JPS58190397A - インターリューキン−２およびその純化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターリューキン２（インターロイキン２）Ｉ　Ｉｎ
ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　＋、　Ｉ　Ｌ　２　：Ｔ−細胞成
長因子〕に、／マーキットリンノ々庸系のＤａｕｄｉ株
の共刺激を伴たって又は伴なわずに生産され、（ＮＦ（
、）、８０．沈澱、イオン交換クロマトグラフィー（ジ
エチルアミノエチルセルｑ−ス）、ゲル濾過〔ＡｃＡ　
４４ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌｌ）、および疎水
クロマトグラフィー、好ましくはブルーアガロース（Ｂ
　ｌｕｅＡｇａｒｏｓｅＬ　　フロジオン−レッドアガ
ロース（Ｐｒｏｃｉｏｎ”−Ｒｅｄ　Ａｇａｒｏｓｅ）
の疎水りａ−ｖトグラフイーニヨリ、リンノぐ球コンデ
ィションド申メディウムから、ｙ、かけ上鉤質的に約３
７，０００倍に純化された。Ｄａｕｄｉ細胞の非存在Ｆ
に生産された自然ＩＬ２（Ｎａｔｉｖｅ　ＩＬ２）は、
ゲル濾過で測定して約２６００ドルトンの分子量を吃っ
ており、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で測定して、変性後に、約１６．０００ド
ルトンと１７，０００ドルトンの２つの分子量をもって
いるＩＬ２を産生ずる。Ｄａｕｄｌ細胞（１０”／＋＋
ｖ／１の存在下に生産されたＩＬ２は、ゲル濾過および
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル′成
気泳動の両方で測定して、杓１４，５００ドルトンの分
子量を示す。

純化したＩＬ２け、分子量に依存することなく約１０’
Ｕ／１１１９プロテインの特異活性を示し、また２６．
０００分子量型で約ｐＨ６，７の等電位点を、分子ｆｋ
１４．ｓｏｏの別型で約ｐＨ８，１の等電位点を示す。

純化したＩＬ２では、インターフェロン（アルファーお
よびガンマ）、顆粒球マクロファージ（ｇｒａｎｕｌｏ
ｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｌ　コロニー刺激因
子（ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔ＋ｒ＞ｇ　ｆａｃ
ｔｏｒ）　％　および胸腺ｆｉ胞胞化化活性ｔｈｙｍｏ
ｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｓｉｎｇ　ａｃｔｉ
ｖＨｙ）が検出されず、また純化したＩＬ２Ｆｉ、ドデ
シル硫酸ナトリウム　Ｉリアクリルア電ドゲル電気泳１
での１１ｔＩ外部標識および銀染色（ｓ　ｉ　Ｉｖｅｒ
　ｓｔａｉｎｉｎｇｌから判断して、汚染プロティンを
含まない。

ＩＬ２の４つの分子型の粋、てが、１０−１１〜１０″
１０Ｍ（０２十〇、　０５　Ｕ／１ｍ／）の濃度で生物
学的に活性であり、ヒトおよびネズミ科の細胞傷害Ｔ−
細胞の成長を支持する、 時遅、機能的および生化学的に特徴的な可溶性プロティ
ンがいくつか発見されている。これらは、免疫系の応答
をｊＩｌｌ整干る中心的な役割を演じ、また免疫機能の
一面あるいけいくつかの面を仲介することのでき抗原非
特異性エフェクター分子として働く。これらの因子の多
くは造血細胞、特Ｋ　ＩＪンパ細胞および単球から合成
され、一般にサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅａ　ｌと
よげれる。

最近、タン・ぞり化学および分離技術が精巧になり、ま
た、特定のサイト力インを分泌すゐ株化細胞が発展し、
詳細なサイトカインの分析が可能となった。免疫応答の
輸入アーム（ａｆｆｅｒｅｎｔ　ａｒｍ）に含まれた細
胞相互作用の多くは、これらの細胞によって作り出され
た可溶性のヘルパーあるいはサプレッサー物質を含むこ
とが発見された。

リン、４球および他の細胞によって生産されたこれらの
非抗体仲介体は、以前からあった抗体自体に灼しての興
味に匹敵しうる興味を生み出した。

今日、免疫応答に関する分野で、サイトカインの働きが
示され、あるいは暗示され々い分野は殆どない。植物レ
クチンがヒトＴ−リンノセ球の増殖を刺激することが発
見されたあと甘も々〈可溶性のマイトジェン因子が培養
−Ｆｙ中に見い出された。１９６５年以来、多くのマイ
トジェン因子（有系分裂誘腎因子）が記載され、検定方
ｆ？によって、多くの異なった治称あるいは頭字語がそ
の活性に対し用いられてきた。

１９７６年、レクチンで刺激した単核細胞からのコンデ
ィションド・メディウムは、レクチンで活性化したヒ）
Ｔ−細胞の連続的な指数的成長を支持するこ表が発見さ
れた。培養Ｔ−細胞の成長は完全に外因性のｌＬ２の供
給によるという点で、上記発見は、’ｒ−ａ＠成長因子
（Ｔα）Ｆ。

１１、２　）　Ｋ　関し急速な、そして定量的な検定方
法の１立を可能にした。２４時間以内に、Ｓ字状のＩＬ
２依存性投与ｆ゛一応答曲線（これはプロビット分析を
受けやすいものである）Ｆｉ、ＩＬ２の力価の比較が可
能な６境性がよく、しかも定量的なデータを与えた。１
■、２分析は速く、簡便で定量的なものに発展し、生化
学的々＃性を規定する実験を促進した。その結果、ＩＬ
ｌｔ、レクチンあるいけ抗原により開始されたＴ−杷胞
活性化ののちに、マイトジェン刺激を生じせしめること
が判った。レクチンあるいは抗原を単核細胞に添加する
と、少なくとも３つの応答が生じる。まず１つは、単球
／マクロファージ（ＩＬＩ）から可溶性因子が放光れる
ことである。

２つ目は、このモノカインの影響に、特異Ｔ−細胞のサ
ブセットによってＩＬ２が遊離されることであり、３つ
目は分離したＴ−細胞サブセットによりＩＬ２が結合し
、増殖応答が生じるこ七である。これらの応答はすべて
レクチンあるいは抗原による開始を必要とし、一方、増
殖応答けＩＬ２単独に媒介される。

インターリューキン２（ＩＬ２Ｔ−細胞成長因子）はモ
ルガンらによって発見され（Ｍｏｒｇａｎ、　Ｄ、Ａ、
。

Ｆ、Ｗ、Ｒｕ５ｃｅｔｔｉ　　ａｎｄ　　Ｒ，、Ｃ，Ｇ
ａ１ｌｏ、５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　　Ｉｎ　　Ｖｉｔｒ。

Ｇｒｏｗｔｈ　　ｏｆ　　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ
　　ｆｒｏｍ　　Ｎｏｒｍａｌ　　Ｈｔ＋ｍａｒ＋　　
ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗｓ、５ｃｉｅｎｃｅ　１９３：１
００７（１９７６１１ｆｒ　’にのであって、抗原ある
いはマイトジェン刺激ののちＴ−リンノに（・衾によっ
て牛妾され、活ゼ）゛什Ｔ−４１用の増殖に必停であＡ
、　ＴＩ、２け免疫反応の仲介１′（Ｎ分子）として必
−１１である（ＰａｅＡｋｓ＋＋、Ｖ、　。

Ｌｖｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　ｏｎ　Ｔｈｅ　’ｖ４ｎｖｅ
、　Ｎａｔｕｒｅ　２９４：６１’１９（１９８１）’
。

Ｒｕ５ｃｅｔｔｉ、　Ｆ、　Ｗ、　、　ａｎｄ　Ｒ，、
Ｃ，ＧＡＩＩＯ，Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ
ｅＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
　ｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ
　　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｎｃｙｔｅｓ、Ｂｌｏｏｄ　　４７
：３７り（１９８１））、　捷　７’？、ＩＬ２がヒト
のリン・ξ、：；球白血病の毘常細泡増殖Ｋ　１４７．
与するという仮ノＪ＋７拠もあったｆＧｉｌｌｉｓ、　
Ｓ、、　Ｒ，。

１１４ｅｒｌｅｌｓｍａｎｎ、　Ｂ、　Ｃ１ａｒｋｓｎ
ｎ　ａｎｄ　Ｍ、　Ａ、　８．　Ｍｏｏｒｅ、　Ｃｏｒ
ｒｅｌａｔｉｏｎｏｆ　ＦＪｌｅｖａｔｅｄ　Ｔｅｒｒ
ｒ＋１ｎａｌ　Ｔｒ：＋ｎａｆｅｒａｓｅ　Ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ（ＴｄＴ）ｗｉｔｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏ
ｆ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＴＣ
ＧＦＩ＋ｎ　Ｈｕｍａｎ　ＬｅｕｋｅｍｉａＣｅｌｌｓ
、ＡＡＣＲ，Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、　９５５゜ｏ、
　２３８（１９８０）”、　Ｖｅｎｕｔａ、　８．、　
Ｒ，Ｍｅｒｌｅｌｓｍａｎｎ、　Ｋ。

Ｗｅｌｔｅ、　Ｓ、　Ｐ、　Ｆｅｌｄｍａｎ、　Ｏ，Ｙ
、〜Ｖａｎｇ　ａｎｄ　Ｍ、　Ａ、　８．　Ｍｏｏｒｅ
。

Ｐｒｎｄｕｃ＋ｉｏｎ　ａｎｄ　ＲｅｇｕｌａｔｉＯｎ
　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ｉｎＨｕｍａｎ　
Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　Ｌｅｕｋｅｅｍｉａｓ　
５ｔｕｄｉｅｄ　ＷｔｔｈＴ−Ｃｅｌｌ　Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ　Ａｎ＋ｉｂｏｄｉｅｓ（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ
））。

Ｃ？ｌらの結果によって抗原特異増殖工り、、答につい
ての検討が始められ、継代ＩＬ−２依存性増殖培養で機
能性の抗原特異Ｔ−＃Ｉ飽を維持＋ふＰみへと引き継が
れていった。＠能性モノクロナルＴ−細胞を培養しつる
能力は、Ｔ−ＭＩｌｌｌＵのφ疫応答の刊質について詳
細に研突するに必要斤雌胞試薬（Ｏｅｌｌｕｒａｌ　ｒ
ｅａｇｅｎＮ　　を与える。また。

培養され九Ｔ−細胞はＩＬ２細胞相互作用の詳細な研究
に必要な細胞試薬を与える。

寮験の結果、ＩＬ２にホルモンに関する殆んどの基準を
満たすことが示された。ＩＩ、Ｆｉある別個の細胞型で
生産され、％異しセプターにより、離れた他の細胞型で
作用する。ＩＬ２生産の分子機格、ホルモンレセプター
の相互作用およびＩＬ２アゴニストと拮抗体の同定につ
いての研寵の結果、Ｔ　−１７ンノ球を含む病理学的疾
病状態についての新たな洞察がイりられた。

未純化のあるいは部分的に純化された製剤をｔｉｔいて
Ｉ　Ｌ　２の作用を研究することは、コンディＡヨンド
・メディウムが強力な生化学的活性をもっている他のリ
ンフ才力インやサイトカインを含むため、困難である。

いくつかのグループ方法が報告されてきた。

ネズｊ　ＩＬ２ Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、　、　８．０ｉ　Ｉ　ｌ　ｉｓ、
　Ｍ、　Ｍａｒｂｒｏｏｋ、　Ｄ、　Ｍｎｃｈｉｚｕｋ
ｌａｎｄＫ、　Ａ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｒ
ｅｇｕｌａｔｏｒｙＭｏｌｅｃｕｌｅｓ、　１．　Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃ１ａｓｓ　ｏｆ　
ＭｕｒｉｎａＬｙｍｐｈｎｋｉｎｅｓ、　Ｊ、　Ｅｘｐ
、　Ｍｐｄ、　Ｉ　５０°８４９（１９７９１：Ｇｒａ
ｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐａｒｎｏ、　Ａ、、　Ｊ、　Ｄ、　
ＶａｌＩｓａｌｌｉ　ａｎｄ　Ｅ。

Ｒｅ１ｅｈ、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆλｆｕ
ｒｉｎｅ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ、
　Ａ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｍｉｔｏｇｅｎ　ｗｉｔ
ｈ　Ｈｅ１ｐｅｒＡｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊ、　Ｂｘｐ、Ｍ
ｅｄ、　１５４：４２２（１９８１）ヒトＩＬ２ Ｍｉｅｒ、　Ｊ、　Ｗ、　、　ａｎｄ　Ｒ，Ｃ，Ｏａｌ
　ｌｏ、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ａｎｄＳｏｍ
ｅ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａ
ｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　ＧｒｏｗｔｈＦｓｃｔｏｒ　Ｆｒｏ
ｍ　Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−８ｔｉｍ
ｕｌａｔｅｄＬｙｍｐｈｏｅｙｔｅ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏ
ｎｅｄ〜（ｅｄｉａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、８．人、’／７　：６Ｊ１４（１９８０）
；Ｇ１１ｌｉｓ。

Ｓ、　、　Ｋ、　Ａ、　Ｓｍ目ｈ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｗａ
ｔｓｏｎ、　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅ
ｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＲｅｇｕｌ
ｓｔｏｒｙＭｏｌｅｃｕｌｅｓ、　１１．　Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　０１ａｓｓ　ｏｆ　Ｒａｔ
ａｎｄ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｌｙｍｐｈｏｋｌｎｅｓ、Ｊ
、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１２４：１９５４（１９８
０）　：　Ｒ，ｏｈｂ、　Ｒ，Ｊ、　、　ａｎｄ　Ｋ、
　Ａ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｈａｔｅｒｏｇｅｎｉｔｙｏｆ
　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔ
ｏｒ（ｓ）　　Ｉ）ｕｅ　Ｔ。

Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｊｏｎ、　Ｍ
ｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１８：１０８７（１９８１
）　）　ａ これらのＩＬ製剤け、さらにＩＬ２　ｉＪ４節を規定す
ることを可能処した。

ヒ）　ＩＬ２の純化（精製）の過程において、と）　Ｉ
Ｌ２を高レベルで生産するための再現性ある条件がいく
つか既に開発されてきた。まず第１に、多くの異型的ド
ナーから調製され、ナイロン−カラムで精製された末梢
血液リンパ球がｌチのフィトヘマグルチニン−Ｍと０．
２５　％のウシ血清アルブミンの存在下に４ＸＩＱ’セ
ル／−で７２時間培養された。一般に、単一のドナーか
らのフィトヘマグルチニンｈ　ａ白血球は非常に少ない
レベルのＩＬ２Ｌか産生しない、第２番目は、単一のド
ナーからのものであって、ＲＭ−１゜ＳＲあるいは１Ｊ
ａａｄｉ　ａのようなり一すンノぞ芽球細胞系からのＸ
＠照射細胞と共培養されたフィトヘマグルチニン刺激細
胞を使用することによる方法である。Ｂ＃ｌＩＢ胞系の
使用についての論理的曲間は異型的刺激の導率的なソー
ス（原料）を与え、数個の異型的ドナーを混合する必要
がなくなった。第３番目に、マイトジェン創業のあとで
ＩＬ２を遊離する細胞系を検索した結果、ヒトＴ−白血
病細胞系Ｊｕｒｋａｔが高産生体であることが判った。

匂来、この細胞系はＩＬ２の好ましいソース（源）とし
て、多くの研究者達に用いられてきた。また、腫瘍プロ
モーターが共刺搬体（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）とし
て用いられ、コンディションド番メディウム中に肩、濃
度でＩＬ２が得られた、しかし、癌を増進する危険が大
きく増大するため、これらの９４剤を大曲に使用するこ
と確かに困難であった。

過去にＩＬ２は前記した３つ方法のいずれによっても粗
リンパ球−コンディションド・メディウムとして誘導さ
れ、血清の一換としてウシ血清アルブミン（０２傷）を
含む血清フリーの条件下にＯＰ４興された。

限外濾過のあとで、粗リンノ球−コンディションド・メ
ディウムｌ’ｔ　（Ｎ　Ｈ４）ｔ　８０４フラクシ冒ネ
ーシ目ンにより濃縮され、ついで透析された。

透析した活性試料は、アニオン交換クロマトグラフカラ
ム［ジエチルア２ノエチルセファローゼ（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　）　］を通された。ＩＬ２活性は、約０、０７
　Ｍ　−ＮａＣ１で中心を示すブロードなピークとして
溶出きれた。引き続いてのウルトロゲルＡｃＡ３４　　
カラム（Ｕｌｔｒｏｇｌｌ　ＡｃＡ　５４１を用いたゲ
ル濾過により、ＩＬ２は検知しうる殆どのプロティンか
ら分離され、この工程の順序により、血清フリーリンノ
球−コンディションド・メディウムのＩＬ２よりも、約
４００倍の特異活性力）得られた。ＩＬ２を含む物質は
、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により、さらに純化された。ＩＬ２活性はド
デシル硫酸ナトリウムゲルで１３，０００分子量域にあ
る１対のプロティン／々ンドに対応した。この手法はと
）　ＩＬ２の純化に関して報告されている（Ｍｉｅｒ　
ａｎｄ　Ｇａ１ｌｏ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１
２８：１１２２（１９８２）。

Ｆｒａｎｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　１２７：２３６１（１９８１）　ｌ。

帰近、ＩＬ２の純化工程の第一段としてフェニルセファ
ローゼを用いることが報告されている（　５ｔａｄｌｓ
ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２８
：１６２ＯＮ９Ｆ＋２）　１゜しかしながら、疎水性吸
着クロマトグラフィーは純化の第１工程でのみ用いられ
たものであり、多数のリンフ才力インの分離についての
この技術の主たる利点は利用きれていないＣ以下参照）
。

このようＫ、ネズミおよびヒトＩＬ２の純化方法は報告
されており、これらの製剤はＩＬ２　　調節をどんどん
よ抄良く規定することを可能にしてきたけれど本、十分
に実証されていない。

本発明者らは、他の分離手段に引き続いて疎水吸着クロ
マトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｌｃ　ａｄｓｏｒ
ｐｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　）　　を行
なうことにより、見かけ上均質に、ヒトＩＬ２を純化し
うることを見い出した。シュタドラーら［５ｔａｄｌｅ
ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２８：１６２０（１９Ｆ＋２）　
〕で報告された６０倍ｏ純化、および、ミイアーら（Ｍ
ｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２８：１２２１　＋９８２１　’
］によって開示された８００倍の純化に比較して３７，
０００倍の純化がｓｅされた、インターフェロン（アル
ファーおよびガンマ−）、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏ
ｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ、’０８Ｆ
）、　Ｔ−細胞置換因子（Ｔ　−ｃｅｌｌ　ｒｅｐｌａ
ｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、Ｂ−細長因子（Ｂ−ｃｅｌ
ｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　”、　ＢＯＧＦ）お
よび血清胸腺因子（ａｅｒｕｍ　ｔｈｙｍｉｃ　ｆａｃ
ｔｏｒ’、ＦＴ８）を含む粗リンパ球−コンディション
ド・メディウム中の他のリンフ才力インおよび因子を本
発明に係るＩＬ２　　製剤は明らかに含ま々い。本発明
方法によって得られた純化ＩＬ２は硝酸銀法による染色
のあとでのあるいはＩＩＩ！の外部標識のあとでのドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で、いかなる汚染プロティン４含まないと思われる（Ｍ
ｅｒｒｉｌ、　Ｏ，Ｒ，、Ｒ，Ｃ，５ｗ１ｔｔｅｒ　ａ
ｎｄ　Ｍ、Ｌ。

Ｖａｎ　Ｋｅｕｒｅｎ、　Ｔｒａｃｐ　Ｐｏ１ｙｐｅｐ
ｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ＣｅｌｌｕｌａｒＥｘｔｒｓｃｔｍ
　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｏｄｙ　Ｆｌｕｉｄｓ　Ｄｅ
ｔｅｃｔｅｄ　ｂｙＴｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　
Ｆ’：ｌｅｋ＋ｒｏｐｂｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇ
ｈｌｙＳｅｎｓｉｔｉｖｅ　５ｉｌｖｅｒ　５ｔａｉｎ
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ。

Ｕ、８．Ａ、７６：４３３５（１９７９）：Ｂｒａｎｃ
ａ、Ａ、Ａ、ａｎｄＢａｇｌｌｏｎｉ、　　α、Ｂｖｉ
ｄｅｎｃｅ　　ｔｈａｔ　　Ｔｙｐｅｓ　　ｌ　　　ａ
ｎｄ　　ｆｊ　　Ｉｎｔｅ−ｒｆｅｒｏｎ　Ｈａｖｅ　
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　　Ｒｅｃｅｐｔｏｒａ、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　　２９４ニア６８（１９８１）　：　Ｂｉｏ−
Ｒａｄ（Ｒ，ｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ）。

Ｔｅｃｈｎｌｃｍｌ　　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　　１０７１
：Ｒ，ａｄｉｏ　　ＩｏｄｉｎａｔｉｎｇＰｒｏｔｅｉ
ｎｓ　ｗｉｔｈ　Ｂｎｚｙｍｏｂｅａｄｓ（Ｍａｙ　　
１９Ｆ１１））。

この染剤中に、３つ才での機能的活性ノ々ンドが検知き
れた。切片としたゲルからの睦ｊａの溶出物は房い特異
活性を有していた。本発明者らはＩＬ２の分子種がＩＬ
２の誘導に用いられた賽験条件によみことを見い出した
。すべての純化工程は、大規模生産を可能にすべく開発
され現在、ｌＯｌ当り、ｌＯｌのコンディションド・メ
ディウムとして用いられている。

（以Ｆ余白） この明細ｔに記載された純化方法は正常リンパ球からの
ＩＬ２に関するばかりでな（、Ｊｕｒｋａｔ細胞系や白
血病リンパ芽球からのＩＬ２に関しても首屋よ（用いる
ことができるが、主として正常ヒトリンパ球からのＩＬ
２に絞って説明する。

純物質はヒトにおける使用を指図しているので、白血病
細胞ソースや肺癌プロモーターを用いる誘導条件（Ｆｒ
ａｎｋ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｒｎｍｎｏｔ、　１
２７　：　２３６１（１９８１）　、、　８１ａｄＬｅ
ｒ　ｅｔ　ｍｌ、、　Ｊ、　ＩｒｒｒｎｕｎｏＬ、　１
２８：１６２Ｇ（１９８２）、および／または勝瘍細胞
系共刺激体（Ｃｏｓｔｌｍｕｔａｔｏｒ　）　（Ｇｉｔ
ｔｉａ　ａｔ　ｍＡ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｔ、　１２４　：　１９５４　（１９８０
）　）　ｆ用いる誘導条件は、この目的のために非常に
好ましくないと考えられる。さらに、それは起こりそう
もないことではあるが、白血病ＩＬ２が、１ｎｖｉマ０
での投与で危険を伴なう可能性がある。

本発明により純化したＩ　Ｌ２％−得ることは、（１）
出発物である培地（５ｏｕｒｃｅ　ｍｅｄｌｕｍ　）を
コンディショニングして、その中のＩＬ２含量を増加せ
しめること、 成分を濃縮し、ついでそれからアミノ酸や小さなペゾチ
ドのような小分子（たとえば分子ｆｉ５０００以下のも
の）や非沈澱物質を除くこと、 （ｃｌ　　透析を経てプロティン性物質から余剰の塩を
除くこと、 ｆｄｌ　　アニオンイオン交換により、次望のプロティ
ン性成分力Σら非指異プロティン、を分離すること、 （ｅ）　　ゲルテ過をこより、ＩＬ２を含むプロティン
性物質の分子量によって分離を行なうこと、および （ｆ）　　疎水りａマドグラフィーにより、はぼ同じ分
子量をもつ他の１１ンフオカインからＩＬ２（疎水性か
大きい）を分離すること を自む。

リンパ球−コンディション上０メデイウム（フニューヨ
ーク血投セ／ター（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ＢＬｏｏｄＣｅ
ｎｓｅｔ　）で複数のドナーの末梢血液からヒトリンパ
球を得た。典型的な手法では、インターフェロンを誘導
する報告書の記載の一部のように８＠ｎｄａｉ　　ビー
ルス（１０４Ｕ／ｍ）　ｊｃ　ヨッテｍｌＢ’＆最初に
刺撤した。１２時間あとで、Ｃ−インターフェロンに富
んでいる培養培地を遠心分離（ｓｏｏｘｒ）で除いた。

ｏ、２５チウシ血清アルブミン〔シグマ（８１１ｍｍ　
）　、　　セントフレイス、ミズリー州、アメリカ合衆
国から得た〕およびｌＬｓフィトヘマグルチニン−Ｍ〔
ギブコ（Ｇｌｂｃｏ）グランドΦアイランド（Ｇｒａａ
ｄ　Ｉａｊｍ＋％ｄ）、ネブラス力州、から得た］を追
加した血清フリーのＲＰＭＩ（Ｇｌｂｃｏから得た〕中
に４　Ｘ　Ｉ　Ｑ”／−で細胞を再分散させ、ついで８
７℃で４８時間培養した。いくつかの１４製−こおいて
は、ＩＬ２の産生を増加するために、照射（５００Ｑｒ
ｍｄ　　）したＤａｕｄｉ　ｌａｐ　（１０’／　−）
　ｆ加エタ、　培養０）ｌｋｍで、遠心分Ｍ（ＩＱ、０
ＯＯＸ　ｆ　、ｌ　５分）１こよりコンディションド・
メディウムから細胞および細胞の残骸を除き、ついで、
上澄み％ＩＬ２の純化のために用いた。

１６８３ｆのＣＮＨ４）＊ＳＯ＋　’ｅ　ａ　ｔ　ｏ＞
りン、ｅ球−コンディションド・メディウムに加え、８
０％飽和とした。４℃で１晩静かに撹拌したあと、沈＃
を旋回して落としく　１０，０ＯＯＸｆ、１５分）、α
ｏ　ｓ　Ｍ　トＱスーＨｏｔに溶かして最終容積が３０
０１１１／とし、ライで、５０容量のＯ，［）ＳＭ）リ
スーＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，８）に対して、透析用緩衝
液を５回交換して４８時間透析した。

アニオン交換クロマトグラフィー（フラクション厘）分
析用に、１０ｍの透析した濃縮液を、予め０、０５　Ｍ
　）リス−Ｈｏｔ　（ｐＨ７，８）で平衡化した微粒の
ジエチルアミノエチルセルロース［ＤＥ５２゜ワットマ
ン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　、イングランドから入手〕の
４０−のカラムに投入した。同じ緩衝液の８０１でカラ
ムを洗い、連続勾配のトリス緩衝ＮａＣ１（Ｑ　〜０．
３　Ｍ　−Ｎａ０Ｌ）を用いてＩＬ２を含むプロティン
を溶出し、ついで、５１１／のフラクションを集めた。

ＩＬ２を含むフラクションをプールしこのプールしたフ
ラクション８濃縮するためにポリエチレングリコール（
分子量ａ、ｏｏｏ）（ｓ。

嗟重量／容積）を含むリン酸緩衝生理的塩類溶液（ｐＨ
７，２）に対して透析した。大規模な純化のために、α
０５Ｍトリス−Ｈｏｊ　（ｐＨ７，８）で平衡化した３
００−のジエチルアミノエチルセルロースのスラリーを
、３００ｔ／の再溶解した透析硫酸アンモニウム沈澱物
に加えた。３０分後、ジエチルアミノエチルセルロース
を遠心分熱して落とし、上澄みを得た（上澄みｌ）。

α　０　１　　Ｍ　　−Ｎａ１ｌ　　　を含む　０．　
０　５　　Ｍ　　ト　リ　ス　−　ＨＣＡ（ｐＨ７，８
）の３００−にペレットを再分散した。

１０分後、ジエチルアミノエチルセルロースを遠心分離
で再び落としくＬｏｏｏｘｆ）、得られた上澄みを、上
澄み１と共にプールした。上記したようなポリエチレン
グリコ−１しく分子量５ｏｏｏ）／リン酸緩衝生理的塩
類溶液（ｐＨ７，２）に対して、プールした上澄みを透
析してＩｋ１Ｍシた。

濃縮したジエチルアミノエチルセルロ−ス剤を、１０１
のアリコートで、Ｏ．１％のポリエチレングリコール（
分子ｉｉ６０００）を含むリン１Ｓ！緩衝生理的場類溶
液（ｐＨ７．２）で予め平衡化したＡｃＡ４　４ウルト
ロゲル（　Ｕｔｔｒｏｇｅｊ　）（ＬＫＢ。

ロックランド（　Ｒｏｃｋｔｓｎｄ　）　、メリーラン
ド州。

アメリカ合衆国から得られた〕のカラム（２１Ｘ９０ｚ
）に適用した。流速ｊ）３０１Ｅ／／ｈｒに調節し、６
ｗｉのフラクションを集めた。ＩＬ２を含むフラクショ
ンをプールした。カラムを、ウシ血情アルブミン（分子
ｇａｓ，ｏｎｏ　）　、キモトリプシノゲン（分子量ｚ
”ｈｎｏｏ　＞およびリボヌクレアーゼ人（分子ｚ１４
ｎｏｏ）［これらは総てファーマシア（　Ｐｈａｒｍａ
ｃｉｍ）　、ビスカットウェイ（　Ｐｌ＠ａ息ｔＷｌｙ
）−ニューシャーシー州，アメリカ合衆国から得られた
〕で検峻した。以前の＠究に伴なって、本発明者らはＡ
ｃＡ５４カラムの方がＡｃＡ４　４よりも好ましいと考
えるようになっていた。

ブルーアカロースのクロマトグラフィー（フラクション
Ｖ）ＡｃＡ４　４カラムからプールした２ｏｏ−の活性
フラクションを、４０１のベッド容積をもち、リンｅｉ
！緩衝失理的塩類溶液（　ｐ）（７．　２　）で予め平
衡化されたブルー　アガロース　カラム（　ＢｌｕｅＡ
ｇａｒｏｓｅ　　ｃｏｔ＋ｎｎ　）　［　ＢＲＬ　、ガ
イタースプルーの（　Ｇａ口ｈｅｒｓｂｕｒｇ　）　　
、メリーランド州．Ｔメリカ合衆国より得た］に適用し
た。リン酸緩衝生理的塩類溶液（ｐＨ７．２）のＮａＣ
ｔ（　０　〜０．　８　Ｍ　）の連続勾配を適用し、２
０１Ｌｌのフラクションを集めた。ＩＬ２を含むフラク
ションを集め、ポリエチレングリコール（分子ｚｓｏｏ
ｏ）を加え、最終ａｆ−ｔｏ．１％（　ｗｔ／　マ．ｔ
　）としてＩＬ２を安建化した。

プロジオン−レッドアガロースのクロマトグラフィー（
フラクション■） ブルーアガロースから浴出した活性フラクションのプー
ルをリン酸緩衝生理的１類溶液（ｐＨ７、２）に透析し
、ついで、予めリン改稜衝生理的埴′ｊＡｗ液で平衡化
した１０１１７のプロジオン−レッド　γガＯ−ス　カ
ラム（　Ｐｒｏｃｌｏｎ　　−　ＩＬｅｄＡｇａｒｏ＠
ａ　　ｃｏｔｕｒｎｎ　）　（　ＢＲＬから得た）に投
入した。

ついで、リン震緩伽生理的塩類溶液（ｐＨ　７．　２　
）でカラムを洗い、次に、出発塩講度が０．　３　Ｍ　
−ＮａＣ１で最終濃度が１．　０　Ｍ　−　ＮｓＣｌ　
の、逐次勾配をもつＮａＣＬ　のリンｒ１１級衝生理的
塩類溶液を用い、結合プロティンを溶出した。

高性能液体クロマトグラフィー 固定波長検知器詔よび注入系を備えたミクロメリテイク
ス液体クロマトグラフ−モデル７００Ｂ（　Ｍｉｃｒｏ
ｒｎｅｒｌｔｉｃ８Ｌｉｑｕｉｄ　　ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈ　Ｍｏｄｅｔ７　０　０　Ｂ）　（　Ｍｌｃ
ｒｏｍｅｔｒｉｅａ製（ミクロメリテイクス）、ノーク
ロス（　Ｎｏｒｅｒｏｓａ　）　、ジョーシア州。

アメリカ合衆国〕を用いた。ドデシル硫酸ナトリウム／
ジチオトレイトールの存在下または非存在下でクロマト
グラフィーを行なった。非変性条件下で、ブルー・アガ
ロースで純化したＩＬ２のｌＩｌ／をミクロパックＴ８
に３０００８Ｗカラム（　Ｍｌｃｒｏｐａｋ　ＴＳＫ　
３　０　０　　ＳＷ　ｃｏｔｕｍｎ　）　　［　／’リ
アン（　Ｖａｒｌａｎ　、）　、サニーペール（　８ｕ
ｎｎｙｖａｔｅ　）。

カルファルニア州，アメリカ合衆国〕に注入し、６、　
ｓ　ａｔ　／　ｍｔｎの流速で、Ｑ．１１３５Ｍ−リン
酸ナトリウム緩衝液（ｐｎａｓ）で溶出した。それぞれ
の０．４−のフラクションを集め、このフラクションに
０．１　％ポリエチレングリコール（分子量６０００）
（ｗｔ／ｖｏｔ）を加えた。カラムをウシ血清アルブミ
ン（分子量６＆、ＱＯＱ　）　、キモトリプシノゲン（
分子ｚＨ，ｏｏｏ）およびリボヌクレアーゼＡ（分子量
１４０００）で較正した。これらはすべてファーマシア
より得た。変性条件下での分析のために、ブルー−アガ
ロースで純化したＩＬ２（７Ｊ１１／をｌ−ドデシｌし
硫酸ナト１ｊウムおよびｌｏｍＭジチオトレイトールで
３７℃で１時間処理し、同じカラムに投入した。なお、
このカラムは０．１チドデシル硫酸ナト１１ウムおよび
１ｍＭジチオトレイトールを含む０．０３５Ｍ１ン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨａｓ）で予め平衡した。標識プロ
ティンを同じ方法で前処理し、ついで、カラム較正に用
いた。

等寛点篭気泳動 ＩＬ２のＡｃＡウルトロゲル製剤１Ｏ−４こ２０チグリ
セリン（ｙｏｔ／　ｖｏｔ）およびｚ％アムフ第１ノ慢
ポリエチレングリコール（Ｍｗ　６０００　）　（ｗ／
ｖ）および２ｓアムフオリンを含む５〜６０％グリセリ
ン密度勾配（＋）Ｈ３，５〜１０）を、等重点電気線動
カラム（１１０ｍ、ＬＫＢ製）に層をなさせた。ＩＬ２
試料を勾配の等寛領域に適用し、定電力供給装置Ｉｔ（
Ｍｏｄｅｌ　２１０３．　　ＬＫＢ製）を用いて、４℃
で２時間泳動させた。終点電圧が２ｏｏｏｖ。

終点電流が５ｍＡであった。５−のフラクションを集め
、各フラクションについてｐＨ８決定した。

すべてのフラクションを、αｌ−ポリエチレングリコー
ル（分子［６０００）　（ｗ／マ）を含むリン酸緩叡生
理的塩類溶液に対して透析し、アムフオリンおよびグリ
セリンの大部分を除いた。

ＩＬ２含有フラクションをプールした。

フンカナノリンＡ−アガロース・クロマトグラフィーゾ
ロジオン−レッド　アガロースで純化したＩＬ２（５０
０Ｕ／ｌｌ／）の１−を、ＩＭ−ＮａＣ１゜１　ｍＭ　
−ＭｇＣ１＠　、　１　ｍＭ　−ＭｎＣＬ、および１　
ｍＭ　−（３ａＣｔ。

を含む０．０２　Ｍ　ＩＪン酸す）　ＩＪウム緩衝液で
平衡した２−のコンカナバリンＡ−アガロースカラム（
ファーマシア製）に投入した。平衡緩衝液でカラムを洗
い、ａ−メチル−ｇ−］）−マンノシド（シグマ製）を
含む同じ緩衝液で洗った。

コムギ麦芽凝集素カラムクロマトグラフイーコムギ麦芽
凝集素カラム（２ｍ／、ファーマシア製）をリン酸緩衝
生理的塩類溶液（ｐＨ７，２）で平衡化し、ついで、プ
ロジオン−レッド嗜アガロースで純化したＩＬ２の／Ｉ
Ｉ／をこのカラムに負荷させた。リン酸塩緩衝生理的塩
＠溶液（ｐＨ７，２）で洗ったのち、αＩＭ−Ｎ−アセ
チルグルコサミン（シグマ製）を含むリン酸塩緩衝生理
的塩類溶液でカラムを溶出した。

ノイラミニダーゼによる処理 酢酸を用いて、ブルーアガロースで純化したＩＬ２（１
０００Ｕ／ａ／　）をｐＨａＱに輝整し、ついで、アガ
ロースに結合したノイラミニダーゼ〔ウエルチシ、由来
のもの、　Ｔｙｐｅ　ＶＩ　−Ａ　、シグマから供給さ
れた〕に添加した。混合物を靜かｌこ振りながら３７℃
で９０分培養（インキュベーション）シた。ついでノイ
ラミニダーゼ−アガロースを遠心分離に、より除き、Ｉ
Ｌ２含有上澄みのｐＨをトリス替基−こより７，８に調
整した。ノイラミニダーゼ−アガロースをインキュベー
ションに先立って除く他は同様にして対照試料を処理し
た。

プロティン分析 口−り一法（Ｌｏｗｒｙ　　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　（Ｌ
ｏｗｒｙ　、　ＯｏＨ，。

Ｈ，Ｊ、　Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　Ａ、Ｌ、　Ｐａｒ
ｒ　ｓｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ｒａｎｄｍｊｔ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍ＊ａｓａｒｅｍｅｒ＋ｔ　ｗｉｔｈ
　ｔｈｅ　Ｆｏｔｉｎ　Ｐｈｅｎｏ！Ｒｅａｇｅｎｔ　
、　Ｊ、　ＢＩｏｗ、　Ｃｈｅｍ、　１９３：２６５（
１’Ｊ　５１　）　）を用い、試料のプロティン含量を
測定した。５ｐｔ／−より低いプロティン濃度に関し、
試料をドデシル億酸ナトリウムーポリアクリルアミド亀
気泳動した。プロティンバンドは銀染色法で可視化した
（　５ｉｔｖｅｒ　ｓｔａｉｎｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅ　）（Ｍｇｒｒｌｌ、　　Ｃ，Ｒ，、Ｒ，Ｃ，Ｓ
ｖ目ｇｅｔ　ａｎｄ　Ｍ、Ｌ、　ＶａｎＫｅｕｒｅｎ、
　　Ｔｒａｃｅ　　Ｐｏｔｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　　Ｉｎ
　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｂｘｔｒｍｃｔｓａｎｄ　Ｈ
ｕｍａｎ　Ｂｏｄｙ　Ｆｌｕｉｄｓ　Ｄｅｔｅｃｔｅｄ
　ｂｙ　Ｔｗｏ　−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｔ　Ｈ１ｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅ＊Ｉｍ　　ａｎｄ　　ａ　　Ｈｉｇｈ
ｔｙ　　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ８ｉｔｖｅｒ　　８ｔａｉ
ｎ、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎｍｔｌ、　　Ａｅａｄ、　　
Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ。

７６：４３３５（１９７９））。プロティン濃度は既値
量のプロティンスタンダード（ダイズトリゾシン阻害剤
およびＣ−ラクトアルブミン）と比較して推定した。こ
れらの神職プロティンの連続希薄（２００ｎｆ〜２　ｎ
ｆ）を用いた。

ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド５〜２０
チ勾配あるいは１５％アクリルアミドを用いる１５ｍ厚
の板状ゲル（５ｔａｂ　ｇｓｊ）について、レム’Ｊ　
（ＬａｅｍｍＬＩ　）の不連続トリス−グリシン系を用
いた（　Ｌａｅｍｍｔｉ　、　Ｕ、に、、　Ｃｔｅａｖ
ａｇｅｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　
Ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ａｓｓｅｍｂｔｙ　ｏｆｔｈｅ
　Ｈｅａｄ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔｙ
、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、）２２７：６８０（１
９７Ｇ））ｏ　ｋ元条件下（２％ドデシル硫酸ナトリウ
ム、５チメルカブトエタノール）および非還元条件下（
２チドデシル硫酸す）　ＩＪウム）で、試料を分析した
。電気泳動ののち、ゲルをクーマシーブリリアントゾル
ーや硝酸針法で染色した（　ＭｅｒｒｌＬ、　Ｃ，Ｒ，
、Ｒ；Ｃ，８ｗｖｒｔｔｅｒＣｅｔＬｕ１．ａｒ　　Ｂ
ｘｔｒａｃｔｓ　　ａｎｄ　Ｈｕｒｎａｎ　　Ｂｏｄｙ
　ＦｊｕｌｄｓＤｅｔｅｃｔｅｄ　　ｂｙ　　Ｔｗｏ　
−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｊ　Ｅｔｅｃｔｒｏｐｈｏｒｔ
ａｉｓａｎｄ　　ａ　Ｈｌｇｈｔｙ　　５ｅｎｓｉｔｉ
ｖｅ　　８１ｔｖｅｒ　　８ｔａｉｎ、　　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｊ、　　Ａｅａｄ、　　８ｃ１．　　Ｕ、８．Ａ
、　　７６　　：　　４３３５（１９〕　９））。

ホスホリラーゼｂ（分子１ｆｔ９４０００　）　ｌウシ
血清アルブミン（分子量６ａ、ｏｏｏ　）　、卵アルブ
ミン（分子量４ｓ、ｏｏｏ　）、炭酸脱水酵素（分子量
３０．０００　）、ダイズトリゾシン阻害剤（分子量ｚ
ｏ、ｏｏｏ　）およびα−ラクトアルブミン（分子１ｉ
１４５Ｇｏ　）のプロティンスタンダードを用いて、見
かけの分子量を決定した。電気泳動ののち、ゲルを１ｍ
の切片にスライスし、ついで、各スライスからのプロテ
ィンを０゜３１１のリン酸酸番生理的塩類溶液（ｐＨ７
，２）で溶出した。１２〜１８時間あとで、溶出した物
質のＩＬ２活性を分析した。

ＩＬ２活性の分析 ＩＬ２分析のためｌこ、４０００のネズミＩＬ２依存性
細胞傷害Ｔ−細胞系を、Ｌｏｇ　２希薄の推定ＩＬ２含
有培地の存在下に、９６−ウェルマイクロティツタ−プ
レート〔コスタ−（Ｃｏ自ｔｅｒ　）　Ｈ。

キャンプリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　）　、マサチュ
ーセッツ州、アメリカ合衆国〕で生育させた。各ウェル
の総容積は０．２−だった。２４時間後、ｏ、３ｐｏｌ
の３Ｈ−チミジン〔特異活性２０　Ｃ１／ｍ　ｍａｔｅ
。

ニューイングランドニュークリア袈（ＮｅｗＩｎｇムｎ
ｄ　Ｎｕｃｊｅｍｒ　）　、ボストン、マサチューセッ
ツ州、アメリカ合衆国〕を各ウェルに加えた。

４時間後、細胞をガラス繊維ス）　ＩＪツブの上ｌこ採
取し、液体シンチレーションカウンター〔）ｑツカード
（Ｐｉｃｋａｒｄ　　）製、ダウナースグローブ（Ｄｏ
ｗｎｅｒ・Ｇｒｏｖｅ　）　、イリノイ州、アメリカ合
衆国〕で３Ｈ−チミジンの混入を画定した。ついで、実
験試料のＩＬＺ＆度を、２Ｕ／１のＩＬ２を含むスタン
ダードを用いプロビット分析で計算した　（ＧｉＡｔＩ
ｍ、　　８．、　　ａｎｄ　　Ｋ、Ａ、　　Ｓｍ１ｔｈ
、　　Ｔ−Ｃｅｔｔ　　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ　：
　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｍ　ｏｆ　Ｐｒａｄｕｃｔｊｏｎ
　ａｎｄ　ａＱｕｉｎＨｔｍｔｉｖｅ　　　Ｍｌｅｒｏ
ｍｍｍａｙ　　ｆｏｒ　　ＡｃｔｌｖＨｙ、　　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｔ、１２０　：　２０２７（１９７８））
　。ＩＬ２の１ユニツト／　ｍｌ　ハ、（、：ｔｌｎ　
Ａ（コンヵナノ々リンＡ）（５μｔ／耐）でｊｐＨ激し
たラット牌＃細胞（１×ｔｏ”／ｌｚ）によりコンディ
ションドされた４８時間の培養培地中ｌこ遊離したＩＬ
２［として定義される（　Ｇｌｕｉｓ、　ｓ、　ａｎｄ
　Ｋ、Ａ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｔ−ＣｅｚｚＧｒｏｗｔｈ
　　Ｆａｃｔｏｒ　　：　　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　　
ｏｆ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　ａｎｄｓ　Ｑｕａｎ
ｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｍｌｃｒｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ａ
ｃｔｉｖｉｔｙ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｔ、　　１２０　：　２　＋１２７　（１
９７８）　　）。

複数のドナーからのプールした末梢血液リンノ々球を連
続的に刺激することによって、高レベルのＩＬ２産生を
達成した。末梢血液リンパ球をます、８ｅｎｄａｌビー
ルスで１２時間刺激した。血清フリーの（血清を含まな
い）陪賓培地を交換したあとで、これらの細胞を、フィ
トヘマグルチニンでざらに４８時間刺激した。

８ｅｎｄａＩビールスあるいはフィトヘマグルチニン単
独では、ＩＬ２の産生を６〜ＩＯＵ／ｄのレベルで刺激
したが、一方、双方を用いた連続的刺激ではＩＬ２の産
生を５０−１００　Ｕ／ＷＪに増加させた。ＩＬ２産生
をさら−こ増加させることは（例えば２００Ｕ／ａ／ｉ
ｉで）、Ｄａｕｄｉ細胞による共刺激によって達成され
た。

リンパ球−コ／デイションド・メディウムを（ＮＨａ）
ｔ８０４’）用い８０チの飽和で沈澱させた。

これは、ＩＬ２活性の高回収率を伴なって約１０倍の濃
度のプロティンを産生じた（第１表参照）（以下余白） ＊）ＬＹ−Ｃ！Ｍ（リンパ球−コンディションド・メデ
ィウムのＩＬ２活性は１ｏｏＵ／１１／であった。

＃−）明細書に詳細に記載したような読値のプロティン
スタンダードを用いて、試料中のプロティン含曾の密度
計での比較により、プロティン濃度を決定した。

（以下余白） 透析した（　ＮＨ，）、Ｓｏ、による沈澱を、ジエチル
アミノエチルセルロースカラム（ＤＥ５２　）に入れた
。ついで、それ８０〜０．３Ｍ−ＮａＣ１の塩勾配の０
．０５　Ｍ　）リスーＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，８）で溶
出した。ＤｓｕｄＩ細胞の非存在下に産生じたＩＬ２は
低塩濃度（Ｏ〜０．０３Ｍ−Ｎ暑ａｔ　）で巾の広いピ
ークとして溶出された。一方、Ｄｎｕｄｉ細胞の共刺激
によって産生されたＩＬ２は０．０３〜０、０８　Ｍ−
ＮａＣ１，の塩＃！度で溶出された（第１図径照）０両
方の柴件下で、ゾロティンの大半は高い塩濃度（αＯ１
〜０．３Ｍ−Ｎ匈Ｃｔ　）で溶出された。このことは、
　　ＩＬ２の溶出でジエチルアミノエチルセルロースの
０．１　Ｍ　−１’１ｌａＣ１洗浄’＆　用イることに
より、大規模なノ々ツチ製造で大半のプロティンからＩ
Ｌ２を分離することを可能にした。

ジエチルアミノエチルセルロースのアニオン交換クロマ
トグラフィーにより約５０倍の純化が達成され、負荷し
たＩＬ２活性の約７５チがこの手法で回収された（第１
表参照）。

ついで、ジエチルアミノエチルセルロースから溶出した
ものを、５０−ポリエチレングリコール（分子ｆｋ６０
００）　（ｗｔ／　ｖｏＡ　）　４こ対する透析により
約２０倍に濃縮し、　ＡｃＡ　４４ウルトロゲル力ラム
に負荷した。Ｄｓａｄｊ細胞の非存在下に産生されたＩ
Ｌ２は、２４０００±４０００ドルトンの分子量に対応
する単一ピークとしてフラクション４２〜５２に溶出さ
れた。Ｄａｕｄｌ細胞の共刺激によってＩＬ２を産生ず
ると、１３，０００〜１＠ｏｏｏドルトンの分子量に対
応するフラクション５２〜６６に活性主ピークが溶出さ
れ、活性の小ピークが２６，０００ドルトンに見い出さ
れた（第２図参照）。ＩＬ２活性を含むフラクションを
プールした。

この純化工程で、特異活性が約２７倍増加し、負荷した
ＩＬ２活性の約ｓｏｂが回収された（ｇ１表参照）。ま
た、この工程は３０，０００ドルトンより大きな分子量
をもつプロティンを効果的に除いた（第５図参照）。

ｗ４３図に示すように、ＩＬ２はブルーアカロースに彊
＜結合し、一方、はとんどのプロティンＭ−ＮａＯＡで
このカラムから溶出され、０．０５〜０、４　Ｍ−Ｎａ
Ｃ１のリン酸緩衝溶液で溶崩されるａ−インターフェロ
ンと明ら力）に分離された。この純化工程で、％異活性
は２５倍に増加し、負荷したＩＬ２０３６１　％かＩｊ
ｊｌ収された（第１表参照）。

！ロシオンーレツドアガロース（Ｐｒｏｃｉｏｎ”　−
Ｒｅｄ　Ａｇｍｒｏｓｅ）はブルーアカロース（Ｂｌｕ
ｅ　Ａｇｍｒｏｍｅ）と異なった結合特性を示す（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ、　Ｓ、Ｔ、、　ａｎｄＢ、Ｂ、　　８ｔ
ｅｊ４ｗａｇｅｎ、　　Ｂｉｎｄｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｃ
１ｂａｃｒｏｎ　　ＢｌｕｅＦ３ＧＡ　　ｔｏ　　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ　　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　　ｔｈｅ　　
ＤｉｎｕｃｔｅｏｔｉｄｅＦｏＬｄ、　　Ｐｒｏｃ　、
　Ｎａｔｊ、　　Ａｃａｄ、　　８ｃ１．　　Ｕ、８．
Ａ、　　　７　３　　二　３６１（１９７６）　　：　
Ｗａｔｓｏｎ、　Ｄ、Ｈ，、Ｈ，Ｊ、　　Ｈａｒｖｅｙ
　ａｎｄＰ、Ｄ、　　Ｄ＠ａｎ、　　Ｔｈｅ　　５ｅｔ
ｅｃｔｉｖｅ　　Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　
ＤＡＤＰ”−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　　Ｄｓｈｙｄｒｏｇ
ｅｎａａｅｓ　　ｂｙ　　Ｉｍｍｏｂｉｔｉｘｅｄ　Ｐ
ｒｏｃｌｏｎＲｅｄ　ＨＥ−３Ｂ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　
Ｊ、　１７３　：　５９１　（１９７ｇ））。

ＩＬ２は、また、このカラムに強く結合し、α７〜０．
８　Ｍ　−ＮｍＣ２溶田液でピーク活性を示して、０、
６〜０．　ｉｌｌ　Ｍ　−ＮａＣ１のリン酸塩緩衝液で
巾広いピークとして溶出さイする（第４図参照）。この
広い溶出プロフィルはＩＬ２の分子的不均質性を示唆す
る。他のプロティンの殆どはプロジオン−レッドアガロ
ースｆこ結合せず、残りは低塩濃度で溶出される（第４
図）。５〜２０悌の勾配ゲル（ドデシルｖＬ酸ナトリウ
ムーポリアクリルアミドゲル篭気泳吻）の銀染色により
、０．７〜０、８　Ｍ−ＮａＣｔ溶出プールは、ＩＬ２
の生産に用いたｐｓ条件ｔこ依り、１４，５００±２０
００．１１１０００±１０００および１７．０００±１
０１１０　　ドルトンの３つの分子成分を各むことが判
った（第７図参照）。

銀染色により可視化し、既知の幾度のプロティンスタン
ダードの連続希洛物でプロティソノ５ンドの密度を比較
して、製剤のプロティン濃度を測定した。この６１１７
定の限界を考隨して、約１ｏ・±ｌＯＬ％Ｕ／−プロテ
ィンの％異活性および３７、１９１倍のえ終糾化度が計
算された。全体を通してのＩＬ２の回収率は、プロジオ
ン−レッドアガロースのクロマトグラフィーのあとで１
９チであった（フラクションｗ　、ｊｌｌ、ｌａ）。

１１．２はプロジオン−レッドアガロースに強（結合す
るので、このプロセスは、また、０．５ＭとＬＯＭ−Ｎ
ａＣ１を含むリン酸塩緩衝液による２段の溶出液を用い
る希？４製剤から＃縮ＩＬ２８祷るのに非常に有用であ
る。この条件で、　　ＩＬ２活性は１．０Ｍ−ＮａＣ１
溶出物中に十分に回収された。

純化の種々の段階からＱ〕ＩＬ２１ｉｉ剤について、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動分析を行なった。第５図に示すように、ブルーアカロ
ースクロマトグラフィー前に得られた製剤（フラクショ
ン■〜Ｗ）ｆ、５〜２０チ勾配ケルのあとクーマシーブ
リリアントブルー染色して分析した。また、ブルーアガ
ロース・クロマトグラフィーおよびプロジオン−レッド
アガロース・クロマトグラフィーのあとに得た製剤を、
第６図に示すように５〜２０チ勾配ゲルののちに商感度
銀染色法により分析した。

ＩＬ２がＤａｕｄｌ細胞の非存在下に生産され、変性さ
れた場合、還元および非還元条件下に、プロジオン−レ
ッドアガロース製剤は、ａｎｏｏと１７、　ｌ’ｌ　Ｏ
Ｏドルトンの分子量をもっただ２つの活性ノンドを示し
た（第６図Ｃ）。Ｄａｕｄｉ細胞がＩＬ２製造の共刺激
に用いられた場合、１４５００トルトンの分子ｆ＃をも
っ１つの活性プロテインノンドが観察された（第６図ｄ
）。Ｄａｕｄ　Ｉ細胞の最善ｌζ次ぐ濃度（５Ｘ１０１
／１１７以下）が用いられた場合、１４５０（１，１（
０００，１７，０１）０　）’ルトンの分子ｉ＋もつ３
つのプロティン／々ンドが見い出された。

より良い結束を得るために、純化したｒＬ２を１５％ア
クリルアミドゲルで分析した。染色のあと、勾配ゲルで
得られたものに似た分子量パターンが見い出された。平
行ゲルを１鯵の切片にスライスし、各スライスからの切
片をリン酸塩酸偽塩類俗漱（ｐＨ７，ｚ）に溶出した。

ＩＬ２活性は、１４５００．１６，０００および１７，
０００ドルトンノ分子墓ｌこ対応するスライスナンバー
ニ局在化して見い出された（第７図参照）。ＩＬ２活性
をもつこの３つのすべてのスライスに存在したプロティ
ンを貴度′亀気泳動じたところ、溶出ノンドを示した。

ブルーアガロースで純化したＩＬ２（Ｄａｕｄｌ　Ｊｌ
ｌ胞の非存在下に産生きれたもの）を、１チのドデシル
硫酸ナトリウムおよび２０ｍＭのジチオトレイトールと
共に、３７℃で１時間培養し、ついで、高性能液体クロ
マトグラフィーゲル濾過カラムに適用した。α１％ドデ
シル硫酸ナトリウムおよび１ｍＭジチオトレイトールを
含む緩衝液でカラムを溶出した。第８図に示すように、
ドデシル硫酸ナトリウムで変性したＩＬ２が１７，００
０ドルトン分子量域で溶出された。ドデシル硫酸ナトＩ
Ｊウムを含丈ない緩衝液で溶出した自然のＩＬ２は、２
１％ＯＯＯドルトンの明瞭な分子量を示した。

ＡｃＡ　４４ウルトロゲル力ラムから得たＩＬ２製列ヲ
、広いｐＨ域（ｐＨａｓ〜１０）でアムフオリン（人ｍ
ｐｈｏｔｌｎｅｓ　）を用いる等′岨点亀気泳動に課し
た。Ｄａｕｄｌ株の共刺激なしに得られたＩＬ２は約６
７の尋電点に集束した（第９図）。末梢血液リンパ球が
Ｄａｕｄｌ細胞の存在下に刺激されたとき、同じＰＩが
見い出された。ｐＨ６，５〜７．５Ｉこ観察された比較
的広い集束範囲は、８そらく報告されたようなＩＬ２の
分子的不均一性に依る（　Ｒｏｂｂ、　ＲｏＪ、、　　
ａｎｄ　　Ｋ、Ａ、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ
ｅｌｔｙ　ｏｆＨｕｍａｎ　　Ｔ−Ｃｅｕ　Ｇｒｏｗｔ
ｈ　　Ｆａｃｔｏｒ（ｓｌ　　　Ｄｕｅ　　　Ｔｏ　　
Ｖｍｒｉａｂ＆（Ｍｙｃｏｓｙｊａｔｉｏｎ、　Ｍｏｔ
、　ＩｍｍｕｎｏＡ、　　１８　：　ｌ　Ｏ８７（１９
８１））。

勢電点電気泳動カラムからのＩＬ２の収率は約３０−で
あった。それゆえ、この方法はＩＬ２の生化学的特性に
関してのみ有用であって、製造的な純化には有利でない
。

ＩＬ２のアガロース結合コンカナ／ンりンＡあるいはコ
ムギ凝集素への結合は検知されなかった。

ＩＬ２をノイラミニダーゼ処理することζこより、その
生化学的活性および分子量パターンに影舎は生じなかっ
た。

正常末梢血液９７２球の有糸分裂８発、ヒトおよびネズ
ミ細細偽害Ｔ細胞系の成長支持、および他のサイトカイ
ン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ　）に関して、純化したＩＬ２で
検討がなされた。フイトヘマグ／Ｌ／　ｆニンの存在を
テストするために、ＩＬ２製剤の有糸分裂誘発（ｍｌｔ
ｏｇｅｎｉｅｉｔｙ）を正常末梢血液９７２球について
研究した。低レベルの有糸分裂誘発活性（リンノぐ球−
コンディションド・メディウム中に存在する約５％の有
糸分裂８発活性）は、ジエチルアミンエチルセルロース
純化工程から得られた未希釈のＩＬ２製剤中ｌこ０）み
検知された。ブルーアカロースあるいはプロジオン−レ
ッドアガロースで純化したＩＬ２は完全に有糸分裂誘発
活性を金談なかった。ブルーアガロースおよびプロジオ
ン−レッドアガロースクロマトグラフィーから得られた
ＩＬ２は、ヒトおよびネズミ細胞傷害Ｔ−細胞系の長期
に亘る成長を非常に活性ζこ支持する。ヒト細胞傷害Ｔ
−細胞系は最善の成長のために約１０Ｕ／ｌ／の純化Ｉ
Ｌ２を必要とし、−万、ネズミ細胞傷害Ｔ−細胞系は２
Ｕ／ａ／で射入（こ刺激される。ＩＬ２の！ロシオンー
レツドアガロース製剤では、アルファーもしくはガンマ
−インターフェロン、顆粒マクロファージ・コロニー刺
激活性、Ｔ−細胞置換因子および胸腺分化活性は検知さ
れなかった。

８ｅｎｄａｉビールスおよびフィトヘマグルチニンによ
る末梢血液リンＡ球の連続刺激およびＤａｕｄ　ｉ細胞
による共刺激のあとで取り上げられたリンノ々球−コン
ディションド・メディウムは１ｏＯ〜２００Ｕ／−のＩ
Ｌ２濃度を示した。それゆえ、ＩＬ２の生物学的試験や
臨床的な試みを妨害するＰＭＡのような他の毒性の強い
共刺激体の非存在下に、高濃度のＩＬ２を得ることが可
能となった（　Ｒｏｂｂ、　Ｒ，Ｊ、、　Ａ、　Ｍｕｎ
ｋ　ａｎｄ　Ｋ、Ａ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｔ−ＣｅｌｌＧ
ｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｑ
ｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ、　ＦａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔ
ｏｒｓ＋　Ｑｕｍｎｔｌｔａｔｉｏｎ、　　　８ｐｅｃ
ｉｆｉｅｌｔｙ、　　　ａｎｄＢｉｏｔｏｇｉｃｍｔＲ
ｅｔｅｖｎｎｅｅ、　Ｊ、　Ｆｒｘｐ、　Ｍｅｄ、　１
５４：１４５５（１９８１）　：　Ｍｉｚｅｔ、　８．
Ｇ、、　ａｎｄ　Ｄ、、Ｍｌｇｅｔ。

Ｐｕｒｌｆｉｃｍｔｌｏｎ　ｔｏ　Ａｐｐａｒｅｎｔ　
Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｕｒｌｒ＋ｅＩｎｔ
ｅｒＬｅｕｋｌｎ　１．　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｔ、　
１２６：８３４（１９８１）。

開示された純化方法は、ＩＬ２の２つの新しい純化工程
として、ブルーアガロースおよびプロジオン−レッドア
カロースのクロマトグラフィーを導入した。これらの染
料が、ジヌクレオチド・フォールド（ｄｉｎｕｃｔｅｏ
ｔｉｔｅ　ｆｏｌｄ　）を含むプロティンに特異的に結
合することは示唆されているをすれども（Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ、　Ｓ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｂ、Ｂ、　Ｓｔｅｔｔ
ｗａｇｏｎ、　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｃ１ｂａｃｒｏ
ｎ　Ｂｔｕｅ　Ｆ３０Ａ　ｔ。

Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　Ｃｏｎｔａｉａｇ　　ｔｈｅ　　
Ｄｉｎｕｃｊｅｏｔｌｄｅ　　Ｆｏｌｄ、　　Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｔ、　Ａｃａｄ、　８ｃｌ。Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７
３：３６１（１９７６））、本発明者らは、７　ＩＬ２
の生物学的活性あるいは生化学的挙動に対してＮＡＤ　
　あるいはＮＡＤＨのいかなる効果もないことを見い出
した。ＩＬ２のこれらの染料に対するボー、合は静電的
なあるいは疎水的な相互作用によるものと思われる。こ
れら２つの工＆ｆ用いることにより、０．２５％ウシ血
清アルブミンの存在下ｌこコンディショニングされた培
地からＩＬ２の３７．０００倍の純化が可能となり、こ
のときの全体に亘ってのＩＬ２ｉ性のＣ＝＋収は１９饅
である。ヒトあるいはネズミＩＬ２についての他の純化
方法はいずれも、本方法に匹敵しうるような％共活性も
収率も示さない。

本発明の純化方法ｌこよれば、また、時間のかかる工程
も必要としない。このため、本発明の方法は大規模なＩ
Ｌ２の純化に非常に有用である。

リンフ才力インおよびＩＬＩのような他の調整分子（Ｍ
ｉｘｅｔ、　Ｓ、Ｇ、、　ａｎｄ　Ｄ、Ｍｌｚｅｔ、　
Ｐｓｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｏ　Ａｐｐａｒｅｎｔ　Ｈ
ｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｉｎｔｅ
ｒｔｅｕｋｉｎｌ、　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ、　１２６
：８３４（１９８１）　　）、アルファ　−モＬ　＜　
ハガンマーインターフェロン、Ｔ−細胞ｉ１ｉ［因子お
よび０８Ｆ　（Ｂｕｒｇｅｓｓ、　Ａ、　Ｗ、、　ａｎ
ｄＤ、　Ｍｅｔｃａｊｆ、　Ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒｅ　ａ
ｎｄ　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＯｒａｎｕｌｏｃｙｔｅＭ
ａｃｒｏｐｈａｇａ　Ｃｏｔｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｔａｔ
ｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ、　Ｂｔｏｏｄ５６１４７（１
９８０）　）は、疎水相互作用を形成する異った能力を
もっている。こｎらの性實を利用して、純化Ｉ　Ｌ　２
　製剤の大部分を汚染する他のリンフ才力インＪｉ）因
子からＩＬ２−）分離する。たとえば、イオン交換クロ
マトグラフィーおよびゲル濾過工程で、ＩＩ、２と共に
純化された櫂−インターフェロンは、ブルーアガロース
クロマトクラフィーにより明らかにＩＬ２から分離され
る（第３図）。プロジオン−レッドアカロースのクロマ
トグラフィーのあとで、ＩＬ２］［ｊ５４は検知しうる
インターフェロン（アルファーおよヒカンマ）、顆粒マ
クロファージ、コロニー刺激因子、Ｔ−細胞置換因子あ
るいは胸腺分化活性を含まない。さらに、プロジオン−
レッドアガロースで純化したＩＬ２は他の汚染プロティ
ンを含まない（第６図）。

自然のＩＬ２はいくつかの分子形態で存在することが以
前に示された（　Ｍｌｅｒ、　Ｊ、　Ｗ、、　ａｎｄ　
Ｒ，Ｃ１Ｇｍ１ｉｏ、　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　
　ａｎｄ　　Ｓｏｍｅ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉ
ｃｓｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　
Ｆａｃｔｏｒ　Ｆｒｏｍ　Ｐｈｙｔｏｈｅｍ−ａｇｇｔ
ｕｔｉｎｉｎ　−８ｔｉｒｎｕｔａｔｅｄ　　Ｌｙｍｐ
ｈｏｃｙｔｅ　　ＣｏｎｄｌｔｌｎｅｄＭｅｄｉａ、　
　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｔ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｅ
ｔ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、　　　７　７　　：６１３４（１
９８０）　　：　Ｇｉｚｔｉｓ、Ｓ、、　Ｋ、Ａ、Ｓｍ
１ｔｈ　ａｎｄＪ、　Ｗａｔｍｏｎ、　ＢＩｏｃｈｅｍ
ｌｃａｔＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆＬ
ｙｍｐｈｏｃｙｔ＠Ｒｅｇｕｔａｔｏｒｙ　ＭｏＬｅｃ
ｕＬｅａ、　　Ｉ　、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
　ａ　Ｃ１ａｓｓ　ｏｆ　Ｒａｔ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ
　Ｌｙｍｐｈｏｋｌｎｅｓ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｔ、　１２４：１９５４（１９８０）：　
Ｒｏｂｂ、　Ｒ，Ｊ、、　ａｎｄＫ、Ａ、　　　Ｓｍ１
ｔｈ、　　Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｔｙ　　ｏｆ　　Ｈｕ
ｍａｎ　　Ｔ−ＣｅＬＬＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（
ｓ）　ＤｕＰ、Ｔｏ　Ｖａｒｌａｂｔｅ　Ｇｔｙｃｏｓ
ｙｔａ（ｉｏｎ。

Ｍｏ４　Ｉｍｍｔ＋ｎｏｔ、　１８　：　１０８７（１
９８１）　）　、）ここに、末梢血管リンフ９球による
Ｉ　Ｌ　２誘導１τ用いられる方法が不均質性に関与す
るこさが示された。

Ｄａｕｄｌ細胞の存在下および非存在下に産生された自
然ＩＬ２けそれぞれ約１４．５０ｎおよび２６．０００
ドルトンの分子量を示す。これらの結果は、ミアーら（
Ｍｉｅｒ、　Ｊ、　Ｗ、、　ａｎｄ　Ｒ，Ｏ，Ｇａ１ｌ
ｏ、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ　Ｓｏｍｅ　Ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ
−Ｃｅｌｌ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ　Ｆｒｏｍ　Ｐ
ｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−８ｔｉｍｕｌａ
ｔｅｄ　Ｌｙｍｐ−ｈｏｃｙｔｅ　０ｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｅｄ　Ｍｅｄｉａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　８．　Ａ、　７７：６１３４（１９８０）　　お
よびギルイスら（Ｇｉｌｌｉｓ、　Ｓ、、　Ｋ、　Ａ、
　Ｓｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｊ、　ＷａｔｓＯｎ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌＣｈａｒａＣｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　
ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ。

■、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃ１ａｓ
ｓ　ｏｆ　Ｒａｔ　ａｎｄ　ＨｕｍａｎＬｙｍｐｈｏｋ
ｉｎｅｓ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２４：１９５
４（１９８０））　Ｋよって報告された分子量の相違は
、主にＩＬ２誘導の方法の相違による本のと思われるこ
とを示す。

ドデシル硫酸ナトリウムνてよる変性のあとで２６、０
００ドルトンのＩＬ２＃−ｉ、嵩性卵液体クロマトグラ
フィーゲル濾過で１６．０００〜１８，０００ドルトン
の分子量を丁した。このｆ＋＃−した形のドル電気泳動
で、それぞれ、約１６，０００および約１７．０００ド
ルトンの分子量をもつ２つの活性ノ々ンドの存在が示さ
ｎた。これらの結果は、キャブランらの結果（Ｏａｐｌ
ｓｎ、　Ｂ、、　Ｏ，Ｇｉｂｂｓ　ａｎｄ　Ｖ、Ｐａｅ
ｔ−ｋａｕ、　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｓｏｄｉ
ｕｍ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　８ｕｌｆａｔｅ−Ｄｅｎａ−ｔ
ｕｒｅｄ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　２．　Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、　１２６＋１２６４（１９８１）を加味し
て、ドデシル硫酸ナトリウムによる変性のあとで、ヒト
およびネズこのＥＬ２は同様な分子ｌ°を屯つことを示
す。Ｄａｕｄｉ細胞の存在Ｆに産生されたヒ）　ＥＬ２
の分子量け、ドデシル硫酸ナトリウム変性によって影響
されない、自然ラン）　ＥＬ２が１５，０００ドルトン
の分子ｉを示すことが報告されているので（Ｇｉｌｌｉ
ａ、　８．、　Ｋ、　Ａ。

Ｓｍ１ｔｈ　　ａｎｄ　　Ｊ、Ｗａｔｍｏｎ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　　０ｈａｒａｃｔｅｉｘａｔｉｏｎｏ
ｆ　　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
　　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ、　　Ｉｌ、　　Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｏｆ　ａ　Ｃｌａｉｍ　ｏｆ　Ｒａｔ　ａ
ｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｋｌｎｅｓ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２４：１９５４（１９８０１’、
　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｋ、　Ａ、、　Ｔ−ＣｅｌｌＧｒｏｗ
ｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｒａｙ、　Ｒ，ｕｓｅｔｔｉ、　Ｆｕｎｃｔ−ｉｏｎａ
ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｓｔｉｃ　ｏｆ　Ｔ−ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃ
ｔｏｒ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｉｍｍｕｎｏｊ、１
５　：　５７９（１９８０）　）　、研究されたすべて
の種において、約１４５００〜１７．　ＯＯＯドルトン
のポリベゾチド中にＩＬ２活性が存在することが明らか
になった。

これらの異なった分子の形か、Ｔ−細胞サブセットの優
先的な刺激のような異なった機能をもっているかどうか
は知られていない。また、同じＴ−細胞がＤａｕｄｌ細
胞の共刺激で、そのＩＬ２合成’）２６，０００ドルト
ンから１４．５００ドルトンに切り替えるかどうかも知
られていないし、異なったＴ−細胞が、ＥＬ２の２つの
分子形の遊離にたしかに関与するかどうかも知られてい
ない。

２つの機能的なＴ−細胞サブセットを推定スルと、第１
のサブセットはフィトヘマグルチニン単独に応答して分
子１１２６．ＧｏｏのＥＬ２（生産し、一方、第２のサ
ブセットは分子１ｋ１４，５００のＥＬ２の生産のため
に、最初の刺激としてフィトヘマグルチニンを、そして
２番目の信号としてＤａｕｄｌ細胞による共刺激を必要
とする。Ｄａｕｄ　ｉ細胞はＨＬＡ−Ｄ几抗原とＦｃレ
セゾターを出す。これら双方の表面分子はＩＬ２応答の
増強に彰４１を与える（　Ｐａ１ａｃ１ｏ＊、　Ｒ９，
ａｎｄ　Ｇ、　ＭｏＬＬｅｒ、　ＨＬＡ−Ｄ几Ａｎｔｉ
ｇｅｎｓ　１９ｅｎｄ＠ｒ　Ｒｅｏｔｉｎｇ　　Ｔ−Ｃ
ｅｊム　８ｅｎｍ田ｖｅ　　ｔ。

Ｉｎｔｅｒｔｅｕｋｌｎ−２ａｎｄ　　Ｉｎｄｕｃｅ　
　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　　ｏｆ　　　ｔｈｅＧｒｏ
ｗｓｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｉｎ　ｔｈｅ　Ａｕｔｏｔｏｇ
ｕｓ　Ｍｉｘｅｄ　ＬｙｍｐｈｏｃｉｔｅＲｅａｃｔｉ
ｏｎ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｔ、　６３　
：　１４３（１９８１）　：８ｈｉｍ１ｇｕ、　　　８
．、　　　ＲｏＴ、　　　８ｍ１ｔｈ、　　　Ｍ、Ａ、
　　　Ｎｏｒｃｒｏｓｍ　　ａｎｄＶ、Ｃ，Ｍａｒｉｏ
、　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　Ｃｏｎｔｒｏｔｔムｎｇ　Ｔ
Ｃ！０ＦＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　Ｃｊｏｎｅｄ　　８
ｕｂｔｉｎｅｓ　　　ｏｆ　　　ＥＬ−４ａｒｇｒ　　
　　１ｎＲｅｓｐｏｎａｅ　　　ｔｏ　　　８ｔｉｒｒ
ｒｕＡｍｔｉｏｎ　　　ｂｙ　　Ａｎｔｉ　　　Ｔｂｙ
−Ｉ　　　ＡｎｔｉｂｏｄｙＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　１！
８：２９６（１９８２））。しがしながら、ＩＬ２応答
に対するＤａｕｄｌ細胞の効果は、前に示唆されたもの
より一層複雑に思われる（　　　Ｐａ１ａｃ１ｏ＊、　
　Ｒ，、ａｎｄ　　Ｇ、　　　Ｍａｌｌｅｔ　　　ＨＬ
Ａ−ＤＲＡｎｔｉｇｅｎｓＲｅｎｄｅｒ　Ｒａａｔｉｎ
ｇ　Ｔ　−Ｃｅｌｔｓ　８ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　Ｉ
ｎｔｅｒｔｅｕｋｉｎ−２ａｎｄ　Ｉｎｄｕｃｅ　Ｐｒ
ｏｃｌｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＧｒｏｗｔｈＦａ
ｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ａｕｔｏｊｏｇｏｕｓ　Ｍｉ
ｘｅｄ　Ｌｙｍｐｈｏｅｙｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ。

Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｒｒｆｎｕｎｏｔ、　６３：　１
４３（１９８１）　：　８ｃｈｍ１ｇｕ。

Ｓ、、　Ｒ，７，８ｍ１ｔｈ、　Ｍ、Ａ、　Ｎｏｒｃｒ
ｏｓｍ　ａｎｄ　Ｖ、Ｃ。

Ｍａｒｉｏ、　　　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　　　Ｃｏｎｔ
ｒｏｕｉｎｇ　　　ＴＣＧＦ　　　Ｐｒｏｄｕｃｔｌｏ
ｎｂｙ　　Ｃｊｏｎｅｄ　　８ｕｂｔ１ｎｅｓ　　ｏｆ
　　ＥＬ−４ａｒｇ’　　Ｉｎ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅｔｏ
　５ｔｌｒｎａｊａｔｌｏｎ　　ｂｙ　Ａｎｔｉ　Ｔｈ
ｙ−Ｉ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｅｔ、　１２８：２９ｆｌ（１９８２）　）
　にれは以下の観点からである。

（ａ）　　Ｄａｕｄｌ細胞により２１（０００から１４
５００ドルトンにＥＬ２の分子量のシフト。

（ｂ）　　ヒトリンパ芽球細胞系Ｊａｒｋａ口こみられ
るようなＩＬＩ依存性ＪＬ２生産の増強（Ｖｅｒ＋ｕｔ
ａ、　８．。

Ｒ，Ｍｅｒｔｅｔｓｍｓｎｎ、　Ｋ、　Ｗａｔｔｓ、　
８．Ｐ、ＦｓＬｄｍｍｎ、　ｃ、ｙ。

Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｍ、Ａ、８．　Ｍｏｏｒｅ、　Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｚ＋　ａｎｄＲｅｇｕｊａｔｉｏｎ　　
ｏｆ　　Ｉｎｔｅｒｔｅａｋｊｎ−２１ｎ　　Ｈｕｍａ
ｎＬｙｍｐｈｏｂｊａｓｔｌｃ　Ｌｅｕｋｅｍｌａｓ　
８ｔｕｄｌｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｔ−ＣｅＬＬＭｏｎｏｃＡ
ｏｎａＡ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（ｍｕｂｍｌＨｅｄ
　）。

（ｃ）　　Ｄａｕｄｌ細胞の共刺激（ｃｏ−ａｔｌｍｕ
Ａｍｌｉｏｎ　）によるヒドリン／ぞ芽球白血病細胞で
の夏Ｌ２の超誘導（Ｖｓａｕｔａ、Ｓ、、　　几、Ｍｅ
ｒｔｅｔｓｍａｎｎ、に、Ｗａｔｔｓ。

Ｓ、Ｐ６Ｆｅｔｄｍａｎ、　Ｃ，Ｙ、　Ｗａｎｇ　ａｎ
ｄ　Ｍ、＾、８．　Ｍｏｏｒｅ。

Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｔａｔｌｏｎ
　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｔ＠ａｋｉｎ−２ｉｎ　Ｈｕｍａｎ
　Ｌｙｍｐｈｏｂｔａｉｔｉｃ　Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ　
Ｓｔｕｄｉｅｄｗｉｔｈ　Ｔ−ＣｅＬＬ　庵ｎｏｃＬｏ
ｎａＬ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）
）。

そしておそらく機能的な不均質性けＥＬ２に特徴的なも
のではない。なぜなら、他のグループのサイトカイン、
たとえば顆粒マクロファージ・コｏニー刺激因子（ｇｒ
ａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｍｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏ
ｎｙ−ｓ＋ｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ）は、
生産細胞タイプに依り異なった分子特性を示す。この特
性は、また、顆粒マクロファージ細胞系のサブセットに
対する優先的な効果に関連がある（Ｂｕｒｇｅ＠ｓ、　
Ａ、　Ｗ、。

ａｎｄ　Ｄ、　Ｍｅｔｃａｌｆ、　Ｔｈｅ　　Ｎａｔｕ
ｒｅ　　ａｎｄ　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒａｎｕ−１
ｏｃｙｔａ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｃｏ１ｏｎｙ　Ｓ
ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ。

Ｂｌｏｏｄ　５６：９４７（１９８０）　ｌ。異なった
Ｔ−細胞サブセットが２つのＥＬ２の形の生産に関与す
る可能性は、ヒト白血病細＠により生産されたＥＬ２の
分子量についての最近のレポートによって支持されてい
る。本発明者らは、以前に、フＪトヘマグルチニン刺激
のあとで、非−Ｔ　（ｎｏｎ−Ｔ）非−Ｂ　（ｎｏｎ−
Ｂ）’）ン・ぐ芽球白血病が分子量２６．０００形のＥ
Ｌ２を生産することを示した（Ｖｅｎｕｔａ、　Ｓ、　
、　Ｒ，Ｍｅｒｔｅｌｓｍａｎｎ、　Ｋ、　Ｗｅｌｔｓ
、　８．　Ｐ、　Ｆｅｌｄｍａｎ。

Ｃ，Ｙ、　Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｍ、　Ａ、　Ｓ、　Ｍｏ
ｏｒｅ、　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　ａｎｄＲｅｇｕｌ
ａｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ｉｎ　
Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｏｈｏｂ−１ｓｓｔｌｃ　Ｌｅｕｋ
ｅｍｉａｓ　　５ｔｕｄｉｅｄ　　ｗＨｈ　　Ｔ−Ｃｅ
ｌｌ　　ＭｏｎｏｃｌｏｎｍｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　
（ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）　）、　　一方、フリートマン
らは、最近、Ｔ−細胞、慢性リンパ球白血病患者から得
た同じ条件で刺激された細胞が、分子量１４．５００形
のＥＬ２を遊離したことを報告した（　Ｆｒｌｅｄｍａ
ｎ、　８．　Ｍ、、　Ｇ、　Ｔｈｏｍｐｍｏｎ、　Ｊ、
　Ｐ、　Ｈｅ１ｐｅｒ　ａｎｄＤ、　Ｍ、　Ｋｎｏｗｌ
ｅｓ、　０Ｔ−ＯＬＬ：Ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ
　ＣｈｒｏｎｉｃＬｙｍｐｈｏｅｙｔｉｅ　Ｌｅｕｋｅ
ｍｉａ　ｔｈａｔ　Ｐｒｏｄｕｃｅｓ　ＥＬ２　ｉｎＨ
ｉｇｈ　Ｔｉｔｅｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２
８：９３５（１９８２）　ｌ。

ドデシル硫酸ナトリウムで変性した自然ＩＬ２の分子的
不均一性の理由については、未だ探究すべきものとして
残されている０種々の程度のグリコシレージョン（ｇｌ
ｙｃｏｓｉｌａｔｌｏｎ）がこの現象を説明する可能性
がある（Ｒｏｂｂ、　Ｒ，Ｊ、、　ａｎｄ　Ｋ、　Ａ。

Ｓｍ１ｔｈ、　Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｏｆ　Ｈ
ｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（
ｓ）　Ｄｕｅ　Ｔｏ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｇｌｙｃｏｓ
ｙｌａｔｉｏｎ、　Ｍｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８：１０８７（１９８１）　：Ｏｌ
ａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ、　１．、　ａｎｄＪ、Ｗ、５ｃｈ
ｒａｄｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｌｃａｌ　　Ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ　
Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔ−Ｃｅ
ｌｌ　Ｈｙｂｒｉ−ｄｏｍａｓ　ａｎｄ　５ｐｌｅｅｎ
　Ｃ！ｅｌｆｓ、　［１，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　Ｆｏｒ　
Ｇｌｙｃｏｓ−ｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　
Ｇｒｏｖｒｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ、Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ
ｌａ−ｃｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ、　ａｒ＋ｄ　Ｇｒａｎ
ｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｅｒｏｐｈａｇｅ　Ｏｏｌｏｎｙ
−８ｔ１ｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ、　Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　１２８：１８０（＋９８２）　）ａロ
ブらは、ノイラミニダーゼ、グリコシダーゼおよびグリ
コシレージョンの禁止剤が扁桃腺９７７５球により生産
されたＴＬ２の不均質性を減少せしめることを示した（
Ｒｏｂｂ、　Ｒ，Ｊ、、　ａｎｄ　Ｋ、　Ａ。

Ｓｍ１ｔｈ、Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｏｆ　Ｔ（
ｕｍａｎ　Ｔ−Ｏｅｌｌ　ＧｒｏｗｔｈＦａｅｔｏｒ（
ｓ）　Ｄｕｅ　Ｔｏ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｇｌｙｃｏｓ
ｙｌａｔｉｏｎ、　Ｍｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１８：１０８７（１９８１）　）、
しかしながら、本発明者らはノイラミニダーゼ処理によ
ｆｉＩＬ２の分子Ｍに影響を与えることができなかった
し、ＥＬ２の固定化レクチンへの結合も検知することが
できなかった（コンカナ、６リンＡおよびコムギ凝集素
）。ＥＬ２のレクチンへの結合がないことはすてにミア
ーらによって報告されている（Ｍｉｅｒ、　Ｊ、　Ｗ、
、　ａｎｄ　ｕ、　Ｏ，０ａｌｌｏ、　Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ　ａｎｄＳｏｍｅ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｓｔｉｃｓ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｔ−Ｃｅｌｌ　
　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ　Ｆｒｏｍ　Ｐｈｙｔｏｈ
ｅｍａｇｇｕｌｔｌｎｉｎ−８ｔｉｍｕｌａｔｅｄＬｙ
ｍｐｈｏｃｙｔ＠（！ｏｎｄｉｔｉｏｎｄ　Ｍｅｄｉａ
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、　８．　Ａ、　７７：６１３４（１９８
０１）、　　これらの結果の相違は、おそらく、ＩＬ２
の誘導法および純化法が異なったためであり、こｈ、ら
けＩＬ２の生化学的特＠に影争を与える。

ここに記載された純化工程は約１０’　Ｕ／”ＩＦプロ
ティンの特異活性でＩＬ２を生産した。活性ＩＬ２ポリ
ペプチドの最も小さな分子ＪＩＪｔ１４，５００ドルト
ンであったので、ＩＬ２のＩＵ／ｓｄが７　Ｘ　１０−
１１Ｍのモル濃度に等価であることが計算された。

１、４　Ｘ　１０”　Ｍあるいは約４Ｘ１０’分子／細
胞のＩＬ２濃度は、ネズミ細胞傷害リンパ球の最大値の
半値刺激を必要とした。同様な値がＩＬＩに関してＭｉ
ｚｅｌによって報告されている（　Ｍｉｔｅｌ。

８、　Ｇ、、　ａｎｄ　Ｄ、　Ｍｉｘｅｌ、　Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ＡｐｐａｒｅｎｔＨｏｍｏｇ
ｅｎｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｉｎｔｅｒｌｅｎｋ
ｌｎ　！、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１２６：Ｒ３４（１９８１）　）。

高ｉ　ｒｔｃ　ｐ化されたＩＬ２　ｔｄ、ｉｎ　ｖｉｖ
ｏおよびＩｎ　ｖｉｔｒｏでのＩＬ２の生物学的活性を
謂ぺるため本発明者らは、以前ｔＫヒトのプロシオンー
レッ）’　７　カＯ−スで糾：化したＩＬ２（フラクシ
ョン■）を添加するときにより、異型的混合リンパ球反
応（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ　ｍ１ｘｅｄ　Ｉｖｍｐｈｏｃ
ｉｔｅ　ｒｅａｃｔｌｎｎｌ（ＭＬＲ）および細胞仲介
リンパ溶解（℃ｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄＩｙｍｐｈｏ
ｌｙｓｌｓ　）　Ｉ　ＯＭＬ　）の双方で、ネゼロフ症
候訃（Ｎｅｚｅｌｏｆｆ’ｓ　ａｙｎｄｒｏｎ−ｃｌの
患者のＴ−細胞の応答を、ｉｎマＩｔ　ｒｏで回復した
。この研究は正常ヒトリンパ球機能、免疫欠損症候群お
よびヒ）　ＩＪンパ芽球白血病の病理学に寄与するｈ（
Ｇ１１ｌｌｓ、　８．＊Ｒ，Ｍｅｒｔｅｌｓｍａｎｎ、
　　Ｂ、　　０１ａｒｋｓｏｎ　　ａｎｄ　　Ｍ、Ａ、
　　Ｓ、　　Ｍｏｏｒｅ。

Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｌｅｖａｔｅｄ　Ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ　ＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅＡｃｔｉｖｉ
ｔｙ（ＴｄＴｌ　ｗｉｔｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏ
ｆ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ　　（Ｔ
ＯＧＦ）　　ｉｎ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｌｅｕｋｅｍｉａ
　　Ｃｅ１ｌｓ、ＡＡＯ几。

Ａｂｓｔｒｕｃｔ　Ｎｏ、　９５５．　ｐ、　２３８（
１９８０）：　Ｖｅｎｕｔａ、　Ｓ、、　Ｒ。

Ｍｅｒｔｅｌｓｍａｎｎ、　Ｋ、　Ｗｅｌｔｅ、　Ｓ、
　Ｐ、　Ｆｅｌｄｍａｎｎ、　Ｏ，Ｙ、　Ｗａｎｇａｎ
ｄ　Ｍ、Ａ、Ｓ、Ｍｏｏｒｅ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　
　ａｎｄ　　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆＩｎｔｅｒ
ｌｅｕｋｉｎ−２ｉｎ　　Ｈｕｍａｎ　　　Ｌｙｍｐｈ
ｏｂｌａｓｔｉｃ　　ＬｅｕｋｅｍｉａｓＳｔｕｄｉｅ
ｄ　　ｗＨｈ　　Ｔ−Ｃｅｌｌ　　Ｍｎｎｏｃｌｏｎａ
ｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　ｌ
　）。

ＩＬ２Ｆｉ、ある種のＴ−細胞新形成をもった慴煮から
のＩＬ２依存性長期細胞系の確立（縫代）および抗原４
？異細胞傷害Ｔ−細胞の連続成長を含むｉｎ　ｖｌｔｒ
ｏ　　での種々のシステムに有用である。自己由来の腫
瘍特異ヒトＴ−細胞を１ｎ−ｖｌｔｒ。

で大量に成長させ、ついで、治療目的をもってこれらの
細胞をｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｋ移すことは実現可能である。

さらに、医薬試験および発癌性試験のために、正常Ｔ−
細抱の長期培養を確立するための使用本者見られる。

ＩＬ２を含む粗コンディションド・メディウムの治療で
の使用を探知するため釦用いられてきた動物モデルは、
ヌードマウス（Ｔ　−Ｍ胞免疫欠損）およびサイトキサ
ン（ｃｙｔｏｘａｎ　）によって免疫抑制されたマウス
である。以前の結果は免疫応答が、これらメディウムに
よって正常化されることを示唆している（　Ｌｉｐｓｉ
ｃｋ　ｅｊ　ａｌ、、　ＰｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　７８：２３９８（１９８１）：　ｋ（ｅｒ
ｌｕｚｚｉ　ｅｔａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　
４１：８５０（１９８１）　）。我々自身の材料を用い
る予備的な検討では実際に活性成分がＩＬ２であること
を示暗してぃふ。

マウス（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｗｕｒ、　Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１　ニア５１（１９８１１）
およびヒト（Ｇｌｌｌｉｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　０
ｌｉｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　６７：９３７（１９８１）　　での研
究にょｈば、年令およびそれＫｑ連した免疫欠陥はＩＬ
２生成の欠陥に関連があるこきが示唆されている。

より最近は、ロペッッーゼテットら（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｏ
ｔｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｎｌ、　１
２８：６７９（１９８２）　）は、ＩＬ２を含み、マイ
トンエンを含ま々い上澄みを添加しあるいけ添加するこ
となしに、フィトヘマグルチニンへの増殖応答に関し、
重く併発した免疫欠損、ライスコツト・アルドリッヒ疾
患（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ　ｓｙｎｄｒｏｍ
ｅ）、　ＩｇＭ　過多を伴なう免疫欠損およびＸ−リン
ク（Ｘ−１ｉｎｋｅｄ　）無ガンマグロ！リン血症がし
た患者を計価した。このグループの患者でのフィトヘマ
グルチニンへの過応答は、ＩＬ２の生産の欠陥と関連が
あった。

（ａＪ同性でのカボシ症候群、（ｂ）ホジキン病および
（ｃ）化学療法に関連した免疫欠損で、ネゼロ７症候群
（Ｎｅｔｅｌｏｆｆ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）　　、也者の
Ｔ−細胞応答が増加する欠陥が、同一由来のＴＬ２のｉ
ｎ　ｖｉｔｒ。

での添加により宇金に正常化＋ることが見い出された。

これらの有望な結果に基いて本発明者らは、先天的およ
び後天的な免疫欠損患者でＩＬ２の第１８階試験を始め
た。今までのところ、１人のネゼロフ症候群獣考（最大
投与針は１００Ｕ／日８、　ｅ、に達した）および１人
の正常々志願者（本発明者らの１人であり、１ｏｏｏＵ
／日ｓ、　ｃ、　ｌ　において、好ましくない反応けみ
られない。

先天的な免疫欠損、ホジキン病（Ｔ−細胞欠陥頻発）、
カポジ症候群、癌に関連した免疫抑制あるいは化学療法
および／ｌたけ放射療法に関連した免疫抑制、Ｐ！、者
、さらには年老いた個人、他の免疫欠損状体患者に有力
カ療法および臨床的な試鯉とし１、さらに広範な期待が
本たれている。

非経口のインクニリンが糖尿病の特異的治芦方法となっ
たように、ＩＬ２単独で、あるいけ他に述べた症候群の
好ましい治療方法に會る々信じられているう さらに、ＡＬＬ（仮言＆′ｌふ・よび熟５’１ｉＴ−細
胞の新形１１ｉ？（確しされている）のようなＴ　Ｌ　
２依存性Ｒ形成の使用に期待さねている。化学的ンζ、
あるいに、ＩＬ２分子細引＃ｊＩ、害物ηを添加してＩ
Ｌ２分子を修正することにより、レセプタ一部の障害に
よるＩＬ２依存性新炬成細胞の姻択的除去、および、Ｉ
Ｌ２応答喝胞への毒物質の輸送に特異的な阿胞型の選択
的除去が可能となった。このアプローチは、自己免疫疾
病のような鍋反応免疫の場合に、ＩＬ２応答細胞を選択
的に除去するに有用である。

本明細橿の開示は以Ｆのものも含む ｆｌ＋　　％許請求の範囲第５〜９項のいずれかに記載
した純化ＩＬ２の免疫欠損の治療におけるｉｎ　ｖｉｖ
ｏ　での使用。

（２）　　特Ｆ＋Ｊ求のｋｐ凹第１０項に記載の純化Ｉ
Ｌ２の免疫欠損の治〆ｒにおけるｉｎ　ｖｉｖｏ　での
使用。

（３）特許請求の範囲第１１項に記載の純化ＩＬ２の、
免疫欠損の治療におけるｉｎ　ｖｉｖｏでの使用。

【図面の簡単な説明】

第１図けＩＬ２のジエチルアミンエチルセルロース（Ｄ
ＢＳ２１クロマトダラフイーに関する、（ＮＨａ）＊８
０＋での沈ｆＩｌ物フラクションをＤＥ５２カラムに負
荷した。プロティンを連続勾配のＮａ１ｌ（０〜ｏ　　
３Ｍ　）　の　０．０５Ｍ）　　リ　ス　−　Ｈｃｚ（
、Ｈ７，ｓ）　　溶液で溶出し、５−のフラクションを
集めた。 ２８０　ｎｍでの吸収：・−・、Ｄａｕｄｉ株の存在Ｔ
Ｋ産生されたＩＬ２（Ｕ／−１：Δ−Δ、Ｄａｕｄ１株
の非存在下に産生されたＩ　Ｌ　２　（Ｕ／ＷＩ／）　
：○−００１！ｇ２図は、ＩＬ２のＡｃＡ４４ウルトロ
ゲルでのゲル濾過に関する。ＤＥ５２で純化したＩＬ２
をＡｃＡ４４ウルトロゲル力ラムに負荷し、リン醒緩伽
生理的塩類溶液（、Ｈ７，２）１０．１％ポリエチレン
グリコール（分子１６０００）で浴出した。 ６−のフラクションを集めた。カラムを、ウシ血清アル
ジミン（分子１ｆ６ｓ、ｏｏｏ）、キモトリプシノゲン
（分子量２５．０Ｑｏ）およびリジヌクレアーゼ（分子
ｔ１４，０００＋で較正した。２８０　ｎｍでの吸収：
・−・、Ｄａｕｒ＋ｉ細胞の存在下に産生されたＩＬ２
（Ｕ／ｓｇ）：Δ−Δ、Ｄａｕｄｉ細胞の非存在下に産
生されたＩＬ２（Ｕ／ｄ）　：　Ｏ−Ｏ７第３図は、ブ
ルーアガロースでのＩＬ２のクロマトグラフィーを水中
。ＡｃＡ４４ウルトロゲルで純化したＩＬ２　？ブルー
アガロースカラム、に適用し、連続勾配のリンｊ口塩緩
衝Ｎａ０４（０，０５〜０、８　Ｍ　）で、写出した。 ２０−のフラクションを琲めだ。２８０　ｎｍでの０．
１）、　：・−・、Ｉ　Ｌ　２　（Ｕ／ｍ）：ムーム、
アルファーインターフェロン（Ｕ／ｍ）：Ｏ−０、Ｎａ
ＣＬモル濃度（Ｍ）　　：　ローロ。 第４図はプロジオン−レッドアガロースカラムでのＩＬ
２のクロマトグラフィーに関する。ブルーアガロースか
らのＩＬ２を含むフラクションヲフールシ、プロジオン
−レッドアガロースカラムに負荷した。結合したプロテ
ィンを、塩濃度を段階的に増加させて浴出した（０．１
５〜ｌＯＭ　−ＮａＣ１リン酸塩緩イｆｍ液）、２８０
ｎｍでの０、　Ｄ、　：・−・、　ＩＬ２（Ｕ／ｍ）：
　　ムーム。 Ｗ！５図は、ＩＬ２の純化の神々の段階のドデシル硫酸
ナトリウム−ボリアクリルア？ドゲル雷気泳動プロフィ
ルを示す。 （内）分子量スタンダード：ホスホリラーゼｂ（分子量
９４，００（１、ウシ血清アルジオン（分子（［６ｓ、
ｏｏｏ）、卵アルブミン（分子量４３．００（１、炭酸
脱水酵素（分子ｆ３０．０００）、ダイズトリプシン阻
害剤（分子１１１）２Ｑ、０ＯＯ）およびアルファーラ
クトアルブミン（分子量１４．５００） （ｂ）　　ＩＬ２含有のリンノ臂球−コンディショント
°・メディウム （ｃ）　　透析した硫酸アンモニウム沈澱物（ｄ）　　
ＩＬ２含有ジエチルアミノエチルセルロース溶出物のプ
ール ＜ｅ）　　ＡＣ人ウつトロゲル（ＡｃＡ４４　　Ｕｌｔ
ｒｏｇｅｌ）　争ゲル濾過からプールしたＩＬ２含有フ
ラククヨン第６図は、ブルーアガロースで純化したＩＬ
２およびプロ７オンーレツドアガＯ−スで純化したＩＬ
２のドデシル硫酸ナトリウム−ボリアクリルア？ドゲル
電気泳動を示す。２１！ドデシル研酸ナトリウムおよび
５ｍＭメルカゾトエタノールでＩＬ２を処理し、５〜２
０悌勾配ゲルを適用した。プロテインノ々ンドを硝酸銀
法で可視化した。以下の標識プロティン（各２００　ｎ
ｙ　）を用いた。卵アルブミン（分子量４３．ｏｏｏ）
、炭酸脱水酵素（分子１ｉ３０．ｏｏｏｌ、ダイズトリ
プクン阻害剤（分子量２０，０００）およびａ−ラクト
アルブミン（分子ψ１４，５００）。 （ａ）　　プロティンスタンダード （ｂ）　　Ｄａｕｄｉ細胞の非存在下に産生されたＩＬ
２であって、ブルーアカロースで純化されたもの（ｃ）
　　Ｄａｕｄｉ細胞の非存在下に産生さｔたＩＬ２でオ
って、プロジオン−レッドアガロースで純化された本の （ｄ）　　Ｄａｕｄｌ細胞での共刺激で得られたＩＬ２
であって、プロジオン−レッドアガロースで純化したも
の ＠７図はＤａｕｄｉ細胞の存在下あるいけ非存在下に産
生された、プロジオン−レッドアガロースで純化したＩ
Ｌ２のドデシル硫酸す）　１３ウムーＩリアクリルアミ
ドゲル゛阿気泳動を示す、　ＩＬ２製剤を、２憾ドデシ
ル硫酸ナトリウムおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノ
ールで処理し、１５１／リアクリルアミドゲルを適用し
た。爽気泳妙のあと、ゲルを１■の切片にスライスし、
プロティンを０３−のリン酸塩緩衛生理的塩類溶液（、
ＩＩ　７．２１で溶出した。！出物のＩＬ２活性を分析
した。矢印は、夕°イズ）　ＩＪプシン阻害剤（分子Ｊ
ｊｋ２０．０００１およびａ−ラクトアルブミン（分子
１ｊ１４，５００）のプロティンスタンダードの位置を
示す。 Ｄａｕｄｉ細胞の存在下に生産されたＩＬ２（Ｕ／ｓａ
ｇ＞二Δ−Δ Ｄａｕｄｉ細胞の非存在下に生産されたＩＬ２（Ｕ／Ｉ
Ｉｄｉ：Ｏ−０ 渠８図は、ドデシル硫酸ナトリウムおよびジチオトレイ
トールの存在Ｆおよび非存任ＰＫ。 高性能液体クロマトグラフィーでのブルーアガロースで
純化したＩＬ２のゲルＦ週クロマトグラフィーに関する
。次のプロティンスタンダードを用いた：ウシ血清アル
ブミン（分子ｐ６ｇ、ｏｎｏ）、卵アルブミン（分子量
４３，０００１、キモトリプシノゲン（分子°ｇ２ｓ、
ｎｏＯ）、ｉＪＩヌクレアーゼ人（分子ｉ＋１４，００
０）。矢印は、キモトリプシノゲンおよび計算した１７
，０００ドルトンの分子量域を示す。斑点頭載は自然Ｔ
Ｌ２の位置を示し、２番目のピークはドデシル硫酸ナト
リウムで変性したＩＬ２に対応する。 ７４９１４ＦｉＡｃＡ　４４ウルトロゲルで純化したＦ
Ｌ２の等電点゛；こ気泳動にμｍ・する。等耐点慰気泳
動カラム（１１Ｃｌ＋＋＋／）’；ｉ　ｐｉ（３，５〜
１０の２幅アムフオリンを含む５〜６０チのグリセリン
密度勾配を負荷して調製した。ＡｃＡ４４　　ウルトロ
ゲルからＭ出したＩＬ２に２％アムフオリン（、Ｈ３，
５〜１０）および２０％グリセリンを追カロし、カラム
勾配の尋＠度域で暖をなさしめた。最終電圧２ｔ）ＯＯ
Ｖ、電流５　ｍＡでカラムに定電力を印加した（２４時
間、４℃）　、　ＩＬ２　（Ｕ／鰐ｌ）：０−０１．Ｈ
勾配：・−・。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　（ｍ）　　リンパ球−コンディションド・メデ
   ィウム中のインターリューキン２産生を刺激する工程、 （ｂ）　　プロティン性成分を沈澱せしめることにより
   、（ａ）工程からの培地のプロティン性成分を濃縮する
   工程、 （Ｃ）　　塩析により、濃縮したプロティン性取分から
   塩を分離する工程、 （ｄ）　　アニオン交換により、（Ｃ）工程の濃縮プロ
   ティン成分から、非特異プロティン骨物質を除く工程、 （ｅ）　　ゲル濾過により、残った濃縮プロティン成分
   の分子量分離を行ない、（１）インターリューキン２を
   含む分子量タンパク物質と（Ｉｔ）非特異分子量タン・
   ぞり骨物質とに分子量分離をする工程、および （ｆ）　　疎水クロマトグラフィーにより、（ｅ））工
   程の（１）の物質を、インタ−リューキン２含有プロテ
   イン件物質と、これとほぼ同じ分子量を本つ非特異プロ
   ティン性物質とに分離する工程 を含むことを特徴とするプロティン性生理学的活性物質
   であるヒトインターリューキンの純化方法。 ２　紬記（ｆ）工程が複数の疎水クロマトグラフ分離を
   含む特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３　前記疎水クロマトグラフ分離の少なくと本１つが、
   ブルーアガロースでのＩＬ２含有プロティン性物質のク
   ロマトグラフである特許請求の範囲９２項記載の方法。 ４、前記疎水クロマトグラフィー分離の少なくとも１つ
   が、プロジオン−レッド・アガロースでのＩＬ２含有プ
   ロティン性物質のクロマトグラフである特許請求の範囲
   第２項または第３項に記載の方法、 ５、　明細書に記載の妹〈少なくとも１０６士ｌＯ係Ｕ
   ／Ｗの特異活性および０．２±ｏ、　ｏ　ｓ　Ｕｈｌ、
   より少ない生化学活性の＠＊濃度を本つことを特書キす
   る純化ヒトインターリニーキン２（ＩＬ２）。 ６、　２６，０００±４．０００の分子量およびｐＨ６
   ，７±０．２の等電点をもつ特許請求の範囲第５項に記
   載の自然の純化ＩＬ２゜ ７、　１４，５００±２，０００の分子量およびｐＨ８
   ，１±０．２の等Ｗ５点をもつ特許請求の範囲第５項に
   記載の自然の純化ＩＬ２゜ ８゜　１６，０００±１，０００の分子量を４つ特許請
   求の範囲第５項に記載の変性した純化ＩＬ２゜９、　１
   ７．０００±１，０００の分子量をもつ特許請求の範囲
   第５項に記載の変性した純化ＩＬ２゜１０　　明細書に
   記載したような硝酸銀法により判断して、プロティン性
   汚染物を実質土倉まない特許請求の範囲第５項〜第９項
   のいずれか１項に記載の純化ＩＬ２゜ １１　　明ＪｇＢ６に記載したようなＩＩＨ外部ラベル
   により判断して、プロティン性汚染物をψ−質上ずれか
   １項に記載の純化ＩＬ２゜ １２、特許請求の範囲第５頂〜第９項のいずれか１項に
   記載の純化ＩＬ２のイン−トロでの使用。 １３　　ヒトインターリューキン２　（ＩＬ２）の純化
   方法において、実質上ＩＬ２とこのＩＴ、２とほぼ同じ
   分子量の非特異プロティン性物質とからなるプロティン
   性物質を単離する工程；およびこの単離したプロティン
   性物質を疎水クロマトグラフィーして該ＩＬ２と非特異
   プロティン性物質とに分離する工程とを含むことを特徴
   とするヒトインターリューキン２の純化方法。 １４、　　前記疎水クロマトグラフィーが、クルーアガ
   ロースおよびプロジオン−レッドアガロースの少なくと
   本１稗と前記プロティン性物質とを接触させる工柵を有
   する特許請求の範囲ｖｇ１３項に記載の方法。