JPS62278980A - 細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＆　発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は、低密度からの動物細胞の増殖゛を可能とする
因子に関するものである。

従来の技術及び発明が解決しようとする問題点血清培地
を用いた場合においても、細胞を低密度で培養すると細
胞が死滅することが多い。例えばとトーヒトハイブリド
ーマＨＢ　４　Ｃ５（Ｈ−Ｍｕｒａｋａｍｉ　、ａｔ　
ａｌ、　：　ＩｒＬＶｉｔｒｏ　ｃｔＬＬｗｌａｒ　ａ
ｒｂｄ　ｔｔｇｖａｌｏｐｍｇｎｔａｔ　Ａｉｏｔｏｇ
ｙ　２１　、５９３−５９６　（１９８５）〕、ヒ）　
ＩＪ　７パ？’球ｉ細胞ａ−ＨＯ−３２３（Ｈ，０ｈａ
ｓｈｉ、ａｔ　ａｌ、：ＣｔＬＬ、Ｂｉｏｌ、Ｉｎｔ、
Ｒｔｐ、　１０（２）　。

７７−８４（１９８６））の亜株であるＨＯ−３２３−
３、ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞株ＣＣＲＦ−Ｃ
ＥＭ等の細胞は、１０細胞／ｄ以下で植え込み培養した
場合には死滅する。更に細胞による物質生産を行う場合
においては無血清培養が望ましいが、この場合にはよシ
顕著にこの死滅現象がおこる。またハイプリドーマ及び
遺伝子導入した細胞の作製又は初代培養における標的細
胞の樹立においては、；Ｉａ胞が非常に少ない状聾から
でも増殖してくることが必要である。

しかし現在までこのような低密度からの細胞増殖を可能
とする因子が見いだされておらず、細胞培養に限界があ
ったっ例えばヒト又はウシ血清アルブミン（Ｓ、Ｎｉ１
ａｕｓｅｎ　：　Ｊ、Ｃｔｔｌ、ｐｈｙ！ｉｏ１．９６
゜１−１４　（１９７８）ｒ　１．Ｙａｍａｎｅ、ｇｔ
　ａｔ、：Ｃｇｌｌ　ＢｉｏＬ、Ｉｎｔ、Ｒａｐ、　３
．５１５−５２３　（１９７９）　）、ラクト７ｚ　　
リ　ｙ　　（８，Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ、ｇｔ　ａｌ、：
Ｈｉｏｃｈｉｍ、５ｉ’Ｐ”／’、Ａｃｔα７６３，３
７７−３８２（１９８３））　トラ：／　スフ　ｘすｙ
　（Ｄ、Ｂａｒｎｅｓ、ｇｔａｔ、　：ＣｔＬ１２２゜
６４９−６５５（１９８０））、インシーリン（Ｇ、Ｏ
。

Ｑｅｙ、ｇｔ　　ａｌ、：　Ｊ、Ａｍ、Ｍａｄ、Ａｚｚ
ｏｃ、　８２．ｌ　６０−１６９（１９２４））、エタ
ノールアミｙ　（Ｈ，Ｍｕｒａｋａｍｉ　、ａｔ　　（
ＬＬ、：ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ　　７９　。

１１５８−１１６２（１９８２））、セレニウム（Ｗ、
Ｌ。

Ｍｃｋｅｅｈａｎ、ａｔ　　ａｌ、：ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｔｔ、Ｓｃｉ、（７５Ａ　７３．２０２３−
２０２７（１９７６））、Ｔ’ａｉ成長因子［Ｄ、人、
Ｍｏｒｇａｎ、ｔｔ　ａｌ、　：５ｃｉｔｎｃｔ　１９
３．１００７−１００８（１９７６））、Ｂ細胞成長因
子（Ｍ　、　Ｈ。

ｗａｒｄ、ｔｔ　　ａｌ、：Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、１５
５＋　９１４　９２３（１９８２））、コロニー形成刺
激因子（Ｄ、Ｈ，Ｐｌｕｚｎｉｋ、ｔｔ　　ａ５　：　
Ｊ、ｃａｌＬ、Ｃｏｍｐ、ｐｈｙｚｉｏＬ、５５．３１
９−３２４（１９６５））等にはこのような増殖活性が
認められなかった。

この発明は、このような問題点を解決しようとして行わ
れたものである。

問題点を解決するための手段 本発明者らは動物細胞の低密度からの増殖を可能とする
因子を得る目的で広く自然界を検索した結果、ヒト血漿
中にこの目的に適合する因子が存在することを見いだし
、これに基づいて本発明を完成するに至った。

本発明の因子はヒト血漿中に広く存在し、人、Ｂ１λＢ
及びＯ型のいずれの血液型の血漿中にも存在する。しか
し血漿を細胞培養用培地に直接添加した場合にはゲル化
が生ずる。軟寒天培養のようにゲル化が生じてもよい場
合もあるが、液体培養においてはゲル化が細胞の取り扱
いを難しくする。従って液体培養に用いるためには、少
なくともＣａ　　処理した血漿を用いる。Ｃａ　　処理
は、ヒト血漿に終濃度で１００ｍＭになるように塩化カ
ルシウムを添加し、室温で３０分間攪拌し生じたフィブ
リンを遠心分離で除去することにより行うことができる
。

本因子は硫酸テンモニウム分画、ゲル濾過及びクロマト
フオーカシングにより精製が可能である。

硫酸アンモニウム分画は０−４０％飽和硫酸アンモニウ
ム画分を得るように行う。ゲル濾過は３ｅｐｈａｃｒｙ
ｌ　Ｓ−３００（７７に？　シフ　）、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ−１５０（ファルマシア）等の樹脂を用い、カラ
ムクロマトグラフィーにより行うことができる。まり、
クロマトフオーカシング（ファルマシ７）はｐＨ７〜４
、ｐＨｇ〜５等のｐ）（範囲のｐｆ（グラジェントによ
り行うことができる。このような精製法により本因子は
約１００倍精製することができる。

本因子の分子量はゲル濾過により求めたところ約１５万
であった。等電点はクロマトフオーカシングの結果から
ｐｌ（６・５付近に６る。また、本因子は９０°Ｃ，５
分間の熱処理により失活し、低温又は凍結保存により失
活する不安定な性質を有していた。

本因子画分を添加する培地としては、通常用いられてい
る血清培地又は無血清培地を固相することができる。例
えば、血清培地としては１０％牛脂児血清添加基本合成
培地を用いる。基本合成培地としてはＲＰＭＩ　１６４
０培地、］）ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅ
ａｇｌｅ培地（ＤＭＥ）等を用いることができる。また
無血清培地としてはインシーリン、トランスフェリン、
エタノールアミン及びセレニウム添加基本合成培地（Ｉ
ＴＥＳ培地）　ＣＨ，Ｍｕｒａｋａｍｉ　、　ａｔ　ｃ
ｔｔ、：　ｐｒａｃ、ＮｏＬｔＬ、ＡｃａｃＬ、Ｓｃｉ
、　ＵＳ　Ａ７９．１１ｓｓ−１１６２（１９８２））
、ＩＴＥＳ培地のトランスフェリンのかわシに２クトフ
エリンを用いたＩＬＥ８培地（Ｓ、Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ
、　ａｔ　ａＬ、　：Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ａｃｔａ　７６３．３７７−３８２（１９８３））等
を使用することができる。無血清培養用の基本合成培地
としては、ＤＭＥ培地及びＨａｍ’５Ｆ−１２培地を１
：１で混合した５ＦＦＤ培地又はＲＰ　Ｍ　ｌ１６４０
培地、ＤＭＥ培地及びＨａｍ’ｓ　　Ｆ　−１２培ｔ％
を２：１：１で混合したＲ　Ｄ　Ｆ培地等を用いる。

これらの血清培地及び無血清培地に本因子画分を添加し
細胞培養を行う。Ｃａ　　処理した血漿を用いる場合に
は、１〃り／ｄ程度のタンパク濃度になるように添加し
、またクロマトフォーカシング両分を用いる場合には１
００μ９／ｍｌになるように添加する。

本因子添加培地を用い種々の動物細胞の培養が可能であ
り、例えばヒトＢ　−ＩＪンバ球細胞、ヒトＴ−リンパ
球細胞、ヒト−ヒトハイブリドーマ等である。

発明の効果 本因子を通常用いられている血清培地又は無血清培地に
添加することにより、１個からでもリンパ球、ハイプリ
ドーマ等の動物細胞を増殖させることが可能となった。

ハイプリドーマの限界希釈法によるクローニングを行っ
たところ、フィーダー細胞を用いることなく９０％以上
の確率で１個から細胞を増殖させることができた。

リンパ球、ハイプリドーマ等を用いコロニー形成率を調
べたところ、本因子を添加した場合には、無添加に比べ
１００倍以上形成率が上昇した。また凍結した細胞を培
養する場合等において、はとんどの細胞が死滅すること
がある。このような場合にも本因子を添加することによ
り増殖させることができた。

ハイプリドーマの作製に本因子を用いることにより、そ
の出現率を数倍上げることができた。従って本因子をハ
イプリドーマ及び遺伝子導入した細胞の作製又は初代培
養における標的細胞の樹立に応用することにより、より
高率により効果的に細胞を得ることが可能となると考え
られる。

次に実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ ヒ）　Ｂ　ＩＪンバ芽球様細胞株ＨＯ−３２３−３、ヒ
ト急性リンパ芽球性白血病Ｔ　、［胞株ＣＣＲＦ−ＣＥ
Ｍ（ｃＥＭ）及びヒト−ヒトハイプリドーマＨＢ４Ｃ５
に対するＣａ　　添加処理した３人のヒト血漿の増殖活
性を調べた（第１表）。培地としては１０％ウシ胎児血
清を添加したＲＰＭ１１６４０培地を用い、細胞を１×
１０　細胞１０で接種した（以下の実施例についても同
様に行った）。３日間の培養により、ヒト血漿を添加し
なかった場合にはいずれの細胞株も死滅した。一方、ヒ
ト血漿を添加した場合には良好な細胞増殖が認められた
。また、その活性に個体差が認められないことから、本
因子はヒト血漿中に広く分布していると考えられる。

その他の血清アルブミン、ラクトフェリン等の生長因子
はヒト血漿のような増殖活性は認められなかった。

第１表　ヒト血漿の種々の細胞株に対する影響無添加　
　　　　　　０．１　　０．０　　０．０、Ｉ　　　　
　　　　４１．５　　１０．２　２５．７実施例２ ＨＯ−３２３−３細胞を用いコロニー形成率に対するＣ
ａ　　添加処理したヒト血漿の影響を調べた（第２表）
。軟寒天培養は通常の方法によシ行った。

血漿を添加しなかった場合には１５００個の細胞を接種
しても２個のコロニーしか得られなかった。

一方、血漿を添加した場合には１５個の細胞を接種する
だけで９個のコロニーが得られた。従ってヒト血漿中の
因子はコロニー形成率をも上げる活性をもっていると考
えられる。

第２表　ヒト血漿のＨＯ−３２３−３細胞ノコロニー形
成率に対する影響 実施例３ 無血清培地を用い、実施例１と同様に血漿の影響を調べ
た。無血清培地としては、インシーリン（５μ７／ｄ）
、ラクトフェリン（２５μり／罰）、エタノールアミン
（２０μＭ）及びセレニウム（２、５ｎＭ）添加ＲＰＭ
Ｉ　１６４０培地を用いた。実施例１の血清培地を用い
た場合と同様、３日間の培養により、ヒト血漿を添加し
なかった場合にはいずれの細胞株も死滅した。一方、ヒ
ト血漿を添加した場合には良好な細胞増殖が認められた
。

第３表　無血清培養におけるヒト血漿の種々の細胞株に
対する影響 無添加　　　ｏ、ｏ　　　　ｏ、ｏ　　　ｏ、。

ヒト血漿、ｒ　　　　　３０．７　　　　　９．４　　
　２２．３、ｌ　　　　　　３４．２　　　　　　８．
７　　　　２５．６、璽　　　　３８．４　　　　１０
．６　　　２４．５実施例４ 本因子の精製を次のように行った。

ヒト血漿（５０ｍｌ）に終濃度１００ｍＭになるように
Ｃａ　　を添加し、室温で３０分間攪拌することにより
フィブリノーゲンを除去した。フィブリノーゲンを除去
した上清（４５ｄ　）に硫酸アンモニウムを添加しＯ〜
４０％飽和硫酸アンモニウム沈殿画分を得た。沈殿を４
１！Ｌｔのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し
、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００カラム（１−２Ｘ１
００Ｃｎ１）クロマトグラフィーにかけた。

その溶出パターンを第１図に示した。１フラクシ冒ン当
り１．８−ずつ集めた。２番目のピークに活性が認めら
れ、本因子はＣａ　　添加処理した血漿の約３０倍に精
製された。この溶出パターンから本因子の分子量は約１
５万であった。増殖活性をもつ２３〜２６番のフラクシ
ｉン（Ｓ−３００ｉｉ！ｉｌｉ分）を集め、これを２５
ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）に対し透
析した後、ｐＨ７〜４のクロマトフオーカシング（ＩＸ
２０ｃｎ１カラム）にかけた。その溶出パターンを第２
図に示した。２８０ｎｍでの吸光度のピークごとにフラ
クシヨンを集め、Ａ−Ｅの５つの両分に分けた。これら
の両分について増殖活性を測定した結果、Ｃ画分にのみ
活性が認められた。このステップにより、本因子は更に
約３倍精製された。このクロマトフオーカシングの結果
から、本因子の等電点はｐＨ５，５と考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例４の硫酸アンモニウム画分の５ｅｐｈ
ａｃｒｙｌ　Ｓ−３００カラムクロマドグ２フイーで、
その溶出パターンを示すグラフである。 第２図は、実施例４の８−３００画分のクロマトフオー
カシングで、その溶出パターンを示すグラフである。 特許出願人　　森永製菓株式会社 第　　１　　図 フラク／ｄ／

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ヒトの血漿中に広く存在し、以下の性質を有する細胞増
   殖因子。 （ａ）動物細胞を１個からでも増殖させる活性を有する
   。 （ｂ）動物細胞のコロニー形成を高める活性を有する。 （ｃ）分子量約１５万の物質である。 （ｄ）ｐＨ６．５付近に等電点を有する。 （ｅ）９０℃、５分間の熱処理により失活する。 （ｆ）低温又は凍結保存により失活する。