JPS6130526A

JPS6130526A - リンパ球増殖因子

Info

Publication number: JPS6130526A
Application number: JP15275284A
Authority: JP
Inventors: ハービー　イラ　カンター; ゲーリー　ナーベル
Original assignee: DAANAA FUAABELL KIYANSAA INST
Current assignee: DAANAA FUAABELL KIYANSAA INST
Priority date: 1984-07-23
Filing date: 1984-07-23
Publication date: 1986-02-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、哺乳動物細胞の増殖を刺激する製品ど，その
ような製品の製造方法および使用方法に関するものであ
る．本発明の好ましい実施態様下では、本発明は、哺乳
動物細胞、特にＴ一細胞リンパ球、Ｂ一細胞リンパ球、
マスト細胞、幹細胞，ｍ維芽細胞等が持っている生理学
的機能、例えば病気に抵抗する免疫系統の有効力を増強
し、または回復するために、これらの細胞の増殖を刺激
することによって、哺乳動物の免疫系統およびその他の
系統の病気を治療する増強因子に関するものでおある。

（従来の技術）哺乳動物の免疫系統は、本来、体液性免疫応答および細
胞性免疫応答を目的として、Ｔ一細胞リンパ球およびＢ
−細胞リンパ球が如何に形成され、如何に増殖するかに
関係がある。哺乳動物はしばしば免疫不全にかかり、こ
れは先天的であることがあり、感染に対して十分な体液
性および／または細胞性応答を呈するのに発生学的に原
因がある不全のような例がある。免疫不全のいくらかは
後天的であり、例えばこれらは栄養不足、放射線、老化
、悪性腫瘍または衰弱に伴なうものである。

はとんどの免疫応答は、誘導物質細胞と呼ぶ一群のＴ−
細胞リンパ球によって生産された蛋白質によって始動す
る。異種生体を殺すリンパ球や単球を含む多くのタイプ
の細胞の増殖と分化を刺激するところのペプチドを、こ
れらの一群のＴ−細胞リンパ球は合成し、分泌する。こ
れらに関しては、　Ｗｉｇｎｅｒ等、ムハｈ肚Ｌ１４８
　：１５２３（１９７８）およびＹａｓａｕｃｈ等、Ｅ
ｕｒ、Ｊ、Ｉｍｓ、１１：９０５（１１１１８１）を参
照し、またＢ−細胞リンパ球に関−しては、１ａｂｅ１
等、江旦２３：１９．（１９８１）を参照し、マスト細
胞に関しては、１ａｂｅ１等、Ｎａｔｕｒｅ　２９１：
３３２（ｔｓｅｔ）、また、造血前駆体細胞については
１ａｂｅ１等、Ｐｒｏｃ、　ｋｔｌ、　Ａｃａｄ　Ｓｃ
ｉ　Ｕ−Ｓ、Ａ、７８：１１５７（１９８１）を参照、
これらの文献の記載内容は参考としてここで採用してい
る。これらの誘導物質分子の生物学的活性は、分子の観
点からは完全には判明してはいない。

免疫不全に打ち勝つ１つの試みが、免疫応答を強化し、
また病気を予防する目的でリンパ球の迅速な成長を促が
すような投薬量を開発するためになされてきた。これら
については、Ｎｏｗｏｔｎｙ氏の米国特許Ｎｏ−４，３
２３，５８１及びＫｉ層氏の米国特許Ｎｏ、　４，３３
３，５８４を参照、これらの記述内容は参考として取り
入れである。

例えば、Ｗａｔｓｏｎ等、ムハム勘も１５０：８４１（
１９７８）およびその他は、ＷａｔｓｏｎがＩｎｔｅｒ
ｌｅｕｃｉｎ−２（ルー２）と呼び、またＴ−細胞の増
殖に効果があるので、Ｗａｔｓｏｎ等が「Ｔ−細胞増殖
因子」と呼んだところの誘導物質分子からの因子を取得
したことについて報告している。＾１ｄｅｒｓｏｎ等、
即旦虹Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾
、　７８１：２４９７（１９８１）。

Ｔａｋａｔｕ等、　　Ｉｍｍｕｎａｌ、１２５：２４ｆ
１４（１９８０）、　：ｃＤｏｕｇａｌｌ等、Ｌエハヱ
ユＷｅｄ、　１４５：８１３（１１７？）を参照のこと
。

これらの文献の記述内容はここに参考として採用されて
いる。然しながら、条件が色々と異なり、刺激用の薬剤
が色々と異なるために、ＩＬ−２分子の特性や大きさお
よび種々のＴ−細胞、Ｔ−細胞Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓが
生産するＬｉｍｐｂａｋｉｎｅｓの多くの因子について
非常に多くの混乱と不一致な報告があるａ　Ａｌｔｍａ
ｎと口、　Ｈ，Ｋａｔｚ、　ｒ’ｌ’−細胞系統および
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａａが分泌する単クローｙＬｉｍｐｈ
ｏｋｉｎｅｓの生態学Ｊ　、　Ａｄｖ’、　ｌｓｍｕｎ
ｏｌ、　３３ニア３−１８８（１９Ｂ２）を参照、この
記述内容はここに参考として採用しである。

（発明の要約）本発明は、種々の特性を持った一群の増殖因子に関する
ものであり、また生きている哺乳動物の細胞のｉｎ　ｖ
ｉｖｏでこのような増殖因子を作りまた使用する方法に
関するものであり、またこの増殖因子を持っている製品
に関するものである。

この発明のこの増殖因子は、元来、適当な抗原、例えば
羊の血赤球（ＳＲＢＧ）または細胞分裂誘起物質、例え
ばコンカナバリン（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　）Ａの
存在下で、誘導物質Ｔ−細胞を培養して得た上澄液から
分離した。この増殖因子に含有されているのは、Ｔ−細
胞リンパ球およびＢ−細胞リンパ球の両者およびその他
の多くのタイプの細胞の増殖を刺激する１４ｋｄ（キロ
ドルトン）のポリペプチド、Ｂ−細胞を刺激して免疫グ
ロブリンを増殖させ１分泌させるような５０ｋｄのポリ
プチド、およびＢ−細胞リンパ球による免疫グロブリン
の分泌を刺激し、ある種のマスト細胞、幹細胞およびあ
る種のその他の細胞の迅速な増殖を刺激するような４５
ｋｄの増殖因子である。

（発明の構成及び作用）本発明の本来の目的はＴ−細胞リンパ球およびＢ−細胞
リンパ球の両者に対して増殖因子として作用するところ
の蛋白質の発見と、この蛋白質の製造方法及び使用方法
から出発している。更に特定すれば、マスト細胞、繊維
芽細胞および幹細胞を含むその他のタイプの細胞はもと
より、Ｔ−細胞およびＢ−細胞の両者の増殖を刺激する
ところの約１４キロドルトン（ｋｄ）の分子量を持った
ポリペプチドを我々は生産し分離した。この１４キロド
ルトンのペプチドは、種々の種類の比較的大きいペプチ
ドが正規通りに会合したものだと考えられており、これ
らの大型ペプチドがいずれかの標的赤血球にその細胞分
裂誘起活性を集中させるのに役立っている。この発明の
主題であるこのポリペプチドは１４キロドルトンの分子
量があり、これはドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ
）ポリアクリルアミド拳ゲル電気泳動法によって測定さ
れ、５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−１００カラムクロマトグ
ラフイーによって確認されている。このポリペプチドの
等電点（ｐｉ）は約０．４であって、これは・平板等電
焦点法（ｆｌａｔ　ｂｅｄ　１ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　
ｆｏｃｕｓｉｎｇ　）によって測定されている。この１
４キロドルトンのリンパ球増殖因子は強力な作因であっ
て、１ミリメートル当たりこのポリペプチドが１ナノグ
ラムのような少ない量で顕著な増殖が誘導される。この
ように、このポリペプチドはペプチド・ホルモンの場合
に観察される濃度と同じ程度の濃度において活性を持っ
ている。この１４キロドルトンのポリペプチドによって
誘導されるＴ−細胞増殖またはＢ−細胞増殖の速さは、
Ｔ−細胞増殖に対するｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ、ま
たはＢ−細胞増殖に対するｌ　１ｐｏｐｏｌｙｓａｃｃ
ｂａｒｉｄｅ　（Ｌ　Ｐ　Ｓ　）の如き、リンパ球細胞
分裂誘起物質を使用する場合の速さと事実上一致してい
る。しかしながら、ＬＰＳとは違って、この１４キロド
ルトンのポリペプチドはＢ−細胞を誘導して免疫グロブ
リンを分泌させるようなことはない。

ＬＰＳの如き細胞分裂誘起物質について更に問題となる
のは、これらは明らかに一度は細胞の増殖番と影響力を
持つが、増殖のために一度刺激を与えた後は、これらの
細胞は今後の刺激に対して抵抗力を持つようになること
である。この発明の増殖因子についてはこうしたことは
ない。

この発明の１４キロドルトン・リンパ球増殖因子はいく
つかの方法で取得され、分離され得る。例えば、刺激を
受けた誘導物質Ｔ−細胞、好ましくはクローンしたＴ−
細胞によって合成されたペプチド上澄液からこの蛋白質
は分離することができる。このようにして、Ｎａｂｅｌ
等、恒ＩＩ　２３：１９（１９８１）に記載しであるよ
うに生産した誘導物質Ｔ−細胞クローンＣ１，Ｌｙ＋　
２　／９（このサンプルは既にメリーランド州ロックビ
ル市のＡ薦ｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣＣＲＬ−８１７１１１と
いう目録番号の下に供託されているが）は、例えば羊の
赤血球（ＳＲＢＣ）またはｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ
の如き適当な抗体または細胞分裂誘起物質と共に培養す
ることによって刺激を受ける。このようにして刺激した
誘導物質細胞から得た上澄液は数種の蛋白質を含有し、
例えばゲル電気泳動法またはクロマトグラフィーまたは
その他の分離方法によって、これらの蛋白質から１４キ
ロドルトン・リンパ球増殖因子を分離することができる
。好ましくは、これらの蛋白質の分離は次に述べるよう
な諸技術を組み合わせた方法で実施するのがよい。すな
わち、クロマトグラフィー法、例えば、蛋白質の分子量
範囲で蛋白質を効果的に分離するような５ｅｐｂａｄｅ
ｘ　（Ｐｂａｒｗａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ社）、ＤＥＡＥセルロースまたはその他の親木性高
ル樹脂のカラムでのクロマトグラフィー法フ７０マドグラ
フィー法（ＨＰＬＣ）　、ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏ
ｃｕｓｉｎｇ（等電焦点法）および／またはＳＤＳポリ
アクリルアミド・ゲル電気泳動法の如き諸技術である。

また１４キロドルトン・リンパ球増殖因子は、尿素また
はＳＤＳのような解離剤でその他の成る種のポリペプチ
ドを処理するか、または担体蛋白質の非存在下の培養の
ように、蛋白質解離に都合のよい条件下でその他の成る
種のポリペプチドを処理するかして取得できる。

例えば、蛋白質解離には不都合な５ｅｐｈａｄｅｘＧ　
１００樹脂上でのクロマトグラフィーによって分離した
誘導物質Ｔ−細胞、例えばりｐ−ンメｃ１ルマｌ＋２−
７８の培養から得た上澄液から、約３０キロドルトンお
よび約４５〜５０キロドルトンの分子量を持ったポリペ
プチドの分離が可能となる。この３０キロドルトンのフ
ラクションはＴ−細胞の増殖を誘導するが、Ｂ−細胞の
増殖を誘導しない。５０キロドルトン・フラクションに
はＢ−細胞を刺激してこれを分割する性質があり、また
Ｂ−細胞を刺激して免疫グロブリンを分泌させる性質が
あるが、この５０キロドルトン争フラクシヨンにはＴ−
細胞を増殖させる効果はなかった。この５０キロドルト
ンのポリペプチドは、Ｂ−細胞に対する細胞分裂誘起物
質である１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　（Ｌ
　Ｐ　Ｓ　）と同じような方法でＢ−ｍＤ増殖および免
疫グロブリン刺激に対して活性であるところの新しく発
見された増殖因子であると考えられる。

これらの分子量が比較的大きいポリペプチドは解離剤お
よび／または解離的条件で処理することによって比較的
小さい蛋白質分節に分離することができる。好ましくは
、比較的大きい蛋白質を濃厚尿素液（１〜１０％、好ま
しくは５〜７Ｍ）または０．０１〜１％　（好ましくは
、約０．０８〜０．２Ｘ　）（７）　Ｓ　Ｄ　Ｓあるい
はその他の清浄剤で処理する。この技術では、その他の
解離剤またはその他のＣｈａｏｔｒｏｐｉｃな薬剤の作
用が知られている。ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔａｌ（Ｄ
・ＴＴ）の如き還元剤は恐らく効果がないだろう。また
、この蛋白質は担体蛋白質の非存在下において、温度を
上げて、例えば、３０〜４５℃、好ましくは３５〜４σ
℃・の温度で容易に培養できる。解離剤または高温にて
の処理がこの分子に逆に作用・するような場合には、余
り過酷でない方法、例えば１ｓｏｅｌｅｃｔｒｊｃ　ｆ
ｏｃｕｓｉｎｇ（等主焦点法）を用いれば解離はうまく
行く。

解離剤による３０キロドルトン蛋白質の処理は、Ｔ−細
胞増殖を誘起する能力を顕著に変化させはしないが、本
発明の１４キロドルトンのリンパ球増殖促進因子および
分子量が１８キロドルトン余りのもラ一つのフラグメン
トに少くとも部分的に解離する。３０キロドルトンのも
のを解離して出来た生成物の中には１４キロドルトンの
ポリペプチドが存在するので、この生成物は公知のＢ−
細胞の細胞分裂誘起物質であるＬＰＳの場合と同じ速さ
でＢ−細胞の増殖を刺激する。

ＳＯＳのような解離剤を用いて処理した５０キロドルト
ン蛋白質はＢ−細胞に対して強力な分裂誘起活性を持っ
た解離生成物となり、この解離生成物は５０キロドルト
ン蛋白質それ自体とは違って、Ｔ−細胞の増殖を刺激す
る力がある。しかしながら、ＳＤＳによって処理したり
、または担体蛋白質の非存在下で３７℃で４時間培養し
て解離を実施すると、この５０キロドルトン・ポリペプ
チドはＢ−細胞を刺激して免疫グロブリンを生産する力
を失なう。

Ｂ−細胞を刺激して免疫グロブリンを分泌する能力を失
うことのない５０キロドルトン蛋白質の解離は、ｆｌａ
ｔ　ｂｅｄ　１ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎ
ｇ　（平板等電焦点法）によって達成される。５０キロ
ドルトン蛋白質を等主焦点法にかけると次のＷ二つの生
成物を生産する：　（ａ）　Ｂ−細胞を刺激して免疫グ
ロブリンを生産し、約６．０の等重点を持つ４５キロド
ルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）蛋白質、および（ｂ）今ま
で述べた如く、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞およびその他の細胞
に対する増殖促進活性を持った上述の１４キロドルトン
蛋白質軸〒（等電点的４．０）。この４．５キロドルト
ン蛋白質は、Ｔ−細胞またはＢ−細胞リンパ球の成長を
引き起しはしないけれど、Ｂ−細胞リンパ球を刺激して
免疫グロブリンを生産させるのに有用であるから、この
蛋白質はこの発明のもう１つの主要な点となる。更に、
この４５キロドルトン蛋白質は、ｈ６ｐａｒｉｎ。

ｈｉｓｔａｍｉｎｅｓ、　　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉ
ｎｓおよびその他の生理学上の重要な物質の重要な原料
であるマスト細胞の増殖を誘導することが発見されてい
る。この同じ４５キロドルトン蛋白質はまた幹細胞を誘
導して新しい単球や顆粒球を生じさせ、これらは感染の
防止に役立つ。この蛋白質はマウスの幹細胞の成熟を刺
激するのに負畦！で使用されてきた。

このように、種々の理由で白血球生産を抑さえられてい
る哺乳動物に対して、幹細胞を刺激して成熟を一層速や
かにし、感染に対する哺乳動物の感受性を速やかに減少
させるためにこの増殖因子が使用され得る。

この発明の増殖因子は、現在成育状態に保つことが大変
困難とされている培養基中に多種類の細胞を成育させる
ためにｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用できる。このようにして
、この増殖因子に応答する細胞、例えばヒトまたはその
他の哺乳動物の免疫系統、神経系統、表皮系統の細胞を
基調とする哺乳動物細胞系統、またはその他の方法では
維持困難なその他の細胞系統を維持および／または増殖
させるために、培養基にこの増殖因子を添加すればよい
。

これらの増殖因子の添加は、リンパ球、マスト細胞、繊
維芽細胞、幹細胞等の細胞系統の維持に特に効果的であ
る。適当な栄養物およびその他の標準的成分またはオプ
ショナルの成分を含む培養基に約０．１ｍｇ／ｍｌから
約１ｎｇ／ｓｌ、好ましくは約１ａｇ／ｓ＋１から約１
０ｎｇ／ｍｌまで添加することによって、細胞系統の成
育に体質的改善を生じる。多くの場合、この発明の増殖
因子を使用すると、細胞系統を維持するために被照射細
胞の如き飼養細胞を使用する必要がなくなる。生産する
細胞系統の純度の点から、これは大変な利点である。

ヒトまたはその他の哺乳動物における、毒性薬品による
反応、感染、放射線、栄養不足、悪性腫瘍に起因する免
疫不全と同様に、侵入に対して効果的な体液性（Ｂ−細
胞抗体）応答および／また細胞性（Ｔ−細胞）応答を表
わすのに先天的に不全である状態を含めて、遺伝的また
は後天的原因による免疫不全を＋ｎ　ｖｉｖｏで処理す
るのに、この発明のリンパ球増殖因子が使用できる。

この増殖因子は単独または組み合わせて投与することが
できる。例えば、４５キロドルトン増殖因子はマスト細
胞およびその他の細胞に増殖−刺激効果を有するが、Ｂ
−細胞リンパ球に対しては持っていない。Ｂ−細胞に対
する４５キロドルトン因子の効果はＢ−細胞の免疫グロ
ブリン分泌を刺激することである。マスト細胞の増殖お
よびＢ−細胞の増殖ならびに免疫グロブリン分泌の両方
を望むならば、５０キロドルトン増殖因子または４５キ
ロドルトン因子と１４キロドルトン因子の混合物の何れ
かを投与すればよい。

動物体内の特別な標的細胞の増殖を促がすには、標的組
織と結合し、またはその他の方法で関係を持つようにな
るところの薬剤と、この増殖因子が共有的またはその他
の方決で結合したり、または関係を持つことによって効
果が現われる。

このようにして、例えば、多くのタイプの細胞に対して
増殖刺激効果を有する１４キロドルトン増殖因子は、そ
の動物のリンパ球の如き標的細胞に対する抗体に付着さ
せられることによって、対象動物へのこの因子の効果を
一層特殊なものとなしうる。このような特殊作用を効果
的に達成させる一つの方法としては、その動物の標的組
織の上に単クローン抗体を載せ、１４キロドルトン増殖
因子をこの単クローン抗体に結合させ、そしてこの抗体
と増殖因子が結合したものをその動物の血の流れの中に
注入させる方法がある。この抗体が増殖因子を標的組織
に送り、抗体は標的組織に付着またはその他の方法で結
合し、増殖因子は標的組織の増殖（および／または分泌
）を刺激する。

（風下α−，）特殊な抗原に対する抗体を取得するための諸技術ｔｈ且
裳は一般的に知られており、多くの単クローン抗体がマ
サチューセッツ州ボストン市ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎ
ｕｃｌｅａｒ社などから、市販品としては入手可能であ
る。単クローン抗体を作る諸技術はＮａｔｕｒｅ　２５
８：４９５（１９７５）にＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅ
ｉｎが最初に書いている。この記載内容はここに参考と
して採用する。この技術の種々の見方および変法が今ま
でに報告されてきた０例えば、１．Ｌｕ等。

Ｃ１ｉｎｉｃａＣ１１ｎｉｃａｌ１　　　Ｎｅｗａｌｅ
ｔｔｅｒ　　１：１　　（１９８０年　８月）、Ｋｏｐ
ｒｏｗｓｋｉ等の米国特許４，１７２，１２４　（これ
には諸文献が記載されている）、Ｗａｎｄｓ等の米国特
許４，２１１，１４５を参照のこと、これらの記載内容
は参考としてここに採用しである。もし必要ならば、処
置すべき個々の動物の標的細胞にこの抗体を載せること
もできる０例えば、マウス、ウサギ、取扱う動物と同じ
種の他の動物の如き抗体源に摂取した状態、また希望す
る哺乳動物から入手したものであって、Ｂリンパ球細胞
またはＢ細胞前駆細胞の培養物の如き抗体を生産すると
ころの細胞培養物を用いて、Ｔ細胞またはＢ細胞リンパ
球は個々の動物またはヒトから取得でき。

それによって、本発明の増殖因子は、細胞の増殖を維持
し、抗体の分泌を誘導するという点で有益に使用できる
。生成された標的細胞に対する抗体、好ましくは単クロ
ーン抗体、および抗体生成細胞は、ｈｙｂｒｉｄｏｓ＋
ａｓを形成して、あるいは適切なりローン化及び培養技
法によって維持できる。

標的細胞に対する抗体は、抗体の生理学的性質または増
殖因子の生理学的性質を損なうことなく、またはそれら
に悪影響を与えることなく蛋白質と反応するところの、
何等かの多機能薬剤を使用することによって、本発明の
増殖因子蛋白質と共に結合することができる。好ましく
は、結合薬剤としては、比較的分子量の低い２機能生薬
剤で、蛋白質分子の反応グループと反応するものが良い
。

このような薬剤はこの技術方面では多く知られており、
それには次のようなものも含む：すなわち、メタキシリ
リン争ジイソシアネート、トルエン２，４ジイソシアネ
ート、ｐ、ｐ’ジフルオロ−ｍ′ｍ−ジニトロジフェニ
ールΦスルホントルエン−２−インシアネート−４−イ
ンチオシアネート、　３−メトキシジフェニ）フタン−
４゜４′−ジイソシアネート、ベンジジン・ジイソシア
ネート、１．５−ナフタレンジスルホニル・クロライド
および３，８−ビス（アセテートマーキュリメチル）ジ
オキサン等、例えば、Ｄ、ＭＪｌｅｉｓ、　Ｇ。

Ａ、Ａｎｄｒｅｓ等、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　１４１°
■層ｕｎＯ１００ｈ、　　３４（１８７７）、”　ｒｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　
ｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉ
ｇｅｎｓ　ｏｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｂｙＥｌｅｃ
ｔｒｏ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”を参照のこと、この記
載内容はここに参考として採用しである。最近ではメタ
キシリリン・ジイソシアネートが良く使用される。

好ましくは１両薬剤は相当に純粋でなければならない。

適当な細胞分裂誘起物質の吸収により、またはＤＥＡＥ
セルロースあるいはその他の適当な物質上でのクロマト
グラフィーの如き公知の他の技術によって、希望する抗
体から希望しない抗ているが、この方面の技術では公知
の如く、同じ蛋白質またはその外の同じ生物学的物質に
ついても見掛けの分子の大きさの変動が観察さている。

それは使用するテストの形式、テストを実施する時の諸
条件、蛋白質のグリコシール化の程度、確認する時の考
え方、クロマトグラフィーに使う媒体または電気泳動法
に使う媒体の変動およびその外の理由によるからである
。ここに報告する方法の変法は見掛けの分子量の如きパ
ラメータに若干の変動を示したが、他のテスト方法、他
のクロマトグラフィー媒体、他の条件ではいくらか異な
った結果を与える可能性がある。この発明に重要なのは
増殖と免疫グロブリン分泌を誘導する蛋白質そのもので
あり、この発明の意図と範囲は、ここに報告する数値と
は違った見掛けの分子量またはその他のパラメータにお
ける諸条件または諸方法を使用することによって生産ま
たはテストした蛋白質を製造、使用、販売することによ
って無効となるものではない、この方面の技術で公知の
如く、これらの蛋白質のアミノ酸配列を測定することが
できる。例えば、Ｓｔｒｉｃｋｂｅｒｇｅｒ、　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ６１０頁以下（ＭｃＭｉｌＪａｎ、１９７Ｂ
　）を参照ノコと。、＝しの記載内容はここに参考とし
て採用する。　Ｂｅｃｋ　−ｍａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕａ＋
ｅｎｔｓ社とＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａ社
から蛋白質自動分析器を入手できる。

旬■Ｗの治療で使用されるべき種々の増殖因子の必要量
（以下、活性成分量という）は、投与経路や治療すべき
状態の正常や程度によって変化し、結局は医師または獣
医の判断による。しかし、一般的には投与量は哺乳動物
の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇからＩＭｇの範囲であって
、好ましくは約１０〜２００ｇ／ｋｇである。投与量は
全てペプチドベースで計算する。

活性成分は治療すべき状態に適した経路で投与すればよ
い。適当な経路としては、経口的、経鼻的／（例えば、
スプレー）および非経口的（皮下的、筋肉的、静脈内的
）がある。治療すべき条件と共に好適経路が変化すると
考えればよい。

活性成分としては粗製４６学品として投与することも可
能であるが、製剤的に調整した薬品とじて提供すること
が好ましい。

家畜に使う場合にも、人間に使う場合にも、本発明の調
剤は１種またはそれ以上の適当な担体およびオプショナ
ルにその他の治療成分と共に、上記の活性成分を含む、
担体はこの調剤の他の成分と両立できるという意味にお
いて［受諾できる（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）Ｊものでな
くてはならず、また使用するものに対して有害なもので
あってはならない。好ましくは、調剤は酸化剤やペプチ
ドが共存しないと考えられているその他の物質を含んで
はならない。便宜上調剤は単位投与量の形式で提供され
、また製薬上の公知の方法で調整される。これらの方法
は全て１種またはそれ以上の付属的成分を含む担体と活
性成分を結合させる工程を含む、一般的に、活性成分を
液状担体または微細にした固形相体またはその両方に均
一に密接に結合させることによってこの調剤は作られ、
必要な場合には、希望する調剤形式に製品を成型する。

経口的投与に適した本発明の調剤は、予め定めた活性成
分量を含むカプセル、カシェ−またはタブレットのよう
な分割単位で提供され、または粒末ないし粒状で、また
、溶液または水性液体ないし非水性液体での懸濁液とし
て、または水中油の液状エマルジョンまたは油中水の液
状エマルジョンとして提供される。また活性成分は丸薬
、鼻スプレー、練り薬、ペーストとして提供される。

タブレットは圧縮するかまたは成型加工によって作るこ
とができ、オプショナルとして１種またはそれ以上の付
属成分を伴なう。圧縮したタブレットは適当な機械で圧
縮することによって調整され、その際活性成分は粉末、
粒状、オプショナルには結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤
、潤滑用薬剤、表面活性剤または分散剤などミックスし
て自由に流動する形状のものとして使用する。成型タブ
レッ′トは適当な機械で不活性液状希釈剤で加湿した粉
末コンパウンドの混合物を成型することによって作られ
る。

非経口的投与に適した大調剤は、その溶液が好ましくは
、使用者の崩液と等浸透圧であるというような活性成分
の無菌水溶液から出来ている。このような調剤は、固形
活性成分を水に溶解し、水溶液となし、この溶液を無菌
となし、ユニットまたは数単位の容器、例えば密封した
アンプルまたは密封したバイアルの形で提供される。

次の点を理解すべきである。すなわち上記した成分に加
えて、本発明の調剤は、１種またはそれ以上の希釈剤、
緩衝剤、香料　、結合剤、表面活性剤、シックナー、潤
滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）およびその他の同様も
のの如き添加成分を含んでいる。

人間に使う場合も、家畜に使う場合にも、例えば特定し
て上記した如く、この調剤が単位投与形式で提供される
場合には、単位製剤は各々約１１００ＩＬから約１００
　ｍｇまでの範囲の量で活性成分（上に定義したように
）を含有する。

この発明を更に次の例示的技術態様によって説明しよう
。

クローン化するための細胞は、Ｃ５７Ｂｌ／ｅＴＬ＋マ
ウスから取得した（Ｅ、Ａ、Ｂｏｙｓｅから入手した）
。

ＢＡＬＢ／ｃのマウスの細胞を調製培養基を作るのに使
用した。ＢＡＬＢ／ｃ？ウスはＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙから手に入れた。

細胞系を開始させるのに使用した方法はＮａｂｅ　１等
、廁ＩＩ　２３：１９　（１９８１）に記載された方法
セあって、これはここに参考として採用されている。

細胞をクローン化し、維持するのに使用した調製培養基
は次の様に調製した：　　Ｇｅｒｒｏｔｉｎｉ等。

虹ハＬ框し１４０ニア０３　（１９７４）の方法に従っ
てアルギニンおよびアスパラギンを、補充して、Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉａ　　（ＤＭ
Ｅ）　　（Ｇ　Ｉ　ＢＣｏ　）を更に修正したもので、
この記録の内容はここに参考にして採用されており、こ
れに更に０．ＯＯｅｇ／ｌの葉酸、ピルビン酸ナトリウ
ムおよび必須ビタミンを補充した。この培養基は、今後
、修正ＤＭＥまたはＭＤＭＥと略す。

ＢＡＬＢ／Ｃのひ臓細胞（５ｘ　１０　ｍｌ）を３７℃
で４５時間４０１のＭＯ肚の中で培養した。このＭＩＩ
ＮＨには更に１０２炭酸ガスを含む雰囲気を持つ組織培
養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ　３０２
４０）中で５ＸｌＯＭ２−マルカブトエタノール（２−
ＭＥ　）、２ｍＭ追加グルタミン、４ｚ加加熱非活性光
子ウシ血清（Ｆｅ２）および２ｍｇ／ｍ１ｃｙ）　Ｃｏ
ｎＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｂｒｉｎｇ社製）を
添加してあった。この培養液の上澄液を０．２０ｍ　Ｎ
ａｌｇｅｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒｔ’濾過し、調節した培地
（ＣＭ　）とした。

細胞は゛°完全調節培地”（ＣＣＭ　）中で生育し、こ
の培地は、５０％ＣＭと５０％ＭＤＭＥを組み合わせて
作られており、更に、５Ｘ１０　　Ｍ２−ＭＥ、２ｍＭ
新鮮グルタミンおよび十分な量の追加ＦＣ３が添加され
ていたので、Ｆｅ２の最終的濃度は全容積の１０％とな
った。細胞濃度は０．５と３×１０５細胞／ｓ＋１の間
に保持され、１日置きに新鮮ＣＣＭ（約１＝４）が培地
に添加された。細胞培地は抗生物質の無い状態に維持さ
れ、Ｈａｙｂｌｉｃｋ。

“　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　　ｆｏ
ｒ　　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　　Ｉｎｆｅｃ−ｔｉｏｎ
ｓ　”　、　Ｋｒ１ｒｅ等、　（Ｅｄ、　）　Ｔｉ５ｓ
ｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅユＭｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａ　
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（Ａｃａｄｅ＋ｓｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ。

Ｎ、Ｙ、　１９７３　）に従って１周期的にマイクロプ
ラズマ汚染について検査した。これの記載内容はここに
参考として採用する。

次のようなりローン化方法が使用された。細胞を最終想
定濃度が１００．１０．１およびｌ細胞１つぼ（ｗｅｌ
ｌ　）となるように微小つぼ（Ｆａｌｃｏｎ　ｐｌａｓ
ｔｉｃｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅｓ　３０４０
　）の中に分けて入れた。

各々のつぼは０．１１のＣＣＭと各種の組織から採うた
照射した（　１５００ｒａｄ　）細胞単一層を含むこと
になった（最終濃度４〜８×１０　細胞１つぼ）。

培地には、つぼの中にコロニーが見えるようになるまで
（１０日間から３週間）２日に１度３０ＩＬｌのＣＣＭ
を補充した。しかし毛のっぽには最初は１００細胞１つ
ぼ以下しかなかった。

クローン化効果（ＣＥ）はポアソン分布に従って計算し
た（　Ｑｕｉｎｔａｎｓ　ａｎｄ　Ｌｅｆｋｏｗｉｔｓ
、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ　　３　：　３９２　（１９７３）（参
考として採用しである））。少なくとも８８のっぽをＣ
Ｅを計算するために使用した。陰性つぼの比率を初期細
胞数の対数の関数としてプロットした。ＣＥが５％超で
、頻度が３８％未満でコロニーから出て来たものを、３
細胞／１０つぼの割合に希釈した後、または単一細胞を
顕微鏡操作した後に２度生育させた単一細胞のことをク
ローンを命名した。初期の細胞コロニーの特質は安定し
ており、単一細胞顕微鏡操作または再希釈して得たコロ
ニーから採取したクローン会コロニーの特質と一致し、
１２種類以上の細胞のコロニーについて別々に試験した
結果は、各クローンから採取した３−１Ｏの娘クローン
は同一の細胞表面抗原、彫態を示し、最適の場合には、
親コロニーの機能を示した。

クローン化した後、細胞を照射した細胞単分子膜の非存
在下で生育させた。それをＣＣツＭ中に０．５Ｘ１０　　細胞／■ｌから３×ｌＯ細胞／
１の濃度に保った。クローン化した細胞を２１のっぽ（
Ｌｉｎｂｒｏ　ｐｌａｔｅｓ　、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ
　）に初めて移植し、　　ＣＣＭ　０．５１１１を加え
、　０．５Ｘ１Ｇ　　／■ｌから３テＸＩＯ／ｍｌに保った。細胞容量に応じて、細胞はＬｉ
ｎｂｒｏ皿、ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ　１００７，１０
０６．３００３　）または組織培養フラスコ（Ｆａｌｃ
ｏｎ　３０２４　）の中で、この濃度で保った。プラス
チック製の組織培養フラスコに軽く付着した細胞はペト
リ皿で生育させて回収を容易にさせた。１８〜４８時間
の間に全ての細胞について２回テストした。細胞の数は
ｌＯ超にもなった。

種々のクローンの表現型は、適当な抗体と共に培養し、
次に蛍光と結合して、フロー細胞蛍光測定法を用いて分
析することによって決定できる。

表現型は、また、適切な細胞表面抗原を表わすＢ６マウ
スの細胞の如きリンパ様細胞または適切な細胞表面抗原
の部位コードだけが異なるところのｃｏｎｇｅｎｉｃ（
ｃｏｎｇｅｎｅｒｉｃ　）近交「パートナ−」種の細胞
と共に培養することによってチェックができる。

１ａｂｅ１等、凹ｊＪ、Ｃｅ旦の２３巻、２５頁を参照
。

単クローン抗体、例えばＴｂｙ　１．２　、　Ｌｙｔ　
１．２およびＬｙｔ　２．２で特定さ′れる単クローン
抗体は市販さレテオリ、例えばＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｎｕｃｌｅａｒ社から入手でき、またその方法自体は
この方面では公知である。

クローンの１つであるＣＩ−１４１２／９はＴｈｙ、ｔ
′ＦＬｙｔ１２ｒ誘導物質ＪＴ細胞表現型を表わすＴ細
胞のクローン化コロニーである。このクローンハＣＣＭ
中で０．５Ｘ　１０’　／ｍｌ〜３Ｘ１０’　／ｍｌの
濃度で１５ケ月以上の連続培養によって生育した。

Ｂリンパ、の・Ｂリンパ球を得るために、ウサギのマウス拮抗性免疫グ
ロブリンをコーテングしたシャーレ上でＣ５？Ｂ１／８
−Ｆウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　）の辞職細胞懸濁液を培養した。Ｓ癒着性の細胞を捨
てた後、免疫グロブリン１細胞を激しくピペット・アウ
トして溶離した。溶離した。細胞は４℃で３５分間最適
の溶菌素生成条件にて単りローン性抗Ｌｙｔ、２．抗１
４２．２および抗’ｒｂｙ　１．２と共に培養し、洗浄
し、ウサギ補体と共に３７９Ｃで３０分追加して培養し
た。抗ＳＢＣプラーク形成細胞応答が無いことによって
、また、単りローン↑ｈ！抗１．２抗体の免疫蛍光によ
って、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの５ＲＢＣによる刺激の後には
残存Ｔ細胞が欠如していることが確認された。

クローン化したＴ細胞コロニーの−Ｌ澄液を刺激したも
のから取得した種々の増殖因子が、［ｉｎマ１ｔｒｏＪ
　Ｂ細胞の免疫グロブリン分泌をどれくらい刺激する能
力があるかは、非免疫給与者のＢ細胞の１〜ｌ０ＸＩＯ
に対してこの因子を最終容積が０．２１になるまで加え
ることによって決定した。抗５ＢＲＣＰＦＣまたは全Ｐ
ＦＣ（免疫グロブリン分泌プラーク形成細胞の全数）が
１ａｂｅ１等、阿上誌、２３江旦２６項に記載されてい
る溶血性プラーク定量法の変法によって計算される前に
。

これらの細胞培養液はｌ０８ＳＲＢＣで５日間刺激を受
けた。馬の赤血球（２５ａｌ　）をウサギ抗マウスＦ（
ａｂ′）２を用いて計算し、テストすべき細胞培養液の
２５ｎｌを１２　Ｘ　２５■腸の試験管で、特別均衡塩
類溶液（５ＢＳＳ　）にＳｅａ　−Ｐｌｅｑｕｅアガロ
−ス（Ｎａ１ｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　）を０．８％溶
かした溶液の４５０ｕｌと共に混合した。各試験管の内
容物を直ちに３０Ｘ１０腸腸のベトリ皿の中の１％Ｓｅ
ａ　Ｋｅ腸アガロース（Ｍａｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ
　）をゲルにしたもの２１の上に層状″に置いた。５％
の炭酸ガスを含む湿った雰囲気中に３７′″Ｃで１時間
放置後、ウサギ抗マウスＦ（ａｂ′）２展開血清（最終
希釈率は５ＢＳＳ中で０．０５■ｇ　／　ｍ　、１とな
る）をこのペトリ皿の上にピペットで載せた。　３７＠
Ｃで更に１時間放置後、この抗血清をデカントし、ｌ：
１０に希釈した同容量の再構成シタ％Ｊｌｔモ、ト補体
（０ｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉ。

Ｉｏｇｉｃａｌ　Ｃｏ、　）で置換した。溶解現象帯（
プラーク）を２時間後に数えた。全ての場合赤血球ＰＦ
Ｃと全ＰＦＣを同時３重培養して測定した。

Ｔ細胞を上記した方法でクローン化した’ｒｈｙ　ｌ＋
ｔ、ｙｔ−２＋コロニーを用いて測定した。このコロニ
ーの成長は全＜　ＩＬ−２に依存している。Ｂ細胞増殖
を高度に精製した休止Ｂ細胞を使用して測定した（これ
はＴ細胞を１〜３　Ｘ　１０４またはＢ細胞を２〜ＩＯ
Ｘ　１０４を平底マイクロ適宜用つぼの中で。

０．２＋ｓｌのＤｅｌｂｅｃｃｏ修正Ｅａｇｌｅｓ培地
、４％の加熱非活性ＦＣ３，５０ｕＭの２−ＭＥおよび
種々の割合の上澄液成分または種々の割合の細胞分裂誘
起物質成分を持った２膳にのグルタミンの中で培養した
。　２０−８８時間の培養後、３Ｈ−チミジンの９　、
５＋ｒＣｉを各つぼに加えた。４時間後、細胞に取り入
れられた放射活性をガラス繊維フィルター上の残留量で
測定した。

太ｌ東ｎＩｃ１豹１１１基クローン化細胞の放射標識上澄物質は次のようにして無
血清条件下で作った：増殖を続けているクローンの細胞
を６時間５ＲＢＣ（１０’）またはＣｏｎｃａｎａｖａ
ｌｉｎＡ（２ｎ　／ｍｌ　）と共に培養し、３回洗浄し
、無メチオ＝ンＲＰＭＩＩＢ４０培地（Ｒｏａ−ｗｅｌ
ｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
　）中に１０’／腸ｌの細胞濃度で培養し、この培地に
は２■にのグルタミン、５ｎｇ／ｍｌのヒトのＴｒａｎ
ａｆｅｒｒｉｎ　、　５Ｊ＋ｇ／ＩＩＩの牛のインシュ
リン、　２０ＪＪ／■１のａｐｒｏＨｎｉｎおよび１０
０　Ｊｌｃｉ　／　８１１７）３５３　　ｍｅｔｈｉｏ
ｎｉｎｅを補足した。３７℃で４時間後、標識のないｍ
ｅｔｈｉｏｎｉｎｅを添加して１ｍＮのｍｅｔｈｉｏｎ
ｉｎｅ最終濃度とした。細胞を遠心分離し、使用前の高
速遠心分離（１００，０００Ｘｇ　）に先立ち担体蛋白
質として上澄液に０．７■ｇ／■ｌノＯｖａｌｂｕｍｉ
ｎを加えた。

の操作は全て０〜４℃で実施した。遠心分離後Ｊクローン
化したＣ１．Ｌｙ　１＋２−７９の５０　ＸＩＯ’の細
胞から得た３５Ｓ−腸ｅｔｈｉｏｎｉｎｅで標識を付け
た上澄液を１０〜２０倍濃縮し、５％のグリセロール、
ｌＯＯ■にの塩化カリウムおよび０．５−のフェニルメ
チルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む燐酸塩
緩衝食塩液（ＰＢＳ　）へ透析した。同一じ緩衝液で平
衡状態にした５ｅｐｈａｄｅｘＧ−１００カラム（１０
０Ｘ２ｃ鵬）に濃縮した上澄液を通した。２層重ずつ集
めて、各フラクションを（１）ＴＣＡで沈殿する放射能
、（２）生物学的活性、すなわち、（ａ）精製Ｂ細胞に
よる免疫グロブリン分泌の刺激、（ｂ）Ｔ細胞が分割す
るように刺激する力（これはトリチウム・チミジンを結
合する能力によって測定できる）につきテストした。カ
ラムを次のような標準物質で均衡させた：牛の血清アル
ブミンＢＳ　Ａ　、　（８８，０００キロドルドア　）
、　Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　（’ＯＶＡ　　）　　、（４
５，０００キロドルトン）およびリゾチーム（ＬＹ　Ｓ
　）、　（１３，０００キロドルトン）。

その結果を図１に示す、この図から明らかな如く、約４
５〜５０キロドルトンの分子量を持つ１つの放射能標識
を持つ蛋白質がＢ細胞からの免疫グロブリンを誘導する
のに活性があり、Ｔ細胞の増殖を誘導するのに活性がな
い、約６０〜８８キロドルトンの分子量を持つもう１つ
の蛋白質は生物学的活性は両方とも持たない、１２〜３
０キロドルトンという広い分子量帯で溶出されたところ
の第三の蛋白質はＴ細胞増殖は活発に誘導したが、Ｂ細
胞による免疫グロブリンの分泌は誘導しなかった。

ポリアクリルアミド・ゲルＬｏｅｎｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　：　８８０
　（１９７０）ノ方法の変法を使用して、０．７膳■の
厚さの板状ゲルで電気泳動を実施した。既に記述した如
く内部的に標識を付けた上澄液標本部分（２５ｕｌ　）
を同量の１８０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＬ　（ｐＨ８，８
）２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、　４％ＳＤＳ、０．２％ブ
ロモフェノールブルーおよび２００■Ｘｄｉｔｈｉｏｔ
ｈｒｅｉｔｏｌと混合した。

１２．５％のアクリルアミドを含有するゲルを１２０ボ
ルトの一定電圧で電気泳動した。ゲルはＣｏｏ■ｄ−ｓ
ｓｉｅブルーで染色し、Ｌａ５ｋｅｙ等、　Ｅｕｒ、Ｊ
、Ｂｉｏｃｂｅｍ５６　：　３３５　（１１１７５）の
方法に従って蛍光写真法にかけ、乾燥し、ラジオオート
グラフにかけた。

図２はｃｔ、ｉ、ｙ　１２　／９の３種の異なる上澄液
についての諸結果を示す：（ａ）ＳＲＢＣと共に培養し
て刺激を受けたｃｔ、ｔ、ｙ　ｌ”２７９からの上澄液
、（ｂ）刺激を受けなかった、すなわち抗原または細胞
分裂誘起物質の非存在化で培養されたところのＣ１，ｔ
、ｙｔ”２−／８からの上澄液、および（ｃ、）　ｃａ
ｎ　−ｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａと共に培養することによ
って刺激を受けたところのＣ１，Ｌｙ　１２　／９から
採取した上澄液。図２で見る如く、刺激を受けない誘導
物質細胞によって合成された上澄ペプチドのＳＤＳポリ
アクリルアミド・ゲル電気泳動はいくつかの小さいバン
ドと共に、５つの大きい標識蛋白質のバンド（見掛けの
分子量が８０．４５．３３．３０および１８キロドルト
ン）を示した。正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ　）抗原（５Ｒ
ＢＣ）またはＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡの存在下では
、細胞は見掛は分子量が１４キロドルトンの新しいポリ
ペプチドを合成した。その他の内部的に標識を付けた蛋
白質は、抗原または細胞分裂誘起物質による刺激後も強
度の明らかな変化または再現性のある強度上の変化は示
さなかった。

刺激を受けたＣ１ルｙ１２／９細胞および刺激を受けな
いｃｔ、ｔ、ｙ　１”２−７１１細胞の上澄蛋白質にさ
らすことによって誘導されるＴ細胞およびＢ細胞の増殖
速度の増加量を、トリチウム処理チミジンのＴ細胞また
はＢ細胞による摂取速度の測定によって決定した。更に
、刺激を受けたＢ細胞および刺激を受けないＢ細胞を５
ＲＢＣにさらし、Ｂ細胞によって分泌された抗５ＲＢＣ
免疫グロブリンの量を検定した。ｃｔ、ｔｙ　１２〜／
８細胞からの上澄液はＲＰＭ　Ｉ　ＩＥ１４０培地中で
４時間１Ｇ’細胞／閤ｌを培養することによって調製し
た。この培地には、この細胞を６時間刺激剤なしに培養
するか、または２ｕｇ／ｍｌのＣａｎ　Ａ　、　１０Ｂ
細胞／１の５ＲＢＣまたは１０６細胞／１のニワトリの
赤血球（ＣＲＢＣ）（これは抗５ＲＢＣ分泌に対して間
違った抗原である）で刺激することの何れかの状態で６
時間培養した（そして２回洗浄する）直後に、５Ｊ１ｇ
／ｍｌのトランフェリンおよび５３Ｊｇ／ｍｌのインシ
ュリンが補充された。上澄液は５　Ｘ　１０’の細胞を
用いてＴ細胞またはＢ細胞増殖の誘導について、および
５　Ｘ　１０’の精製Ｂ細胞を用いて抗５ＲＢＣ分泌の
誘導についてテストを受けた。

（表　■）ゼロ　　　　　　４８５±１２５　　３．７５１±５４
３０Ｃｏｎ　Ａ　　　　１７，５４３±５２８　２１，
８７８±５２８　２，３９７±１１０ＳＲＢＣ：　　　
　　１３，３５３±３８１　２０，７７７±１．５４３
　３１０±１８ＣＲＢＣ４８７±３９５　　　　ｎ、ｄ
、　　　　　　９Ｂ±３５プラス　のコントロール（ＬＰＳ　　４　　ｍｃｇ／　ＪＬ　１）　　　　３６
２±１１０　　１３０．９８７±２．３４５　　４．２
３０±１３４（Ｃａｎ　Ａ　２ｕｇｓ／ｍｌ）　８，１
４８±８２　２，９８４±６４０　　　　　０製した１
４キロドルトンのポリペプチドの紋旅ｊ］ｕ１献直方１４キロドルトンのペプチドおよびその他の活性は、予
備的ＳＤＳポリアクリルアミド争ゲル上で分離した後、
類似の方法でテストした。１１膳のスライスを１０〜２
０キロドルトンに該当する部分の板状ゲルから切り取っ
た。各スライスの蛋白質を抽出し、ＴＣＡ沈殿性放射能
と機能とをテストした。予期した如く、１４キロドルト
ンおよび１８キロドルトン帯に該当するスライスだけが
抽出可能な蛋白質を持っていた（ＴＣＡ沈殿性放射能に
よって測定した）。ＳＤＳを除くために広範な透析を実
施した後、２ｎｇ／ｍｌのレベルでＴまたはＢ細胞増殖
の刺激について、ペプチドのテストをし　　。

た。Ｃｏｎ　ＡおよびＬＰＳが２ｎｇ／ｍｌおよび４ｎ
ｇ／ｍ１でコントロールとして使用された。これらの結
果を表ＩＩに示す。

（表■）利影ハＧＥで　−したペプチドの細胞培地に　　　　４３Ｈチミジンの摂取量　　Ｂ細胞
の免疫加えたペプチド　　エ履烟　　　　　旦癒廖　　
　グロブリン分泌Ω町Ｚｍｌ）　　　　　　　　　　　
　　　　　　建江Ｚ遣ｉ）ゼロ　　　　　　１８？±１
２　　　７，６３１±３６５３±１１４Ｋｄ　　　　、
２５，２７３±４３２　　　９３．３８？±４．３２１
　　　０１６Ｋｄ　　　　　　　　２８ｅ±２３　　　
　６，７２３±１．３２３　　　０１４Ｋｄ　＆　１６
Ｋｄ　　　２０，１０４±１．２３４　　８２．３４３
十Ｅｌ、００１　　　０コントロールＣａｎ　Ａ　　　　　２３，２４０ｆ：１，２３４　　
７．８５１＋６５２　　　　０Ｌ　Ｓ　Ｐ　　　　　　
　１９９±５５　　　１３０．７５９±３．２１１６．
５３１　−１＝４５６１４キロドルトンと標識を付けた
バンドに該当するスライスから抽出したペプチドは、Ｔ
およびＢ細胞の両者の増殖を誘導した。１８キロドルト
ンバンドからのペプチドは、最低限の細胞増殖を誘導し
、残余の１０〜２０キロドルトンスライスは分割を刺激
しなかった。６０キロドルトンバンドからの蛋白質は、
十分なＴＣＡ沈殿性放射能を含有したが、何れのタイプ
の細胞の分割をも刺激しなかった。１４キロドルトンの
各ペプチドの混合物はＴ又はＢ細胞の増殖に対して殆ど
加算的効果を示した。

精製１４キロドルトン拳ペプチドは、細胞増殖の強力な
誘導物質である。ＳＯ３含有ゲルから抽出した後でさえ
、１４キロドルトン・ペプチドは僅かｌｎｇ／ｍｌでリ
ンパ球増殖を誘導し、このようにしてペプチド・ホルモ
ンの場合に認めた濃度と同じような濃度で活性である。

同じような濃度で、１４キロドルトン・ペプチドが誘導
するＴまたはＢ細胞増殖速度は、実質上リンパ球細胞分
裂誘起物質、つまりｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡおよび
１ｉｐｏｐｏｌｙ　−５ａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ　
）による増殖の刺激と同一であった。しかしながら、Ｌ
ＰＳとは違って、１４キロドルトン・ペプチドは如何な
る濃度でもＢ細胞免疫グロブリン分泌を誘導しなかった
。

−′アミノ　・、　の。

２ｄゲルから得た１４キロドルトン−ポリペプチドをＣ
ａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＹで処理した。放出さ
れたアミノ酸を透析し、ポリアミド・シート上での２次
元クロマトグラフィーで同定した。２次元クロマトグラ
フィーの溶剤は蟻酸（１，５％　）で、次にベンゼンと
酢酸の９：ｌの混合物だった。得られたアミノ酸はアラ
ニン、フェニールアラニンおよびグリシンだった。１４
キロドルトン・ポリペプチドのＣ末端の割当てはＧｌｙ
−Ｐｈｅ−Ａｌａであると結論された。

今まで述べた如く、上述した実施例における５ｅｐｈａ
ｄｅｘＧ　−１００クロマトグラフイーによって得た５
０キロドルトンポリペプチドは、新規のＢ細胞増殖因子
であって、今までに分離もされておらず、記録もない。

これに加えて５ｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフイーでの
約３０キロドルトンの分子量に該当する因子は、Ｔ細胞
を誘導して増殖させるが、Ｂ細胞は誘導しないところの
生物学的活性を示した。

これらの２つの活性フラクションが１４キロドルトン増
殖因子に対して何等かの関係を持っているかどうかを決
定するために、３０キロドルトンおよび５０キロドルト
ン・フラクションを解離剤および／または解離的条件の
下で処理したり「解離的条件」という言葉は、蛋白質の
構成成分の性質を損なうことはなく、蛋白質をその主要
構成成分に分離するのに役立つような条件を意味する。

５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−１００カラムφフラクシヨン
３８〜４０（平均見掛は分子量５０キロドルトン）およ
びフラクション４８〜５０（平均見掛は分子量３０キロ
ドルトン）のアリクオツド（図１参照）を０．１％ＳＤ
Ｓ、６Ｍ尿素または０．０１ＭＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔ
ｂｒｉ　−ｅｔｏｌ　）の何れかで室温で３０分間処理
するか、または３７°Ｃで１２時間担体蛋白質なしで培
養した。培養後、サンプルを透析し、生物学的活性を定
量した。汚染した細胞を最小限に押えるために、２×１
０へのＢ細胞を増殖定量に使った。コントロールとして
、公知の細胞分裂誘起物質であるＣａｎ　ＡおよＩＬｐ
ｓをＴ細胞およびＢ細胞用にそれぞれ使用した。Ｃａｎ
　Ａが存在すれば、Ｔ細胞によって２３，２４０ｃｐ＋
ｓが結合した。ＬＰＳで刺激したＢ細胞は１３，０７５
ｃｐｍのＨ−チミジンを吸収し、１０８細胞当り２５０
の全ＰＥＣおよび１０’細胞当り１Ｂ５の５ＲＢＣＰＦ
Ｃを形成した。その結果を表■に示す。

６Ｍの尿素または０．１％ＳＤＳで３０キロドルトン・
フラクションの処理は、Ｔ細胞増殖を誘導するそれの能
力を顕著に変化させはしなかった。また、担体蛋白質の
非存在下で３７℃で１２時間このフラクションＢを培養
してもＴ細胞増殖を誘導するその能力を変化させなかっ
た。しかしながら、これらの解離処理は全て、３０キロ
ドルトン・フラクションが新たな活性を取得する結果と
なった：すなわち、この解離生成物は今度はＢ細胞のは
げしい増殖を刺激し、この増殖はＢ細胞分裂誘起物質Ｌ
ＰＳが誘導する増殖と等しいものだった。

５０キロドルトン・フラクションを同様に処理しても同
様な結果が得られた。３７℃で４時間の培養または０．
１％ＳＯ３を用いての培養は、Ｂ細胞を誘導して免疫グ
ロブリンを分泌するこのフラクションの能力を消失させ
たけれども、これらの処理は結果的にはＢ細胞に対して
は細胞分裂誘起活性を強化することになり、またＴ細胞
にとっては細胞分裂誘起活性の取得となった。

これをまとめてみれば、３０および５０キロドルト拳フ
ラクシヨンはＳＤＳでの処理後共通の活性を獲得した：
すなわち、それらはＴおよびＢ細胞の両者の増殖を刺激
した。解離に伴なうこの分割された機能に関与している
ペプチドの見掛けの分子量を決定するために、内部的に
標識を付けた５０キロドルトン・フラクションを再度ク
ロマトグラフにかけた。図３で分かる如く、今度はＴお
よびＢ細胞増殖活性が約１４キロドルトンの場所に一緒
に溶出されてきた。この図において、Ｔ細胞増殖に関す
る曲線は黒マルで示し、Ｂ細胞増殖に関する曲線は白マ
ルで示す、Ａの部分は５ＤＳ−処理した５０キロドルト
ン・フラクションについての結果を示し、Ｂの部分は、
５ＤＳ−処理した３０キロドルトン・フラクションにつ
いての結果を表わす。

（ｒム下な臼）Ｌ　″　往古−Ｆｌａｔ−Ｂｅｄ　ｌ５ｏｅｌｅｃｔｒ
ｉｃ５０キロドルトンおよび３０キロドルトン物質を更
に研究するために、それらを平板等電焦点法（Ｆｌａｔ
−Ｂｅｄ　　ｌ５ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎ
ｇ　）にかけた。

その方法はＬＫＢシステム（Ｌ　Ｋ　Ｂ　　ＩｎｓＬｒ
ｕｍｅ−ｎｔｓ社、　Ｒｏｃｋｖｌｌｅ、　Ｍｄ、　）
を用いた５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−７５の水平層で実施し
た。ＤＥＡＥ−セルロースから溶出した活性物質を透析
し蒸留水に対して）した後、その７６１をゲル皿に入れ
る前に、４ｍｌのＡｍｐｈｏｌｙｔｅｓ（ｐＨ３，５−
８）および４ｇｍのＵｌｔｒｏｄｅｘ（両方ともＬ　Ｋ
　Ｂ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を含む溶液に加え
た。この皿を冷却用のプレート（１０°Ｃ上に置き、６
４０ポルトの一定電圧で１８時間電気泳動させる。電気
泳動後、ゲルを３０の部分にスライスし、各々のスライ
スのｐＨを測定し、各スライドは、担体として０．０２
％の０マａｌｂｕ腸ｉｎを含む４１の燐酸塩緩衝塩類溶
液（ＰＢＳ　）で蛋白質を溶出する前に、５ｅｐｈａｄ
ｅｘＧ　−２５カラム（９Ｍ１ｃｍ）に通した。

等電焦点法は、特に５０キロドルトン蛋白質の成分を解
離するのに有益である。その理由は、蛋白質をＳＯ３を
使用して解離する時にＢ細胞の免疫グロブリン分泌活性
が破損されたが、等電焦点法で°はそのようなことはな
かったからである。５０キロドルトン・ペプチドについ
ての結果を図４に示す。

図４に示す如く、Ｂ細胞免疫グロブリン分泌は約６．０
の等電点を持つ内部的に標識を付けたペプチドによって
誘導された。ＴまたはＢ細胞増殖は約４．０の等電点を
持つ内部的に標識を付けたペプチドによって誘導された
。前者の内部的に標識を付けたペプチド（等電点６．０
）は５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４５キロドルトンの分子
量の１つのバンドとなった。一方では、後者のペプチド
（等電点４．０）は１４キロドルトンの分子量の１つの
バンドとなった。　５ｅｐｈａｄｅｘ分割後の３０キロ
ドルトンの分子量を持つペプチドを５ＤＳ−ＰＡＧＥス
ラブ・ゲルにかけた。この物質を繰り返し分析して、１
４キロドルトンと１８キロドルトンの分子量の、２つの
分かれたバンドが判明した。それらは約同量のＴＣＡ沈
殿性ｃｐ層を含有し、ゲル中の全ｃｐｓの６０〜７５％
以上を占めた。このバンドをゲルから溶出し、細胞分裂
誘起活性をテストした。１４キロドルトン・ペプチドは
ＴおよびＢ増殖を刺激し、一方では１８キロドルトンも
２５キロドルトン〜３５キロドルトンからのフラクショ
ンも検出できるような細胞分裂誘起活性を示さなかった
。　５ｅｐｈａｃｒｙｌクロマトグラフイーを終了した
３０キロドルトン・フラクションは、等電焦点法によっ
て分離した。

２２の異なったフラクションを細胞分裂誘起活性につい
てテストした。約３．９〜４．０の等電点を持つフラク
ションだけがＴおよびＢ細胞を刺激した。

細胞分裂誘起フラクションをＳＤＳポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動にかけるとｃｐ■の８５％が１４−１８
キロドルトンに集まった。

図５はｃ＋、ｔ、ｙ　１２　／９上澄フラクションの５
ＤＳ−ＰＡＧＥの密度計による操作の結果を示す＝（＾
）　５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−１００クロマトグラフイー
後の５０キロドルトン・フラクション；（Ｂ）ＩＥＦで
の５０キロドルトン物質の分離後の等電点６．０フラク
シ甘ン（図４参照　）；（Ｃ）ＩＥＦ下での分離後の５
０キロドルトン物質からの等電点礁、０フラクシＥｌ　
７　；　（Ｄ）　５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−１００クロマ
トグラフイー後の３０キロドルトン；（Ｅ）ＩＥＦでの
３０キロドルトン・フラクション分離後に得られた細胞
分裂誘起フラクション（等電点は約４．０　）。

子と　　との乳　　の増殖が求められる標識細胞に特異的である蛋白質と増殖
因子の結合の１つの実施例として、Ｔ細胞と結合する抗
体に１４キロドルトン増殖因子が結合できる０例えば、
使用する抗体は単クローン抗体であるＡｎｔｉ−ｈｕｍ
ａｎ　Ｉａ　（クローン７．２）でも良く、これはＮｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社から市販されて
おり、このものは末梢性血球Ｂ細胞に特異的に結合する
。従って抗体の８９％以上がＢ細胞に結合し、１％以下
が末梢性血球Ｔ細胞または胸腺中の細胞と結合する。

結合剤（メタキシリレンΦジイソシアネート）は先ず１
４キロドルトン増殖促進蛋白質と結合する。生成した蛋
白質を、最終濃度が０．１Ｍ１ｌ酸塩緩衝液中で約２０
〜２５＋ｍｇ／ｍｌの蛋白質となるような容量を十分に
取って、０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）および
０．３Ｍ硼酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）と共に水浴で混合
する。冷たい液状メタキシリレンφジイソシアネートを
、蛋白質１００會ｇ当りメタキシリレン・ジイソアネー
トを０．１■ｌの割合で加える。次にこの混合物を水浴
で４５分間マグネチック攪拌器ではげしくかきまぜ、３
０分間４℃、　１５００ｇで遠心分離する。上澄液は七
ノー置換生成物を含有し、抗体との４笥合に直接使用す
るのに適している。

燐酸塩緩衝塩類溶液（ｐＨ７，２）中の単クローンＡｎ
ｔｉ−ｈｕｊａｎ　　Ｉａ（クローン？、２．　ＮＥＮ
　）を、上述の第１段階で調整した上澄液と１４キロド
ルトン蛋白質の４部に対して抗体を約１部の重量比で混
合する。追加の硼酸塩緩衝液を約０．１．および約３．
５のｐｉを維持するように加える。これらの成分を　℃
で４部時間マグネチック撹拌器でゆっくりとかきまぜる
。

梠合しなかった抗体および／または蛋白質は適当な技術
、例えば電気泳動、シ目糖密度勾配遠心法（Ｓｕｃｒｏ
ｓｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎｔｒ
ｉｆｕｇａｔｉｏｎ）等で除去できる。上に述べた如く
、抱合抗体の満足できる抱合状態および不変の特異性は
免疫電気泳動によって確認できる。

得られた抱合体含有溶液は、細菌用フィルター（例えば
、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社などから入手できる）を通過
させることによって無菌化でき、使用前の相当長期にわ
たる期間低温（４°Ｃ）での貯蔵が可能である。

このようにして、この発明は多数のリンパ球増殖因子を
含みその１つは約１４キロドルトンの平均見掛は分子量
を持ち、それは約３．８〜４の等電点を有し、Ｔ細胞、
Ｂ細胞およびその他のタイプの細胞を刺激して増殖させ
るが、それ自身Ｂ細胞により免疫グロブリン分泌を促進
はしない、１４キロドルトン増殖因子は抗原の存在下で
誘導物質Ｔ細胞を培養し、上澄液から増殖因子を分離す
ることで生成できる。誘導物質Ｔ細胞を抗原または細胞
分裂誘起物質の存在下または非存在下においてｊ８養す
る時に上澄液中に生成される比較的大きいペプチドの解
離によって、１４キロドルトン増殖因子は生成できる。

更に、平均見掛は分子量がやく５０キロドルトンであり
、それ自体新規に発見されたＢ細胞に対する増殖因子を
含むようなそのような上澄液に見出される蛋白質からも
生成可能である。このＢ細胞増殖因子は、また、このよ
うに刺激を受けた上澄液から、例えばクロマトグラフィ
ー、電気泳動または等主焦点法などの分離技術によって
生成することができる。　１４キロドルトン増殖因子は
５０キロドルトンの分子量を持つ上澄液から別の蛋白質
をそれらの主要構成部分に解離することによって生成で
きる。比較的大きい蛋白質を解離条件下で解離剤と共に
処理するかまたは等主焦点法によってこのことは実施で
きる。

本発明の製品は、また、遺伝工学例えば希望する物質の
アミノ酸配列順序を少なくとも部分的に分析し、ＤＮＡ
またはＲＮＡ消息子を得るためにアミノ酸配列順序を利
用し、問題とする増殖因子を作っている遺伝因子を決定
するためにこの消息子を使用し、この遺伝因子を適当な
媒介者を使って適当なバクテリアまたはイーストに移し
、この遺伝因子およびその細菌的宿主を複製し、問題と
する増殖因子を発現させることによって、作ることがで
きる。このようにして出来るリンパ球増殖因子は上述し
た如く免疫不全を治療するのに使用できる。

ここに述べた特定的技術態様は単に例示的であると解釈
すべきであって、種々の変法がこの技術分野の有識者に
は自明である。これらの変法を網羅するために以下に特
許請求の範囲を述べる。

【図面の簡単な説明】

図１は、誘導物質Ｔ−細胞のクローン培養を刺激して得
た上澄液を溶離して５ｅｐｈａｄｅｘＧ　１００のカラ
ムに分別された種々の蛋白質を示すグラフであって、種
々のフラクションが、（ａ）　Ｂ−細胞からの免疫グロ
ブリン分泌をどれだけ誘導する効果があるか、（ｂ）　
Ｔ−細胞の増殖をどれだけ誘導する効果があるか、をト
リチウム・チミジンで賦形させて測定したものである。図２は、種々の液体の成分を示しているＳ　Ｄ　Ｓ　−
。ＰＡＧＥ電気泳動のコピーである。図３は、（Ａ）　５０キロドルトンの物質の成分を用い
て処理し、（Ｂ）　３０キロドルトンの物質の成分を用
いて処理した場合の、Ｔ−細胞増殖とＢ−細胞増殖のグ
ラフを示す。図４は、５０キロドルトンのポリペプチドを等電画に分
離した成分による等電点電気泳動、免疫グロブリン分泌
およびリンパ球刺激を示す。図５は、種々のフラクションおよび種々の物質の光学的
濃度スキャニングによる結果を示す１組のグラフである
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）哺乳動物の誘導物質Ｔリンパ球を分離し、この誘
導物質リンパ球を抗体または細胞分裂誘起物質と接触さ
せることによって増殖因子生成を促進し、この刺激を受
けたリンパ球が生成した物質から少なくとも１つの増殖
因子を分離することから成る、哺乳動物細胞用の増殖因
子を生成する方法。
（２）誘導物質リンパ球を羊の赤血球に接触させること
を特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（３）誘導物質リンパ球をコンカナバリン（Ｃｏｎ−ｃ
ａｎａｖａｌｉｎ）Ａに接触させることを特徴とする、
特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（４）刺激したリンパ球が生産した物質をクロマトグラ
フ的に分別することによって増殖因子を分離することを
特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（５）刺激したリンパ球が生産した物質を電気泳動法に
かけることによって増殖因子を分離することを特徴とす
る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（６）誘導物質Ｔリンパ球がクローン化したマウス誘導
物質Ｔリンパ球であることを特徴とする、特許請求の範
囲第１項に記載の方法。
（７）誘導物質Ｔリンパ球がクローンＣｌ．Ｌｙ１＾＋
２＾−／９の特性を有することを特徴とする、特許請求
の範囲第１項に記載の方法。
（８）刺激したリンパ球が生産した物質からの約５０キ
ロドルトンの分子量を持つ蛋白質を分離し、この蛋白質
を解離して約１４キロドルトンの見掛け分子量を持つ第
１番目の増殖因子と約４５キロドルトンの見掛けの分子
量を持つ第２番目の増殖因子を生成することを特徴とす
る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（９）第１番目の増殖因子を分離し、第２番目の増殖因
子を分離することを特徴とする、特許請求の範囲第８項
に記載の方法。
（１０）刺激したリンパ球が生産した物質から約３０キ
ロドルトンの分子量を持つ蛋白質を分離し、この３０キ
ロドルトンの蛋白質を解離させ、約１４キロドルトンの
分子量を持つ哺乳動物の細胞の増殖因子を生産すること
を特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（１１）特許請求の範囲第１項の方法に従って生産した
哺乳動物細胞増殖因子。
（１２）約１４キロドルトンの分子量を持つポリペプチ
ドからなり、その増殖因子がＴ細胞リンパ球およびＢ細
胞リンパ球の両者の増殖を刺激する機能を有することか
らなる、哺乳動物細胞の増殖因子。
（１３）当該増殖因子が、また、マスト細胞および繊維
芽細胞の増殖を刺激する機能も有することを特徴とする
、特許請求の範囲第１２項に記載の増殖因子。
（１４）増殖因子が約３．０〜４．０の等電点を有する
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１２項に記載の増
殖因子。
（１５）約５０キロドルトンの分子量を持つポリペプチ
ドから成り、Ｂ細胞リンパ球を刺激する機能を有するこ
とから成る、哺乳動物細胞増殖因子。
（１６）当該増殖因子がＢ細胞による免疫グロブリン分
泌を刺激する能力があることを特徴とする、特許請求の
範囲第１５項に記載の増殖因子。
（１７）増殖因子が約６．０の等電点を有することを特
徴とする、特許請求の範囲第１５項に記載のリンパ球増
殖因子。
（１８）哺乳動物細胞増殖因子および製薬的に受け入れ
ることができる担体からなり、その増殖因子が（ａ）約
１４キロドルトンの分子量を持ち、Ｂリンパ球およびＴ
リンパ球の両方の増殖を刺激する機能を持つ蛋白質、（
ｂ）約５０キロドルトンの見掛けの分子量を持ち、Ｂリ
ンパ球の増殖を刺激する機能を持つ蛋白質、または（ｃ
）約４５キロドルトンの見掛けの平均分子量を持ち、マ
スト細胞の増殖を刺激する機能を持つ増殖因子から成る
、製薬的組成物。
（１９）増殖因子が約１００μｇから１００ｍｇ単位投
与量であることを特徴とする、特許請求の範囲第１８項
に記載の製薬的組成物。
（２０）増殖因子が治療すべき細胞と結合するところの
標的物質に付着していることを特徴とする、特許請求の
範囲第１８項に記載の製薬的組成物。
（２１）標的物質が治療すべき細胞と結合するところの
抗体であることを特徴とする、特許請求の範囲第２０項
に記載の製薬的組成物。
（２２）細胞を哺乳動物増殖因子と接触させ、その増殖
因子は（ａ）約１４キロドルトンの分子量を持ち、また
ＢおよびＴリンパ球の増殖を刺激する機能を有する蛋白
質、（ｂ）約５０キロドルトンの分子量を持ち、またＢ
リンパ球の増殖を刺激する機能を有する蛋白質、または
（ｃ）約４５キロドルトンの見掛け上の平均分子量を持
ち、またマスト細胞の増殖を刺激する機能を有する増殖
因子からなる、細胞の増殖を増進する方法。
（２３）増殖因子が治療すべき細胞と結合するところの
標的物質に付着していることを特徴とする、特許請求の
範囲第２２項に記載の方法。
（２４）標的物質が治療すべき細胞と結合するところの
抗体であることを特徴とする、特許請求の範囲第２３項
に記載の方法。