 비장 세포를 피더(feeder)로 사용하여 뮤린 콘카나발린 A(Con A)-자극 임파세포 배양 상층액(Con A SN)의 존재하에서, 필요하다면 KLH를 가하여 7일간의 항원 자극 후 7일간의 무자극의 싸이클을 반복하는 방법으로 유지된다. 다른 3가지 IL2-의존성 세포주, CTLL-2(J.Exp.Med.149 : 273, 1979), CT6 및 HT-2(J.Exp.Med.150 : 1510, 1979)를 뮤린 Con A SN을 함유하는 배양액에서 유지한다.
[흉선 간질 세포주]
본 발명가들은 최근 배양 BALB/c 흉선 간질 조직 배양액으로부터 두가지 형태의 세포주를 수립했다. 형태학적으로, 하나는 상피세포성 특징을 나타내는 반면에, 다른 하나는 섬유아세포성 특징을 나타낸다. 본 명세서에서, 이 두가지 형태의 세포주를 TSCE(상피 세포 형태의 흉선 간질 세포주) 및 TSCF(섬유아세포 형태의 흉선 간질 세포주)로 각각 약칭한다. TSCE 및 TSCF를 마이코플라즈마 시험계(Mycoplasma test system, Gen-Probe, San Diego, CA)로 정기적으로 시험하고 마이코플라즈마 오염이 없음을 확인한 후 사용한다.
[흉선 간질 세포의 일차 단층 배양]
흉선 간질 세포의 일차 단층 배양을 통상적인 방법을 변형하여 수행한다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80 : 6005, 1983). 간단히 설명하면, C3H/He 흉선 세포의 1∼2×108세포를 25cm2배양 플라스크내 10ml의 배양배지에서 배양한다. 배양 개시 2일 후, 흉선 세포를 살짝 세척하고 잔존 접착성 세포를 50% 신선한 배지 및 일차 흉선 의식 배양액으로부터 원심분리로 흉선 세포를 제거하여 수득된 50% 조정 배지로 영양보급한다. 그런 후, 일차 배양액을 동일한 50 : 50의 신선한 배지 및 조정 배지 혼합물로 매주 영양 보급하여 유지시킨다.
[흉선 간질-유래 T 세포 성장 인자(TSTGF)를 함유하는 배양 상층액의 채취]
수립된 흉선 간질 세포주의 배양액 또는 단층이 콘플루언스(confluence)에 도달한지 일주일 후 흉선 간질 세포의 일차 단층 배양액으로부터 상층액을 채취한다.
[배양배지]
모든 T세포 클론을 10% 소태아 혈청(FBS)(Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL), 5×10-5M 2-메르캅토에탄올(2-ME) 및 스트렙토마이신(100μg/ml)+ 페니실린(100U/ml)가 보충된 RPMI 1640에서 유지한다. 수립된 흉선 간질 세포주를 유지하고 흉선 간질세포의 일차 단층을 수립하기 위하여, 10% FBS, 5×10-5M -ME 및 겐타마이신(50μg/ml)이 보충된 둘베코 최소 필수 배지(DMEM)를 사용한다.
또한, 이 DMEM 완전 배지를 모든 형태의 증식 응답에 대해 사용한다.
[단클론성 항체]
항-IL2 수용기(7D4) 및 항-IL4(11B11) 단클론성 항체를 각각 사용한다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80 : 5694, 1983 및 Nature 315 : 333, 1985).
[Th 세포 클론의 증식 응답]
시험 시료(흉선 간질 세포주의 배양 상층액)의 단계 희석 용액(100μl)을 평편 96-웰 마이크로플레이트(No.25860 : Corning Glass Works)의 웰 내에 1∼5×105세포 : ml Th 클론 상층액(100μl)에 가하고 배양에 특별한 제한이 없는 한 37℃, CO2배양기(95% 공기/5% CO2)내에서 2일 동안 배양한다.
그런 후, 세포를 0.5μ Ci/웰의 [3H] 티미딘으로 7시간 동안 펄스시킨 후 자동 시료 채취기(Bellco Glass Inc., Vineland, NJ)를 사용하여 유리 필터 상에서 채취하고, DNA에 혼입된 방사능을 액체 신틸레이션분광계(liquid scintillation spectrometer, Aloka Co., Ltd. Tokyo)로 측정한다.
[IL1 분석]
IL1 및 식물성 혈구 응집소(PHA)의 존재하에서 IL2를 생산하는 T세포 클론 LBRM-33 lA5를 사용하여 IL1 활성을 검출하기 위한 측정법이 문헌(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78 : 1133, 1981)에 기재되어 있다. 간단히 설명하면, 1×105의 LBRM-33 lA5 세포를 37℃, 평편 96-웰 마이크로플레이트 내 200μl의 분석 배지에서 20시간 동안 배양한다. 이 배지는 PHA(2μGg/ml) 및 단계 희석 표준 IL1 또는 시험 시료를 함유한다. 배양 후, 세포-제거 SN을 각 웰에서 채취하고 IL2-의존성 T세포주 CTLL-2를 사용하는 IL2 분석계(후술)내에서 IL2활성을 시험한다. 이렇게 IL2 활성을 측정하여, 시험 시료내 IL1 활성을 결정한다.
[IL2 분석]
IL-2-의존성 뮤린 T 세포주 CTLL-2의 [3H] 티미딘 취입량을 측정하여 IL2 활성을 분석한다(J.Exp.Med.152 : 759, 1980). 분석을 위해, 1×104CTLL-2 세포를 표준인 다른 농도의 재조합 뮤린 IL2와 함께, 시험 시료를 함유하는 200μl 부피로 배양한다. 37℃에서 24시간 배양한 후, 세포를 0.5μ Ci/웰의[3H]티미딘(TdR)로 펄스시키고 8시간 후 세포를 채취한다.
[IL3 분석]
IL3-의존성 세포주 FDC-P2의 [3H] 티미딘 취입량을 측정하여 IL3 활성을 분석한다(J.Exp.Med. 152 : 1036, 1980).
분석을 위해, 2×104FDC-P2 세포를 다른 농도의 재조합 뮤린 IL3 희석용액 또는 시험 시료를 함유하는 200μl의 배양 용액에서 배양한다. 24시간 배양한 후, 세포를 0.5μCi/웰의 [3H]TdR로 펄스시키고 4시간 후 채취한다.
[IL4분석(B세포 공동자극 분석)]
IL4(BSF-1) 활성을 항-IgM 공동 자극 분석법의 변형으로 측정한다(J.Exp.Med.155 : 914, 1982). 간단히 설명하면, BALB/c 비장 B 세포를 일반적으로 공지된 방법으로 제조하고 (J.Exp.Med.154 : 1681, 1981, J.Immunol.130 : 2219, 1983), 105정제 B세포를 재조합 뮤린 IL4의 각종 희석 용액 또는 시험 시료와 함께 5μg/ml의 항-IgM의 존재하 또는 부재하에서 3일 동안 배양한다. 1μ Ci/웰의 [3H]TdR에 의한 최종 16시간 펄스로 DNA 활성을 평가한다.
[결과]
섬유아세포 형태의 흉선 간질-유래 세포주 또는 그의 배양 SN에 의한 Th 클론의 성장 응답
본 발명가들은 두가지 형태의 BALB/c 흉선 간질-유래 세포주, 즉 TSCF(섬유 아세포형태) 및 TSCE(상피세포형태)를 최근 수립하였다. T세포와의 상호 작용에서 이 세포주의 기능적 활성을 조사하기 위해, 우선 T세포 클론의 성장 지지능력을 시험한다. KLH-프라임된 (C57BL/6×C3H/He) Fl 비장 세포에서 수립된(J.Exp.Med.158 : 1178, 1983) 9-16Th 클론, KLH-특이적 및 I-Ek구속성 Th 클론(Thy-1+, Lyt-1+, Lyt-2+)를 TSCF, TSCE 또는 BALB/3T3 단층과 공동-배양한다. 표 1의 실험 1에 제시되었듯이, TSCF 단층과 9일 동안 공동-배양된 9-16Th 클론의 수확 세포수는 KLH 및 I-Ek항원-제시 세포 또는 의인성 림포카인의 부재하에서 초기 유입된 세포수와 비교할때 약 3∼5배 증가했음을 나타낸다. 이것은 단독으로 배양된 또는 TSCE 또는 BALB/3T3과 공동-배양된 9-16Th 클론의 세포수에서는 대조적으로 감소된다.
또한, 9-16Th 클론의 성자을 지지하는 TSCF 단층의 능력은 TSCF의 배양 SN에서 발견된다(표 1의 실험 2). TSCF 배양 SN의 존재하에서 이러한 9-16Th 클론의 성장은 또한 [3H] 티미딘(TdR) 취입량으로 증명되고 DNA 합성의 피크 응답은 Th 클론을 TSCF 배양 SN과 함께 배양한지 2~3일 후에 관찰된다(제1도). 이 결과는 최근에 수립되고 본 명세서에서 TSCF로 약칭된 흉선 간질-유래 세포주가 KLH 및 I-Ek항원-제시세포 또는 의인성 림포카인의 요구없이 Th클론의 성장을 지지하는 능력을 갖는다는 사실을 나타내준다. 또한, 그것은 배양 상층액에서, 가용성 인자 또는 이러한 성장을 지지할 수 있는 인자를 생산한다. 그러므로 상기 인자를 흉선 간질-유래 T세포 성장 인자(TSTGF)로 명명한다.
[강력한 TSTGF 활성을 얻을 수 있는 TSCF 배양액의 최적 수확시기]
TSCF 배양액으로부터 강력한 TSTGF 활성을 얻을 수 있는 최적 시기를 결정하기 위해, 24-웰 플레이트에 접종한지 수일후에 TSCF 세포 및 그의 SN을 한 웰의 복제 TSCF 배양액으로부터 수확한다. TSCF 수확 세포수 및 수확된 배양 SN 중의 TSTGF 활성을 측정한다. TSCF 자체의 DNA 합성은 다른 웰의 복제 배양액 내 [3H] TdR 취입량으로 측정한다. 결과를 제2도에 요약한다. 세포수 증가로 평가된 TSCF 자체의 성장은 TSCF가 콘플루언스 단층을 형성한 배양 약 8일 쯤까지 계속된다. 한편, TSCF에 의한 [3H]TdR 취입량의 피크 응답은 세포수의 증가에 따라 진행된다. 피크는 배양 4일째에 나타나고, 세포단층이 콘플루언스에 도달한 후에는 감소하기 시작한다.
TSCF 배양액내의 TSTGF 활성은 TSCF 단층에 의한 콘플루언스 획득과 동시적으로 약 8 또는 9일쯤에 검출 가능하게 되었다. 그러므로, 활성이 계속 증가하고, 최대 활성은 접종 12~14일 후에 얻어진다. 그러므로 이때에 수확된 TSCF배양 SN은 하기 실험에서 TSTGF 원으로 사용된다.
[TSTGF를 함유하는 배양 상층액내에서 상장을 유지한 후의 Th 클론의 항원 반응성의 보유]
다음으로, 본 발명가들은 TSTGF의 첨가로 유지된 Th 클론이 그 항원-반응성을 보유하는지의 여부를 연구하였다. 9-16 Th 클론을 TSCF 단층에서 또는 TSCF 배양 SN(TSTFG)와 함께 매주 배양 배지를 바꿔주면서 4주간 배양하고, KLH+1-Ek항원-제시 세포에 의한 자극 반응성에 대해 시험한다(표 2).
결과는 TSCF 단층에서 또는 TSTGF와의 배양 후 수확된 9-16 Th 클론이 악성 전환 세포와 같은 자연 증식능력을 획득하지는 못하지만, 명백히 항원(KLH)-특이적 반응성을 보유함을 증명해준다. 그러므로, 항원+항원-제시 세포의 부재하에서도, Th클론은 항원-반응성을 보유하면서 TSTGF에 의해 증식이 촉진된다.
[TSCF 배양 SN내의 림포카인 및 모노카인 활성]
이제까지는 임파세포 및 단핵세포에 의해 생산된 다수의 림포카인 및 모노카인이 보고되었다. 그러므로, 어떤 공지의 림포카인 또는 모노카인 활성이 TSCF 단층 배양 SN 내에서 검출될 수 있는지에 대한 연구가 이루어졌다. 재조합 림포카인 및 림포카인을 함유하는 표준 배양 SN을 대응 분석계서 양성 대조로 사용한다. 그것을 TSCF의 배양 SN과 비교하여, IL1, IL2, IL3, IL4 및 IL5 활성을 시험한다. 표 3에 요약된 결과는 Il1, IL2, IL3 및 IL4의 양성 대조가 대응 응답 세포를 증식시키거나 또는 활성화시키도록 작용하는 반면에, ISCF의 배양 SN이 이러한 인터류킨 활성을 검출가능한 수준으로 나타내지는 않음을 시사한다. 또한 다른 실험도 IL5 및 인터페론(IFN) 활성이 TSCF SN에서 검출되지 않음을 보여준다.
[TSTGF와 각종 인터류킨과의 관계]
TSTGF와 T세포 성장 인자로 공지된 림포카인과의 관계를 밝히기 위하여, 우선 9-16 Th 클론의 증식을 촉진할 수 있는 림포카인의 형태(들)로 만들기 위해 연구했다. 인터류킨(IL1, IL2, IL3 및 IL4) 및 인터페론(IFN-α, IFN-β 및 IFN-
Figure kpo00002
)를 9-16Th 클론의 성장 지지능력에 대해 TSTGF에 의해 수득된 것과 비교하여 시험한다. 제3도의 결과는 9-16Th 클론의 증식이 TSTGF 뿐만 아니라 IL2 및 IL4에 의해 유도되지만 IL1, IL3 및 인터페론에 의해서는 유도되지 않음을 보여준다. 또한, 또다른 실험 결과는 IL5 및 IL6가 9-16Th 클론의 증식을 유도하지 않음을 밝혀준다. 비록 IL2 또는 IL4 활성이 TSCF 단층의 배양 SN 내에서 검출되지는 않지만(표 3), 제3도의 결과는 9-16Th클론의 성장이 TSCF 배양 SN내 검출 불가능한 양으로 생산된 IL2 또는 IL4에 의해 촉진될 수 있다는 가능성을 시사해준다. 이 가능성은 9-16Th 클론의 TSTGF-유도 증식 응답에 대한 항-IL2 수용기 또는 항-IL4단클를 항체의 효과를 조사하여 연구되었다.
제4도의 결과는 9-16 Th 클론의 증식은 IL2 및 IL4에 지지되고(우측 도면) 이러한 증식은 항-IL2 수용기 또는 항-IL4항체를 가함으로써 거의 완전히 억제됨을 증명해준다.
이와는 대조적으로, 9-16 Th 클론의 TSTGF-유도 증식은 이런 항체중 어떤 것의 존재에 의해서도 거의 영향받지 않는다(좌측 도면). 이 결과는 TSTGF가 TL2 또는 IL4의 기작과는 완전히 다른 기작으로 Th 클론의 증식을 유도하고 TSTGF는 IL2 및 IL4와 기능적으로 다름을 나타낸다.
[Th 및 CTL 클론의 증식에 대한 TSTGF의 특징]
다음으로, 각종 Th 및 CTL 클론의 증식 촉진에 대한 TSTGF의 효과를 연구한다. 표 4의 결과에서 볼 수 있듯이, 각 클론에서의 증식 정도는 다양하지만, TSTGF가 모든 형태는 아니지만 다양한 형태의 Th 클론(항원 특이성 및 주요 조직 적합 항원(MHC)에 대한 구속 특이성이 각각 다름)을 증식시킬 수 있다.
한편, TSTGF는 본 실험에서 사용되는 항-Kk(IMP)클론과 같이 새로 수립된 CTL 클론의 증식 및 이제까지 널리 사용되었던 각종 CTL 클론의 증식 또한 지지할 수 없다.
한편, IL2는 모든 T세포 클론의 증식을 유도하고, IL4는 일부 Th 및 CTL 클론의 증식을 유도한다. 그러므로 TSTGF-유도 증식을 나타내는 T세포클론의 종류는 IL2 또는 IL4에서 수득된 종류와는 다르다. 이것으로 TSTGF는 IL2 또는 IL4와 기능적으로 다르다는 결론에 도달할 수 있다.
[일차 흉선 의식 배양 세포에 의한 Th 클론의 성장 촉진]
흉선 세포 및 흉선 간질 세포 모두를 함유하는 C3H/HeN 흉선 세포 현탁액을 배양 플라스크에 접종한다. 비접착 세포(주로 흉선 세포 및 죽은 세포)를 버린 후 접착 세포를 배양하고 50% 신선한 배지 및 50%조정 배지로 영양 보급한다. 9-16Th 클론을 TSCF, TSCE 또는 일차 접착 흉선 의식 세포층과 함께 배양할때, 일차 흉선 배양액에서 수득된 접착 세포는 형태학적 특성 뿐만 아니라 Th 클론의 증식 지지능력에 있어서도 TSCF 세포주와 유사하다. 또한 9-16Th 세포는 TSCF 및 일차 흉선 배양 세포에 접착하고 정도의 차이는 있지만 증식시킨다. 중요하게도, 일차 흉선 의식 배양 세포 또한 TSTGF 활성을 생산하고 이 TSTGF는 Th 클론에서 선택적으로 성장-촉진을 나타냄이 명백해졌다(표 5). 그러므로, 이 결과는 T 세포 클론의 증식을 지지할 수 있는 TSTGF가 흉선 간질-유래 세포주에 의해서 뿐만 아니라 일차 흉선 의식에 의해서도 생산됨을 시사한다.
[실시예 2]
흉선 간질-유래 세포주의 배양 상층액에서 수득된 TSTGF의 물리 화학적 특성을 연구하기 위하여, 하기 실험을 수행한다.
[흉선 간질-유래 세포주]
상술했듯이, 본 발명가들은 흉선 간질-유래 세포주 TSCF를 수립하였다. 형태학적으로, 이 세포주는 섬유아세포 형태를 갖는다. 하기 실험예에서, 이 TSCF의 클로닝 세포주를 사용한다.
[TSTGF 활성의 측정]
시험시료(조 또는 부분 정제 TSTGF)(100μl)를 100μl의 9-16Th 클론 현탁액(1×105세포/ml)가 담긴 96-웰 평판 마이크로플레이트(No. 25860 : Corning Glass Works)의 웰에 가하고 37℃, CO2배양기(95% 공기/5% CO2) 내에서 2일 동안 배양한다. 그런후, 이 세포를 0.5μ Ci/웰의 [3H] 티미딘(New England Nuclear, Boston, MA)으로 7시간 동안 펄스시킨 후 자동 시료 채취기(Bellco Glass Inc., Vineland, NJ)를 사용하여 유리 필터에서 채취하고, 혼입된 방사능을 신틸레이션 분광계(Aloka Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 측정한다.
[콜로니-자극인자(CSF)의 활성 측정]
CSF에 대한 증식 반응을 측정하는데, 두가지 다른 방법이 사용된다. 이것은 공지방법과 본질적으로 동일하다(J.Immunol.131 : 2374, 1983). 하나는 반고체 한천에서의 콜로니 형성을 측정하는 전통적인 방법이다. 다른 하나는 CSF로 자극된 골수 세포에 의한 [3H]티미딘(3H-TdR)의 취입량에 기초하는 방법이다. CSF의 기본적 클로닝 분석법은 문헌(Infect.Immunn.26 : 408, 1979)에 상세히 기술되어 있다.
간단히 설명하면, ml당 105대퇴골 유핵 골수 세포를 15% FBS, 항생물질 및 0.3% 한천을 함유하는 보온(42℃) 강화 맥코이 5A 배지에 현탁시킨다. 1ml의 이 혼합물을 CSF원을 0.25ml까지 함유하는 35-mm 페트리디쉬에 가한다. 냉각후, 5% CO2내 37℃에서 10일 동안 배양한다. 디쉬를 35×배율 현미경으로 관찰하여 증식 중심(
Figure kpo00003
25세포/콜로니)를 센다. CSF활성 측정용3H-TdR 혼입 분석법은 응답 세포의 수가 다르고 외인성 일차 분열 시그날이 요구되지 않는다는 점을 제외하고는 기본적으로 인터류킨 1(J.Immunol. 116 : 1466, 1976) 및 인터류킨 2(Mol.Immunol.17 : 579, 1980)에 대한 검출 분석법의 변형이다. 이 계내에서, CSF 이외에 다른 첨가물을 가하지 않는다. 간단히 설명하면, 생쥐 밀도 원심분리 배지의 분리(Lympholyte M.Cedarlane Laboratories Ltd., Ontario)로 수득된 0.5∼1×105대퇴콜 유핵 골수 세포를 CSF를 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 총 부피 0.2ml로 배양한다. 사용되는 배지 및 배양 조건은 반고체 한천을 제외하고는 클로닝 분석법에서 사용된 것과 동일하다.
최종 6시간에 1μCi의3H-TdR을 가하여 총 72시간 동안 배양한다. 그런후 배양액을 세포 채취기를 사용하여 유리 필터에서 채취하고3H-TdR 혼입량을 액체 신틸레이션 분광계로 측정한다.
[DEAE-세파셀 크로마토그래피]
TSTGF 활성을 함유하는 배양 상층액을 25mM 이미다졸-HCl 완충액(pH 7.5)으로 투석하고 동일 완충액으로 평형화된 DEAE-세파셀 컬럼(3.0×45cm)에 통과시킨다. 컬럼을 1000ml의 동일 완충액으로 세척하고 0.08M 염화나트륨을 함유하는 25mM 이미다졸-HCl 완충액(pH 7.5)을 사용하여 20ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 각각 50ml의 분획을 수집하고 행크 평형 염용액(HBSS)로 투석하고, TSTGF 활성 및 O.D.280nm에서의 단백질 함량을 측정한다. 컬럼내에 잔류하는 단백질을 0.2M 염화나트륨을 함유하는 25mM 이미다졸-HCl 완충액(pH 7.5)으로 용출시킨다. 그런후, 유사한 방법으로 활성을 측정한다.
[PBE 94 크로마토포커싱]
PBE 94 컬럼을 사용하여 크로마토포커싱한다. 간단히 설명하면, PBE 94 컬럼(1.0×25cm)을 25mM 이미다졸-HCl 완충액(pH 7.5)로 평형화시키고, 동일 완충액으로 투석된 시료를 컬럼에 넣는다. 컬럼을 구배가 시작하기 전에 20ml의 동일 완충액으로 세척한다. 증류수로 1/9회석된 파르마시아 폴리버퍼 74를 사용하여 16ml/시간의 유속으로 구배를 제조한다(그러므로, pH 구배는 7.5와 4.0 사이에서 제조된다). 각각 4ml의 분획을 수집하고 HBSS로 투석하여, 활성 측정을 위해 사용한다.
[세파크릴 S-200 겔 여과 크로마토그래피]
PBE 94 컬럼으로부터 수득된 TSTGF 활성-함유 분획을 아미콘 8400셀 YM 10막(Amicon corp., Lexington, MA)을 사용하여 한외 여과시켜 10배 농축시킨다. 농축액을 HBSS 완충액으로 투석한다. 2ml의 농축시료를 동일 완충액으로 평형화된 1.5×9.5cm 세파크릴 S-200(Pharmacia Fine Chemicals) 컬럼에 통과시킨다. 분획(2.5ml)을 수집하고, HBSS로 투석하여, TSTGF 활성을 분석한다.
[소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)]
크로마토포커싱 후 TSTGF-함유 농축 시료를 2.88% 아크릴아미드, 0.12% 비스-아크릴아미드, 0.125M 트리스-HCl(pH 6.8) 및 0.1% SDS로 구성된 상층 겔(1cm) 및 11.52% 아크릴아미드, 0.48% 비스-아크릴아미드, 0.375M 트리스-HCl(pH 8.8) 및 0.1% SDS로 구성된 하층 겔(8cm)을 사용하여 불연속 SDS-PAGE(0.75mm×16cm×20cm 슬랩 겔)로 분석한다(Methods in Enzymol. 116 : 493, 1985). 전개 완충액은 0.025M트리스 염기, 0.192M 글리신 및 0.1% SDS를 함유한다. 겔을 시료가 하충 겔로 들어갈때까지(약 1시간) 30V에서 전개시킨후 최종까지는 (약 4시간) 120V에서 전개시킨다. 전기영동후, SDS-PAGE 겔을 5mm 단편으로 절단한다. 각각의 단편을 10mg/ml 소혈청 알부민을 함유하는 1ml의 RPM 11640 배지로 용출시킨후 TSTGF 활성 측정을 위해 사용한다. 시료 또는 표준 단백질이 담긴 겔을 메릴등의 방법(Merril et al., Science 211 : 1437, 1981)으로 염색한다.
[부분 정제된 TSTGF의 화학적 및 효소학적 처리]
DEAE-세파셀 크로마토그래피 및 PBE 94 크로마토포커싱으로 수득된 50μl 시료의 부분 정제된 TSTGF를 트립신(15μg/ml, 37℃, 2시간) 또는 디티오트레이톨(DTT, 50ml, 25℃, 2시간)로 처리한다. TSTGF의 생물학적 안정성을 가열 및 0.2M 트리스-HCL 아세트산나트륨 또는 글리신-HCl 중 하나를 사용하여 pH처리로 조사한다. 이 처리후, 시료를 HBSS로 투석하고 TSTGF활성 측정을 위해 사용한다.
[결과]
[TSTGF의 부분 정제]
TSTGF 활성을 헬퍼 T세포(Th) 클론 9-16의 증식으로 기록한다. TSCF 배양 상층액을 TSCF 세포주가 콘플루언스를 획득한지 1주일 후에 수집한다. DEAE-세파셀 컬럼으로부터의 TSTGF 용출의 최적 염농도를 결정하기 위해, 염화나트륨의 농도를 연속적으로 증가시키면서 용출을 수행한다. 결과는 대부분의 TSTGF활성이 0.08M 염화나트륨의 농도에서 용출됨을 나타낸다. 그러므로, 부분 정제를 위해, 약 1ℓ의 배양 상층액을 DEAE-세파셀 컬럼에 통과시키고 0.08M 염화나트륨을 함유하는 완충액으로 용출시킨다. 결과적으로, 이 분획에서 모든 TSTGF 활성이 회수된다(제5도). 더 많은 TSTGF 활성이 비교적 초기 단계에서 0.08M 염화나트륨으로 용출되고 0.08M NaCl 및 0.5M NaCl로 용출된 주요 단백질 피크와 뚜렷이 구분된다.
DEAE-세파셀 컬럼으로부터 수득된 TSTGF 활성-함유 분획을 또한 PBE 94 크로마토포커싱 컬럼에 통과시킨다. 전형적인 용출 결과가 제6도에 제시된다. TSTGF 활성은 약 6.0의 pI 값을 갖는 단일 피크로 용출된다. 또한, DEAE-세파셀 컬럼을 통과하지 않은 TSCF 배양 상층액을 소규모로 직접 PBE 94 크로마토포커싱하면, TSTGF 활성은 pI 6.0을 갖는 단일 피크로 유사하게 용출된다. DEAE-세파셀 분획 및 크로마토포커싱 분리로 수득된 TSTGF 활성-함유 분획을 모아 하기 실험용 부분 정제 TSTGF제제로 사용한다. DEAE-세파로스 및 크로마토포커싱 컬럼에 통과시킨후의 TSTGF 활성 회수비율은 약 20%이고, 단백질 농도를 기준으로 한 특이 활성도는 이 단계에서 약 300배 증가한다.
[부분 정제 TSTGF에 의한 TSTGF 활성의 투여량 응답성]
TSTGF의 투여량 응답곡선 및 TSTGF의 역가를 연구하기 위해, 상기 부분 정제 TSTGF 일부를 아미콘 8400 셀(Amicon 8400 cell) 및 YM 5막(Amicon Corp., Lexington, MA)을 사용하여 한외여과로 약 100배 농축한다. 농축 및 비농축 TSTGF를 재조합 IL2(rIL2)로 수득된 것과 비교하여 9-16 Th 세포 성장의 지지능력을 시험한다. TSTGF 활성의 투여량 응답 곡선은 제7도에 제시된다. 결과는 TSTGF 농축액은 6.25% 희석시 최대 응답이고 이 최대 응답은 rIL2에 의해 수득된 것과 거의 필적할만한 것임을 나타내준다.
또한 비농축 TSTGF 시료는 유사한 투여량 응답 곡선을 보여준다. 농축 및 비농축 부분 정제 TSTGF 제제의 TSTGF 활성 역가는 TSTGF 농축액에 의한 투여량 응답과 비교하여 계산한다.
결과는 역가가 약 60인데 IL-2의 역가로는 0.7U/ml 이다.
[TSTGF의 분자량 측정]
TSTGF의 분자량을 측정하기 위해, 100배 농축후, 부분 정제 TSTGF 제제를 세파크릴 S-200 컬럼에 통과시키고 크로마토그래피로 수득된 각 분획내의 TSTGF 활성을 9-16 세포 증식 유도 능력으로 평가한다. 제8도에서 볼 수 있듯이, 세파크릴 S-200 겔 여과에 의한 TSTGF의 분석은 그의 겉보기 분자량이 25000임을 나타내준다. 또한 동일한 농축시료를 비환원 조건하에서 SDS-PAGE(12.5% 아크릴아미드)로 분석한다. 전개완료후, 겔을 0.5cm 조각으로 절단하고 각 절단 겔로 부터 단백질을 용출시킨다. 각 분획을 9-16Th 세포를 사용하여 TSTGF 활성 분석한다. 3가지 별도 실험에서, TSTGF 활성은 약 25000의 분자량을 갖는 분획에서 재검출된다. 대표적인 실험을 제9도에 제시한다.
[TSTGF의 물리 화학적 특성]
부분 정제된 TSTGF 제제를 여러가지 처리시켜 TSTGF의 안정성을 조사한다. 활성은 적당한 열처리(65℃, 10분)에 견디고 산성(pH 2.0) 및 알칼리성(pH 9.0) 조건하에서도 안정한 반면에 몇가지 미지의 이유로 pH 4.0∼5.0 부근에서 활성이 부분적으로 감소한다(표 6). 이와는 대조적으로, 트립신에 의한 가단백질 분해 및 DTT(10mM DDT, 2시간)에 의한 환원에는 약하다(표 7).
[부분 정제된 TSTGF 제제에서 공지 시토카인 활성의 결핍]
상술했듯이, TSCF 세포주의 배양 상층액내에서는 인터류킨(IL1, IL2, IL3, IL4, IL5) 또는 인터페론 활성이 검출되지 않는다. 그러나, 몇가지 시토카인은 T세포 증식을 유도하는 것으로 이미 공지되어 있다. 여기에는 IL2, IL4 및 GM-CSF가 포함된다(J. Immunol.138 : 4208, 1987 ; J. Immunol. 138 : 4293, 1987). 사실, 표 8의 결과는 TSTGF 활성의 표적으로 사용되는 9-16Th 클론이 IL2 또는 IL4의 존재하에서는 증식시킬 수 있지만, GM-CSF 존재하에서는 증식시킬 수 없음을 나타내준다. 그러므로, 농축된 정제 TSTGF가 이러한 공지의 시토카인, 특히 IL2 또는 IL4를 함유하는지의 여부를 연구하였다. 표 9의 결과는 부분 정제 제제가 IL2 및/또는 IL4에 응답할 수 있는 CTLL-2 및 HT-2의 증식을 유도할 수 없음을 명백히 시사한다. 정제 제제에는 또한 어떠한 다른 인터류킨 또는 인터페론 활성이 검출되지 않는다. 여기에서 콜로니-자극인자(CSF)가 TSCF 세포주의 배양 상층액에 존재함이 주목된다. 그러므로, TSCF 상층액에 함유된 CSF의 성질을 연구하고 또한 이러한 CSF 활성이 여전히 부분 정제 제제에 함유되어 있는지 또는 부분 정제 제제로 제외되었는지를 조사하기 위한 실험이 만들어졌다. 부분 정제된 TSTGF가 0.7U/ml TSTGF 활성을 함유하므로, 거의 동일한 TSTGF 활성 역가를 갖는 TSCF 배양 상층액이 대조로 사용된다. 표 10의 결과는 TSCF의 배양 상층액이 2가지 다른 형태의 CSF 분석에서 상당한 CSF 활성을 나타냄을 시사해준다. 형태학적 조사는 이 분석에서 증식된 거의 모든 콜로니가 대식세포 형태임을 나타내 주는데, CSF 는 GM-CSF가 아니고 M-CSF로 분류된다. 이것은 또한 L 세포 배양 상층액에 의해 생산된 콜로니의 경우에도 해당한다. 둘다 상당히 강력한 M-CSF 활성을 갖는 L 세포 배양 상층액 또는 WEHI-3 배양 상층액내에서 TSTGF 활성이 검출되지 않기 때문에, TSTGF 활성(9-16 Th 클론의 증식)은 TSCF 배양 상층액에 함유된 CSF(M-CSF)로 조정되지 않음이 증명되었다.
이러한 상황에서 중요한 점은 TSCF 배양 상층액내의 이러한 CSF 활성(M-CSF, GM-CSF)이 거의 동일한 TSTGF 활성역가를 갖는 부분 정제된 TSTGF 제제에서 완전히 제거된다는 점이다. 상기를 요약하면, 이 결과는 TSTGF가 IL2, IL4 및 GM-CSF와 같이 T세포 증식을 유도할 수 있는 것을 포함하는 전술된 시토카인중 어느것과도 다르다는 것을 시사해준다.
[실시예 3]
상기 연구는 TSTGF가 다양한 항원-특이적 헬퍼 T세포 클론에 대한 강력한 T세포 성장인자(TCGF)로 작용함을 증명해준다. 생리학적 중요성의 견지에서 T세포의 성장 촉진을 유도하는 능력을 평가하기 위하여, TSTGF가 흉선 세포의 성장에 기여하는지를 연구하였다.
[항체 및 시약]
뮤린 T3 분자(2C11)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 1374, 1987), 뮤린 L3T4 분자(GK 1.5)(J. Immunol. 131 : 2445, 1983) 및 Lyt2 분자(3.155) (ATCC로부터 이용)에 대한 단클론성 항체를 이용한다.
GK 1.5 단클론성 항체-생산 하이브리도마 세포를 프리스탄-프라임된 BALB/c nu/nu 생쥐에 복강내 접종하고 복수액을 수집한다. 또한 3.155 및 2C11 단클론성 항체-생산 하이브리도마로부터 배양 상층액(SNs)을 수집한다. 세포-제거 복수 및 배양 SNs 중 감마-글로불린 분획을 황산 암모늄으로 40% 포화침전시켜 수득한다. 플루오레스세인 이소티오시아네이트(FITC)를 일반적인 방법으로 GK 1.5 또는 2C11 단클론성 항체에 결합시킨 후, DE-52(Whatman Biochemicals Ltd., England) 이온-교환 크로마토그래피 시킨다. FITC/GL 1.5 또는 FITC/2C11의 F/P 비율은 1.6 또는 6.8이다. FITC-결합 항-Lyt2, 항-Thy 1.2 및 생쥐 항-쥐 IgG는 시판품이다[각각 Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA, of Bio Yeda Ltd., Rehovot, Israel 및 Jackson Immunoresearch Laboratories, INC., West Grove, PA의 제품].
이오노마이신은 베링 디아그노스틱스(Behring Diagnostics, La Jolla, CA)로 부터 수득된다. 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)는 시그마 케미칼 주식회사(Sigma Chemical Co., St. Louis. MO)로 부터 구입한다.
[L3T4-Lyt2-또는 L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 성인 흉선 세포의 제조]
방법은 전술한 것과 본질적으로 동일하다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3856, 1987, J. Immunol. 136 : 4075, 1986), 몇몇 성인 흉선을 절개하고 단일 세포 현탁액을 제조한다. L3T4-Lyt2-흉선 세포를 수득하기 위해, 세포를 4℃에서 쥐 항-L3T4(GK 1.5) 및 쥐 항-Lyt2(3.155) 단클론성 항체로 처리한 후 37℃에서 45분동안 토끼 보체(C)로 처리한다. 세포를 세척하고 다시 상기 항체와 함께 4℃에서 배양한다. 처리세포를 세척한 후 쥐 Ig와 교차-반응하는 염소 항-생쥐 Ig(Cappel, Malvern, PA)를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 전처리한 조직 배양급 페트리 디쉬(Corining Glass Works, NY)에서 1시간동안 배양한다. 비접착 세포를 살짝 피펫팅하여 수집한다. 이 방법으로 0.5∼1.0%의 출발 흉선 세포 집단에 해당하는 L3T4-Lyt2-흉선 세포 집단을 수득한다.
L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 흉선 세포를 제조하기 위하여, 보체 처리 및 패닝 단계에서 추가의 항-T3(2C11) 단클론성 항체를 항-L3T4 및 항-Lyt2 항체와 함께 혼합하고, 패닝을 위한 플레이트 처리시에 염소 항-햄스터 IgG(Cappel, Malvern, PA)를 가한다. 제조된 흉선 세포 일부를 이 방법의 효율을 결정하기 위해 플로우 마이크로플루오로메트리 분석용으로 사용한다.
[면역 형광 염색 및 플로우 마이크로플루오로메트리(FMF)]
세포 제조 및 염색 방법은 본질적으로 전술한 것과 동일하다(J. Immunol. 136 : 1178, 1986). 간단히 설명하면, 1×106임파형 세포를 FITC-결합 항체와 함께 4℃에서 30분동안 배양하고, 2회 세척하고, 재현탁시킨 후 형광 분석한다. 이 방법을 0.1% 소혈청 알부민(BSA) 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 행크평형 염용액(페놀 레드가 포함되지 않음)내에서 수행한다. FACStar(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA)를 사용하여 FMF 분석을 수행한다. 모든 결과는 로그 증폭을 사용하여 수득하고, 죽은 세포는 프로피듐 요오다이드로 추가 염색시켜 분석하지 않는다.
[결과]
[PMA와의 결합 자극에 인한 L3T4-Lyt2-흉선 세포에 대한 TSTGF의 성장-촉진 효과]
우선 성인 흉선 세포의 전체 집단(3×105/웰)을 PMA 부재하 또는 존재하에서 TSTGF 또는 재조합 인터류킨(ILs)으로 시험관내 자극시킨다. 표 12의 결과는 rIL4 + PMA 또는 이오노마이신 +PMA가 성인 흉선세포의 강력한 증식을 유도할 수 있음을 확인시켜 주고(Pooc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 1862, 1986, J. Immunol. 137 : 2260, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3856, 1987, Eur. J. Immunol. 16 : 12, 1986), 또한 미분별 성인 흉선 세포의 성장을 rIL1+PMA 또는 rIL2+PMA의 조합이 아닌 TSTGF+PMA 의 조합으로 지지됨을 증명해준다. 이 결과는 rIL4뿐만 아니라 TSTGF가 PMA의 존재하에서 성인 흉선 세포의 몇몇 분획의 성장을 촉진할 수 있음을 시사해준다. 그러나, TSTGF- 또는 IL4-유도 성장-지지효과는 배양을 3×104/웰의 응답 세포수(표 12의 Exp. 2)에서 수행할때만 겨우 관찰됨을 주목할 수 있다.
성인 흉선 세포는 그의 L3T4 및 Lyt2 표현형을 기준으로 4집단으로 나눌 수 있다(J. Exp. Med. 162 : 802, 1985, J. Immunol. 134 : 3632, 1985). 이중 한가지 집단이 L3T4-Lyt2-(이중-음성) 흉선 세포(＜총 흉선 세포중 5%)는 조사 흉선샘을 재정착시키고 이 기관에서 정상적으로 발견되는 다른 모든 T 세포 집단을 생산할 수 있는 세포를 함유한다.(J. Exp. Med. 162 : 802, 1985). 이 이중 음성, 미성숙 흉선 세포 집단이 TSTGF+PMA에 의해 그 성장이 지지되느냐를 조사하기 위하여, 본 발명가들은 항-L3T4 및 -Lyt2 항체+보체 C를 이용한 용해 처리를 통하여 L3T4+및/또는 Lyt2+흉선 세포를 제거하고 염소 항-생쥐 Ig(쥐 Ig와의 교차-반응)로 전코팅시킨 디쉬에서 연속 패닝시킴으로서 5∼6주 된 생쥐로 부터 이 집단을 분리한다. 제10도의 결과는 이 일련의 처리로 이중-음성 흉선 세포가 분리됨을 설명한다(세포수율, 0.5∼1.0% ; 순도＞99%).
이중-음성 성인 흉선 세포 집단(3×104/웰)을 TSTGF+PMA와 함께 배양한다. 표 13에서 볼 수 있듯이, 이중-음성 흉선 세포는 둘중 한가지의 자극물질에는 응답하지 못하지만 이 두가지 자극물질의 공동 자극으로는 미성숙 흉선 세포 집단의 적당한 증식이 초래된다. 제11도는 또한 TSTGF가 PMA와 결합된 투여량-의존 방법에서 이중-음성 흉선 세포의 증식을 촉진시킴을 보여준다. 미분별 흉선 세포의 동일한 세포 농도(3×104/웰)는 TSTGF+PMA의 존재하에서 증식 능력을 나타낼 수 없다는 점을 고려하면(표 12의 Exp. 2), 표 13의 결과는 TSTGF+PMA의 조합이 주로 이중 음성 미성숙 성인 흉선 세포에서 성장-촉진 효과를 유도함을 나타내준다. 또한 표 13에서는 이 자극물질-조합이 또한 이중-음성으로 여겨지는 14일된 태아 흉선 세포의 성장을 지지할 수 있음을 나타내준다(J. Immunol. 133 : 1117, 1984, Immunol. Rev. 82 : 141, 1984, Immunol. Rev. 82 : 79, 1984).
[TSTGF는 IL2- 또는 IL4- 의존성 오토크린 기작없이 이중-음성 흉선 세포의 성장-촉진을 유도함]
PMA+IL2 또는 IL4(표 12)로 자극된 전체 흉선 세포 집단(3×105세포/웰)에서 약한 또는 강력한 증식이 관찰되므로, 본 발명가들은 TSTGF와 IL2 또는 IL4간의 이중-음성 흉선 세포의 성장-촉진에 대한 공동-자극 활성을 비교하였다. 표 14의 결과는 IL4는 TSTGF로서 효과적으로 이중-음성 세포에 공동-자극 효과를 유도할 수 있지만 IL2 는 그렇게 할 수 없음을 증명해준다. 이 관찰로 TSTGF+PMA의 조합이 이중-음성 흉선 세포에 의한 IL4의 생산을 유도하고 생산된 IL4는 PMA와 함께 이중-음성 세포의 성장을 촉진시키도록 작용한다는 가능성을 높여준다. 이 가능성은 TSTGF+PMA에 의해 유도된 것과 같은 증식에 대한 항-IL4 항체의 효과를 조사함으로써 연구된다. 그러므로, 이중-음성 흉선 세포는 항-IL4 또는 항-IL2 수용기(대조) 항체 존재하 또는 부재하에서 IL2, IL4 또는 TSTGF+PMA 의 조합으로 자극된다(제12도). 결과는 배양액내 항-IL4 수용기 항체의 함유가 IL4+PMA에 의해 자극된 이중-음성 흉선 세포의 증식을 적당히 억제시키지만 항 IL2-수용기 항체는 그렇지 못하다는 것을 증명해준다. 대조적으로 TSTGF+PMA에 의해 유도된 증식은 이중 어느 형태의 항체 존재하에서도 영향받지 않는다. 이 결과는 TSTGF+IL2- 또는 IL4-독립적 경로를 통하여 이중-음성 세포의 성장-촉진에 기여한다는 사실과 일치한다.
[IL1는 TSTGF와의 조합에서 이중-음성 흉선 세포의 성장에 대한 강력한 공동 자극 활성을 갖음]
이제까지 제시된 자료들은 TSTGF가 그의 증식 응답에 대해 미성숙 흉선 세포에 작용하지만 그의 능력은 공동 자극물질인 PMA의 존재에 달려 있음을 시사해준다. PMA는 비-생리 화학적이므로, PMA의 기능이 어떠한 생리학적 인자에 의해 대체될 수 있느냐의 문제가 야기된다. 이러한 질문에 대해 대답하기 위해, T 세포 및 비-T 세포 기원의 각종 시토카인이 이중-음성 흉선 세포의 성장을 지지하도록 TSTGF의 공동 자극 물질로서 작용하는지를 실험한다. 표 15의 결과는 IL1이 TSTGF와의 상승 작용으로 PMA와 같이 효과적으로 이중-음성 흉선 세포의 성장을 촉진할 수 있음을 증명해준다. 이 결과는 또한 IL2 또는 IL4가 이중-음성 흉선 세포의 증식에 대한 적절한 공동-자극 활성을 갖는 반면에, IL6은 이중-음성 흉선 세포의 증식에 대해 TSTGF와 상승 효과를 내지 못함을 나타내준다(표 15).
IL1이 가장 효과적인 공동-자극 물질이므로, TSTGF와 IL1간의 상승효과를 좀더 정확히 연구하기 위해 추가 실험을 수행한다(제13도). IL1의 공동-자극 효과는 투여량-의존성이고 IL1 0.02∼0.2U/ml 사이의 낮은 투여량에서도 여전히 적절한 공동-자극 활성을 생산한다(제13a도). 그것은 또한 TSTGF+IL1에 의해 유도된 이중-음성 흉선 세포의 증식은 배양 개시 약 3일 후에 피크 응답을 나타내고 TSTGF+IL1으로 자극된 배양액에서의 피크 응답 시기뿐만 아니라 크기까지도 TSTGF+PMA에 의해 얻어진 것과 일치함(제13b도)을 나타낸다.
TSTGF, IL1 및 IL2 또는 IL4의 조합에 의한 이중-음성 흉선 세포의 강력한 증식
IL1이 이중-음성 흉선 세포의 성장에 대한 TSTGF의 공동 자극 물질로서 가장 효과적인 PMA의 대체 물질임을 밝혀주는 동시에, 표 15는 또한 그의 증식은 TSTGF+주로 TCGF(IL2 또는 IL4)의 또 다른 조합에 의해 적절한 정도로 유도될 수 있음을 증명해준다. 이 두가지 종류의 조합이 첨가/상승 방식으로 작용하는지를 결정하기 위하여, 이중-음성 흉선 세포를 TSTGF, IL1 및 IL2 또는 IL4의 존재하에서 배양한다.
제14도의 결과는 3가지 시토카인(TSTGF, IL1 및 IL2 또는 TSTGF, IL1 및 IL4)를 배양액에 첨가하면 상기 두가지 시토카인의 각 조합에 의해 유도된 것과 비교할 때 매우 증강된 이중-음성 흉선 세포의 증식을 초래한다는 사실을 설명해 준다. 그러므로, 그것은 TSTGF+IL1 및 TSTGF+IL2 또는 IL4의 두가지 형태의 조합이 이중-음성 집단에 가법의 성장-촉진 효과를 유도할 수 있음을 나타낸다.
TSTGF를 포함하는 4가지 시토카인의 혼합물에 대한 L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 성인 흉선 세포의 강력한 증식
최근의 몇가지 연구는 L3T4-Lyt2-흉선 세포가 별개의 아군으로 세분될 수 있음을 나타내주는데 이것은 하나의 계통 발달 줄기 이상으로 제시되는것 같다(Nature 326 : 79, 1987). 대부분의 연구 결과는 흉선에서의 발달이 전형적인 αβ-보유 성숙 T 세포로 진행되는 초기 흉선 세포(이중-음성)가 T 세포 수용기(TcR)를 형질 발형시키지 않음을 나타낸다(Nature 326 : 79, 1987). 그러므로, 본 발명가들은 T3 브라이트(bright) 이중-음성 흉선 세포의 제거로 수득되는 L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 흉선 세포가 TSTGF를 포함하는 시토카인의 혼합물로 자극될 수 있는지를 마침내 연구하였다.
L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감선 흉선 세포 아군을 제조하기 위하여, 항-T3(2C11) 항체를 보체처리 및 패닝단계 모두에서 항-L3T4 및 항-Lyt2 항체와 함께 포함시킨다. T3 브라이트 흉선 세포를 제거하는 항-T3 항체의 효과를 제15도의 결과로 제시한다. 이중-음성 흉선 세포 집단이 T3-또는 둔감성 및 T3 브라이트 아군을 모두 함유하는데 반하여, T3 브라이트 세포-제거 아군은 다수의 T3-및 소수의 T3 둔감성 흉선 세포로 구성된다.
표 16은 단독으로 또는 각종 조합으로 이제까지 사용된 시토카인의 L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 흉선 세포 아집단의 증식을 유도하는 효과를 나타낸다. 그 결과는 증식 정도가 상기 두가지 시토카인의 어떤 조합에 의한 자극의 경우보다 TSTGF, IL1 및 IL2 또는 IL4에 의한 자극의 경우에 더욱 강함을 증명해준다. 이중-음성 흉선 세포에 대해 얻어진 증식 형태와 비교하여(제14도), 특히 TSTGF, IL1 및 IL4의 조합으로 자극할 때 L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 흉선 세포 집단에서 관찰되는 성장-촉진 효과는 가법이상임을 주목한다.
[표 1]
흉선-간질 유래 세포주 또는그의 배양 SN의 시험관내 Th 클론의 성장 지지능력
Figure kpo00004
a. 단층은 흉선 간질-유래세포주 또는 BALB/3T3 세포주의 2가지 형태(섬유아세포형태 ; TSCF 및 상피세포 형태 ; TSCE)로부터 제조된다.
b. 10×104(실험 1) 또는 5×104(실험 2)의 9-16Th 클론을 24-웰 배양 플레이트내에서 2-ml 부피로 단층 또는 상층액(SN)중 하나와 함께 배양한다. 9일(Exp. 1) 또는 6일(Exp. 2) 후에 9-16 세포가 수득된다.
[표 2]
TSCF 단층 또는 그의 SN에 의한 성장-유지 후 Th 클론의 항원-반응성의 보유
Figure kpo00005
a. 9-16세포(1×4/웰)는 KLH 항원(8μg/ml)의 존재 또는 부재하에서 I-Ek항원-제시 세포로서 2000R X선 조사 C3H/He 비장세포(5×104/웰)에 의해 자극된다.
b. 9-16 세포를 I-Ek및 KLH 항원의 부재하에서 TSCF 단층 또는 그의 SN과 함께 4주 동안 전배양 한다. 배양배지를 TSCF 단층과의 전 배양을 위해 신선한 배지로 매주 교환하거나 TSCF SN과의 전배양을 위해 25% TSCF SN을 함유하는 신선한 배지로 매주 교환한다.
[표 3]
Figure kpo00006
a. LBRM-33 1A5세포를 PHA(2μg/ml)의 존재하에서 rIL1 또는 TSTGF(25% TSCF SN)의 각종 희석 용액에 노출시킨다. IL2-의존성 CTLL-2을 사용하여 이 배양 SN에서 생산된 IL2 활성을 측정하여 1L1 활성을 수득한다.
b. 대조로서 항-생쥐 IgM 및 TSCF SN 또는 rIL4와의 공동-자극에 의한 B세포 증식을 측정하여 IL4 활성을 평가한다.
c. WEHI SN은 WEHI-3 세포주의 배양 SN으로부터 수득된다.
[표 4]
각종 T세포 클론의 증식에 대한 TSTGF의 효과
Figure kpo00007
a. 각종 T세포 클론(1 또는 5×104/웰)을 96-웰 마이크로플레이트 내에서 2일동안 센트리콘 막에 의해 0.2부피로 농축된 배양 SN중의 rIL2(20μ/ml), rIL4(25μ/ml) 또는 TSTGF(50% v/v)와 함께 배양한다.
[표 5]
일차 흉선 외식 배양에 의한 TSTGF의 생산
Figure kpo00008
a. 일차 C3H/HeN 흉선 외식으로부터 배양 SN을 흉선 세포 현탁액의 배양 개시 4주(Exp. 1) 또는 5주(Exp. 2)후에 수득한다.
b. 9-16 Th 또는 CTLL-2 CTL 클론(104/웰)을 제시된 각종 농도로 배양 SN의 존재하에서 배양한다.
[표 6]
열 또는 pH처리 후 TSTGF의 안정성
Figure kpo00009
a. 부분 정제된 TSTGF 제제를 가열(제시된대로) 하거나 또는 0.2M 글리신 -HCl(pH 2.0), 0.2M 아세트산나트륨(pH 5.0) 또는 0.2M 트리스-HCl(pH 9.0)중 하나를 3배 부피로 가한다. 그런 후, 시료를 HBSS에 대해 투석한다.
b. 투석시료(50μl)를 105/웰 9-16Th 클론의 각 웰에 가한다. TSTGF 시료의 부재하에서 동일한 수의 9-16 세포에 의한3H-TdR 취입량은 120이다.
[표 7]
TSTGF 활성에 대한 트립신-또는 DTT-처리효과
Figure kpo00010
a. 부분 정제된 TSTGF 시료를 37℃에서 2시간 동안 트립신(최종 농도 15μg/ml)으로 처리한 후 최종농도 1mM의 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)+소혈청 알부민(BSA)(2.5mg/ml)를 가하고(B군), 동량의 트립신, PMSF 및 BSA를 동시에 가하거나(C군) 또는 25℃에서 2시간 동안 디티오트레이톨(최종 농도 50mM)로 처리한다(D군). 이 처리 후, 시료를 HBSS로 투석하고 분석을 위해 사용한다.
[표 8]
GM-CSF에 의한 것이 아니라 IL2 또는 IL4에 의한 9-16Th 클론의 성장-촉진
Figure kpo00011
a. 재조합 GM-CSF의 효과는 두가지 다른 분석법으로 확인한다. 우선, 50U/ml의 GM-CSF는 과립세포 또는 대식 세포로 구성된 68.7±4.5개의 콜로니를 형성시킨다. 두번째로, 정상 골수 세포(5×104)의 증식(3H-TdR 취입량)은 GM-CSF(50U/ml)vs 543의 존재하 및 GM-CSF의 부재하에서 19948이다.
[표 9]
부분 정제된 TSTGF에서의 IL2 및 IL4 활성의 결핍
Figure kpo00012
a. CTLL-2(1×104/웰) 또는 HT-2(1×104/웰) 세포를 재조합 IL2(rIL2), rIL4 또는 부분 정제된 TSTGF중 하나로 자극시킨다.
[표 10]
부분 정제된 TSTGF 제제에서의 CSF 활성의 감소
Figure kpo00013
a. TSCF, L세포 또는 WEHE-3 세포주 또는 부분 정제된 TSTGF 제제로부터의 배양 상층액(SN)을 제시된 최종 농도로 TSTGF 분석 또는 CSF 분석을 위해 사용한다.
b. TSTGF 활성은 1059-16Th 클론의3H-TdR 취입량으로 평가한다.
c. 콜로니 형성 및3H-TdR 혼입 분석은 동일한 골수 제제에서의 세포를 사용하여 수행한다. 콜로니 형성은 배양 10일 후에 결정한다.3H-TdR의 혼입은 72시간 배양 후에 측정한다.
[표 11]
T세포 증식을 일으킬 수 있는 각종 인자간의 기능 및 특성의 비교
Figure kpo00014
a. GM-CSF는 몇몇 실험실에서 유지된 HT-2 세포의 증식은 유도하지만 본 발명자들의 실험실에서 유지된 HT-2 세포를 증식시키지 못했다.
[표 12]
성인 생쥐로부터의 흉선 세포 성장에 대한 TSTGF+PMA의 효과
Figure kpo00015
a. 6주된 정상 C3H/He 생쥐로부터의 전체 흉선 세포(3×105또는 3×104/웰)를 각종 자극제와 함께 3일동안 배양한다.
b. MRL 104.8a 배양 SN을 DEAE-세파셀 크로마토그래피 및 PBE 94 크로마토포커싱시키고 용출된 TSTGF-함유 분획을 농축시켜 TSTGF 시료를 제조한다. TSTGF 1단위를 9-16 헬퍼 T세포 클론을 사용하여 1/2-최대 응답을 생산하는 희석에 상당하는 것으로 정의한다.
c. 세포를 0.5μCi/웰의3H-TdR로 6시간 동안 펄스시킨 후 혼입된 방사능을 결정한다. 자료값은 삼중 배양액/군의 평균 값±S.E.를 나타낸다.
[표 13]
L3T4-Lyt2-성인 흉선 세포 또는 14일된 태아 흉선 세포의 성장에 대한 TSTGF+PMA의 상승 효과
Figure kpo00016
a. L3T3-Lyt2-성인 흉선 세포(3×104/웰) 또는 14일된 태아 흉선 세포(2×104/웰)를 표 12와 동일한 투여량으로 각종 자극제와 함께 3일 동안 배양한다.
[표 14]
PMA의 존재하에서 이중 음성 흉선 세포의 성장 촉진 능력에 대한 TSTGF와 각종 ILs간의 비교
Figure kpo00017
a. 이중 음성(L3T4-Lyt2-) 성인 흉선 세포를 표 12와 동일한 투여량의 각종 자극제로 자극시킨다.
[표 15]
각종 인터류킨과의 상승 작용에 의한 L3T4-Lyt2-흉선 세포의 성장-촉진에 대한 TSTGF의 효과
Figure kpo00018
a. 이중 음성 성인 흉선 세포(3×104/웰)를 TSTGF(20U/ml)의 존재하 또는 부재하에서 각종 자극제(제시된대로)로 자극시킨다.
b. rIL6의 농도는 10U/ml이다.
[표 16]
[ISTGF+IL1] 및 IL2 또는 IL4의 조합에 의한 L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 흉선 세포의 증식 강화
Figure kpo00019
a. L3T4-Lyt2-T3-또는 둔감성 성인 흉선 세포(3×104/웰)를 제시된 시토카인의 조합으로 3일 동안 자극시킨다.

Claims (8)

  1. 흉선 간질 세포의 배양 상층액에서 수득되고, T세포 클론 및/또는 흉선 세포의 성장을 촉진함을 특징으로 하는 흉선 간질에서 유래된 T세포 성장 인자.
  2. 제1항에 있어서, 흉선 간질이 포유류 기원인 T세포 성장 인자.
  3. 제1항에 있어서, T세포 클론이 헬퍼 T세포 클론인 T세포 성장 인자.
  4. 제1항에 있어서, 흉선 세포가 미성숙 흉선 세포(L3T4-Lyt2-)인 T세포 성장 인자.
  5. 제1항에 있어서, 하기 특징을 갖는 T세포 성장 인자 : (a) 분자량 : 약 25,000, (b) 등전점 : 약 6.0, (c) 열처리 저항성(65℃, 10분), (d) pH 2.0∼9.0에서 안정, (e) 트립신 또는 디티오트레이톨에 민감, (f) 그 분자내에 이황화 결합을 갖는다.
  6. 흉선 간질 세포를 배양 배지에서 배양하고 배양 배지의 상층액에서 T세포의 성장을 촉진하는 인자를 수집함을 특징으로 하는 흉선 간질 유래의 T세포 성장 인자의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 인자가 DEAE 컬럼 크로마토그래피 및 크로마토포커싱에 의해 수집되는 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 배양을 12∼14일 동안 수행하는 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1196958B (it) * 1986-07-10 1988-11-25 Ellem Ind Farmaceutica Derivato di timo attivo per via orale, procedimenti per la sua preparazione e relative composizioni farmaceutiche
ZA887773B (en) * 1987-10-26 1989-07-26 Immunex Corp Interleukin-7
CA2000695A1 (en) * 1989-03-16 1990-09-16 Nancy M. Hedberg Cytokine
US5346988A (en) * 1990-06-20 1994-09-13 Tampa Bay Research Institute Process for obtaining cellular protein having anti-HIV activity
JPH04186696A (ja) * 1990-11-16 1992-07-03 Mitsubishi Electric Corp ボンディング装置
DE69331574T2 (de) * 1992-03-13 2002-10-02 Terry R Beardsley Thymus-stammendes, immunverstärkendes agens zur therapeutischen verwendung in einem wirt mit einem angegriffenen immunsystem
ATE226250T1 (de) * 1992-04-30 2002-11-15 Innogenetics Nv Polypeptide und peptide dafür kodierende nukleinsaüre und ihre verwendung im zusammenhang mit tumortherapie, entzündung oder immunology
FI98493C (fi) * 1994-06-10 1997-07-10 Olavi Kajander Kasvutekijävalmiste, menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi ja sitä sisältävä elatusaine
US5643881A (en) * 1994-08-04 1997-07-01 Tampa Bay Research Institute Protein having anti-HIV activity and method for obtaining it
CN107299138B (zh) * 2014-04-09 2021-05-07 上海欣生源药业有限公司 Cxcl4单抗治疗肿瘤及化疗后肿瘤加速再增殖基因筛选法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0163543A3 (en) * 1984-06-01 1987-08-12 VXR, Inc. Marrow cell stimulator
AU610916B2 (en) * 1987-08-04 1991-05-30 Meguro Institute Co., Ltd. Human placenta-derived thermostable cell growth factor and a process for production thereof
AU626800B2 (en) * 1987-10-02 1992-08-13 Rockefeller University, The Macrophage-derived inflammatory mediator (mip-1alpha and mip-1beta)

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