UA74128C2 - Способи лікування, що базуються на стимуляції проліферації стовбурових клітин за допомогою фрагментів гемоглобінового ланцюга (варіанти) - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способів лікування, що базуються на стимулюванні проліферації стовбурових клітин пептидами, що являють собою фрагменти альфа-, бета-ланцюгів гемоглобіну людини (INPROL).

Description

Опис винаходу

Цей винахід має відношення до використання модуляторів проліферації стовбурових клітин для регулювання 2 мітотичного циклу стовбурових клітин при лікуванні людей та тварин від автоїмунних захворювань, старіння, рак/, мієлодисплазії передлейкозу, лейкозу, псоріазу, синдрому набутого імунодефіциту (СНІД), мієлодиспластичних синдромів, гіпопластичної анемії або інших захворювань, у тому числі, гіпер- або гіпопроліферативних станів, а також до застосування таких сполук для аналгезії. Цей винахід також має відношення до способу лікування людей або тварин, яким призначено або яких було піддано обробці 70 хіміотерапевтичними речовинами, іншими речовинами, які пошкоджують стовбурові клітини, які знаходяться у стані мітотичної активності, або радідсактивному опроміненню та для захисту проти таких речовин під час обробок ех мімо. і, нарешті, цей винахід має відношення до поліпшення підтримки та розмноження культур стовбурових клітин для авто- та алотрансплантаційних процедур або для переносу генів, а також до обробок іп мімо для поліпшення таких процедур. 12 Більшість клітин на термінальній стадії диференціювання у відновлювальних системах є короткоіснуючими і повинні бути безперервно замінюваними впродовж їх строку існування. Наприклад, клітини крові походять від самовідновлювальної популяції поліпотентних гемопоетичних стовбурових клітин (НС). Гемопоетичні стовбурові клітини є субпопуляцією гемопоетичних клітин. Гемопоетичні клітини можна одержати, наприклад, з кісткового мозку, крові пупкового канатику або периферичної крові (немобілізованої або мобілізованої за допомогою такого агенту, як -С5Е (гранулоцитарний колонієстимулювальний фактор); до гемопоетичних клітин належить популяція стовбурових клітин, клітини- попередники, диференційовані клітини, А-клітини, стромальні клітини та інші клітини, які вносять свій вклад до середовища, яке є необхідним для продукування зрілих клітин крові. Гемопоетичні клітини-попередники представляють собою субпопуляцію стовбурових клітин, які є більш обмеженими щодо своєї здатності до розвитку. Клітини-попередники є здатними до диференціювання с тільки за одним або двома напрямками (наприклад, ВРО-Е (еритроїдна бурстутворювальна одиниця (БУОЕ))та (3

СРЦИ-Е (колонієутворювальна одиниця еритроцитів (КУОЕ)), які забезпечують утворення лише еритроцитів або

СРО-ОМ (гранулоцитарна-макрофагальна колонієутворювальна одиниця (КУО-ГМ)), які забезпечують утворення гранулоцитів та макрофагів), у той час, як стовбурові клітини (наприклад, СРО-МІХ (колонієутворювальна одиниця змішаної культури клітин (КУО-ЗК)) та СЕРО-ЗЕММ (колонієутворювальна одиниця со гранулоцитів-еритроцитіз макрофагів-мегакаріоцитів (КУО-ГЕММ)) можуть утворювати численні напрямки с диференціювання та/або інші стовбурові клітини. Оскільки гемопоетичні стовбурові клітини є необхідними для розвитку усіх зрілих клітин гемопоетичної та імунної систем, їх виживаність є суттєвою для повторного -- відтворення повністю функціональної системи захисту хазяїна у суб'єктів, яких було піддано лікуванню «І хіміотерапевтичними або іншими засобами. 3о Продукування гемопоетичних клітин регулюється цілою низкою факторів, які стимулюють ріст та в диференціювання гемопоетичних клітин, причому деякі з них, наприклад, еритропоетин, ОМ-С5Е (гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулювальний фактор) та 5-С5Е, застосовуються зараз у клінічній практиці. Однією частиною контрольної сітки, яку не було піддано екстенсивному характеризуванню, однак, є « фізіологічний механізм, який контролює статус мітотичної активності стовбурових клітин (Івз (Еамевз) та інші, З 50 ІВІсод 78: 110-117, 1991; Лорд (Гога) у Біет СеїЇз (видавець К.С. Поттен (С.5. РоЦеп), стор. 401-22, 1997 с (видавництво Асадетіс Ргевзз, Нью-Йорк).

Із» У попередніх дослідженнях Лорд та співробітники продемонстрували існування розчинних білкових факторів у нормальних та регенерованих екстрактах кісткового мозку, які можуть пригнічувати або стимулювати проліферацію стовбурових клітин |див. огляд у: Лорд та Райт (МУгідНО, Віосд СеїЇз 6: 581-593, 1980; Райт та

Лорімор (І огітоге), СеїІ Тізвце Кіпеї 20: 191-203, 1987; Маршалл (Магзпаї!) та Лорд, Іпїі Кем. Суї. 167: і 185-261, 1996). Ці активні продукти було позначено, як інгібітор стовбурових клітин (ЗСІ) та стимулятор «» стовбурових клітин (ЗС5), відповідно.

До сього часу з екстрактів кісткового мозку, одержаних, як описано Лордом та іншими (оглядові статті, - посилання на які зроблено перед тим), не було очищено молекул, які відповідали б характеристикам 5С5. ка 20 Очищення ЗС5 або ЗСІ з первинних джерел не було здійснено внаслідок труднощів, пов'язаних з проведенням випробувань іп мімо, які потребують великої кількості опромінених мишей. У намаганні перебороти згадані со проблеми, Прагнелл (Ргадпеїї) та співробітники розробили пробу іп мімо для визначення первинних гемопоетичнкх клітин (СРО-А (колонієутворювальна одиниця стовбурових клітин крові)) та відібрали лінії клітин, як джерело пригнічувальної активності |див., Грехем (Стапат) та інші, Маїшге 344: 442-444, 1990). У 52 попередніх дослідженнях макрофаги було ідентифіковано, як можливі джерела ЗСІ |Лорд та інші, Віоса СеїЇв 6:

ГФ) 581-593, 1980), та відібрано лінію клітин макрофагів мишей 774.2 (Грехем та інші, Майшге 344:442-444, 1990).

Кондиціоноване середовище з цієї лінії клітин було використано Грехемом та іншими для очищення; було о виділено пептид-інгібітор, який виявився ідентичним до попередньо описаного цитокіну-макрофагального медіатора алергічного запалення 1-альфа (МІР-ТА). Було клоновано рецептори для МІР-1А; подібно іншим 60 хемокінетичним рецепторам, згадані рецептори МІР-1А є рецепторами сьомого трансмембранного домену (або "б-пов'язаними" рецепторами), з'єднаними з білками, які зв'язують гуаніновий нуклеотид (СТР), С пригнічувального підкласу ("5/) (огляд наведено у Мурфі |Митгрпу), СуюКіпе 5 Сгомлй Расіог Кеум., 7: 47-64, 1996). Позначення "пригнічувальний" відносно підкласу | вказує на його пригнічувальний вплив на аденілатциклазу.

МІР-ЯТА було виділено з лінії клітин, а не з первинного матеріалу. У той час, як Грехем та інші бо спостерігали, що антитіла до МІР-1ТА анулювали активність неочищеного екстракту кісткового мозку, інші дослідники продемонстрували важливість інших пригнічувальних активних продуктів. Наприклад, Грехем та інші

ЇМ. Ехр. Меа., 178: 925-32, 1993| висловили припущення щодо того, що головним інгібітором гемопоетичних стовбурових клітин є ТОЕВ (трансформувальний фактор росту), а не МІР-1А. Додатково, Івз та інші |РМА5, 90: 12015-19, 1993| висловили припущення щодо того, що як МІР-1А, так і ТОЕВ, є присутніми у нормальному кістковому мозку на субоптимальних рівнях і що пригнічення вимагає синергізму між двома згаданими факторами.

Нещодавно були одержані миші, ген МІР-ТА у яких було видалено шляхом гомологічної рекомбінації ІКук (СооК) та інші, Зсіепсе 269: 1583-5, 1995)|. У таких мишей не спостерігається явного розладу гемопоетичної 7/0 бистеми, що ставило б під сумнів роль МІР-ІА, як фізіологічного регулятору мітотичної активноегі стовбурових клітин за нормальних гомеостатичних умов. Подібним же чином, незважаючи на те, що трансформувальний фактор росту бета (ТОЕВ) також має пригнічувальний вплив на стовбурові клітини, тривалий період часу, якого потребують стовбурові клітини для відповіді на цей цитокін, дозволяє припустити, що він не є ендогенним фактором, присутнім у екстрактах кісткового мозку; додатково, нейтралізуючі антитіла до ТОЕВ не ліквідують /5 активності ЗСІ у супернатантах кісткового мозку |Гемпсон (Натрзгоп) та інші, Ехр. Нетаї. 19: 245-249, 19911.

Інші дослідники описують додаткові інгібуючі фактори стовбурових клітин. Фріндел (Ргіпдеї) та співробітники виділили тетрапептид з кісткового мозку зародку великої рогатої худоби та з екстрактів печінки, який має інгібіторну активність відносно стовбурових клітин (Ленфант (Іепіап)) та інші, РМА5, 86: 779-782, 1989). Пауковіц (РашйКкоміїв) та інші |Сапсег Кев. 50: 328-332, 1990| визначили характеристики пентапептиду, 2о який, у своїй мономерній формі, є інгібітором, а у своїй димерній формі - стимулятором мітотичної активності стовбурових клітин. Інші фактори також було заявлено, як інгібітори у різних системах іп міїго |див., Райт та

Прагнелл у Вайіегез Сіїпісаї Наетаїйоіоем. том 5, стор.723-39, 1992 (Ваййеге Тіпада|І, Париж); Маршалл та

Лорд, Іпі. Кеу. Суї. 167: 185-261, 1996).

Цирлова (Тзупіома) та інші, авторське свідоцтво СРСР Мо1561261, розкриває процес очищення |інгібітору с ов проліферації стовбурових клітин.

У міжнародних заявках УУО 94/22915 та М/О 96/10634, які знаходяться у спільному посіданні, розкривається (8) інгібітор проліферації стовбурових клітин, і, завдяки цьому, їх у повному обсязі включено до цього опису посиланням.

До сього часу жоден з цих факторів не було схвалено до клінічного використання. Існує, однак, со зо необхідність у ефективних інгібіторах стовбурових клітин. Головним токсичним ефектом, пов'язаним з хіміотерапією або променевою терапією, є знищення нормально проліферуючих клітин, наслідком чого може с бути супресія кісткового мозку або токсичний вплив на шлунково-кишковий тракт. Ефективний інгібітор «- стовбурових клітин забезпечить захист цих клітин та дозволить оптимізувати згадані схеми лікування. Подібно тому, як існує підтверджена потреба у різноманітних стимулювальних цитокінах (наприклад, таких цитокінах, як « з5 Цінтерлейкін)-1ї, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 0-17, 0-13, 1-14, 01-15, 9-С5Р, ОМ-О5Е, вк еритропоетин, тромбопоетин, фактор стовбурових клітин, ліганд ЯК2ЛИЗ і т.п., які стимулюють мітотичну активність гемопоетичних клітин) у залежності від клінічної ситуації, також, можливо, з'явиться необхідність і у різноманітних інгібуючих факторах для задоволення різних клінічних потреб.

Додатково, існує необхідність у швидкому обертанні (реверсуванні) напрямку активності такого інгібітору. «

Попередні дослідження Лорда та інших (оглядові роботи, посилання на які було зроблено перед тим) з с продемонстрували, що інгібіторна активність може бути реверсована шляхом додання стимулювального активного продукту. Незважаючи на те, що було ідентифіковано різноманітні стимулювальні цитокіни ;» стовбурових клітин (див. перед тим), жоден з них не був продемонстрований, як такий активний продукт, опис якого наведено Лордом та співробітниками, що є присутнім у екстрактах кісткового мозку або здатним до реверсування активності інгібітору. -І Гемопоетичні клітини-попередники та стовбурові клітини у нормальних дорослих людей знаходяться, головним чином, у кістковому мозку. За певних умов, наприклад, під час хіміотерапії або лікування цитокінами, пи наприклад, (-С5Е, значна кількість згаданих клітин-попередників та стовбурових клітин виходить до - периферичної крові. Цей процес називають "мобілізацією" (огляд у Сіммонс (Зіттопв) та інші, Зіет СеїЇв 12 (додаток 1): 187-202, 1994; Шединг (Зспедіпо) та інші, Зіет СеїЇв 12 (додаток 1): 203-11, 1994; Манген ю (Мапдап), Зегп. Опсоіоду, 22: 202-9, 1995; Мултен (МооМеп), Зет. Опсоіоду, 22: 271-90, 1995). Нещодавно с опубліковані дані дозволяють зробити припущення, що переважна більшість мобілізованих клітин-попередників не відіграє активної ролі у мітотичному циклі (|Роберте (Кобрегіз) та Меткалф (Меїса!Ю), Віоса, 86: 1600-, 1995; Донахью (Юопапйце) та інші, Віоса, 87: 1644-, 1996; Зігерт (біедег) та Серке (Зегке), Вопе Маїтомжм

Тгапв., 17: 467-, 1996; Учіда (Оспіда) та інші, Віоса 89: 465-72, 1997).

Гемоглобін є висококонсервативним тетрамерним білком, молекулярна маса якого дорівнює, приблизно, 64 (Ф) 000 Дальтон. Він складається з двох альфа- та двох бета-ланцюгів. Кожен зі згаданих ланцюгів зв'язує одну ка молекулу гему (феропротопорфірину ІХ) залізовміщувальної простетичної групи. Альфа- та бета-ланцюги хребетних, можливо, були утворені з одного предкового гену, який подвоївся з наступною дивергенцією; два бо ланцюги зберігають значний рівень ідентичності послідовностей як між собою, так і між різними хребетними (див. Фіг.16А). У людини, альфа-ланцюговий кластер на хромосомі 16 вміщує два альфа-гени (альфа 1 та альфа 2), які кодують ідентичні поліпептиди, а також гени, які кодують інші альфаподібні ланцюги: дзета, тета та декілька нетранскрибованих псевдогенів (див. Фіг1б6В: кКДНК та амінокислотні послідовності альфа-ланцюгу людини). Бета-ланцюговий кластер на хромосомі 11 складається з одного бета-ланцюгового гену та декількох 65 бетаподібних генів: дельта, епсилон, б-гамма та А-гамма, а також, щонайменше, двох неекспресованих псевдогенів (див. Фіг.16С: кКДНК та амінокислотні послідовності бета ланцюгу людини).

Експресія цих генів змінюється впродовж розвитку. Під час гемопоезу у людини, який було екстенсивно охарактеризовано, еритробласти зародісу успішно синтезують тетрамери двох дзета-ланцюгів та двох епсилон-ланцюгів (Сомег І), двох альфа-ланцюгів та двох епсилон-ланцюгів (Сомег ІІ) або двох дзета-ланцюгів та двох гамма-ланцюгів (НЬ Рогіапа). Впродовж ембріогенезу, переважаюча форма представляє собою зародковий гемоглобін (НЬ ЕР), до складу якого входить два альфа-ланцюги та два гамма-ланцюги. Гемоглобін дорослої людини (два альфа- та два бета-ланцюги) починає синтезуватись впродовж зародкового періоду; під час народження 5095 гемоглобіну знаходиться у дорослій формі і перехід завершується, приблизно, на 6 місяці життя. Переважаюча більшість гемоглобіну (приблизно, 9790) у дорослої людини належить до різновиду з двома /о альфа- та двома бета-ланцюгами (Нь А) з існуванням незначних кількостей НЬ Е або дельта-ланцюгу (НЬ А»).

Для експресування рекомбінантних гемоглобінових ланцюгів у Е.соїї та дріжджів використовують декілька методів (наприклад, Джессен ()еззеп) та інші, Меїоаз Епл., 231: 347-364, 1994; Лукер (ІооКег) та інші,

Меїйподз Еп2., 231: 364-374, 1994; Огден (Одаеп) та інші, Меїйодвз Епл., 231: 374-390, 1994; Мартін де Льяно (Магііп де Шапо) та інші, Меїфйодвз Епл., 231: 364-374, 1994 Поки що виділений альфа-ланцюг людини /5 експресувати рекомбінантними методами у значних кількостях неможливо Інаприклад, Гофман (Нойптагп) та інші,

РМАЗ 87: 8521-25, 1990; Ернан (Негпап) та інші, Віоспет. 31: 8619-28, 19921. Очевидно, виділений альфа-ланцюг не набуває стійкої конформації і швидко деградує у Е.соїї. Наслідком коекспресії бета-ланцюгу з альфа-ланцюгом є підвищена експресія обох (Гофман та інші, та Ернан та інші, цитовані роботи). Незважаючи на те, що альфа-ланцюг було експресовано, як злитий білок з частиною бета-ланцюгу та сайтом розпізнавання 2о фактору Ха (Нагаї (Мадаї) та Торгерсен (Трогдегзеп), Мейфйоайв Епл., 231: 347-364, 1994), за цих умов він експресується, як нерозчинне тіло включення.

До складу як бета-ланцюгу, так і альфа-ланцюгу входять сайти зв'язування гаптоглобіну. Гаптоглобін є білком сироватки з надзвичайно високою спорідненістю до гемоглобіну |наприклад, Патнем (Риїпат) у Тпе

Ріавта Ргоїеіпв-БігисіШге. Еипсіоп апа Сепейс Сопіго! (видавець Патнем Ф.З. (Ршпат ЕМУ/.)), том 2, сч ов стор.1-49 (видавництво Асадетіс Ргезв, Нью-Йорк); Хванг (Нуапо) та Грір (Огеег), УВС, 255: 3038-3041, 1980).

Транспортування гаптоглобіну до печінки є головним катаболічним шляхом циркулювання гемоглобіну. Для і) гаптоглобіну існує один зв'язувальний сайт на альфа-ланцюзі (амінокислоти 121-127) та два на бета-ланцюзі (ділянки амінокислот 11-25 та 131-146) |Казім (Кагіт) та Атассі (Агазві), Віоспет. .). 197: 507-510, 1981;

Маккормік (МеСогтіскК) та Атассі, 9. Ргої. Спет. 9: 735-742, 1990). со зо Біологічно активні пептиди з опіатною активністю було одержано шляхом протеолітичного розщеплення гемоглобіну (огляд у Карелін (Кагеїїп) та інші, Реріїдез, 16: 693-697, 1995). Альфа-ланцюг гемоглобіну має с кислотолабільний сайт розщеплення між амінокислотами 94-95 |Шефер (Зпаепег), 9. Віої. Спет. 269: «- 29530-29536, 1994).

Креглер (Кгедієг) та інші (Ехр. Нетаї. 9: 11-21, 1981) встановили, що гемоглобін має підсилювальний вплив « зв НВ колонії клітин-попередників кісткового мозку мишей (СЕРО-С). Такі проби демонструють вплив на популяції ї- клітин-попередників СЕРОЮ-ЗМ та СРИО-М (макрофагальна колонієутворювальна одиниця), у протилежність до таких стовбурових клітин, як СРЕО-МІХ. Згадані автори спостерігали активність на обох виділених альфа- та бета-ланцюгах гемоглобіну. Цю активність було ліквідовано шляхом обробки М-етилмалеїмідом, що дало змогу

Креглеру та іншим припустити необхідність сульфгідрильних груп. Це спостереження, разом з фактом того, що « Сстимуляторна активність була стійкою до розщеплення трипсином, дозволили Креглеру та іншим зробити в с припущення про те, що за згадану активність відповідає С-кінцевий гідрофобний домен або "центральна" ділянка. Мокатташ (Модайази) та інші (Асіа. НаетаїйоіІ. 92: 182-186, 1994)| встановили, що рекомбінантний з гемоглобін має стимуляторний вплив на кількість клітин-попередників СЕО-Е, ВРО-Е та СЕО-ОМ, що співпадало зі спостереженнями відносно геміну. Меллер (Миегег) та інші (Віоса 86: 1974, 1995) встановили, що очищений гемоглобін дорослої людини стимулює клітини-попередники еритроцитів таким же самим чином, що і -І клітини-попередники геміну.

Петров (Реїгом) та інші ІВіозсіепсе Керогів 15: 1-14, 1995| розкрив застосування "неідентифікованої е мієлопептидної суміші" при лікуванні гемолітичної анемії у мишей лінії МУЛУ". Згадана суміш підвищувала - численність колоній селезінки, зокрема, колоній еритроїдного типу.

Гем та гемін було піддано екстенсивному дослідженню відносно їх впливу на гемопоез |див. оглядові роботи ді С. Саеса (5. базза) бЗетіпагз Нетаї. 25: 312-20, 1980 та Н. Абрахама (М. Абгапйат) та інших, Іпї. 9. Сеї (Че Сіопіпо, 9: 185-210, 1991). Гем є необхідним для визрівання еритробластів; гемін (хлорферопротопорфірин ІХ, тобто гем з додатковим іоном хлориду) іп міго підвищує проліферацію СРО-ЗЕММ, ВРО-Е та СРО-Е. Подібним же чином, гемін підвищує об'єм клітинного вмісту у культурах декстерівського типу. "Опіати" є речовинами з аналгетичними властивостями, подібними морфіну, головній активній речовині опію.

Опіати можуть бути невеликими органічними молекулами, такими як морфін, інші алкалоїди або синтетичні іФ) сполуки, або ендогенними пептидами, наприклад, енкефалінами, ендорфінами, динорфінами та їх синтетичними ко похідними. Ендогенні опіатні пептиди продукуються іп мімо з більших попередників -перед-проенкефаліну А у разі Ме та І ен-енкефалінів, перед-проопіомеланокортину у разі А, В та Г ендорфінів, та перед-продінорфіну у бо разі динорфінів А та В, А-неоендорфіну та В-неоендорфіну. На додаток до цього, пептиди з опіатною активністю можуть бути одержаними з некласичних джерел, наприклад, внаслідок протеолізу або гідролізу білків, наприклад, А або В казеїну, пшеничної клейковини, лактальбуміну, цитохромів або гемоглобіну, або з інших видів, наприклад, жаб'ячої шкіри (дерморфіни) або мозкової речовини надниркових залоз великої рогатої худоби.

Такі пептиди називають "екзорфінами", у протилежність до класичних ендорфінів; їх також називають атиповими 65 опіатними пептидами ІЗудру (іоцдгои) та інші, УВС 254: 2446-9, 1979; Кіріон (Оцігіоп) та Вайсс (МУеївз),

Реріідев 4: 445, 1983; Лукас (І оиКав) та інші, Віоспет. 22: 4567, 1983; Брантл (Вгапії), Еиг. У. Ріпагт. 106:

213-14, 1984; Брантл та інші, Еиг. У. Ріагт. 111: 293-4, 1985; Брантл та інші, Еиг. 9). Рпапт. 125: 309-10, 1986; Брантл та Нубер (Мецрег), ТІРЗ 7: 6-7, 1986; Гламста (СіІатвіа) та інші, ВВС 184: 1060-6, 1992;

Тешмахер (Тезспетаснпег), Напдароок Ехр. Рпагт. 104: 499-28, 1993; Петров та інші, Віозсіепсе Керогів 15: 1-14, 1995; Карелін та інші, Реріїдез 16: 693-7, 19951). Крім того, було також показано, що інші ендогенні пептиди, наприклад, сімейства Туг-МІЕ (фактор гальмування міграції)-1, також мають опіатну активність (Рід (Кеед) та інші, Мешгозсі. та Віорепам. Кему. 18: 519-25, 1994).

Опіати здійснюють свій вплив шляхом зв'язування ендогенних опіатних рецепторів трьох головних фармакологічних класів - мю, дельта та каппа. Рецептори, які представляють кожний фармакологічний клас, 70 було клоновано і показано, що це є ОС-зв'язані рецептори, які відносяться до с ; (огляд у: Різін (Кеїзіпе) та

Белл (Веї), ТІМ 16: 506-510, 1993; Уль (НІ) та інші, ТІМ 17: 89-93, 1994; Кнапп (Кпарр) та інші, РЕАЗЕВ ). 9: 516-525, 1995; Сато (Зап) та Мінамі (Міпаті), Рпагт. Тег. 68: 343-64, 1995; Кіфер (КіепПег), СеїЇ. Мої.

Меигобіої. 15: 615-635, 1995; Різін, Мешигорпагт. 34: 463-472, 1995; Закі (2акі) та інші, Апп. Кеу. РНагт.

Тохісої!., 36: 379-401, 1996).

Специфічні агоністи та антагоністи є доступними для рецептору кожного типу, наприклад, для мю рецепторів (які вибірково активізуються ОАМОО та РАЇ ДА і вибірково антагонізуються СТОР та налоксоназіном), для каппа рецепторів (які вибірково активізуються фумаратом СК 89696 та И-69593 і вибірково антагонізуються пог-біналторфіміну гідрохлоридом) та для дельта рецепторів (які вибірково активізуються ОАОІ Е та ОРОРЕ і вибірково антагонізуються натріндолом). На додаток до цього, існують антагоністи широкого спектру дії (наприклад, налоксон) та агоністи (наприклад, еторфін), які діють на рецептори усіх трьох підтипів.

Як класичні, так і атипові опіатні пептиди можуть піддаватись хімічним змінам або дериватизуватись для зміни їх специфічних властивостей зв'язування опіатних рецепторів (огляд у: Грабі (Нгибу) та Геріг (сенгід),

Мей. Кев. Кеу. 9: 343-401, 1989; Шіллер (ЗспШег), Ргод. Мед. Спет. 28: 301-40, 1991; Тешмахер, Напароок

Ехр. Рпагт. 104: 499-28, 1993; Напдроок ої Ехрегітепіа| Рпагтасоіооду, А. Герц (А. Негіг) (видавець), томи сч 104/Л та 104/ЛІ, 1993, видавництво Зргіпдег Мегіад, Берлін; Карелін та інші, Рерііде5, 16: 693-7, 1995). До прикладів належать похідні дерморфіну (наприклад, САЇ ОА) та енкефалінів (наприклад, ОАОГЕ, ОАМОО або і)

БАММЕ). Пептиди, які за нормальних умов не зв'язуються з опіатними рецепторами, наприклад, соматостатин, також можуть бути дериватизованими для демонстрування специфічного зв'язування опіатних рецепторів

Інаприклад, СТОР (Хокінс (Намж/Кіпз) та інші, )У. Рпагт. Ехр. Тпег. 248:73, 1989)). Аналоги можуть бути також со зо одержаними з алкалоїдів, наприклад, морфіну, зі зміненими властивостями зв'язування рецептору (наприклад, героїн, кодеїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, леваллорфан, гідрокодон, оксикодон, налорфін, с налоксон, налтрексон, бупренорфін, бутанорфанол та налбуфін); на додаток до цього, невеликі молекули, які «- структурно не пов'язані з морфіном, також можуть діяти на опіатні рецептори (наприклад, меперідин та представники того ж роду альфапродин, дифеноксилат та фентаніл) |див. НапароокК ої Ехрегітепіа| «

Рпагтасоіоду, цитовано перед тим; Те РІагтасоіодіса! Вазіз ої ТПегареціїсв Гудмана та Гілмана, 7 видання, ї-

А.Г. Гілман (А.О. Сітап), Л.С. Гудман (1.5. Сосдтап), Т.В. Ралл (Т.М. Каї) та Ф. Мурад (Р. Мигад) (видавці) 1985, компанія Мастійап Рибіїзпіпуд Со., Нью-Йоркі.

Ендогенні опіатні пептиди (енкефаліни, ендорфіни та динорфіни) мають консервативний М-кінцевий тетрапептид Туг-СіІу-сІу-Рпе, за яким ідуть Ге або Меї та будь-яка залишкова С-кінцева послідовність. «

Наслідком видалення гідроксильної групи на М-кінцевому Туг (що веде до появи М-кінцевого Ре) є повна втрата Ше) с активності відносно Меї-енкефаліну. Ці структурні дані ведуть до появи гіпотези "Інформація-адреса", за якою . М-кінцева "Інформація" передає біологічну активність, у той час, як С-кінцева "адреса" передає специфічність и?» та підсилену активність (Чавкін (Спамкіп) та Гольдштейн (Соїдвівіп), РМАБ 78: 6543-7, 1981). Екзорфіни, як правило, мають Туг-Рго, які заміщують М-кінцеві Туг-СІу класичних опіатних пептидів; проліновий залишок, як

Гадають, надає підвищену стійкість проти амінопептидазного розщеплення |Шіп (Зпірр) та інші, РМАЗ 86: 287-, -І 1989; Гламста та інші, ВВКС 184: 1060-6, 19921).

Нещодавно було клоновано сирітський рецептор ("ОКІ 1") внаслідок спорідненості його послідовності з ве опіатними рецепторами мю, дельта та каппа |Моллеро (МоїІегеаи) та інші, РЕВ5 341: 33-38, 1994; Фукада - (Гикида) та інші, РЕВ5 343: 42-46, 1994; Бунзов (Випг2ому) та інші, РЕВ5 347: 284-8, 1994; Чен (Спеп) та інші,

ГЕВЗ 347: 279-83, 1994; Ванг (УУапо) та інші, РЕВЗ 348: 75-79, 1994; Кейт (Кейй) та інші, Кед. Реріідез 54: де 143-4, 1994; Вік (МУісК) та інші, Мої. Вгаіп Кев. 27: 37-44, 1994; Хелфорд (Найога) та інші, 9У.Меигоіїттип. с 59: 91-101, 1995). Було клоновано ліганд для цього рецептору, який називають по-різному-ноціцептинсм або сирітським РО (у подальшому він буде називатись "ноціцептин"). Було показано, що він є гептадекапептидом, який було одержано з більшого попереднику |Муньє (Мешпіег) та інші, Маїшге 377: 532-535, 1995; РайншаіїщЩщ дв (Кеїпзспеїй) та інші, Зсіеєпсе 270: 792-794, 1995). Було показано, що він має проноціцептивні, гіпералгетичні функції іп мімо, у протилежність до класичних опіатів, які мають аналгетичні властивості. Ноціцептин має

Ф) РПпе-СіІу-СіІу-Рпем-кінцеву ділянку, у протилежність до Туг-СіІу-сСіІу-Рпем-кінцевої ділянки класичних опіатних ка пептидів, які обговорювались перед тим. У відповідності до вимоги присутності М-кінцевого Туг для опіатної активності у класичних опіатних пептидів, ноціцептин майже не демонструє або демонструє незначну во спорідненість до опіатних рецепторів мю, каппа або дельта. Подібним же чином, у опіатного антагоністу широкого спектру дії налоксону відсутня помітна спорідненість до ОКІ 1.

Спостерігалось, що енкефаліни мають вплив на гематопоез мишачих іп мімо за умов іммобілізаційного стресу (Гольдберг ((зоЇдрего) та інші, оїїа Віої. (Прага) 36: 319-331, 1990). Іец-енкефалін пригнічував, а тей -енкефалін стимулював гемопоез кісткового мозку. Ці ефекти були опосередковані, як гадають Гольдберг та 65 інші, внаслідок впливу на рівні глюкокортикоїдів та міграцію Т-лімфоцитів. Крізанак-Бенгез (Кгігапас-Вепде?г) та інші (ІВіотей. 5 РІагтасоїйег. 46: 367-43, 1992; Віотейд. 5 РНаптасоїйпег. 49: 27-31, 1995; Віотеай. «

РПпаптасоїнег. 50: 85-91, 1996) досліджували ефекти цих сполук іп міго. Попередня обробка кісткового мозку мишачих Меї- або Іец-енкефаліном або налоксоном впливала на кількість клітин-попередників ЗМ, що спостерігалась під час аналізу колоній. Цей ефект був дуже змінним і наслідком його була супресія, стимуляція або відсутність ефекту; додатково, була відсутня чітка залежність між дозою та реакцією. Ця змінність

Крізанаком-Бенгезом та іншими була віднесена на рахунок циркадних ритмів та А-клітин.

Нещодавно було продемонстровано, що миші, мю-опіатний рецептор у яких було видалено за допомогою гомологічної рекомбінації, мають підвищену кількість СРО-ЗМ, ВРО-Е та СРО-ЗЕММ на стегнову кістку.

Клітини-попередники селезінки та кісткового мозку у цих мишей з видаленим мю-рецептором мали більш високу 7/0 Мітотичну активність, у порівнянні до нормальних мишей. Не було визначено, чи були ці ефекти обумовлені прямим або опосередкованим впливом на стовбурові клітини кісткового мозку внаслідок відсутності мю-рецептору у цих тварин (Броксмейєр (Вгохтеуег") та інші, Віоса 88: 3З8а, 19971.

І. Хіміотерапія та радіотерапія раку

Наслідком продуктивного дослідження факторів стимулювання росту є клінічне використання цілого ряду 7/5 Згаданих факторів (еритропоетин, 5-СЗЕ, ЗМ-СЗЕ ї. тн). Ці фактори зменшили рівень захворюваності та смертності, пов'язаний з хіміотерапевтичною та променевою терапією. Додаткові клінічні благотворні наслідки для пацієнтів, які піддаються хіміотерапії або опроміненню, можуть бути реалізовані альтернативною стратегією блокування надходження стовбурових клітин до мітотичного циклу, завдяки чому забезпечується їх захист від побічних токсичних ефектів. Реверсування цього захисту забезпечить швидке відновлення функції кісткового мозку після хіміо- або радіотерапії.

І. Трансплантування кісткового мозку та стовбурових клітин, ех мімо розмноження стовбурових клітин та десенсибілізування пухлинних клітин

Трансплантація кісткового мозку (ВМТ) є придатним лікуванням для різноманітних гематологічних, автоіїмунних та злоякісних захворювань. У лікувальних методах, які застосовуються на цей час, використовують с об Гемопоетичні клітини, одержані з крові пупкового канатику, печінки зародку або з периферичної крові (немобілізованої або мобілізованої такими речовинами, як 5-С5ЗЕ або циклофосфамід), а також з кісткового і) мозку; стовбурові клітини можуть бути неочищеними, частково очищеними (наприклад, шляхом афінної очистки популяції СОЗ4ж) або високоочищеними (наприклад, за допомогою клітинного сортеру зі збудженням флуоресценції з використанням таких маркерів, як СОЗ34, СОЗ8 або родаміну). Маніпулювання гемопоетичними со зо клітинами ех мімо використовують зараз для розмноження первинних стовбурових клітин для одержання популяції, придатної для трансплантації. Оптимізація цієї процедури потребує: (1) достатньої кількості с стовбурових клітин, здатних до підтримки довгострокового відновлення гемопоезу; (2) вичерпання Т-лімфоцитів, «- які індукують реакцію "трансплантат проти хазяїна" та (3) відсутності залишкових злоякісних клітин. Ця процедура може бути оптимізована шляхом включення інгібітору(-ів) стовбурових клітин та/або стимулятору(-ів) « з5 стовбурових клітин. ча

Ефективність десенсибілізування гемопоетичних клітин цитотоксичними лікарськими засобами для винищення залишкових злоякісних клітин обмежена внаслідок токсичності цих сполук для нормальних гемопоетичних клітин" і особливо, стовбурових клітин. Існує необхідність у ефективному захисті нормальних « клітин під час десенсибілізування; захист може забезпечуватись шляхом вилучення стовбурових клітин з 70 мітотичного циклу за допомогою ефективного інгібітора. - с ПІ. Збирання периферичних стовбурових клітин ц Стовбурові клітини периферичної крові (РВЗС) мають ряд потенційних переваг над кістковим мозком для "» автологічної трансплантації. Пацієнти, позбавлені придатних ділянок для збору кісткового мозку внаслідок розповсюдження пухлини або попередньої радіотерапії, можуть піддаватись збиранню РВ5С. Застосування стовбурових клітин крові виключає необхідність загального анестезування та хірургічних процедур у пацієнтів, -І які погано їх переносять. Технологія аферезу, необхідна для збирання клітин крові, є ефективною та широкодоступною у більшості значних медичних центрів. Головними обмеженнями згаданого способу є низька е нормальна постійна частота стовбурових клітин у периферичній крові та їх високий мітотичний статус після - мобілізаційних процедур за допомогою лікарських засобів або факторів росту (наприклад, циклофосфаміду, -СЗЕ, фактору стовбурових клітин). Ефективний інгібітор стовбурових клітин буде корисним для повернення ді цих клітин до неактивного стану, що сприятиме тим самим запобіганню їх втрати внаслідок диференціації. (Че ІМ. Лікування гіперпроліферативних розладів.

Характерним для цілого ряду хвороб є гіперпроліферативний стан, при якому розрегульовані стовбурові клітини забезпечують перепродукування клітин на термінальній стадії диференціювання. До таких хвороб належать, але ними не обмежуються, псоріаз, при захворюванні яким відбувається перепродукування епідермальних клітин, стани, які передують утворенню злоякісних пухлин у шлунково-кишковому тракті, які

Ф, характеризуються появою кишкових поліпів, та синдром набутого імунодефіциту (СНІД), коли первинні ко стовбурові клітини не є інфікованими вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), але мають високу мітотичну активність, наслідком чого є вичерпання стовбурових клітин. Інгібітор стовбурових клітин буде корисним при бо лікуванні таких станів.

М. Лікування гіпопроліферативних розладів

Характерним для цілого ряду хвороб є гіпопроліферативний стан, при якому розрегульовані стовбурові клітини не забезпечують достатнього рівня продукування клітин на термінальній стадії диференціювання. До таких хворобливих станів належать мієлодиспластичні синдроми або апластична анемія, при яких 65 спостерігається недостатній рівень продукування клітин крові, та стани, пов'язані зі старінням, при яких спостерігається дефіцитне відновлення та заміщення клітин. Стимулятор стовбурових клітин буде корисним при лікуванні таких станів.

МІ. Перенос генів

Зараз у клінічних умовах використовують здатність до переносу генетичної інформації до гемопоетичних клітин. Гемопоетичні клітини є придатними мішенями для генної терапії, що обумовлено легким доступом, широким досвідом маніпулювання та лікування цієї тканини ех мімо та завдяки здатності клітин крові до проходження через тканини. На додаток до цього, стає можливою корекція певних генетичних дефектів людини шляхом введення функціонального гену до первинних стовбурових клітин гемопоетичної системи людини.

Існує декілька обмежень для введення генів до гемопоетичних клітин людини за допомогою векторів на 7/0 основі ретровірусів або фізичних способів переносу гену: (1) Низька частота стовбурових клітин у гемопоетичних тканинах обумовила необхідність розвитку високоефективних способів переносу генів; та (2) стовбурові клітини з підвищеною мітотичною активністю виявились більш вразливими до векторного інфікування, однак підвищення частоти інфікування шляхом стимулювання проліферації стовбурових клітин ростовими факторами викликає негативні наслідки щодо довгострокової експресії генів, оскільки клітини, до складу яких /5 Входять трансгени, примушуються до необоротної диференціації і втрачають здатність до самооновлення. Ці проблеми можна поліпшити шляхом використання інгібітору стовбурових клітин для запобігання диференціації та втраті здатності до самооновлення, та стимулятора стовбурових клітин для регулювання вступу стовбурових клітин до мітотичного циклу і, тим самим, полегшити перенос генів, опосередкований ретровірусами.

Цей винахід має відношення до сполук, до яких належать пептиди та поліпептиди, які є інгібіторами та/або стимуляторами проліферації стовбурових клітин (ІМРКОЇ. або опіатні сполуки), та їх використання.

Цей винахід включає інгібітор проліферації стовбурових клітин, який характеризується наступними властивостями: (а) Питома активність (ІСео), яка є меншою ніж або дорівнює 2Онг/мл у пробі на колонієутворювальні одиниці селезінки (СЕО-5) мишачих (див. Приклад 4), сч (Б) Молекулярна маса більша 10000 та менша 100000 Дальтон (визначена ультрафільтрацією), (с) Активний продукт, чутливий до розщеплення трипсином, і) (4) Більш гідрофобний, аніж МІР-1А або ТОЕВ та відокремлюється від обох за допомогою хроматографії з оберненою фазою (див. Приклад 12), (е) Біологічна активність зберігається після нагрівання впродовж однієї години при 37 С, 5592 або 7590 у со зо водному розчині, та ( Біологічна активність зберігається після осадження 195 хлористоводневою кислотою у ацетоні. сч

Цей винахід додатково характеризується та відрізняється від інших придатних інгібіторів стовбурових «-- клітин (наприклад, МІР-Т1а, ТОЕВ та різноманітних олігопептидів) його здатністю до забезпечення пригнічення у пробі іп міго після короткого передінкубаційного періоду (див. Приклад 5). в

До складу цього винаходу також входять фармацевтичні композиції, які включають ІМРКОЇ, для лікування ї- різноманітних розладів.

Цей винахід надає спосіб лікування суб'єкту, якому призначено введення засобу, здатного вбити або пошкодити стовбурові клітини, шляхом введення згаданому суб'єктові ефективної кількості композиції, яка пригнічує стовбурозі клітини. Стовбуровими клітинами, які захищаються цим способом, можуть бути « гемопоетичні стовбурові клітини, які звичайно є присутніми та діляться у кістковому мозку, крові пупкового шщ с канатику, печінці зародку або мобілізуються до периферичної крові. У той час, як більшість мобілізованих й стовбурових клітин, за результатами аналізу за допомогою клітинного сортеру зі збудженням флуоресценції «» (ЕГАС5), знаходиться у неактивному стані, поліпотентні стовбурозі клітини знаходяться у стані мітотичної активності та піддаються пригніченню за допомогою ІМРКОЇ у кількостях, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин. У альтернативному варіанті, стовбурові клітини можуть бути епітеліальними, розміщеними, -і наприклад, у кишках, на вкритій волоссям частині голові або на інших ділянках тіла або статевих клітин, які знаходяться у репродуктивних органах. Спосіб за цим винаходом може бути, у переважному варіанті, ть застосованим на людині, хоча цим способом передбачається також лікування тварин. Термін "суб'єкт" або - "пацієнт", який використано у цьому описі, означає тварину, наприклад, ссавця, у тому числі, людину.

Цей винахід надає також спосіб лікування суб'єкту з гіпопроліферацією стовбурових клітин шляхом введення де згаданому суб'єктові ефективної кількості композиції, яка стимулює стовбурові клітини. Згаданими стовбуровими со клітинами, які стимулюються цим способом, можуть бути гемопоетичні стовбурові клітини, які звичайно є присутніми у кістковому мозку, крові пупкового канатику, печінці зародку або мобілізуються до периферичної крові; згадані стовбурові клітини могли бути попередньо переведеними до неактивного стану шляхом

Застосування ІМРКОЇ. у кількостях, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин. ІМРКОГ. у кількостях, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин, надасть змогу стимулювання мітотичної активності стовбурових іФ) клітин за потребою, наприклад, після збирання стовбурових клітин для використання під час розмноження ех ко мімо або іп мімо після трансплантації та приживлення стовбурових клітин. У альтернативному варіанті, стовбурові клітини можуть бути епітеліальними, розміщеними, наприклад, у кишках, на вкритій волоссям частині бо голови або на інших. ділянках тіла або статевими клітинами, які знаходяться у репродуктивних органах.

За іншим аспектом, цей винахід надає спосіб захисту та відновлення гемопоетичної, імунної або іншої системи стовбурових клітин пацієнту, якого було піддано хіміотерапії, який включає введення згаданому пацієнтові ефективної кількості ІМРКОЇ, яка забезпечує пригнічення стовбурових клітин та/або стимулює одужання після хіміотерапії або променевої терапії шляхом введення ефективної кількості ІМРКОЇ, яка б5 забезпечує стимулювання стовбурових клітин.

За додатковим аспектом, цей винахід залучає спосіб допоміжного лікування раку будь-якого типу, у тому числі такого, який відрізняється твердими пухлинами (наприклад, грудної залози, товстої кишки, легень, тестикулярного, яєчнику, печінки, нирок, підшлункової залози, мозку, саркоми), шляхом введення пацієнту, який страждає на рак, ефективної кількості ІМРКОЇ, яка забезпечує пригнічення стовбурових клітин, для захисту Згаданих стовбурових клітин кісткового мозку, шлунково-кишкового тракту або інших органів від токсичного впливу хіміотерапії або променевої терапії та/"або стимулювання одужання після хіміотерапії або променевої терапії шляхом введення певних кількостей ІМРКОЇ,, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин.

За ще іншим аспектом, цей винахід залучає спосіб лікування лейкозу (наприклад, хронічного мієлогенного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, хронічного лімфолейкозу, гострого лімфолейкозу, мієломи, 7/0 лімфогранулематоза), який включає обробку гемопоетичних клітин, до складу яких входять проліферуючі лейкозні клітини, ефективною кількістю ІМРКОЇ. для пригнічення проліферації нормальних стовбурових клітин, та обробку кісткового мозку цитотоксичним засобом для знищення лейкозних клітин. Цей спосіб може бути підсилено наступною обробкою кісткового мозку іншими засобами, які стимулюють його проліферацію; наприклад, колонієстимулювальними факторами та/або ІМРКОЇ у кількостях, які стимулюють стовбурові клітини. /5 За одним з варіантів втілення цього винаходу, цей спосіб здійснюється іп мімо. У альтернативному варіанті, цей спосіб також є придатним для ех мімо десенсибілізування та розмноження гемопоетичних клітин для трансплантування.

Ще за одним додатковим аспектом, згаданий спосіб включає лікування суб'єкту, який має будь-який розлад, спричинений проліферацією стовбурових клітин. Такі розлади, наприклад, псоріаз, мієлодисплазія, деякі 2о автоїмунні захворювання, імунодепресія при старінні, мієлодиспластичний синдром, апластична анемія або вичерпання стовбурових клітин при СНІДІ, лікуються шляхом введення згаданому суб'єктові ефективної кількості

ІМРКОЇ. для пригнічення або стимулювання проліферації згаданих стовбурових клітин.

Цей винахід надає спосіб оборотного захисту стовбурових клітин від пошкодження цитотоксичним засобом, здатним убити або пошкодити стовбурові клітини. Згаданий спосіб залучає введення суб'єкту, якому призначена с обробка таким засобом, ефективної кількості ІМРКОЇ,, яка забезпечує пригнічення стовбурових клітин.

Цей винахід надає також спосіб оборотного стимулювання проліферації стовбурових клітин на етапі і) відновлення після хіміотерапії або променевої терапії. Згаданий спосіб залучає введення суб'єкту, якому призначена обробка таким засобом, ефективної кількості ІМРКОЇ, яка забезпечує стимулювання стовбурових клітин. со зо Цей винахід, крім того, надає:

Інгібітор, проліферації стовбурових клітин, виділений зі свинячого або іншого кісткового мозку за с допомогою наведених далі процедур (див. Приклад 12): «- (а) Екстрагування кісткового мозку та видалення подрібненої речовини шляхом фільтрування, (Б) Теплова обробка при 562С впродовж 40 хвилин з наступним охолодженням на льодяній бані, « (с) Видалення осаду шляхом центрифугування при 100009 впродовж З0 хвилин при 42С, ї- (4) Кислотне осадження шляхом додання супернатанту до 10 об'ємів перемішуваного ацетону, який має температуру таяння льоду, до складу якого входить 1 об'ємний 95 концентрованої хлористоводневої кислоти, та інкубування при 42С впродовж 16 годин, « (е) Виділення осаду шляхом центрифугування при 200009 впродовж ЗО хвилин при 4 «С та промиванням холодним ацетоном з наступним висушуванням, - с (9 Виділення хроматографуванням з оберненою фазою та контролювання активності шляхом пригнічення а утворення колоній клітинами кісткового мозку, попередньо обробленими 5-фторурацилом та інкубуванням у є» присутності мишачого І (інтерлейкіну)-3, а також абсорбуванням на 28Онм та електрофорезом у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (5205-РАСЕ).

Цей винахід також надає: -і Спосіб очищення інгібітора проліферації стовбурових клітин, який, по суті, є позбавленим інших білкових їх матеріалів, який включає етапи, наведені перед тим, а також докладно описані далі.

Цей винахід також надає: - Спосіб лікування людей або тварин, де інгібітор проліферації стовбурових клітин забезпечує полегшення 7 50 імуносупресії, спричиненої гіперпроліферацією стовбурових клітин.

Цей винахід також надає: 42) Спосіб лікування людей або тварин, де ІМРКОЇ у кількостях, які стимулюють стовбурові клітини, забезпечує полегшення супресії кісткового мозку, спричиненої гіпопроліферацією стовбурових клітин.

Цей винахід також надає:

Спосіб лікування людей або тварин, де згаданий інгібітор проліферації стовбурових клітин вводиться після о індукування проліферації стовбурових клітин шляхом піддання впливу цитотоксичного лікарського засобу або опромінювання. Стовбурові клітини, звичайно, знаходяться у неактивному стані, але стимулюються до вступу до їмо) мітотичного циклу після хіміотерапії. Це робить їх більш чутливими до другого введення хіміотерапевтичного засобу; згаданий спосіб захищає їх від цієї обробки. 6о0 Цей винахід також надає:

Спосіб лікування людей або тварин, де стимулятор проліферації стовбурових клітин (наприклад, ІМРКОЇГ. у кількостях, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин) вводиться перед або після ІМРКОЇ у кількостях, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин, для підсилення відновлення кісткового мозку. Кількості

ІМРКОЇ,, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин, уповільнюють швидкість проходження стовбуровими б5 клітинами мітотичного циклу та захищають їх від хіміотерапевтичних засобів та опромінювання; кількості

ІМРКОЇ, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин, реверсують згадане пригнічення та підсилюють відновлення кісткового мозку. У альтернативному варіанті, кількості ІМРКОЇ,, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин, можуть застосовуватись для підсилення відновлення функціонування кісткового мозку, у той час, як кількості, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин, використовуються на наступному етапі для повернення згаданих стовбурових клітин до неактивного стану після досягнення відновлення функціонування кісткового мозку.

Цей винахід також надає:

Спосіб лікування людей або тварин, де згаданий інгібітор проліферації стовбурових клітин вводять, як ад'ювант перед або під час вакцинації з метою підвищення імунної реакції. 70 Цей винахід також надає:

Спосіб лікування імунодефіциту у ссавців, який включає введення згаданому ссавцеві імуностимулювальної кількості ІМРКОЇ..

Цей винахід також надає:

Спосіб лікування болю у ссавця, який включає введення згаданому ссавцеві кількості ІМРКОЇ, яка індукує /5 аналгезію.

Цей винахід також надає:

Спосіб лікування людей або тварин, які одержують цитотоксичні лікарські засоби або піддаються променевій терапії, який включає введення ефективної кількості інгібітору проліферації стовбурових клітин для захисту стовбурових клітин від пошкодження.

Цей винахід також надає:

Спосіб лікування людей або тварин, які одержують цитотоксичні лікарські засоби або піддаються променевій терапії, який включає введення ефективної кількості ІМРКОЇ,, яка забезпечує стимулювання стовбурових клітин, для прискорення одужання після лікування.

Цей винахід включає також фармацевтичну композицію, до складу якої входить гемоглобін та сч фармацевтично прийнятний носій.

Цей винахід включає також фармацевтичну композицію, до складу якої входить (а) поліпептид, який вибрано і) з групи, до складу якої входить альфа-ланцюг гемоглобіну, бета-ланцюг гемоглобіну, гамма-ланцюг гемоглобіну, дельта-ланцюг гемоглобіну, епсилон-ланцюг гемоглобіну та дзета-ланцюг гемоглобіну, поліпептид, до складу якого входять амінокислоти 1-97 альфа-ланцюгу гемоглобіну людини ("пептид 1-97") та поліпептид, до складу со зо якого входять амінокислоти 1-94 альфа-ланцюгу гемоглобіну людини ("пептид 1-94") та (Б) фармацевтично прийнятний носій. Такі фармацевтичні композиції можуть складатись з одного поліпептиду, який обирають зі с згаданої групи, суміші поліпептидів, які обирають зі згаданої групи, або поліпептидів зі згаданої групи у «- формі димерів або полімерів з або без гему.

Цей винахід включає також пептиди, які мають наведені далі послідовності: «

РПпе-Рго-Нівз-РПе-Азвр-І еш-Зег-Нівз-Сїу- Зег-АІа-СІп-Ма! ("Пептид 43-55"), ї-

Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув де два Суз залишка об'єднуються дисульфідним зв'язком ("Циклічний пептид 43-55"),

Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув де два Суз залишки об'єднуються вуглецевим містком, «

Азр-Аїа-І ен-Тпг-Азп-АІа-МаІ-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Меї-Рго-Авп-Аїа-Ї ец-5ег-АЇІа ("Пептид 64-82") та з с пептид, до складу якого входять перші 97 М-кінцевих амінокислот альфа-гемоглобіну людини, як показано на

Фіг.16А. з До цього винаходу включено також білкові та пептидні послідовності, до складу яких входять модифіковані варіанти альфа-ланцюгу людини, які зберігають інгібіторні та/або стимуляторні властивості відносно стовбурових клітин. Такі модифікації включають, але не обмежуються, видалення або модифікацію С-кінцевого -І гідрофобного домену (наслідком чого є поліпшення характеристик розчинності) та/(або видалення або модифікацію домену зв'язування гаптоглобіну (наслідком чого є поліпшення фармакокінетичних властивостей). пи С-кінцевий гідрофобний домен альфа-гемоглобіну людини складається з ділянки від 98 амінокислоти - (фенілаланін) до 141 амінокислоти (аргінін) і включає 23 гідрофобні амінокислоти з загальної кількості 44.

Весь домен або одна або декілька з цих гідрофобних амінокислот (6 аланінів, 4 валіни, 8 лейцинів, 2 проліни ю та 3 фенілаланіни) можуть бути видалені делецією ("видалений делецією" С-кінцевий гідрофобний домен). У с альтернативному варіанті, одна або декілька з цих амінокислот може бути заміщена неполярною амінокислотою (наприклад, гліцином, серином, треоніном, цистеїном, тирозином, аспарагіном або глутаміном) ("заміщений"

С-кінцевий гідрофобний домен).

У іншому варіанті втілення використовують такі хімічні модифікації, наприклад, карбоксиметилювання, які послаблюють гідрофобні властивості цієї ділянки та підсилюють розчинність.

Ф) У іншому варіанті втілення, гідрофобні залишки у послідовності бета-гемоглобіну людини заміщаються ка відповідними гідрофільними ділянками. Наприклад, кожна з ділянок послідовності бета-гемоглобіну людини між амінокислотами 107 (гліцин) та 117 (гістидин) або між амінокислотами 130 (тирозин) та 139 (аспарагін) є бо Відносно гідрофільною і кожна з них або обидві можуть бути заміщеними еквівалентними гідрофобними ділянками альфа-гемоглобіну людини.

Домен зв'язування гаптоглобіну знаходиться у межах С-кінцевої гідрофобної ділянки і складається з амінокислот 121-127. Ця ділянка може бути видалена делецією у повному об'ємі або на цій ділянці тим же самим чином може бути видалена одна або декілька амінокислот ("видалений делецією" С-кінцевий домен зв'язування 65 гаптоглобіну). Ця ділянка або одна, або декілька амінокислот на цій ділянці можуть бути заміщеними іншими амінокислотами, наприклад, поліаланіном або полігліцином, або іншими амінокислотами, наслідком чого є усунення зв'язування поліпептиду з гаптоглобіном, однак, підтримка пригнічувальної активності відносно стовбурових клітин ("заміщений" С-кінцевий домен зв'язування гаптоглобіну).

Іншими варіантами втілення цього винаходу передбачаються відповідні модифікації бета-ланцюгу гемоглобіну (на С-кінцевій гідрофобній ділянці та/або на одному або обох доменах зв'язування гаптоглобіну (амінокислоти 11-25 та 136-146)) та відповідні модифікації дельта-, гамма-, епсилон- та/або дзета-ланцюгів гемоглобіну.

До цього винаходу включено також послідовності ДНК, які кодують вищезгадані пептиди, вектори, до складу яких входять згадані послідовності ДНК, та клітини-хазяї, до складу яких входять згадані вектори. Ці пептиди 7/0 Можуть бути синтезованими за допомогою стандартних хімічних способів (наприклад, твердофазним синтезом) або за допомогою рекомбінантних способів (з включенням систем злиття, наприклад, таких, у яких застосовується глутатіон-З-трансфераза |Д.Б. Сміт (О.В. тій) та К.С. Джонсон (К.5. доппвоп), Сепе 67: 31-40, 1988), тіоредоксин (Ла Валлі (Іа Маїйе) та інші, Віоїесппоіоду 11: 187-193, 1993 або убіквітин (Батт (Ви та інші, РМАЗ 86: 2540-4, 1989; Черні (Спегпеу) та інші, Віоспет. 30: 10420-7, 1991; Бейкер (Вакег) та інші, УВС 269: 25381-6, 1994; патенти США МоМо5132213; 5196321 та 5391490 та міжнародна заявка МО 91/17245). Кожну з цих статей, заявок та патентів включено до цього опису як посилання.

Цей винахід додатково включає спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який включає контактування гемопоетичнкх клітин зі сполукою, здатною до зв'язування опіатних рецепторів, у переважному варіанті, опіатних рецепторів підкласу мю. Цей винахід, додатково, включає спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який включає контактування гемопоетичних клітин зі сполукою, здатною до зв'язування рецепторів ноціцептину (наприклад, ОКІ 1). Цей винахід, додатково, включає спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який включає контактування гемопоетичних клітин зі сполукою, здатною до зо зв'язування "опіатоподібних" рецепторів.

Пептиди (які було названо "геморфінами") було виділено з гемоглобіну, який демонструє опіатну активність сч об Інаприклад, Брантл (Вгапії) та інші, Еиг. У. Рпагт. 125: 309-10, 1986; Девіс (Оамів) та інші, Реріїдев 10; 747-51, 1989; Гофман та інші, РМАЗ 87: 8521-25, 1990; Ернан та інші, Віоспет. 31: 8619-28, 1992; Карелін та (8) інші, Віосп. Віорпуз. Кев. Сотт. 202: 410-5, 1994; Жао (2Ппао) та інші, Апп. М.М. Асад. Зсіепсе 750: 452-8, 1995; Петров та інші, Віозсіепсе Керогіз 15: 1-14, 1995; Карелін та інші, Реріїдев 16: 693-697, 1995). Кожну з цих статей включено до цього опису посиланням. Існують також інші атипові опіатні пептиди та невеликі со зо молекули ЇЗудру та інші, УВС 254: 2446-9, 1979; Кіріон та Вайсс, Рерііїдез 4: 445, 1983; Лукас та інші,

Віоспет. 22: 4567, 1983; Брантл, Еиг. У. Ріпапт. 106: 213-14, 1984; Брантл та інші, Еиг. У. Рпагт. 111: 293-4, с 1985; Брантл та Нубер, ТІР5 7: 6-7, 1986; Грабі та Геріг, Мед. Кез. Кеу. 9: 343-401, 1989; Шіллер, Ргод. Мед. «-

Спет. 28: 301-40, 1991; Гламста та інші, ВВКС 184: 1060-6, 1992; Тешмахер, НапароокК Ехр. Ріагт. 104: 499-28, 1993; Напаброок ОЇ Ехрегітепіаі Рпагтасоіоду, А. Герц (видавець), томи 104/ та 104/І, 1993, видавництво «

Зргіпдег Мепад, Берлін; Рід та інші, Мецйговсі. апа Віорепам. Кем. 18: 519-25, 1994; Карелін та інші, ї-

Реріїдез 16: 693-7, 1995). Кожну з цих статей включено до цього опису посиланням. "Опіатоподібні рецептори", як використано у цьому описі, визначаються за їх здатністю до зв'язування опіатів, ІМРКОЇ, геморфінів, екзорфінів, ноціцептину, членів сімейства Туг-МІБ-1, алкалоїдів та/або інших сполук, які пригнічують або стимулюють проліферацію стовбурових клітин способом, який антагонізується включенням відповідної кількості « Налоксону (див. Приклади 29 та З8). з с Цей винахід додатково включає спосіб ідентифікування рецептору(-ів) та лігандів, який включає . застосування ІМРКОЇ. (у переважному варіанті, у пептидних формах, наприклад, Пептид 1-94, 1-97, 43-55 або и?» 64-82) у пробі на зв'язування рецепторів. Цей винахід додатково включає спосіб ідентифікування рецептору(-ів) та лігандів, який включає застосування ІМРКОЇ у пробі на аденілатциклазу.

Цей винахід додатково включає спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який -І включає контактування гемопоетичних клітин зі сполукою (наприклад, мастопараном), здатною до активізації

СТР-зв'язувальних білків, у переважному варіанті, білків С пригнічувального ПІДТИПУ. ве Цей винахід додатково включає спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який - включає контактування гемопоетичних клітин з пептидом, обраним з групи пептидів-геморфінів, які мають 5о наведену далі послідовність: ю Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, с Г еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СіІп-Ага,

Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр- ТАг-Сіп,

Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТНАг,

Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр,

Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго,

Ф) маї-маі-туг-Рго-Тгр-Тпг-СІп, ка Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе,

Туг-Рго-Ттр-Тиг-СіІп-Ага, во Туг-Рго-Ттр-ТАг-СіІп, та

Туг-Ро-Тгр-ТНг.

Вищенаведені пептиди мають подібність послідовності та/або біологічну активність, подібну до інших атипових опіатних пептидів, наприклад, опіатних пептидів сімейства Туг-МІБ-1 |огляд див. Рід та інші,

Меишговзсі. Віорепам. Кему. 18: 519-25, 1994), казеїнопохідних казоморфінів (Брантл та інші, РПузіоЇї. Спет. 65 Хоппе-Сейлера (Норре-Зеуїег) 360: 1211-16, 1979; Лукас та інші, Віоспет. 22: 4567-4573, 1983; Фіат (Ріа) та

Джолз (доМПМев), Мої. СеїЇ. Віоспет. 87: 5-30, 1989), пептидів, одержаних з цитохрому б, які називають цитохрофінами |Брантл та інші, Еицг. У. Ріапт. 111: 293-4, 1985), різних екзорфінів та опіатних пептидів людини та інших видів, за виключенням людини |Зудру та інші, УВС 254: 2446-9, 1979; Брантл, ЄЕиг. 3. Ріагт. 106: 2133-14, 1984; Брантл та інші, Еиг. 9. РІапт. 125: 309-10, 1986; Брантл та Нубер, ТІРЗ 7: 6-7, 1986;

Гламста та інші, ВВКС 184: 1060-6, 1992; Тешмахер, Напдроок Ехр. Рпагт. 104: 499-28, 1993; Карелін та інші,

Реріїдез 16: 693-7, 1995), а також до пептидів, одержаних з комбінаторних бібліотек, відібраних за здатністю до зв'язування з опіатними рецепторами (огляд див. Дулі (Оооіеу) та інші, Реріїде Кезеагсі 8: 124-137, 1995).

Кожну з цих статей включено до цього опису посиланням.

Цей винахід включає також спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який 7/0 Включає контактування гемопоетичних клітин з пептидом, обраним з групи, до складу якої входять пептиди, пов'язані з Туг-МІБ-1, казоморфіни, цитохрофіни та екзорфіни. Зокрема, включено пептиди Туг-МІЕ-1, які мають послідовності, наведені далі:

Туг-Ро-Тгу-СтІу-МН»5,

Туг-Рго-Ї ув-СІу-МН»,

Туг-Ріо-Г еш-С1у-МН о», та

Ріо-І ен-СТу-МН».

Цей винахід включає також спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який включає контактування гемопоетичних клітин з опіатним пептидом, обраним з групи, до складу якої входять: (О-Аіа?,М-Ме-Рне",Сіу-ол7)-Енкефалш (ПАМО0О), (О-Аго? І ув")-Дерморфін-(1-4)-амід (ОА! ОА), (Рпе")-Дерморфін-(1-4)-амід,

Ас-Ага-Рпе-Меї-Ттр-Мег-Аго-МН»,

Ас-Ага-Рпе-Меї-Ттр-Мей-І угз-МН 5», та

Н-Туг-СіІу-Сіу-Рпе-МеАго-Ага-МаІ-МН». с

Цей винахід включає також спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який о включає контактування гемопоетичних клітин зі сполукою опіатного антагоністу, який обирають з групи, до складу якої входить морфін, кодеїн, метадон, героїн, меперідин, альфапродин, дифеноксилат, фентаніл, суфентаніл, альфентаніл, леворфанол, гідрокодон, дигідрокодеїн, оксикодон, гідроморфон, пропоксифен, бупренорфін, еторфін, оксиморфону декстопропоксифен та мептазинол. Зокрема, включено морфін у 00 пригнічувальних кількостях, які складають менше 10-7моль. с

Цей винахід включає також спосіб пригнічення або стимулювання проліферації стовбурових клітин, який включає контактування гемопоетичних клітин з опіатним антагоністом або змішаним агоністом/антагоністом,який (7 обирають з групи, до складу якої входить налоксон, налтрексон, налорфін, пентазоцин, налбуфін та буторфанол. «г

Зокрема, включено налоксон у пригнічувальних кількостях, які складають менше 10 моль.

Зо Цей винахід включає також спосіб стимулювання проліферації стовбурових клітин, який включає - контактування гемопоетичних клітин з кількістю білку або пептиду, яка стимулює стовбурові клітини, який обирають з групи, до складу якої входить ІМРКОЇ, міоглобін, ОАМОО та БА бА.

Цей винахід включає також спосіб проведення генної терапії ссавця, який включає: « а) видалення гемопоетичних клітин зі згаданого ссавця, З 70 Б) обробку згаданих гемопоетичних клітин ех мімо кількістю ІМРКОЇ, яка стимулює стовбурові клітини, с та/або опіатною сполукою, з» с) трансфектування або інфікування згаданих гемопоетичних клітин попередньо визначеним геном, 4) контактування згаданих трансфектованих гемопоетичних клітин ех мімо з кількістю ІМРКОЇ, яка пригнічує стовбурові клітини, та/або опіатною сполукою, е) трансплантування згаданому ссавцеві гемопоетичних клітин етапу 4, і Ї) факультативну обробку згаданого ссавця іп мімо кількістю ІМРКОЇ,, яка пригнічує або стимулює стовбурові «г» клітини, та/або опіатною сполукою.

Цей винахід включає також спосіб проведення розмноження стовбурових клітин ех мімо, який включає - обробку згаданих гемопоетичних клітин кількістю ІМРКОЇ, яка пригнічує стовбурові клітини, та, щонайменше, ка 20 одним стимулювальним цитокіном. ІМРКОЇ. контактує зі згаданими гемопоетичними клітинами перед, під час та/або після контактування з стимулювальним цитокіном. Розмноження стовбурових клітин ех мімо надає змогу со одержання достатніх кількостей стовбурових клітин з обмежених джерел, наприклад, крові пупкового канатику, печінки зародку, автологічного кісткового мозку після хіміотерапії і. т.п. або після очищення (наприклад, за допомогою клітинного сортеру зі збудженням флуоресценції з застосуванням таких маркерів, як СО34, СОЗ8 або родамін). Спроможність вибіркового вирощування певних гемопоетичних ліній, крім того, дає змогу клініцистам

ГФ) безпосередньо конструювати трансплантати стовбурових клітин відповідно до потреб конкретного пацієнту.

Цей винахід включає також спосіб проведення розмноження стовбурових клітин ех мімо, який включає о обробку згаданих гемопоетичних клітин кількістю ІМРКОЇ, яка стимулює стовбурові клітини, з або без щонайменше одного додаткового стимулювального цитокіну. ІМРКОЇ контактує зі згаданими гемопоетичними 60 клітинами перед, під час та/або після контактування з стимулювальним цитокіном(-ами). Застосування стимулятору стовбурових клітин дозволить розмножити стовбурові клітини та/або клітини-попередники, у той час, як інгібітор стовбурових клітин буде підтримувати стовбурові клітини у недиференційованому стані.

Згадана процедура може також бути оптимізована шляхом застосування ІМРКОЇ іп мімо у кількостях, які пригнічують стовбурові клітини, для підтримки згаданих стовбурових клітин у неактивному стані до їх бо приживлення, після чого ІМРКОЇ. у кількостях, які стимулюють стовбурові клітини, може бути застосованим для стимулювання регенерації кісткового мозку. Факультативно, гемопоетичні клітини можуть бути розділені на два препарати; один з них обробляють кількостями ІМРКОЇ,, які стимулюють стовбурові клітини, для підсилення розмноження згаданих стовбурових клітин та/або клітин-попередників, у той час, як другий обробляють кількостями ІМРКОЇ, які пригнічують стовбурові клітини, для підтримки згаданих стовбурових клітин у недиференційованому стані. Після цього два згадані препарати можуть об'єднуватись і вводитись пацієнту.

Цей винахід включає також фармацевтичну композицію, до складу якої входить (а) ІМРКОЇ та (Б) щонайменше одна пригнічувальна сполука, яку обирають з групи, до складу якої входить МІР-1АА, ТОЕВ, ТМЕА (фактор некротизації пухлин), ІМЕА (інтерферон), ІМЕВ, ІМЕГ, пентапептид піросіШ-сІШ-Авзр-Сув-Ї ув, тетрапептид 7/0. М-ацетил-Зег-Авр-Гув-Рго та трипептид глутатіон (СІу-Сув-усім).

Цей винахід включає також фармацевтичну композицію, до складу якої входить (а) ІМРКОЇ та (Б) щонайменше один стимулювальний цитокін, який обирають з групи, до складу якої входить І (інтерлейкін)-1,

І-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 12-11, 11-13, 11-14, 1-15, 5-С5Е, ОМ-С5Е, М-С5Е (макрофагальний колонієстимулювальний фактор), еритропоетин, тромбопоетин, фактор стовбурових клітин, дельтаподібний білок та ліганд ЯК2ЛІВЗ,

Цей винахід описує інгібітор стовбурових клітин (ІМРКОЇ), який відрізняється від відомих у цій галузі техніки, наприклад, МІР-ТА, ТОЕВ, тетрапептиду Фріндела (РЕгіпае!)Й та співробітників або пентапептиду

Пауковіца (РашкКоміїв) та співробітників (порівняй, Райт (МугідчйнО 4 Прагнелл (РгадпеїІ), 1992 (цитовано перед тим)). Природний нативний ІМРКОЇ має молекулярну масу, яка перевищує 10000 Дальтон (визначено ультрафільтрацією), що відрізняє його від тетрапептиду, а також від пентапептиду. Він є більш гідрофобним, аніж МІР-1А або ТОЕВ (хроматографічні системи з оберненою фазою), що відрізняє його від згаданих цитокінів.

Додатково, його спосіб дії відрізняється від способу дії будь-якого попередньо описаного інгібітору тим, що він є активним у пробі іп мійго тільки у разі використання впродовж передінкубаційного періоду. МІР-1А, наприклад, втрачає ефективність у разі його використання тільки впродовж передінкубаційного періоду (Приклад сч ов З). Додатково, природний ІМРКОЇ. є активним у пробі на визначення "колонієутворювальних клітин з високим проліферативним потенціалом" (НРР-РЕС), у той час, як МІР-1А подібної активності не має (Приклад 6). ІМРКОЇ. і) відрізняється від стимуляторів, відомих у цій галузі техніки, наприклад, 1-1, 1/-2, 1-3, 1-4, 1-5, 11 -6,

І -7, 1-9, 1-10, 11-11, 10-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, с-С5Б, ОМ-С5Е, М-С5РЕ, еритропоетину, тромбопоетину, фактору стовбурових клітин та ліганду ЯК2ЛИЗ. Природний ІМРКОЇ не має або має незначну со зо схожість послідовності зі згаданими цитокінами.

На Фіг.1-4 наведено результати електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату с натрію, якому піддається продукт після кожного етапу очищення. «-

Фіг.1 - Смуга 1 - хімотрипсиноген, Смуга 2 - овальбумін, Смуга З - ВБА (сироватковий альбумін великої рогатої худоби), Смуга 4 - фракція «ЗОкД, Смуга 5 - фракції 30-50КД та Смуга 6 - фракції 50-100кД. «

Фіг2 - Смуга 1 - після осадження сульфатом амонію (40-8095) та смуги 2-55 - фракції ОЕАЕ М (діетиламіноетилцелюлоза) (Смуга 2 представляє активну фракцію).

Фіг.З - Смуга 1 - супернатант після осадження сульфатом амонію, Смуга 2 - активна фракція ОЕАЕ, Смуги 3-5 представляють фракції гель-фільтрації (смуга Мо5 представляє активну фракцію).

Фіг.4 - Смуга 2 представляє кінцевий продукт. «

На Фіг.5 представлено хроматограму кінцевого очищення (високоефективна рідинна хроматографія (НРІС) 3 пт-) с оберненою фазою). . На Фіг.б6 представлено включення тимідину, міченого радіоактивним тритієм (срт-кількість імпульсів за а хвилину) до клітин лінії ГОСР-тіх без (Контроль-095 пригнічення) та з різними кількостями ІМРКОЇ, очищеного з свинячого кісткового мозку (рІМРКОЇ). Дані нормалізовано проти контрольного значення.

На Фіг.7 представлено відсоток клітин у 5З-фазі мітотичного циклу після обробки мишей пропіонатом -І тестостерону (ТР), ТР плюс рІМРКОЇ або носієм (Контроль). До складу кожної групи входить 25 тварин (3-4 на часову точку). ве На Фіг.8 представлено виживаність мишей, оброблених двома дозами 5-РШ (фторурацил) з або без обробки - рІМРКОЇГ.. Кожна група складається з 30 тварин.

На Фіг.9 представлено виживаність опромінених мишей з або без обробки ріМмРКОЇ. Кожна група де складається з 50 тварин. с На Фіг.10А та 108 представлено відновлення нормальних культур декстерівського типу через 1 тиждень (10А) та З тижні (108) після обробки Ага-С або Ага-С плюс рІМРКОЇ.

На Фіг.11 представлено виживаність мишей (75 на групу) після летального опромінення та трансплантації Зх107 клітин кісткового мозку після попереднього інкубування з живильним середовищем (Контроль) або о рІМРКОГ (25нг/мл) впродовж 4 годин. Виживаність контролювали впродовж 30 днів.

На Фіг.12 представлено кількість СРО-ОМ, утворених через 14 днів у культурі клітинами кісткового мозку іме) мишей після летального опромінення та відновлення донорськими клітинами кісткового мозку, попередньо проінкубованих з рІМРКОЇ. або живильним середовищем впродовж 4 годин. 60 На Фіг.13 представлено суспендовані клітини з довгоіснуючої культури лімфоцитів, які відбирались кожного тижня, промивались та висівались з 1-7 (1Онг/мл) після попереднього інкубування з живильним середовищем або рІМРКОЇ. впродовж 4 годин.

На Фіг.14 представлено репопуляційну здатність лейкозних клітин периферійної крові, оброблених рІМРКОЇ.

Клітини, які започатковують довгоіїснуючі культури клітин (І ТС-ІС), визначались шляхом посіву адгезивних та 65 неадгезивних клітин довгоїснуючих культур з та без ріМРКОЇ та підрахунку СРО-ОМ на 7 день. Дані нормалізовано проти контрольних значень.

На Фіг.15А представлено хроматограму з оберненою фазою С4 очищеного рІМРКОЇ, елюйованого 5395 ацетонітрилу. Смуга 1 - неочищений матеріал, Смуга 2 - маркери молекулярної маси та Смута З - очищений матеріал.

На Фіг.158 представлено хроматограму з оберненою фазою С4 МІР-1А, елюйованого 43,9965 ацетонітрилу.

На Фіг.15С представлено хроматограму 5О5-РАСЕ (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію) неочищеного препарату рІМРКОЇГ. та очищеного препарату після оберненої фази.

На Фіг.1б6 представлено послідовності гемоглобіну: На Фіг.1бА представлено послідовності КДНК та амінокислот альфа-гемоглобіну людини; на Фіг1б6В представлено послідовності кКДНК та амінокислот 70 бета-гемоглобіну людини. Числова індексація відповідно: до амінокислоти. На Фіг.16С представлено порівняння амінокислотних послідовностей альфа- та бета-ланцюгів людського, мишачого та свинячого гемоглобінів.

На Фіг.17 представлено порівняння слідових кількостей (визначених за допомогою НРІ С з оберненою фазою

С4) рІМРКОЇ (Фіг.17А) та кристалізованого свинячого гемоглобіну (Фіг.17 В).

На Фіг.18 представлено результати 5ЗО5-РАСЕ фракцій, одержаних шляхом відокремлення кристалізованого 7/5 бВвИНЯЧОГО гемоглобіну засобами НРІ С з оберненою фазою С4. Смуга 1 - маркери молекулярної маси, Смуга 2 - фракції 48-49, одержані з першого піку (на 47,1ї1хв.), Смута З - фракції 50-51, одержані з другого піку (на 49,153хв.), Смуга 4 - фракції 54-55, одержані з третього піку (на 52,25хв.) та Смуга 5 - фракції 56-57, одержані з четвертого піку (на 53,613хв.).

На Фіг.19 представлено порівняння результатів двомірного високовольтного електрофорезу ріМРКОЇ. (Фіг.19А) та очищеного свинячого бета-гемоглобіну (Фіг.198).

На Фіг.20 представлено порівняння впливу очищеного свинячого альфа-гемоглобіну, бета-гемоглобіну або рІМРКОЇГ. на результати аналізу ЕОСР-МІХ.

На Фіг.21 представлено результати відокремлення свинячого гемоглобіну засобами НРІ С з оберненою фазою за допомогою градієнту елюювання широкого діапазону. с

На Фіг.22А представлено плазміду Гочалі (Носпиіїї) та інших (1988); на Фіг.228 представлено плазміду Летшера (І оеівспег) та інших (1991); на Фіг.22С представлено плазміду і) роБИБ.

На Фіг.23 представлено вплив обробки ІМРКОГ ом на дані проби на утворення груп клітин.

Для повнішого зрозуміння описаного винаходу далі наведено докладний опис. Цей опис, взірцевий для цього ду зо винаходу, не повинен розглядатись як такий, що конкретно обмежує цей винахід та такі варіанти, які стануть зрозумілими фахівцю у цій галузі техніки і повинні розглядатись, як такі, що входять до обсягу цього винаходу. с

ІМРКОЇ. оборотно пригнічує або стимулює поділ стовбурових клітин. Не маючи бажання бути зв'язаним «- конкретною теорією, гадають, що інгібітори та стимулятори стовбурових клітин впливають на швидкість, з якою стовбурові клітини проходять через мітотичний цикл. Зокрема, ІМРКОЇ є ефективним для тимчасового « пригнічення або стимулювання поділу гемопоетичних стовбурових клітин у залежності від використаної кількості. ї-

Спроможність клінічного застосування сполуки, яка може пригнічувати або стимулювати проліферацію стовбурових клітин, надає можливість точного контролювання мітотичної активності гемопоетичних стовбурових клітин, наприклад, під час проведення хіміотерапевтичних заходів, трансплантування стовбурових клітин або здійснення протоколів генної терапії. Таким чином, спосіб за цим винаходом може бути застосовано для « полегшення небажаних побічних ефектів хіміотерапевтичних заходів на гемопоетичну, мієлоїдну та імунну з с системи шляхом захисту стовбурових клітин від пошкодження, спричиненого хіміотерапевтичними засобами або опроміненням, які застосовуються для знищення ракових або вірусінфікованих клітин або шляхом стимулювання з відновлення після такого пошкодження. За одним з варіантів втілення цього винаходу, ІМРКОЇГ. вводять пацієнту у дозі, достатній для пригнічення поділу стовбурових клітин, у той час, як хіміотерапевтичний засіб діє на хвору клітину. Після завершення функції хіміотерапевтичного засобу, стовбурова клітина, пригнічена ІМРКОЇ, -І відновить поділ без подальшої додаткової обробки. У разі необхідності підсилити відновлення гемопоезу, додатково можуть бути застосовані фактори стимулювання росту, цитокіни або ІМРКОЇ у кількостях, які ве стимулюють стовбурові клітини. - Термін "ІМРКО!", який використано у цьому описі, означає білки ссавців та нессавців, очищені, як наведено

У Прикладах, гемоглобін, альфа-ланцюг гемоглобіну (з або без групи гему), бета-ланцюг гемоглобіну (з або без ю групи гему), суміші альфа- та бета-ланцюгів (з або без групи гему) та фрагменти або аналоги згаданих білків, с у тому числі, ембріональні, зародкові або дорослі форми (наприклад, альфа-, бета-, гамма-, дельта-, епсилон- або дзета-ланцюги, поодинці або у сумішах, димери або полімери, з або без групи гему), які мають здатність пригнічувати та/або стимулювати проліферацію стовбурових клітин. Термін "ІМРКО!" означає природні, а також ов неприродні (наприклад, рекомбінантні та/або синтетично продуковані) форми цих білків. Термін "ІМРКОЇ. поліпептид" означає ІМРКОЇ,, який складається з 40 або більше амінокислот.

Ф) Термін "опіатні сполуки", який використано у цьому описі, означає сполуки, у тому числі, опіати, але не ка ІМРКОЇ,, які зв'язуються з оплатними рецепторами (або з рецепторами, які мають послідовну спорідненість з опіатними рецепторами, наприклад, ОКІ!1) та здійснюють свою агоністичну, антагоністичну або змішану бо агоністично/антагоністичну активність. Наприклад, специфічні агоністи та антагоністи існують для мю рецепторів (які вибірково активізуються ОАМОО та БА ДА і вибірково антагонізуються СТОР та налоксоназіном), для каппа рецепторів (які вибірково активізуються фумаратом Кк 89696 та 0-69593 і вибірково антагонізуються пог-біналторфіміку гідрохлоридом) та для дельта рецепторів (які вибірково активізуються ОАОІ Е та ОРОРЕ і вибірково антагонізуються натріндолом). На додаток до цього, існують антагоністи широкого спектру дії 65 (наприклад, налоксон) та агоністи (наприклад, еторфін), які діють на рецептори усіх трьох підтипів.

Ноціцептин, зокрема, агонізує рецептор ОКІ 1. Опіатні сполуки, які мають стимулювальну та/або пригнічувальну активність відносно стовбурових клітин, можуть використовуватись для кожного з застосувань, які згадано у цьому описі для ІМРКОЇ.

Вираз "кількість, яка стимулює стовбурові клітини", який використано у цьому описі, означає таку кількість, яка індукує проліферацію стовбурових клітин. Вираз "кількість, яка пригнічує стовбурові клітини", який використано у цьому описі, означає таку кількість, яка пригнічує проліферацію стовбурових клітин. В усіх випадках, як іп мімо, так і ех мімо, обрана кількість буде залежати від специфічного ІМРКОЇ або обраної опіатної сполуки та специфічних умов або застосування; зокрема, активними є як еквімолярні дози поліпептидів або фрагментів ІМРКОЇ,, так і еквімолярні дози опіатних пептидів або невеликих молекул. 70 У типовій клінічній ситуації, коли виникає необхідність у пригніченні стовбурових клітин, ІМРКОЇ вводять пацієнту щоденно шляхом інтравенозного впорскування або вливання у стандартній дозованій формі, наприклад, від 0,01 до 1О0Омг/кг, у переважному варіанті, від 0,1 до 1,Омг/кг, наприклад, за 4-60 годин до стандартної хіміотерапевтичної або променевої терапії у разі, коли виникає необхідність у пригніченні мітотичного циклу клітини.

У ситуаціях, коли необхідним є стимулювання мітотичного циклу клітини, наприклад, для прискорення одужання після хіміотерапії або опромінення, ІМРКОЇ. застосовують у кількостях, які стимулюють стовбурові клітини. Такі дози, звичайно, дорівнюють 1-50Омг/кг, у переважному варіанті, вони складають від 1Омг до 10Омг/кг.

У тих випадках, коли виникає необхідність застосування опіатної сполуки (сполук) для пригнічення або 2о стимулювання мітотичного циклу клітини, згадану опіатну сполуку (сполуки) застосовують у еквімолярних концентраціях відносно концентрацій, вказаних для ІМРКОЇ.

За іншим варіантом втілення цього винаходу, попередня обробка ІМРКОЇ у кількостях, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин, надає можливість застосування підвищених доз хіміотерапевтичних засобів або доз опромінення, які перевищують ті дози, які, за нормальних умов, є стерпними для пацієнтів. Подібним же сч об ЧИНОМ, постхіміотерапевтична або постопромінювальна обробка ІМРКОЇ у кількостях, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин, також надає можливість підвищення звичайних стерпних доз і) хіміотерапевтичного засобу або опромінення.

Значна частина гемопоетичних стовбурових клітин, за нормальних умов, знаходиться у неактивному стані (мітотичний цикл не відбувається або відбувається повільно). Однак, як компенсаторна реакція на гемопоетичне со зо пошкодження, індуковане застосуванням хіміотерапевтичних засобів, більша частина стовбурових клітин розпочинає мітотичний цикл після хіміотерапії, що робить їх особливо вразливими для наступних доз с цитотоксичних хіміотерапевтичних засобів або терапевтичного опромінення. Завдяки пригніченню мітотичного «- циклу стовбурових клітин, обробка ІМРКОЇ дозволяє більш раннє або більш часте введення наступних доз цитотоксичних хіміотерапевтичних засобів як у традиційних, так і у підвищених дозах. «

Стовбурові клітини деяких нормальних індивідів мають спонтанно прискорену мітотичну активність; ІМРКОЇГ. у ї- кількостях, які пригнічують стовбурові клітини, є корисним для таких індивідів, навіть якщо він вводиться перед першою дозою опромінення або хіміотерапевтичного засобу.

За одним з варіантів втілення цього винаходу, ІМРКОЇ (від О,їмг до бг/кг маси тіла, у переважному варіанті, від 1,0 до бОмг/кг) вводиться, приблизно, через 24 години-10 днів після введення початкової дози «

Хіміотерапевтичною засобу. Ще через 4-60 годин, у переважному варіанті, через 24-48 годин, вводиться з с наступна доза хіміотерапевтичного засобу. Цей цикл переміжного введення хіміотерапевтичного засобу та

ІМРКОЇ. продовжують відповідно до терапевтичних показань. У стандартній клінічній практиці, хіміотерапевтичні з засоби та протоколи введення обирають відповідно до їх придатності для пухлин конкретних типів.

Факультативно, фактори стимулювання росту, наприклад, С-С5Е, фактор стовбурових клітин або ІМРКОЇ у

Кількостях, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин, застосовують після хіміотерапії або променевої -І терапії для додаткового поліпшення відновлення гемопоетичної функції.

Для застосування ех мімо, у випадках, коли виникає необхідність у пригніченні проліферації стовбурових ть клітин, ІМРКОЇ застосовують у дозі від О,Тнг до 1бонг/105клітин/мл, у переважному варіанті, 2-БОнг/105 - клітин/мл. У разі, коли виникає необхідність у стимулюванні стовбурових клітин, ІМРКОЇ. застосовують у дозі т 50 від 1Онг до 10О0мкг/1Обклітин/мл, у переважному варіанті, 1-100 мкг/10бклітин/мл.

У тих випадках, коли виникає необхідність застосування опіатної сполуки (сполук) для пригнічення або

ІЧ е) стимулювання мітотичного циклу клітини, згадану опіатну сполуку (сполуки) застосовують у еквімолярних концентраціях відносно концентрацій, вказаних для ІМРКОЇ.

За іншим варіантом втілення цього винаходу, ІМРКОЇ. використовують у способі приготування автологічних гемопоетичних клітин для трансплантування. Гемопоетичні клітини обробляють ех мімо ефективною кількістю

ІМРКОЇГ. для пригнічення поділу стовбурових клітин, після чого ракові клітини видаляють шляхом введення до о культур кісткового мозку ефективної кількості хіміотерапевтичного засобу або ефективної дози опромінення. іме) Перевага надається хіміотерапевтичним засобам, специфічним для клітин у стані мітотичної активності.

Оброблений подібним чином кістковий мозок повторно впорскують автологічному донору. Факультативно, 60о згаданий пацієнт піддається обробці кількостями ІМРКОЇ, які стимулюють стовбурові клітини, та/або іншим відомим засобом стимулювання гемопоезу для поліпшення гемопоетичних функцій згаданого пацієнта. Така методика забезпечує ефективне видалення пухлинних клітин під час трансплантування автологічного кісткового мозку, з одночасним забезпеченням захисту гемопоетичних стовбурових клітин. Такий захист може забезпечуватись протоколами очищення як ех мімо, так і іп мімо. Після успішного трансплантування виникає 65 необхідність у швидкій проліферації стовбурових клітин для відновлення нормальних функцій кісткового мозку.

Це може забезпечуватись застосуванням ІМРКОЇ. у стимулювальних кількостях, яю забезпечують стимулювання мітотичного циклу стовбурових клітин та прискорюють відновлення функцій кісткового мозку.

За іншим варіантом втілення цього винаходу, ІМРКОЇ. використовують у способі приготування гемопоетичних клітин для генної терапії. Гемопоетичні клітини обробляють ех мімо ІМРКОГ ом у кількостях, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин, та/"або іншим стимулювальним цитокіном(-ами) для стимулювання поділу стовбурових клітин, після чого трансфектують (у переважному варіанті, інфікують за допомогою, наприклад, вектору на основі ретровірусів) необхідним геном (генами). Після завершення трансфектування, клітини промивають і обробляють ІМРКОЇ у кількостях, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин, для повернення згаданих стовбурових клітин до неактивного стану. Оброблений таким чином кістковий мозок 7/0 повторно впорскують донорові. Факультативно, згаданий пацієнт піддається обробці ІМРКОЇ іп мімо у кількостях, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин, для підтримки згаданих стовбурових клітин у неактивній формі та підсилення їх здатності до повторного заселення кісткового мозку.

За іншим варіантом втілення цього винаходу, ІМРКОЇГ. застосовують, як додатковий терапевтичний засіб при лікуванні лейкозу. Наприклад, при хворобливих станах, коли лейкозні клітини не реагують на ІМРКОЇ, /5 Гемопоетичні клітини обробляють ех мімо ІМРКОГ ом у кількостях, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин. Введення ІМРКОЇ. запобігає проліферації нормальних стовбурових клітин. Таким чином, впродовж того періоду часу, коли лейкозні клітини, які проліферують, обробляються цитотоксичним засобом, специфічним для клітин у стані мітотичної активності, популяція нормальних стовбурових клітин є захищеною від пошкодження.

Додатково, стимулювальний цитокін, наприклад, ІЇ/-3, (з3М-СЗЕ, факультативно вводять для індукування Мітотичної активності лейкозних клітин під час обробки хіміотерапевтичним засобом або опромінення, у той час, як нормальні стовбурові клітини є захищеними за допомогою ІМРКОЇ. Згаданого пацієнта лікують хіміотерапевтичними засобами або піддають променевій терапії для знищення лейкозних клітин і кістковий мозок з десенсибілізованими пухлинними клітинами після цього знову трансплантують згаданому пацієнту для відновлення гемопоетичних функцій. сч

Подібним же чином, у іншому варіанті втілення цього винаходу, для лікування пацієнтів з серйозними вірусними інфекціями, які залучають клітини крові або лімфоцити, наприклад, у разі ВІЛ-інфекції, гемопоетичні і) клітини обробляють ех мімо або іп мімо ІМРКОГ ом, потім противірусними засобами, лікарськими засобами, які знищують інфіковані клітини, або системами на основі антитіл, для видалення інфікованих клітин. Після мієлоаблативної противірусної або мієлоаблативної хіміотерапії для видалення з пацієнту вірусінфікованих со

Зо Клітин, клітини кісткового мозку, оброблені ІМРКОЇ, знову повертаються згаданому пацієнту.

У іншому варіанті втілення цього винаходу, ІМРКОЇ застосовують для лікування розладів, пов'язаних з с гіперпролірфберативними стовбуровими клітинами. Наприклад, псоріаз є хворобою, яка викликається «- гіперпроліферацією епітеліальних клітин шкіри і яку, подеколи, лікують цитотоксичними лікарськими засобами.

Для лікування інших пошкоджень, які передують виникненню новоутворень, до яких залучена проліферація « стовбурових клітин, також використовують ефективні кількості ІМРКОЇ, які застосовують для пригнічення ї- проліферації стовбурових клітин. У пацієнтів з синдромом набутого імунодефіциту спостерігається аномально висока швидкість мітотичної активності, наслідком чого є вичерпання стовбурових клітин; для цих пацієнтів також є корисним лікування ефективними кількостями ІМРКОЇГ. для пригнічення мітотичного циклу клітин. З цією метою, у можливих випадках, застосовують композиції для локальної або черезшкірної доставки (наприклад, « мазі, лосьони, гелі або пластирі), до складу яких входить ІМРКОЇ,, як альтернативу парентеральному введенню. з с У більшості випадків лейкозу клітинами-попередниками лейкозних клітин є популяції диференційованих клітин, які не піддаються впливу ІМРКОЇ і які, таким чином, необхідно обробляти за способами використання з ІМРКОЇ, подібними тим, які було описано перед тим. У тих випадках, коли клітини-попередники лейкозних клітин є дуже примітивними і безпосередньо чутливими до пригнічення їх ІМРКОЇ, проліферація лейкозних клітин послаблюється введенням ефективної кількості ІМРКОЇ.. -І У іншому варіанті втілення цього винаходу, ІМРКОЇ застосовують для лікування розладів, пов'язаних з гіпопроліферативними стовбуровими клітинами. Наприклад, мієлодиспластичні синдроми та апластична анемія є ве розладами, які спричинюються гіпопроліферацією стовбурових клітин кісткового мозку. Інші синдроми, до яких - залучено гіпопроліферацію стовбурових клітин, лікуються введенням ІМРКОЇ. у кількостях, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин. де Антитіла, моноклональні або поліклональні, до ІМРКОЇ. пептидів або поліпептидів, одержують за допомогою с стандартних способів. Згадані антитіла або ІМРКОЇ пептиди або поліпептиди мітять мітками, які піддаються виявленню, багато типів яких відомо у цій галузі техніки. Мічені ІМРКОЇГ. або анти-ІМРКОЇ. антитіла після цього використовують, як маркери стовбурових клітин для ідентифікування та виділення стовбурових клітин шляхом їх ов введення пацієнту безпосередньо з діагностичною метою. У альтернативному варіанті ці мічені пептиди, поліпептиди або антитіла застосовують ех мімо для ідентифікування стовбурових клітин у гемопоетичних (Ф, клітинних препаратах для забезпечення їх видалення перед десенсибілізуванням неопластичних клітин у ка кістковому мозку. Подібним же чином, такі мічені пептиди, поліпептиди або антитіла використовують для виділення або ідентифікування епітеліальних або інших стовбурових клітин. На додаток, такі антитіла, мічені во або немічені, використовують терапевтично шляхом нейтралізування активності ІМРКОЇ або діагностично шляхом виявлення рівнів циркулюючого ІМРКОЇ.

ІМРКОЇ може бути клонованим з генних або кКДНК бібліотек людини для експресування рекомбінантного

ІМРКОЇ людини за допомогою стандартних способів. Наприклад, у разі використання інформації відносно послідовності, одержаної з очищеного білку, конструюються олігонуклеотидні зонди, які можуть помічатись, 65 наприклад, фосфором 32, та використовуватись для добору відповідної бібліотеки кДНК (наприклад, з кісткового мозку). У альтернативному варіанті, бібліотека послідовностей, які експресуються, з відповідного джерела

(наприклад, кісткового мозку), перевіряється на кодування ІМРКОЇ. кДНК за допомогою антитіл або відповідної функціональної проби (наприклад, такої, опис якої наведено у Прикладі 2). Сам по собі гемоглобін, а також окремі альфа-та бета-ланцюги, було клоновано та експресовано за допомогою способів, відомих у цій галузі техніки |див. Паньє (Радпіег) та інші, Кем. Ег. Тгапвтв. Нетобіо!Ї. 35: 407-15, 1992; Лукер (І сокКег) та інші,

Майшге 356: 258-600, 1992; Меїподвз іп Епгутоіоду, том 231, 1994).

Цей винахід включає послідовності ДНК, до яких належать: включення кодонів, "яким надається перевага", для експресування окремими хазяями-не ссавцями; забезпечення сайтів розщеплення рестриктазами; та забезпечення додаткових початкових, кінцевих або проміжних послідовностей ДНК, які полегшують 7/0 Конструювання векторів, які легко експресуються, або продукування, або очищення альфа-, бета-, гамма-, дельта-, епсилон - та/або дзета-ланцюгу гемоглобіну.

Цей винахід також надає послідовності ДНК, які кодують поліпептидиі аналоги або похідні альфа-, бета-, гамма-, дельта-, епсилон- та/або дзета-ланцюгів гемоглобіну, які відрізняються від природних форм ідентичністю або місцезнаходженням одного або декількох амінокислотних залишків (наприклад, делеційні /5 аналоги, до складу яких входять менше, ніж усі вказані залишки; субституційні аналоги, у яких один або декілька вказаних залишків заміщено іншими залишками; та додаткові аналоги, у яких один або декілька амінокислотних залишків додаються до кінцевої або серединної ділянки поліпептиду) та які поділяють деякі або усі властивості природних форм.

У переважному варіанті втілення, ІМРКОЇ є продуктом експресії хазяїном-прокаріотом або еукаріотом (наприклад, клітинами бактерій, дріжджів, вищих рослин, комах або ссавців у культурі) послідовності екзогенної ДНК, одержаної клонуванням геному або кДНК, або синтезом генів. Тобто, у переважному варіанті втілення, ІМРКОЇ є "рекомбінантним ІМРКОГ ом". Продута експресування типових дріжджів (наприклад,

Засспаготусевз сегемізіде) або прокаріотних клітин-хазяїв (наприклад, Е.соїї) не має зв'язку з будь-якими білками ссавців. Продукти експресування клітин хребетних (наприклад, ссавців, за виключенням людини сч об (наприклад, СОЗ (клітини яєчнику мавп) або СНО (клітини яєчнику китайських хом'ячків))) не мають зв'язку з будь-якими білками людини. У залежності від використаного хазяїна, поліпептиди за цим винаходом можуть бути (8) глікозильованими або можуть не бути глікозильованими. До складу поліпептидів за цим винаходом, факультативно, може входити також початковий метіоніновий амінокислотний залишок (у позиції - 1).

Цей винахід охоплює також інші продукти, наприклад, поліпептидні аналоги альфа-, бета-, гамма-, дельта-, со зо епсилон- та/або дзета-ланцюгу гемоглобіну. До складу таких аналогів входять фрагменти альфа-, бета-, гамма-, дельта-, епсилон- та/(або дзета-ланцюгу гемоглобіну. У разі використання добре відомих способів, можна легко с сконструювати та одержати гени, які кодують мікробну експресію поліпептидів, які мають первинні «- послідовності, які відрізняють їх від згаданих у цьому описі ідентичністю або місцезнаходженням одного або декількох залишків (наприклад, субституцій, кінцевих та проміжних додатків та делецій). У альтернативному « варіанті, модифікація генів КДНК та геному може бути легко здійснена за допомогою добре відомих способів ї- сайтспрямованого мутагенезу та застосована для одержання аналогів та похідних альфа-, бета-, гамма-, дельта-, епсилон- або дзета-ланцюгів гемоглобіну. Такі продукти поділяють, щонайменше, одну з біологічних властивостей ІМРКОЇ, але можуть відрізнятись за іншими. Як приклад, до продуктів за цим винаходом належать альфа-, бета-, гамма-, дельта-, епсилон- або дзета-ланцюги, які піддаються попередньому скороченню, « 70 наприклад, делеціями; або більш стійкі до гідролізу (і які, як наслідок, можуть мати більш виявлений або в с більш тривалий ефект, аніж природні); або такі, які було піддано зміненню шляхом видалення або додання однієї або декількох потенційних ділянок для О-глікозилювання та/або М-глікозилювання, або які мають один або з декілька цистеїнових залишків, які було видалено або заміщено, наприклад, аланіновими або сериновими залишками, і які легше виділяються у активній формі з мікробних систем; або які мають один або декілька

Ттирозинових залишків, заміщених фенілаланіном, та зв'язуються з більшою або меншою легкістю з -І білками-мішенями або рецепторами на клітинах-мішенях. До цього винаходу входять також фрагменти пептидів або поліпептидів, які дублюють тільки частину безперервної амінокислотної послідовності або вторинні ве конформації з альфа-, бета-, гамма-, дельта-, епсилон- або дзета-ланцюгами, причому згадані фрагменти - можуть мати одну властивість ІМРКОЇ (наприклад, зв'язування рецептору), і не мати іншої (наприклад, 5ор активності пригнічення стовбурових клітин). Слід занотувати, що активність будь-якого одного або декількох ю продуктів за цим винаходом не обов'язково повинна мати терапевтичну придатність Ідив., Вейланд (У/ейапа) та с інші, ВІішЕ 44: 173-5, 1982) або придатність у інших контекстах, наприклад, у пробах на антагонізм фактору пригнічення. Конкурентні антагоністи є придатними у випадках перепродукування інгібіторів стовбурових клітин або їх рецептору.

На додаток до цього, пептиди, які є похідними білкової послідовності, які зберігають біологічну активність, можуть бути хімічно синтезованими за допомогою стандартних способів. Цей винахід забезпечує (Ф, також кодування послідовностей для пептидних аналогів або похідних альфа-, бета-, гамма-, дельта-, епсилон- ка або дзета-ланцюгів гемоглобіну, які відрізняються від природних форм ідентичністю або місцезнаходженням одного або декількох амінокислотних залишків (наприклад, делеційні аналоги, до складу яких входять менше, бо Ніж усі вказані залишки; субституційні аналоги, у яких один або декілька вказаних залишків заміщено іншими залишками, природними або іншими аналогами, відомими у цій галузі техніки, наприклад О-амінокислотами; та додаткові аналоги, у яких один або декілька амінокислотних залишків піддаються хімічній модифікації для підвищення стабільності, розчинності та/або стійкості до протеолізу) та які поділяють деякі або усі властивості природних форм. 65 Пептидні послідовності, наприклад, такі опис яких наведено перед тим, можуть бути ідентифіковані різноманітними засобами. Шляхом порівняння об'ємних структур нативних гемоглобінових ланцюгів, активних у пробі (наприклад, альфа-ланцюгу), з структурно спорідненими білками, які позбавлені активності (наприклад, міоглобіном) можна ідентифікувати ділянки, які мають інші об'ємні конформації, і які, таким чином, є придатними ділянками для активних пептидів. У іншому підході застосовують вибірковий протеоліз, під час якого протеолітичні ферменти використовують для обмеженого розщеплення гемоглобінових ланцюгів, наслідком чого є пептиди, які можна відокремлювати, наприклад, засобами НРІС з оберненою фазою, з наступним випробування на пригнічення стовбурових клітин. Пептиди можна також одержувати хімічним синтезом (наприклад, твердофазним синтезом); таким чином можна легко одержати цілий ряд пептидів, які взаємно перекриваються (наприклад, 15--ленних), до складу яких входить необхідна послідовність гемоглобінового /о ланцюгу (наприклад, альфа-ланцюгу) і які можна випробувати у пробах на стовбурових клітинах. Можна одержати комбінаторні бібліотеки, у яких здійснюють різнобічний хімічний синтез та у яких позиції окремих амінокислот робляться змінними, наслідком чого є одержання значної кількості пептидних аналогів для перевірки (наприклад, Дулі та інші, Реріїде Кезеагсп 8: 124-137, 1995) У альтернативному варіанті, можна використовувати рекомбінантні способи. Для ідентифікування критичних залишків, необхідних для активності 7/5 Конкретного ланцюгу гемоглобіну, може бути використано сайтспрямований мутагенез. Ділянки ланцюгу, який, як відомо, має активність, як інгібітор стовбурових клітин (наприклад, альфа-ланцюгу), можуть заміщуватись ділянками спорідненого, але позбавленого активності білку (наприклад, міоглобіну), та перевірятись у пробах на стовбурових клітинах, що дозволяє ідентифікувати ділянки, необхідні для активності. Такі ідентифіковані ділянки можуть експресуватись, як пептиди, і перевірятись на активність у пробах з мітотичним циклом клітин.

Гомологічні або аналогічні варіанти ІМРКОЇ. від інших видів використовують з різними цілями у ветеринарії, подібно терапевтичним варіантам втілення цього винаходу, опис яких наведено перед тим.

ІМРКОЇГ. у кількостях, які забезпечують пригнічення стовбурових клітин, справляє свій вплив на клітини у стані мітотичної активності шляхом оборотного переведення їх до стану "покою", у якому вони не поділяються або поділяються повільно. Коли виникає необхідність стимулювання поділу клітин, які знаходяться у сч ов Ннеактивному стані, наприклад, після лікування ракового пацієнта хіміотерапевтичними засобами або піддання його променевій терапії, ІМРКОЇ може бути застосований у кількостях, які забезпечують стимулювання і) стовбурових клітин. У альтернативному варіанті, або на додаток, суб'єкту можуть бути введені колонієстимулювальні фактори або інші гемопоетичні стимулятори. До прикладів таких стимуляторів належать, але їми не обмежуються: М-С5Е (С5Б-1), ОМ-С5Е, 0-С5Б, МедаКагуосуїе-С5ЗЕ (мегакаріоцитарний со зо колонієстимулювальний фактор), тромбопоетин, фактор стовбурових клітин або інші цитокіни, наприклад, 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 11-11, 11-12, 1-13, 11-14 або еритропоетин. с

ІМРКОЇ. поліпептиди або активні фрагменти, які мають активність пригнічення стовбурових клітин, очищають - де або синтезують традиційними хімічними способами у поєднанні з відповідними біопробами на активність пригнічення стовбурових клітин, як представлено прикладами у протоколах, опис яких буде наведено далі. -

У одному варіанті втілення цього винаходу терапевтично ефективна кількість ІМРКОЇ білку або його ї- терапевтично ефективного фрагменту використовується у суміші з фармацевтично прийнятним носієм. Ця

ІМРКОЇ. композиція, як правило, вводиться парентеральним впорскуванням або вливанням. Підшкірний, інтравенозний або внутрішньом'язовий шляхи впорскування вибирають відповідно до досягнутого терапевтичного ефекту. «

У разі системного введення, терапевтична композиція для використання за цим винаходом має форму в с апірогенного парентерально прийнятного водного розчину. Виготовлення прийнятного стерильного білкового розчину з відповідними показниками рн, ізотонічності, стабільності, вмісту білків-носіїв може бути здійснено ;» при сьогоднішньому стані даної галузі техніки.

Цим винаходом передбачаються також фармацевтичні композиції, до складу яких входять терапевтично ефективні кількості пептидного або поліпептидного продуктів за цим винаходом, разом з прийнятними -І розріджувачамі!, консервантами, розчинниками, емульгаторами, ад'ювантами та/або носіями, придатними для

ІМРКОГ. терапії. Вираз "терапевтично ефективна кількість", який використано у цьому описі, означає кількість, ве яка забезпечує терапевтичний ефект для даного стану та запровадженого режиму лікування. Такі композиції є - рідинами, гелями, мазями, ліофілізованими або висушеними іншими засобами лікарськими формами і до їх 5ор складу входять розріджувачі з різним вмістом буферу (наприклад, Трис-НСІ-буфер, ацетат, фосфат), рН та о іонною силою, додатки, наприклад, альбумін або желатина для запобігання адсорбуванню на поверхнях, с детергенти (наприклад, Твін 20, Твін 80, Плюронік Е68, солі жовчних кислот), розчинники (наприклад, гліцерин, поліетиленгліколь), антиокисники (наприклад, аскорбінова кислота, метабісульфіт натрію), консерванти (наприклад, Тімеросал, бензиловий спирт, парабени), речовини для збільшення основної маси та модифікатори дво тонусу (наприклад, лактоза, маніт), ковалентного зв'язку полімерів, наприклад, поліетиленгліколя до білку, утворення комплексних сполук з іонами металів або включення матеріалу до або на подрібнені препарати (Ф) полімерних сполук, наприклад, полімеру молочної кислоти, полігліколевої кислоти, гідрогелей і т.ін., або до ка ліпосом, ніосом, мікроемульсій, міцелл, одношарових або багатошарових везікул, мікрокапсул або мікросфер до впорскування, які піддаються біологічному розкладу, або білкових матриць, гемолізованих еритроцитів, бо сферопластів, шкірних пластирів або інших способів виділення або пакування фармацевтичних препаратів. Такі композиції будуть впливати на фізичний стан, розчинність, стабільність, швидкість виділення іп мімо та швидкість виведення ІМРКОЇ. іп мімо. До композицій з контрольованим або подовженим виділенням належать лікарські форми у ліпофільних депо (наприклад, жирних кислотах, смолах, маслах). До цього винаходу належать також подрібнені композиції, вкриті шаром полімерів (наприклад, полоксамерів або полоксамінів) та ІМРКОЇ, 65 поєднаний з антитілами, спрямованими проти тканиноспецифічних рецепторів, лігандів або антигенів, або поєднаних з лігандами тканиноспецифічних рецепторів. Інші варіанти композицій за цим винаходом включають подрібнені форми захисних покрить, факторів пригнічення протеази або підсилювачів проникнення для різних шляхів введення, у тому числі, парентерального, легеневого, назального, локального (шкіра або слизова оболонка) та орального. За іншими варіантами втілення, композиція, до складу якої входить ІМРКОЇ, вводиться локально або за допомогою черезшкірного пластиру.

За одним з варіантів втілення, композиції за цим винаходом розфасовано до стерильних флаконів або ампул у стандартній дозованій формі.

Цей винахід включає також композиції, до складу яких входить один або декілька додаткових факторів, наприклад, хіміотерапевтичних речовин (наприклад, 5-фторурацил (5ЕУ), цитозинарабінозид, циклофосфамід, 7/0 Чисплатин, карбоплатин, доксирубіцин, етопозид, таксол, алкілюючі агенти), противірусних речовин (наприклад,

АТ (азидодезокситимідин), ацикловір), фактор некротизації пухлин, цитокіни (наприклад, інтерлейкіни), антипроліферативні лікарські засоби, антиметаболіти та лікарські засоби, які втручаються в метаболізм ДНК.

Режим дозування, який передбачається для способу лікування суб'єкта, якому призначено введення згаданих цитотоксичних засобів або для обробки гіперпроліферативних стовбурових клітин, визначається 7/5 лікарем з урахуванням різних факторів, які модифікують дію лікарських засобів; наприклад, стану, маси тіла, статі та раціону згаданого пацієнта, тяжкості будь-якої інфекції, часу введення та інших клінічних факторів.

Після піддання згаданого суб'єкту обробці цитотоксичним засобом або опроміненню, терапевтичним способом за цим винаходом, факультативно, передбачається введення суб'єкту ІМРКОЇ у кількостях, які забезпечують стимулювання стовбурових клітин, з факультативним включенням одного або декількох Ллімфокінів, колонієстимулювальних факторів або інших цитокінів, гемопоетинів, інтерлейкінів або факторів росту для загального стимулювання росту та поділу стовбурових клітин (або їх нащадків), пригнічених попередньою обробкою ІМРКОГ ом. До таких терапевтичних засобів, які заохочують гемопоез, належать 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 11 -6, 11 -7, Мед-С5Е, М-СЗЕ (СБЕ-1), СМ-С5Е, 5-С5Е або еритропоетин. Дози цих засобів підбирають відповідно до даних, одержаних під час їх застосування у клінічних випробуваннях на ефективність сч ов Підсилення відновлення гемопоетичної функції після хіміотерапії або трансплантування гемопоетичних стовбурових клітин. Ці дози повинні підбиратись з метою компенсування відхилень у фізичному стані пацієнту, і) кількості та типу хіміотерапевтичного засобу або дози опромінення, яким цього пацієнта було піддано. Розвиток реверсування пригнічення стовбурових клітин, спричиненого введенням ІМРКОЇ пацієнту, який піддавався лікуванню, контролюють традиційними способами. со зо При лікуванні лейкозу, одночасно з введенням цитотоксичного лікарського засобу або під час опромінювання, рекомендовано вводити як ІМРКОЇ. для пригнічення нормального мітотичного циклу стовбурових клітин, так і с стимулятор росту лейкозних клітин, наприклад, ІЇ-3 або (М-СЗЕ. Завдяки згаданому протоколу можна досягти «- максимальної різниці між статусом мітотичної активності та чутливістю нормальних та лейкозних клітин до лікарського засобу. -

Приклад 1: Аналіз пригнічення проліферації стовбурових клітин іп мімо ї-

Для виявлення проліферації стовбурових клітин, кількість СРО-5 у 5-фазі мітотичного циклу визначали за допомогою методу "самовбивства" ЗН-Тимідином |Бекер (Вескег") та інші, Віооад 26: 296-308, 1965).

Незрілі гемопоетичні клітини-попередники-Колонієутворювальні Одиниці у селезінці (СЕО-5)-можна виявляти « іп мімо шляхом утворення макроскопічних колоній у селезінці летально опромінених мишей через 8-12 днів після внутрішньовенозного впорскування гемопоетичних клітин | ТГілл (Тіїї) та МакКаллох (МеСшіосі), 19611. - с Для стандартного аналізу проліферації СРО-5, звичайно, застосовують метод "самовбивства". ЗН-Тимідином а (Бекер та інші, 1965). Згаданий метод засновано на включенні тимідину, попередника ДНК, міченого -» радіоактивним ізотопом, (ЗН-Тимідину), до клітини під час синтезу ДНК. СЕРО-5, які знаходяться у фазі синтезу (5-фазі) мітотичного циклу під час проведення випробування, забиваються високим рівнем радісактивності, внаслідок чого стають нездатними до утворення колоній у селезінці. Таким чином, різниця між кількістю СЕРО-5, ш- утворених шляхом впорскування проби клітин, інкубованих без ЗН-Тимідину, і кількістю таких же самих клітин, «г» інкубованих з ЗН-Тимідином, демонструє відсоток проліферативних СЕО-5 у вихідному зразку.

Випробування інгібітору не може проводитись на популяції стовбурових клітин кісткового мозку - нестимульованих тварин, оскільки інгібітор впливає лише на СЕРО-5 у стані мітотичної активності, які складають ко 20 лише 7-1096 від загальної популяції СРО-5 у кістковому мозку нормальних мишей.

Для стимулювання проліферації СРО-5 було використано фенілгідразин (РН) або застосовано сублетальне со опромінення (Лорд (І ога), 1976).

Ми розробили спосіб використання тестостеронпропіонату (ТОР), який засновано на стимулювальному впливі останнього на мітотичну активність СРО-5 |Байрон (Вугоп) та інші, Майте 228: 1204, 1970), який спрощує випробування і не викликає будь-яких побічних ефектів. ТеР-індуковане стимулювання проліферації

ГФ) СРИ-5 через 20-24 години після впорскування і його вплив можна спостерігати, як мінімум, впродовж 7 днів. кю Процедура, застосована для скринінгу фракцій під час очищення інгібітору, виглядала наступним чином:

Миші: Під час проведення усіх іспитів були використані миші ліній ВОЕ. або СВЕ..

Мишам-донорам вводили 1Омг/100г дозу Т5Р внутрішньоочеревинним впорскуванням з розрахунку бо О,2мл/мишу з метою переведення 30-3595 СЕРИО-5 до 5-фази.

Через двадцять чотири години зі стегнової кістки відбирали кістковий мозок для виготовлення клітинних суспензій. Після цього від п'яти до десяти мільйонів клітин на мл інкубували з різними контрольними та експериментальними фракціями впродовж 3,5 годин при 372С на водяній бані з двома пробірками для кожної групи (одна для гарячої (радіоактивної) і одна для холодної (нерадіоактивної)). 65 Через 3,5 години до кожної гарячої пробірки у об'ємі 200мкл на мл клітинної суспензії додавали ЗнН-Тимідин

(ІмікроКюрі/мл, питома активність 18-25Кюрі/ммоль); до холодних пробірок не додавали нічого. Інкубування додатково провадили впродовж 30 хвилин при 3720.

Після 30-хвилинного інкубування реакцію забиття було завершено шляхом додання 10 мл холодного (4 ес)

Живильного середовища, до складу якого входило 40О0мкг/мл нерадіоактивного Тимідину. Клітини екстенсивно промивали (З рази).

Клітини ресуспендували і розводили до необхідної концентрації для впорскувань, як правило, 2-4 х10"клітин на мишу у 0,3-0,5мл.

Мишей-реципієнтів, 8-10 на групу, опромінюють не пізніше, ніж за 6 годин до впорскування.

Селезінки мишей-реципієнтів збирають на 9-12 день і фіксують у розчині Теллесницького; підрахунок колоній здійснюють неозброєним оком. Відсоток клітин у 5-фазі вираховують за допомогою наведеної далі формули: 8 на 1005) де а - кількість СЕО-5 без ЗН-Тимідину де Ь - кількість СЕО-5 з ЗН-Тимідином

Експериментальні дані з ІМРКОЇ, наведені у Таблиці 1, демонструють, що стовбурові клітини у стані мітотичної активності після обробки ІМРКОЇ. стають стійкими до дії ЗН-Тимідину. Для цього та усіх наступних прикладів, термін "рРІМРКОЇ" означає очищений білок з свинячого кісткового мозку. Такий же самий захист спостерігається у разі цитотоксичних лікарських засобів, специфічних для З-фази, цитозинарабінозиду та тідроксисечовини (дані не наведено). У разі, якщо оброблені стовбурові клітини після цього промити холодним живильним середовищем, до складу якого входить нерадіоактивнкий Тимідин, стовбурові клітини, які вижили, проліферують у мишачих селезінках з нормальним утворенням колоній. сч 7 9 ріМРКОЇ. на проліферацію СРО-5 впродовж чотиригодинного інкубування з клітинами кісткового мозку со » й - «

Приклад 2: Аналіз пригнічення проліферації стовбурових клітин іп мйго че

Безпосередній ефект ІМРКОЇ було продемонстровано за допомогою наведеної далі експериментальної системи |Лорд та інші, Те Іппірйоге ої Нетаїйороїіевзів. стор.227-239, 1987). Лінію стовбурових клітин, залежну від полівалентного фактору росту (1-3), РЕОСР тіх А4 (А4), підтримували на живильному середовищі

Дульбекко, модифікованому за способом Іскоза (МОМ), доповненому 2095 конячої сироватки та 1090 «

Кондиціонованого живильного середовища УЕНІ-3, як джерела колонієстимулювального І1І--3. шщ с Для визначення проліферації було використано пробу на включення тимідину, міченого радіоактивним ц тритієм: клітини А4 (5х107 у 100мкл живильного середовища з 2095 конячої сироватки та 50956 СМ "» (кондиціонованого живильного середовища) М/ЕНІ-3) інкубували при 372С у 5956 СО» впродовж 16 годин.

На початку додавали рІМРКОЇ або неочищений ВМЕ (екстракт кісткового мозку) (фракція ІМ). Після цього до кожної групи на З додаткових години інкубування додавали тимідин, мічений радіоактивним тритієм (ЗН-таюк) - 3З,7КБк у 5БОмкл при 740ГБк/ммоль). Рівень проліферації вимірювали шляхом збору клітин та 95 пригнічення їз вираховували за допомогою наведеної далі формули: 95 пригнічення - сртбезічР БОЇ. - срт з ІМР БОЇ. х 10095) - срт безІМР ОЇ. т 50 Включення тимідину, міченого радіоактивним тритієм (ЗН-Так) клітинами ЕОосСР тіх-А4, які було вирощено у присутності певних доз екстракту нормального кісткового мозку або рІМРКОЇ, представлено на Фіг.б6. Видно, що

ІЧ е) активність очищеної композиції рІМРКОЇ майже у 1000 разів перевищує активність вихідного матеріалу. Час експонування (16 годин) є важливим фактором для ефективного пригнічення і демонструє ознаки безпосереднього впливу рІМРКОЇ. на стовбурові клітини лінії клітин А4.

Приклад З: Пригнічення проліферації СРО-5 за допомогою впорскування ІМРКОЇ іп мімо. Дози та тривалість ефекту о Дослідження ефекту впорскування ІМРКОЇ іп мімо виявило, що ІМРКОЇ. може ефективно блокувати рекрутинг іме) СРИ-5 до мітотичного циклу, і, тим самим, забезпечувати захист цих клітин від цитотоксичного впливу наступної обробки, що демонструє його потенційну клінічну придатність. 60 Експериментальний протокол переслідував дві мети: перевірити ефект ІМРКОЇ на СРО-5 у разі впорскування іп мімо та визначити ефективну тривалість активності ІМРКОЇ. відносно стовбурових клітин, які знаходяться у стані мітотичної активності.

Для стимулювання проліферації СРО-5 вдавались до впорскування тестостеронпропіонату, виходячи з ефекту, згаданого перед тим у Прикладі 1. 65 Мишам лінії ВОР. впорскували ТР (1Омг/100г) у День 0; через 24 години мишам кожної експериментальної групи (4 миші на групу) внутрішньоочеревинно впорскували ріМРКОЇ у дозах Омкг, 5мкг, 1Омкг та 15мкг/мишу.

Через 24 години після впорскування рІМРКОЇ. мишей забивали і відсоток СРО-5 у стані мітотичної активності визначали пробою, опис якої наведено у Прикладі 1. Впорскування ТОР індукувало перехід, приблизно, 5090

СРО-5 до стану мітотичної активності, у порівнянні з 7956 у необроблених мишей. рІМРКОЇ. у дозах, які складали

Всього 2мкг/мишу, був спроможним пригнітити ТеР-індуковану проліферацію до нормального рівня.

З метою оцінки тривалості ефекту, одній групі мишей (21 миша на групу) впорскували тільки ТУР, а іншій групі впорскували як ТУР, так і рІМРКОЇ (через 24 години після Т5Р). Мітотичну активність СРО-5 визначали кожні 24 години впродовж тижня шляхом відбору З донорів від кожної групи та вимірювання мітотичного статусу

СРО-5 у їх кістковому мозку за методом, опис якого було наведено перед тим (див. Приклад 1). Дані, 70 представлені на Фіг.7, показують, що, у той час, як тривалість ефекту ТОР дорівнює, як мінімум, 7 дням, одноразове впорскування ІМРКОЇ. може перевести СРО-5 до неактивного стану і утримувати їх від переходу до стану мітотичної активності впродовж не більше, ніж 48-72 години. Оскільки період напіввиведення іп мімо більшості хіміотерапевтичних засобів, які використовуються при раковій та лейкозній хіміотерапії, є відносно коротким, і складає, як правило, менше, ніж 24 години, тривалість ефекту ІМРКОЇ, відповідно до одержаних /5 даних, є довшою, аніж ефективний час, впродовж якого хіміотерапевтичні засоби, наприклад, цитозинарабінозид або гідроксисечовина, зберігають свою активність іп мімо. Більш важливим є те, що у разі хіміотерапії та променевої терапії, які мають більш тривалі інтервали (більше 24 годин і менше 96 годин) між першим (під час якого стовбурові клітини не пошкоджуються) та другим (який викликає пошкодження СЕИО-5) сеансами, одноразове впорскування ІМРКОЇ. під час інтервалів між двома застосуваннями хіміотерапевтичного засобу або опромінення повинно бути достатнім. Для декількох повторних циклів цитотоксичної або променевої терапії може застосовуватись та ж сама стратегія, виходячи з тривалості ефекту ІМРКОЇ.

Приклад 4: Більшість первинних гемопоетичних стовбурових клітин. стимульованих до прискореного мітотичного циклу після обробки 5-РО. захищаються ІМРКОЇ від другої обробки 5-БИ

Лікарський засіб 5-фторурацил (5-ЕО) докорінно зменшує численність клітин у мієлоїдній та лімфоїдній сч г пакунах. Цей лікарський засіб розглядають, звичайно, як мітотично специфічний і прицільно діючий на клітини у стані прискореної проліферації, оскільки наслідком включення нуклеотидного аналогу до ДНК на 5-фазі і) мітотичного циклу або перед ним є загибель клітини. Одноразова доза 5-БО не впливає на довгострокову виживаність та імуногемопоетичне відновлення кісткового мозку мишей; було, однак, продемонстровано

ІГаррісон (Наїтізоп) та інші, Віоод 78: 1237-1240, 1991), що поліпотентні гемопоетичні стовбурові клітини со зо «РНЗС) стають вразливими до другої дози 5-ГО на короткий період часу, приблизно, 3-5 днів після початкової дози. Це може пояснюватись тим, що мітотичний цикл РНЗС, як правило, є надто повільним для того, щоб с одноразова доза 5-ЕО могла бути ефективною, і згадані клітини стимулюються до прискореного мітотичного «- циклу стимулами, які виникають внаслідок початкової обробки 5-РО. Ми гадаємо, що РНОЗС можна повернути до статусу повільної мітотичної активності за допомогою ІМРКОЇ і, тим самим, захистити їх від другої обробки 5-РО. «

Під час проведення цих експериментів було використано мишей-самців лінії ВОЕ.. Концентрований розчин ї- 5-РУ (компанія бідта) було виготовлено у фізрозчині при концентрації 1Омкг/мл. Кожній з оброблених мишей вводили 2мг 5-РЮО на 10г маси тіла через хвостову вену у День 0 експерименту; через 24 години мишам внутрішньоочеревинно було впорскнуто рІМРКОГ. (1Омкг/100г маси тіла), та у День З їм було впорскнуто другу дозу 5-ГО. Дослідження виживаності проводили шляхом контролювання загибелі мишей у експериментальній « (введення рІМРКОГ) та контрольній групах (кожна з яких складалась з 30 мишей). Криві виживаності з с представлено на Фіг.8.

Приклад 5: Порівняння впливу попереднього інкубування з ІМРКОЇ. та МІР-1А на клітини кісткового мозку ;» Метою цього експерименту було порівняння пригнічувальних ефектів попереднього інкубування з рІМРКОЇ. та

МІР-1А на клітини мишачого кісткового мозку іп міїго.

Було використано наступну процедуру: -І іп мімо: мишам лінії ВОР. віком 6-15 тижнів впорскували 200мг/кг 5-РО внутрішньоочеревинно за 48 годин до збору кісткового мозку зі стегнових кісток. е іп міго: Підраховували одиночну збірну суспензію клітин і 5х105 клітин інкубували, загалом, у 2мл з або без - рІМРКОЇГ. або МІР-1А з 595 конячої сироватки, у живильному середовищі ІМОМ з доданим І -глутаміном, при 372 кю 5р0 та 5 СО» впродовж 4 годин. Після цього клітини двічі промивали і повторно підраховували. Згадані клітини висівали до метилцелюлози за наступних наведених далі кінцевих умов: со 0,896 метилцелюлози 25906 конячої сироватки 2Онг/мл рекомбінантного мишачого ІІ -3 доданий І -глутамін о Бх105 клітин на мл живильне середовище ІМОМ іме) Планшети інкубували впродовж 11 днів при 372С та 5956 СО» при 10095 вологості. Підраховували колонії, які мали більше 50 клітин. 60 бо

Приклад 6: ІМРКОЇ. пригнічує проліферацію НРР-СЕС

Аналізом іп міго для визначення відновлюваних мишачих стовбурових клітин та ранніх клітин-попередників є аналіз колонієутворювальних клітин з високим проліферативним потенціалом (НРР-РЕС); інші споріднені типи аналізу, наприклад, СРО-А, СЕО-ОМ, СРО-Е та СЕО-СЕММ дозволяють виявити популяції клітин-попередників, чисельність яких прогресивно зменшується |М. Мур (М. Мооге), Віоод 177: 2122-2128, 1991). Цей приклад показує, що попередня обробка клітин рІМРКОЇ. пригнічує їх проліферацію, у той час, як МІР-1ТА не викликає таких наслідків за тих же самих експериментальних умов.

Мишей лінії ВОЕ. обробляли 5-фторурацилом (200мг/кг внутрішньоочеревинно) перед проведенням аналізу 7/о на кількість НРР-СЕС у їх кістковому мозку. Клітини промивали центрифугуванням та інкубували при густині від 106 до 5х105/мл у живильному середовищі без доданого засобу (Контроль), з доданим ріМРЕО!. (25нг/мл) або

МІР-1А (200нг/мл) впродовж 4 годин. Після інкубування клітини промивали і висівали до агару (0,395) з 3095 ЕС та комбінованим живильним середовищем від ліній клітин 5637 та МУЕНІ-3В (7,595 кожного живильного середовища, як рекомендовано Шарпом (Зпагр) та іншими, 1991). Концентрація посіву складала 5 х10"клітин/мл 75 у вОмм чашках. Підрахунок колоній проводили на 14 день, одержані результати наведено далі. 2

Відповідно до цих результатів, МІР-ТА не пригнічував проліферацію більшості незрілих клітин-попередників у разі присутності тільки впродовж періоду попереднього інкубування. рІіМРКОЇ ефективно пригнічував Ге проліферацію за тих же умов, що свідчить про фундаментальну різницю між рІМРКОЇГ. та МІР-1А з точки зору о біологічної активності.

Приклад 7: Терапевтичний ефект ІМРКОЇ на одужання від радіаційно індукованої аплазії кісткового мозку

Аплазія кісткового мозку є головним обмежувальним токсичним фактором променевої терапії раку. Було показано, що деякі фактори росту (наприклад, 5-С5Е, ЗМ-С5Е, еритропоетин) можуть прискорювати одужання (ее) від радіаційно індукованої аплазії кісткового мозку. Концепція захисту шляхом застосування |інгібітору сч проліферації стовбурових клітин є іншим та доповнювальним підходом до проблеми боротьби з гематологічними ураженнями. Для того, щоб скористатися терапевтичною процедурою, яку було розроблено раніш (Приклади «- 3-4), розробили модель летального опромінення мишей. У цій галузі техніки відомо, що миші, яких було « опромінено 9Гр кобальту 60, починають вмирати через 10-14 днів; на ЗО день рівень смертності складає, приблизно, 5095. Цю летальну дозу було застосовано у нашій моделі шляхом розподілу її на два послідовні - сеанси по 4,5Гр кожний з інтервалом у З дні між дозами. Попередні дані показали, що крива виживаності у цій моделі була дуже близькою до кривої, відомої для одноразового опромінення ОГр; більше того, аналіз проліферації СРО-5 показав, що через 24 години після першого опромінення у 35-5095 СЕО-5 індукується « проліферація. Захист таких клітин може забезпечуватись інгібітором стовбурових клітин, введеним перед другою дозою. ші с З метою перевірки цієї можливості, мишей (5омишей/групу) у День 0 було опромінено дозою 4,5Гр. Через 24 ч години одній групі ввели ріМРКОЇ (2мкг/мишу внутрішньоочеревинно), а другій, контрольній групі, було -» впорскнуто фізрозчин. Другу дозу опромінення (4,5Гр) миші одержали на З день.

На Фіг.9 показано підвищення виживаності після однієї дози рІМРКОЇ. Умови згаданої моделі є клінічно придатними для лікування раку будь-якого типу, у тому числі тих, які характеризуються наявністю твердих -і пухлин; подібному лікуванню можна було б піддавати ракового хворого шляхом введенім ефективної дози ї» ІМРКОЇГ. між двома послідовними дозами опромінення, що дозволило б застосувати підвищені дози опромінення для лікування раку. Цей спосіб впливу можливо було б поширити також на хіміотерапевтичні засоби. -й Приклад 8: Застосування ІМРКОЇ. для трансплантування автологічного кісткового мозку 7 50 Трансплантування кісткового мозку є єдиним відомим способом лікування лейкозів декількох типів (СМІ. (хронічний мієлолейкоз), АМІ. (гострий мієлобластний лейкоз) та інші). Кондиціювання автологічного кісткового со мозку ех мімо для трансплантування повинно забезпечити потенційні автологічні джерела нормальних стовбурових клітин, вільних від лейкозного забруднення та здатних до повторного заселення гемопоетичної системи реципієнта для забезпечення агресивної та ефективної терапії. 1. Культура декстерівського типу І 1210. як модель лейкозу для дослідження ефекту ІМРКОЇ зі збереженням о нормального гемопоезу під час десенсибілізування пухлинних клітин за допомогою Агас

Культури декстерівського типу (ТВМС) одержували за методикою, запропонованою Токсозом (ТоКво7) та іме) іншими |Віоса 55: 931-936, 19801); лінію лейкозних клітин І 1210 було адаптовано до | ТВМС шляхом сумісного культивування впродовж 2 тижнів. У цих комбінованих культурах І! ТВМС/ 1210 відбувався одночасний ріст бо нормальних та лейкозних клітин-попередників, що нагадує ситуацію у кістковому мозку лейкозного пацієнту.

Розрізнення між нормальними колонієутворювальними одиницями (СЕУ) та лейкозними СРО було можливим завдяки їх вирощуванню у вигляді колоній на агарі у присутності або у відсутності комбінованого живильного середовища від У/ЕНІ-3 (мишача лінія клітин-продуцентів 1-3). Нормальні клітини піддаються апоптозу у присутності ІЇ/-3, у той час, як лейкозні клітини за його відсутністю утворюють колонії. Суспендовані клітини 65 композиції І ТВМС-1 1210 давали, приблизно, 150 колоній у присутності ІІ -3 (нормальні гемопоетичні клони) та 70 колоній у разі вирощування без ІІ -3 (лейкозні клони) (на 50000 висіяних клітин).

Процедура десенсибілізування пухлинних клітин виглядала наступним чином: у День 0 усі суспендовані клітини та живильні середовища (1Омл/матрас) видаляли з матрасів з І! ТВМС-1Ї 1210 і заміняли 2мл живильних середовищ, до складу яких входило 200мкг цитозинарабінозиду (АгасС) ІЦирлова (Тзугіома) та інші, у І еикетіа:

Адуапсез іп Віем апа ТНнегару, том 35, 1988); після 20 годин інкубування матраси промивали і до них на 4 години вносили по 2мл тільки свіжих живильних середовищ (контрольна група ) або живильних середовищ, до складу яких входив ріМРКОЇ (25нг/мл). Після цього попереднього інкубування клітини знову інкубували з 100мкг/матрас АгасС впродовж З годин при 372С. Кожну групу складало 4 матраси. Культури І ТВМС-Ї 12101. тричі промивали і заміняли свіжим живильним середовищем І ТВС; їх підтримували, як і попередньо, для проведення 7/0 досліджень відновлення впродовж 3-4 тижнів.

Дані представлено на Фіг.10. У контрольних культурах, які було оброблено тільки АгасС, ріст клітин не спостерігався, у той час, як у матрасах, захищених ІМРКОЇ, відновлення гемопоезу відбувалось набагато швидше внаслідок проліферації клітин-попередників з адгезивного шару. Більше того, клітини з експериментальної групи, у разі висадження на агар, росли тільки у присутності ІІ -3 і давали, приблизно, 100 75 СРО на 50000 клітин; впродовж, як мінімум, 4 тижнів ніякого росту лейкозних клітин не спостерігалось. Таким чином, кістковий мозок, оброблений ех мімо ефективною дозою АгаС у комбінації з ІМРКОЇ може бути позбавленим ракових клітин, у той час, як стовбурові клітини виявляються захищеними. Існує можливість розповсюдження цього способу впливу на інші форми хіміотерапії або променевої терапії. 2. Репопуляційна здатність кісткового мозку (МКА) та тридцятиденний радіаційний захист підвищуються 2о завдяки обробці ІМРКОГ ом іп міго

МЕРА, тобто здатність клітин до повторного заселення кісткового мозку летально опромінених мишей, разом зі здатністю забезпечувати радіаційний захист впродовж 30 днів, є безпосереднім визначенням іп мімо потенціалу рятування мієлосупресованих тварин |ІВісер (Міззег) та інші, Віооса СеїЇз 14: 369-384, 19881.

З метою проведення досліджень явища радіаційного захисту, мишей лінії ВО. опромінювали дозою 9,5Гр та с лікували трансплантуванням кісткового мозку тестостеронстимульованих донорів. Одну групу реципієнтів було виліковано шляхом трансплантування клітин кісткового мозку, попередньо проінкубованих впродовж 4 годин з о живильним середовищем (контроль-група А) і іншу (групу В) - з 25нг/мл ріМРКОЇ. Клітини у обох групах промивали і опроміненим тваринам було трансплантовано ЗО0ООклітин/мишу. Надано дані по виживаності (Фіг.11). Відображено суму З експериментів; контролі нормалізовано до 10095. Інкубування з рІМРКОЇ підвищило о виживаність мишей у контрольній групі з 36,595 до 61,8905 на 30 день.

Підвищення МКА, індуковане попереднім інкубуванням з ІМРКОЇ,, може бути одним з механізмів поліпшення с радіаційного захисту. З метою перевірки згаданої гіпотези, рівень МКА визначали за методикою, -«жпе запропонованою Вісер та іншими (цитована робота). Стисло, мишей-донорів лінії ВОЕ- попередньо обробляли тестостероном, їх кістковий мозок попередньо інкубували з живильним середовищем або рІМРКОЇ. впродовж 4 в годин та впорскували опроміненим тваринам. На 13 день клітини кісткового мозку з стегнової кістки реципієнту ча висівали на агар з З різними концентраціями (0,01, 0,05, 0,1 еквіваленту стегнової кістки) у присутності 2090 конячої сироватки та 1095 УМЕНІ-СМ. Кількість колоній на 7 день відображала МКА, оскільки колонієутворювальні клітини у кістковому мозку реципієнтів на той час були клітинами-попередниками незрілих стовбурових клітин донора. «

Як показано на Фіг.12, МКА популяції клітин, попередньо проінкубованих з ІМРКОЇ, є вищою, аніж у шщ с контрольній групі (В). й Приклад 9: Антигіперпроліферативний ефект ІМРКОЇ на стовбурові клітини може змінити аномалії, які «» спостерігаються серед них під час диференціювання

Гіперпроліферація СРО-5 спостерігається не тільки під час відновлення після застосування цитотоксичних лікарських засобів або опромінення, але також як наслідок нормального старіння, і, як гадають, це є головною -і особливістю Мієлодиспластичного Синдрому (МОБ). Він супроводжується порушенням диференціації, наприклад, перевагою на користь еритроїдної диференціації, у той час, як диференціація по гранулоцитарному шк шляху зменшується. - Клітини кісткового мозку інкубували впродовж 4 годин при 372С з 25нг/мл рІМРКОЇ. або живильних середовищ (Контроль), промивали, після чого висівали на агар з 2095 конячої сироватки, 2оОд./мл еритропоетину та 1090 о М/ЕНІ-СМ. Кількість колоній ВРО-Е та ОМ-СРІШ підраховували на 7 день. У Таблиці 4 наведено дані, узагальнені с для З експериментів - для кожної групи було взято 4 тварини на часову точку; засівали по 4 чашки.

Як випливає з Таблиці 4, інкубування нормального кісткового мозку (МВМ) від інтактних молодих тварин (миші лінії ВО. віком 8-12 тижнів) з ІМРКОЇ не змінило кількості або пропорції колоній різних типів. Миші-донори лінії ВОЕ/, попередньо оброблені тестостеронпропіонатом (ТР), продемонстрували таке ж саме підвищення проліферації СЕО-5, яке спостерігалось перед тим (Приклад 1, 3, 4), незначне підвищення кількості о клітин-попередників еритроцитів (колонії ВРО-Е) та скорочення (ЗМ-СРИ, що було повністю ліквідоване внаслідок ко інкубування з ІМРКОЇ.. На додаток до цього, аномально високий рівень проліферації СРО-5 повернувся до 1090

СРО-5 на 5-фазі мітотичного циклу. Відомо, що гіперпроліферація СРО-5 є особливістю деяких мишачих ліній, бо сприйнятливих до індукування вірусного лейкозу, наприклад, мишей лінії ВаІр/с (Таблиця 4) і може також спостерігатись у тварин старшого віку (Таблиця 4). Той же самий перерозподіл детермінованих клітин-попередників, який спостерігався у мишей лінії ВО 4, оброблених ТР, спостерігається у мишей лінії

Ваїр/с та у мишей лінії ВОР. старшого віку (23-25 місяців), спільним для яких є аномально високий рівень проліферації СРО-5. Корекція як проліферації СРО-5, так і диференціації була індукована інкубуванням з 65 ІМРКОЇГ.. Ще більш важливе клінічне значення має те, що результати досліджень показали, що впорскування

ІМРКОЇ іп мімо (2мкг/мишу) впливало як на проліферацію СЕРО-5, так і на співвідношення еритроїдних (ВЕО-Е) та

ОМ-колоній (Таблиця 4). детерміновані клітини- попередники ВРО-Е та СРО-СМ

Ж 15,041,3 22,00-3,74 |А7,703,72

Старі миші лінії ВО - 47,1-1,9 43,75--1,54 | 24,0--1,33 » нн ЕН ЕД ес

Ж 720 12,0041,83 |35,50-1,А

Ж 23,042,4 24,86-2,53 |70,60-4,96

Приклад 10: Імуностимуляторна активність ІМРКОЇ.

Спостерігали, що інкубування клітин кісткового мозку, які включають високу пропорцію проліферуючих

СРИ-5, з ІМРКОЇ. не тільки змінювало мітотичний цикл СРИО-5, але і їх диференціацію; переважно, еритроїдна диференціація змінювалась на користь гранулоцитарних та лімфоїдних клітин-попередників. Ця властивість |МРКОЇ. має значення внаслідок імуносупресорних побічних ефектів цитотоксичної хіміотерапії або променевої терапії, а також імуносупресії, яка супроводжує розлади, обумовлені гіперпроліферацією стовбурових клітин та старінням.

Цей приклад показує прямий вплив ІМРКОЇ. на диференціацію незрілих клітин-попередників довгоїснуючих культур лімфоцитів (ГТС), які було одержано за методикою, запропонованою Уіїтлоком (УМіШосКк) та Уіїттом с (МУЩе) |Апп. Кем. Іттип. 3: 213-35, 1985), на клітини-попередники перед-В, який визначали за утворенням о колоній у метилцелюлозі, до складу якої було включено ІІ -7.

ЇСТС одержували, як було описано перед тим, і підкормлювали свіжим живильним середовищем ГТС (компанія Тегпу Рох І арз., Ванкувер, Канада) двічі на тиждень. Неадгезивні клітини збирали один раз на тиждень, промивали від факторів та інкубували впродовж 4 годин з 25нг/мл рІМРЕОЇ або тільки з живильним 99 середовищем для контролю. Після інкубування клітини промивали та висівали у концентрації 10 "клітин/мл до с метилцелюлози, до складу якої було включено 3095 ЕС5 та 1Онг/мл 1-7. Дані З тижнів представлено на Фіг.13.

Кількість великих колоній перед-В у контролі була змінною. Вона підвищувалась з часом, але передінкубування зЙ 87

ІМРКОЇ. завжди стимулювало підвищення росту колоній у 4-8 разів над контрольним рівнем. Це демонструє « імуностимулювальну властивість ІМРКОЇГ,, яка може бути придатною при коректуванні імунодефіцитних станів та 32 при підвищенні необхідних імунних реакцій, наприклад, на вакцинування. -

Приклад 11: ІМРКОЇ. поліпшує репопуляційну здатність стовбурових клітин, які започатковують довгоіснуючі культури клітин від пацієнту з СМІ...

Хронічний мієлолейкоз (ЗМІ) є летальним злоякісним захворюванням гемопоетичних стовбурових клітин. «

Лікуванням СМІ у хронічній фазі шляхом застосування одного хіміотерапевтичного засобу, комбінованої хіміотерапії, спленектомії або опроміненням селезінки можна контролювати клінічні ознаки та симптоми, однак в) с це не забезпечує суттєвого подовження виживаності. В міру того, як СМІ. прогресує від хронічної до прискореної "з стадії, стандартна терапія втрачає свою ефективність. На сьогоднішній день трансплантування кісткового мозку " (ВМТ) є єдиним відомим способом лікування СМІ. Терапевтичні заходи з ВМТ від неспорідненого донора ускладнюються внаслідок проблем з гістосумісністю. Менше 4095 у всіх останніх відношеннях придатних пацієнтів з СМІ буде мати прийнятного спорідненого донора; внаслідок цього перевага надається це. автотрансплантуванню. Кондиціювання автотрансплантату кісткового мозку для вливання разом зі здатністю до їз обирання нелейкозних (Рі-негативних) мієлоїдних клітин-попередників від Рі-позитивних пацієнтів, які було вирощено у довгоїснуючих культурах (ІТС), вказують на потенціал автологічних джерел нормальних - стовбурових клітин щодо забезпечення агресивної та ефективної терапії СМІ. ко 50 У контексті ВМТ гемопоетична стовбурова клітина може визначатись, як така, що має здатність до утворення зрілих клітин крові впродовж значних періодів часу. Нами було використано систему І ТС людини, розроблену К. со Івзом (С. Еамев) та А. Івзом (А. Еамез), як для кількісного визначення стовбурових клітин, так і як засіб маніпулювання ними для терапевтичного використання. Це залучає висівання клітин на попередньо одержаний опромінений адгезивний шар клітин кісткового мозку людини; після цього, ці культури підтримуються впродовж 5 259 тижнів. Кінцевою точкою є загальний вміст клоногенних клітин (адгезивніннеадгезивні) культур, зібраних у

ГФ) кінці цього часового періоду. Вихід клоногенних клітин за цих умов є лінійно зв'язаним з кількістю клітин-попередників (клітин, які започатковують довгоіїснуючі культури клітин (ІТС-ІС)), які було додано на де початку; середній вихід від окремих І ТС-ІС людини дорівнює 4 клоногенним клітинам-попередникам на І ТС-ІС.

Раніше було показано, що у разі, коли клітини кісткового мозку пацієнтів з СМІ. опиняються у подібних умовах, 60 кількість лейкозних (Рі-позитивних) клоногенних клітин різко зменшується. Внаслідок кількісного визначення залишкових нормальних І ТС-ІС у пацієнтів з СМІ. можливо відібрати ті з них, для яких виявиться корисною інтенсивна терапія, підсилена трансплантуванням культивованих автотрансплантатів |Філіпс (РАЙірв) та інші,

Вопе Маїтом/ Тгапзріапіайоп 8: 477-487, 19911.

Наступну процедуру було використано для перевірки впливу ІМРКОЇ на кількість клоногенних клітин (І ТС-ІС) бо серед трансплантатних клітин кісткового мозку, які було одержано з периферійної крові пацієнтів з СМІ.

Культури закладались, як довгоїснуючі на попередньо опроміненій стромі. Периферійну кров здорового донору використовували, як контроль. Клітини периферійної крові пацієнтів з СМІ. попередньо інкубували з або без рІМРКОЇ| (25нг/мл) впродовж 4 годин, промивали і вміщували до системи І ТС-ІС на 5 тижнів для визначення контрольної кількості ГТОС-ІС. Для експериментів інші, паралельні культури підтримувались впродовж 10 днів.

Суміш адгезивних та неадгезивних клітин з культур, які вирощувались впродовж 10 днів, попередньо інкубували з або без рІМРКОЇ і переносили на попередньо одержані фідери на 8 додаткових тижнів. Кількість І ТС-ІС з кожної експериментальної культури визначали шляхом висівання як адгезивних, так і неадгезивних клітин на метилцелюлозу з відповідними факторами росту (компанія Тегпу Рох ІаБрогайюгіех, Ванкувер, Канада) та /о підрахуванням загальної одержаної кількості колонієутворювальних клітин. Показники ГТС-ІС, одержані за допомогою цієї процедури, виводили з оцінки загального вмісту клоногенних клітин (СЕС) за допомогою наведеної формули:

Кількість ГТО-ІС-кількості СЕС/А

Дані, представлені на Фіг.14, показують відсутність втрати ГТС-ІС впродовж перших 10 днів культивування, 7/5 розпочатого з клітин кісткового мозку здорового донору і, приблизно, 3095 від початкової кількості ЇТС-ІС було ще присутнім після 5 тижнів культивування. Кількість ГТС-ІС пацієнту з СМІ. різко зменшилась (приблизно, до 895) впродовж 10-денного періоду і не відновлювалась під час додаткового інкубування, у той час, як попереднє інкубування клітин з ІМРКОЇГ. підвищило рівень І ТС-ІС до 3090 від вихідної кількості і цей рівень підтримувався впродовж 8 тижнів.

До важливих у клінічному відношенні застосувань ІМРКОЇ, які прогнозувались наведеними попередніми даними, належить його використання у стратегіях вибіркового поліпшення вмісту нормальних стовбурових клітин свіжих або культивованих трансплантатів кісткового мозку, стратегіях підсилення рекрутингу залишкових нормальних стовбурових клітин іп мімо, а також у протоколах переносу нового генетичного матеріалу до стовбурових клітин кісткового мозку людини для подальшого трансплантування пацієнтам. с

Приклад 12А: Спосіб виділення імуноактивного інгібітору проліферації стовбурових клітин з препаратів о кісткового мозку

Кістковий мозок виділяли з свинячих ребер. Ребра свинячих туш відокремлювали і очищали від м'язових волокон та жиру, розрізали на шматки і кістковий мозок екстрагували за допомогою гідравлічного пресу, виготовленого компанією Віорпугргірог. Клітини кісткового мозку відокремлювали центрифугуванням на со зо Чентрифузі К-70 при 2000об/хв впродовж 20 хвилин. Після цього супернатант екстракту з успіхом піддавали ультрафільтруванню через мембрани Атісоп ОБА ХМ-100, РМЗО, РМ-50. За даними електрофоретичного с аналізу, головною складовою частиною згаданого продукту є альбумін (див. Фіг.1). «-

Біохімічне очищення

Екстракт кісткового мозку та білкові компоненти фракцій було аналізовано на кожному етапі очищення « засобами гель-електрофорезу у 1095 поліакриламіду, до складу якого входило 0,195 додецилсульфату натрію. М

Перед нанесенням на гель до зразків, які інкубували впродовж 5 хвилин при 70 С, додавали до 195 додецилсульфату натрію та до 0,5-196 меркаптоетанолу.

Електрофорез здійснювали на 20см блоці гелю впродовж 5 годин. Після цього гель фарбували 0,2590 фарбнику Кумасі СВВС 250 у суміші етанол:водаоцтова кислота 5:5:1 впродовж однієї години при 209С і « промивали у декількох змінах 795 оцтової кислоти. Активність одержаного продукту визначали за методом с пригнічення проліферації гемопоетичних стовбурових клітин (СЕРО-5). Докладний опис згаданого методу ц наведено далі. "» Етап 1. Очищення шляхом осадження сульфатом амонію

Активний продукт очищали шляхом осадження сульфатом амонію при 2595 з насиченням до 40-8090, які обирали, виходячи з результатів, наведених у Таблиці 5. -І т - й й й о, їмо) Кількість згаданого препарату, яку було використано для іспитів після кожного етапу очищення, визначали у с відповідності до рівня очищення та еквіваленту дози 2 х102мг вихідного продукту. Активність визначали за формулою:

Уо зміни: УоЗа-05р де 95 За є 905 у контролі до є 905 після інкубування з експериментальною фракцією.

Ф) Згадану фракцію знесолювали для зменшення концентрації сульфату амонію у 20 разів перед кожним ка випробуванням активності та перед кожним наступним етапом очищення.

Етап 2. Неочищений інгібітор з Етапу 1 застосовують після знесолювання та фракціонують за допомогою во іонообмінної хроматографії (у даному випадку, діетгиламіннетилцелюлоза (ОЕАЕ 23)) з наступним елююванням градієнтом натрійацетатного буферу (рнНб,О0).

Активні фракції інгібітору елюювались між 3-5ММ.

Об'єм колонки дорівнював 1мл; швидкість елюювання дорівнювала 4мл/годину. Детектування здійснювали за допомогою хроматографу Міїййспготе на 230 та 280нм. Фракцію 1 (див. Фіг.2), яка демонструвала найвищу 65 активність, виділили та елюювали 5мМ натрійацетатним буфером (див. Таблицю 6).

9 Дані електрофорезу вказують на те, що головний білковий забруднювач - альбумін (див. Фіг.3) видаляється з цієї фракції, наслідком чого є додаткове чотирикратне очищення.

Етап 3. Частково очищений інгібітор з Етапу 2 вносять безпосередньо до колонки 05-75 Зерпадех.

Об'єм колонки дорівнює 2Омл (20х1), швидкість елюювання дорівнює 2мл/годину. Для елюювання /о Застосовують буфер 50мМ Масі, 10мММ Трис-НСІ-буфер, рН7,5. Детектування здійснювали за допомогою хроматографу Міїїїспготе на 230 та 280нм. Було виділено фракцію 5, яка мала найвищу активність. й

Етап 4. Хроматографування з оберненою фазою (РІагтасіа ЕРІ С Зузіет) з використанням колонок Рго-КЕС здійснювали на матриці ОПгазтега. Білок елюювали за допомогою 0,195 трифтороцтової кислоти у градієнті ацетонітрилу.

За результатами аналізу електрофореграми (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію) гомогенність продукту, при молекулярній масі 16-17КД, дорівнювала 9095 (див. Фіг.б).

Згаданий результат представлено на Фіг.4. Активність визначається на фракції 5. Кінцевий вихід продукту складав 595. Як наслідок, загальна кількість білку з молекулярною масою 16КД після очищення дорівнювала б5онг/мл вихідного продукту. Під час процесу очищення згаданий продукт було піддано тепловому інкубуванню при 702С впродовж декількох хвилин, однак втрати біологічної активності виявлено не було. с 29 Приклад 128: Альтернативний спосіб виділення більших кількостей ІМРКОЇ. Ге)

Початкове виділення

Ребра свіжих свинячих туш очищали від м'язових волокон та жиру, розрізали на шматки і просочували фізрозчином, забуференим фосфатом у співвідношенні 1:1 (у відношенні маси до об'єму). Одержану суміш подрібнювати за допомогою гідравлічного пресу для відокремлення кісткового мозку від твердого кісткового со матеріалу. Ге

Суспензію клітин кісткового мозку збирали і відфільтровували від твердих частинок через чотири шари марлі. Фільтрат інкубували при 5623 впродовж 40 хвилин, після чого охолоджували на льодяній бані до 426. -

Одержаний осад видаляли центрифугуванням при 100009 впродовж 30 хвилин при 42С і позбавлялись від нього. «

Просвітлений супернатант прикраплювали впродовж 30 хвилин до 10 об'ємів перемішуваного ацетону, який їч- мав температуру таяння льоду, до складу якого входив 1 об'ємний 95 концентрованої хлористоводневої кислоти.

Одержану суміш витримували при 42С впродовж 16 годин для повного утворення осаду. Після цього згаданий осад гранулювали при 200009 впродовж 30 хвилин при 42. Цей гранулят промивали холодним ацетоном і висушували. «

Очищення засобами високоефективної рідинної хроматографії (НРІ С) шщ с Згаданий гранулят розчиняли у буфері А НРІ С для елюювання, до складу якого входило 595 ацетонітрилу й (Мескм) та 0,195 трифтороцтової кислоти (ТЕА), до одержання кінцевої концентрації білку 8-1ТОмг/мл. Цей розчин а (0,5-0,бмл) вносили до хроматографувальної колонки (250х4,бмм), заповненої Роїїзві 005-300 (1Омкм) і урівноважували за допомогою того ж самого буферу А.

Елюювання здійснювали градієнтом буферу В (9095 Месм, 0,195 ТРА) у буфері А зі швидкістю Імл/хвилину за -і наступною програмою: ї- Час, хвилини В - о о 4 о о 29 5 25 с 25 90

Було введено додатковий етап (10095 В впродовж 5 хвилин) для промивки колонки перед повторним врівноваженням. Після цього колонку знову урівноважували для повернення її до вихідного стану та для введення наступної порції білкового розчину. Типову хроматограму представлено на Фіг.5. (Ф; Під час розподілу елюент колонки контролюється на 280нм для виявлення білкових піків. Фракції, до складу

ГІ яких входить білковий матеріал, збирають, розподілені піки об'єднують та випарюють на роторному випарювачі при З309С до сухості. Одержані залишки розчиняють у дистильованій воді, піддають випробуванню на 60 біоактивність та ЗО5-РАСЕ (1495 гель, відновлювальні умови). Пік, який вміщує активний матеріал, елююють між 70 та 8095 буферу В; за даними ЗО5-РАСЕ, до його складу входить головна смуга білку 16КД та сліди білків, які переміщуються з більшою швидкістю.

Аналіз матеріалу, одержаного при збиранні тільки другого головного піку НРІ С, представлено на Фіг.15 (А та С). Матеріал, до складу якого входять обидва піки (наприклад, Фіг.5), позначається у цьому описі, як 65 рІМРКОЇ. Препарат 1; матеріали, до складу яких входить лише другий пік, позначаються у цьому описі, як рІМРКОЇ. Препарат 2. 50О0мкг згаданого активного очищеного рІМРКОЇ Препарату 2 вносили до колонки з оберненою фазою С4 (компанія Мудас) і елюювали за допомогою лінійного градієнту 59595 ацетонітрилу у 0,190 трифтороцтової кислоти. Матеріал елюювався у вигляді окремого піку у 5390 ацетонітрилу (Фіг.15А). У разі прогонки 250мкг МІР-ТА (компанія К 85 ОО Бувіетв) за ідентичних умов, він, однак, елюювався у 43,990 ацетонітрилу (Фіг.158 - зверніть увагу на те, що піки, які попереджають 1495 ацетонітрилу, є артефактами і обумовлені пузирями повітря у детекторі). Таким чином, природний ІМРКОЇ. є значно гідрофобнішим, аніж

МІР-ТА за тих же самих умов. Відомо, що ТОЕр елююється при нижчих концентраціях, аніж ті, які спостерігаються у разі рІМРКОЇ. за тих же самих умов |Міазоно (Міуагопо) та інші, 9. Віої. Спет. 263: 6407-15, 19881. 70 Гель елюйованого рІМРКОЇ. матеріалу представлено на Фігурі 15С. Смуга 1 - неочищений матеріал, Смуга 2 - маркери молекулярної маси та Смуга З - очищений матеріал. Існує дві головні смуги, одна приблизно на 14КД і ще одна приблизно на З5КД. Гадають, що смуга З5КД є полімерною формою смуги 14КД.

Приклад 13ЗА. До складу активних препаратів ІМРКОЇ. входить бета-ланцюг гемоглобіну

РІМРКОЇГ. було одержано, як показано на Фіг.5 (тобто рІМРКОЇ. Препарат 1 (див. Приклад 128)). Матеріал піддавали 5ЗО5-РАСЕ і переносили до нітроцелюлози за стандартною методикою. Згаданий матеріал було піддано М-кінцевому секвенуванню за допомогою білкового секвенатору АВІ477А з аналізатором 120А Опіїпе

РТН-АА за стандартною методикою. Було одержано наступну М-кінцеву послідовність:

МНІЗАЕЕКЕАМІ СІ МСКУММОМ.

За даними комп'ютерного пошуку білкових баз даних виявилось, що ця послідовність була ідентичною

М-кінцевій послідовності бета-ланцюгу свинячого гемоглобіну (порівняй Фіг.16С).

Приклад 138. До складу активних препаратів ІМРКОЇ. входить бета-ланцюг гемоглобіну

Як показано на Фіг.15С, білок, очищений після збирання другого головного піку, який представлено на Фіг.5 (тобто, рРІМРКОЇ. Препарат 2), дав дві головні смуги, які відповідають молекулярним масам приблизно 15КД та

ЗОКД, а також декілька другорядних смуг. ЗОЗ-РАСЕ гелі було перенесено до нітроцелюлози за стандартною сч ов Методикою; окремі смуги було вирізано та піддано М-кінцевому секвенуванню, як у Прикладі 13А. Для смуги 15КД було одержано наступну М-кінцеву послідовність: і)

МІ ЗААОЯКАМУКААМ ОКУ.

Смугу ЗОКД було піддано обмеженому протеолітичному розщепленню; одержали наступну внутрішню послідовність: "ЕРНЕМІ БНОЗБРОМК со зо Перша послідовність є ідентичною М-кінцевій послідовності альфа-ланцюгу свинячого гемоглобіну, у той час, як друга послідовність є ідентичною залишкам 43-56 альфа-ланцюгу свинячого гемоглобіну (див. Фіг.16С для с порівняння послідовності альфа- та бета-ланцюгів чоловічого, мишачого та свинячого гемоглобіну). Повторне «- секвенування цих смуг, а також деяких з другорядних смуг, постійно давало ділянки послідовності альфа-ланцюгу гемоглобіну. Таким чином, різні смуги, наведені на Фіг.15С, представляють фрагменти або «

Зв агрегати альфа-ланцюгу свинячого гемоглобіну. Приклад 13С: Додаткове визначення характеристик свинячого ї-

ІМРКОЇГ..

Для додаткового порівняння рІМРКОЇ з свинячим гемоглобіном, від компанії Зідта Спетіса! Сотрапу одержали двічі кристалізований свинячий гемоглобін та піддали його НРІ С з оберненою фазою, як описано у

Прикладі 1288 для Фіг.15. Як показано на Фіг.17, НРІ С хроматографа інтактного гемоглобіну є подібною до « Ххроматограми рІМРКОГ. Препарату 1. Додатково, у разі безпосереднього порівняння, хроматограма рІМРКОЇ. з с Препарату 2, яку представлено на Фіг.17А (тобто, який було одержано з другого піку Фіг.5), перекривається з хроматограмою двох інших піків свинячого гемоглобіну (Фіг.17В), з часом утримання 52,51 та 52,25 хвилин для ;» головних піків, відповідно. Слід звернути увагу на те, що гем сумісно мігрує з першим головним піком у гемоглобіні, у цьому випадку на 49,153 хвилини; таким чином, гем є складовою ріМмРКОЇ Препарату 1, а не Препарату 2. Це підтверджується відсутністю поглинання цього рІМРКОГ. препарату на 575нм, тобто на довжині -І хвилі, яка є діагностичною для присутності гему.

Запрогнозовані молекулярні маси альфа- та бета-ланцюгів свинячого гемоглобіну дорівнюють 15038 Дальтон пи та 16034 Дальтон, відповідно. Як видно на 50О5-РАСЕ хроматограмі на Фіг.18, перші два піки складаються з - ланцюгу більшої молекулярної маси, у той час, як два других складаються з ланцюгу меншої молекулярної маси.

Таким чином, перші два піки представляють бета-ланцюг гемоглобіну, а два других піки представляють ю альфа-ланцюг гемоглобіну. с Було проведено додаткові розподіли свинячого гемоглобіну з застосуванням градієнту елюювання широкого діапазону (Фіг.21). М-кінцевий аналіз цих піків продемонстрував, що перший пік є альфа-ланцюгом, а другий - бета-ланцюгом свинячого гемоглобіну. Результати біопроби підтверджують, що обидва ізольовані ланцюги гемоглобіну є біологічно активними (наприклад, Приклади 14 та 15).

З метою додаткового порівняння рІМРКОЇ Препарату 2 та бета-ланцкну гемоглобіну, було проведено

Ф) двомірний високовольтний електрофорез (Фіг.19). У першому вимірі, ізоелектричне фокусування здійснювали у ка скляних пробірках за допомогою 295 амфолінів, рН4а-8, при 9600 вольт-годинах. Тропоміозин (молекулярна маса

ЗЗКД, рі 5,2) було використано, як внутрішній стандарт; його позицію на кінцевому двомірному блоці гелю бор позначено стрілкою. Гель у пробірках було урівноважено у буфері з наступним перенесенням на концентруючий гель, після чого нанесено на блок 12,595 акриламідного гелю. Електрофорез у гелевому блоці у присутності додецилсульфату натрію проводили впродовж 4 годин при 12,5мА/гель. Гелеві блоки забарвлювались сріблом та висушувались.

Під час порівняння двомірних високовольтних електрофоретичних профілей було встановлено, що тільки в5 одна або дві другорядні плями відрізнялись між бета-ланцюгом гемоглобіну, який було очищено засобами НРІ С, та рІМРКОЇ. Препаратом 2. Результати вестерн-блотингу з застосуванням антисвинячих гемоглобінових антитіл,

та одномірного або двомірного високовольтного електрофорезу, підтвердили присутність бета-ланцюгу гемоглобіну у препараті. Таким чином, активний рІМРКОЇ Препарат 2, який було одержано відповідно до

Прикладу 128, представляє собою, по суті, бета-ланцюг свинячого гемоглобіну.

Приклад 14: Альфа-ланцюг гемоглобіну, бета-ланцюг гемоглобіну або інтактний гемоглобін демонструють пригнічувальну активність відносно стовбурових клітин

З метою підтвердження того, що бета-ланцюг гемоглобіну має ІМРКОЇ. активність, було проведено пробу на самовбивство з використанням кісткового мозку мишей, оброблених тестостероном, за методикою, опис якої наведено у Прикладі 1 та з застосуванням матеріалу, очищеного, як описано у Прикладі 128. Як показано у 76 Таблиці 8, було забито 1595 нормальних клітин мишачого кісткового мозку, у протилежність 3695 у тварин, оброблених тестостероном. Як і очікувалось, це вказує на те, що обробка тестостероном підвищує відсоток клітин у стані мітотичної активності (що, таким чином, робить їх більш сприйнятливими до забиття - див., наприклад, Приклад 1). У гострому контрасті, клітини тварин, оброблених тестостероном, які було інкубовано з рІМРКОЇ. або з бета-ланцюгом очищеного гемоглобіну (4Онг/мл), продемонстрували різке зменшення відсотку клітин у стані мітотичної активності (від 3695 до 095 та 795, відповідно). Підвищена доза (20Онг) була менш ефективною для обох білків. Як позитивний контроль, попередньо охарактеризований інгібітор стовбурових клітин МІР-ТА зменшував рівень мітотичної активності до 13905.

Подібну пробу можна здійснити іп міго з використанням статусу мітотичної активності СРО-МІХ замість

СРО-5. Пробу ставлять, як було описано перед тим для проби на СЕРО-5, за виключенням того, що цитозинарабінозид (АгаС, ЗОмікрограм/мл) використовують, як циклоспецифічний токсичний агент, замість високої дози тимідину, міченого радіоактивним тритієм |див. Б.І. Лорд (В.І. Гога), у Наетороїіезів-А Ргасіїса

Арргоаси. Н.Г. Теста (М.О. Тевіа) та Г. Муліно (0. Моїїпеих) (Видавці), ІК! Ргезз 1993; Прагнел та інші, у

Сийиге ої Нетаїйороїіейіс СеїЇв. Р.І. Фрешні (К.І. Егезппеу), І.Б. Прагнел (І.В. Ргадпеї!), М.Г. Фрешні (М.О.

Егезппеу) (Видавці), УМіеу Гізз 1994) та лінію мишей з високим рівнем мітотичної активності (Ваїр/с) замість сч оброблених тестостероном мишей лінії ВОР.. Як показано у таблиці У, активними у цій пробі є як високоочищений бета-ланцюг, так і високоочищений альфа-ланцюг свинячого гемоглобіну. Необхідно звернути і) увагу на те, що у цій пробі рівні мітотичної активності клітин, оброблених рІМРКОЇ, подеколи мають від'ємні номери, які вказують на те, що пул, який було піддано обробці Агас, має навіть більше колоній, аніж пул, який обробці не піддавався. со зо Як описано у Прикладі 2, рІМРКОЇ. пригнічує проліферацію лінії мишачих стовбурових клітин ЕЄОСР-МІХ у пробі на включення тимідину, міченого радіоактивним тритієм. На Фігурі 20 показано, що у цій пробі активними с є як альфа-, так і бета-ланцюги очищеного гемоглобіну, причому пригнічення спостерігається при дозі«2нг/мл. «-

Попереднє свідчить про те, що бета-ланцюг свинячого гемоглобіну демонструє ІМРКОЇ активність. Інші дані (див., наприклад, Таблицю 9, Фіг.20) демонструють, що виділений альфа-ланцюг, а також інтактний гемоглобін, «

Зв також є активними, як інгібітори стовбурових клітин. До активних препаратів належать також суміші альфа- та ї- бета-ланцюгів (див., наприклад, Фіг.5).

Спостереження відносно активності виділеного альфа-ланцюгу гемоглобіну та/або виділеного бета-ланцюгу гемоглобіну свідчать про те, що активні продукти, опис яких наведено, не потребують об'ємної інтактної структури гемоглобіну. Фрагменти альфа- та бета-ланцюгу також є активними, як інгібітори та стимулятори « стовбурових клітин. з ш ї» я - вом - ю

Й

2ТРВМ- кістковий мозок мишей, оброблених тестостероном

Зньа- бета-ланцюг свинячого гемоглобіну, очищений засобами НРІ С з оберненою фазою СА (одержаний з двічі кристалізованого свинячого гемоглобіну) о з 7 2100нг/мл (Очищено, як на Фіг.21) б5

Приклад 15: Очищений ІМРКОЇ.. очищений альфа-ланцюг свинячого гемоглобіну або очищений бета-ланцюг свинячого гемоглобіну є активними іп мімо

З метою перевірки здатності ланцюгів очищеного свинячого гемоглобіну діяти іп мімо, мишам лінії ВОЕ 4 було

Ввпорекнуто тестостерону пропіонат, як описано у Прикладі 1. Через двадцять чотири години мишам інтравенозно було введено по 500нг рІМРКОЇ,, альфа-ланцюгу свинячого гемоглобіну (очищеного з еритроцитів периферичної крові, як на Фіг.21), бета-ланцюгу свинячого гемоглобіну (очищеного з еритроцитів периферичної крові, як на

Фіг.21) або еквівалентний об'єм носія. Через сорок вісім годин від кожної миші було зібрано кістковий мозок і проведено пробу на СЕО-МІХ, як описано у Прикладі 14. Як показано у Таблиці 10, рІМРКОЇ, альфа-ланцюг 7/0 свинячого гемоглобіну та бета-ланцюг свинячого гемоглобіну були активними іп мімо і забезпечували зниження відсотку СРО-МІХ у стані мітотичної активності до базисних рівнів.

Ів 2 10онг/мл

З Кістковий мозок мишей лінії ВОГНІ, які не оброблялись тестостероном с

Приклад 16: Альфа-ланцюг очищеного гемоглобіну людини, біотинільований альфа-ланцюг гемоглобіну людини, біотинільований бета-ланцюг гемоглобіну людини, гамма-ланцюг гемоглобіну людини та дельта-ланцюг о гемоглобіну людини демонструють пригнічувальну активність відносно стовбурових клітин іп мйго

Гемоглобін людини було одержано від компанії Зідта Спетіса! Согрогайоп або виділено стандартними способами з периферичної крові дорослої людини або з крові пупкового канатику. Окремі ланцюги було виділено о зо засобами НРІ С з оберненою фазою подібним же чином, як це описано перед тим для альфа- та бета-ланцюгів свинячого гемоглобіну |див. Б.Мазала (В. Мазаїа) та Л.Манка (І. Мапса), Меїйодз іп Епгутоіоду, том 231, с стор.21-44, 1994). Було одержано очищені альфа-, бета-, гамма- та дельта-ланцюги. З метою одержання «-- біотинільованих альфа- та бета-ланцюгів, І мг гемоглобіну дорослої людини обробляли З7мкг біотину МН ІС (компанія Ріегсе) і згадані ланцюги відокремлювали засобами НРІ С з оберненою фазою, як описано перед тим. в

Як показано у Таблицях 11, 12 та 13, альфа-ланцюг очищеного гемоглобіну людини, біотинільований ї- альфа-ланцюг гемоглобіну людини, біотинільований бета-ланцюг гемоглобіну людини, гамма-ланцюг гемоглобіну людини та дельта-ланцюг гемоглобіну людини є активними у пробі на мітотичну активність СЕО-МІХ. « но с

І що : ї» 2 10оОнг/мл - о де со и

ГФ) 2100нг/мл іме) во

Жевюль! 18 бо Біотинільований бета-ланцюг гемоглобіну людини? 25

2100нг/мл 9 Приклад 17: Альфа-ланцюг очищеного гемоглобіну людини, димер альфа-бета-ланцюгів або гемоглобін є активними іп мімо

Альфа-ланцюг очищеного гемоглобіну людини, димер альфа-бета-ланцюгів або гемоглобін випробувались у пробі іп мімо, як описано у Прикладі 15. Як показано у Таблиці 14, кожен з них був активним при концентрації 5ООнг/мишу. й

Приклад 18: Свинячий ІМРРЕОЇ. є активним відносно мононуклеарних клітин людини або СРЗ4 "клітин крові пупкового канатику іп міго

З метою дослідження здатності очищеного ІМРКОЇ. свинячого кісткового мозку впливати на мітотичний цикл клітин-попередників людини, були одержані клітини крові пупкового канатику. Було використано або загальну ря фракцію мононуклеарних клітин, одержану після розподілу на колонці РісоїЇ, або СОЗ34 "фракцію, яку було см одержано після фракціонування на анти-СБ34 афінних колонках (компанія СеїІРго Іпс.). Клітини було інкубовано (о) впродовж 48 годин іп міго у присутності інтерлейкіну З (1/-3) та фактору стовбурових клітин (ЗСЕ) (1ООнг/мл кожного) для забезпечення мітотичної активності первинних стовбурових клітин. Після згаданого попереднього інкубування, проби на мітотичну активність було проведено, як описано у Прикладі 14 для мишей, за со виключенням того, що на 18 день після висівання підраховували СЕО-СЕММ (замість СЕО-МІХ). Як показано у

Таблиці 15, свинячий ІМРКОЇ. пригнічував мітотичну активність СРО-ЗЕММ як об'ємних мононуклеарних клітин, с такі СОЗА "фракції. «- - з Горова. забиття к (І Контоль | 93 вжевомі 16 ч и жонтоль| 5 З - вкРо г »

Приклад 19: Альфа-ланцюг очищеного гемоглобіну людини є активним відносно СЕО-ЗЕММ людини -і Були одержані мононуклеарні клітини крові пупкового канатику людини, які інкубували з ІІ -3 та ЗСЕ (фактор стовбурових клітин) і використали у пробі на мітотичну активність, як описано у Прикладі 18. Як показано у ть Таблиці 16, активними у цій пробі були як свинячий ІМРКОЇ, який було очищено з кісткового мозку, так і - альфа-ланцюг гемоглобіну людини, очищений з периферичної крові. зо со вмево 18 о іме)

Приклад 20: Активними є пептиди, одержані з альфа-ланцюгу гемоглобіну людини та з послідовностей бо бета-ланцюгу гемоглобіну людини

З метою ідентифікування активних пептидних послідовностей, об'ємну структуру міоглобіну (який не має активності у цій пробі) накладали, за допомогою програми комп'ютерного моделювання, на об'ємну структуру нативного альфа-ланцюгу, присутнього у гемоглобіні дорослої людини. Було ідентифіковано два пептиди (які представляють амінокислоти 43-55 та 64-82, які є ділянками, які структурно відрізняються від міоглобіну у 65 об'ємному просторі), як такі, що мають активність у пробі на мітотичну активність СРО-МІХ. Для більш тісного наближення до петлі, яку було знайдено у нативному альфа-ланцюзі, синтезували також циклічну похідну пептиду 43-55 (с43-55) (з використанням дисульфідного зв'язку), яка виявилась активною.

Послідовність цих пептидів виглядає наступним чином: 43-55 Рпе-Рго-Ніз-РПе-Авр-І еи-Зег-Ніз-СіІу-Зег-АІа-СІп-Маї ("Пептид 43-55") с(43-55). Сув-РПпе-Рго-Нівз-РПпе-Агр-їЇ ец-Зег-Нів-Су-Зег-АІа-С|Іп-МаІ-Сув (де два Суз залишки мають дисульфідний зв'язок) ("Циклічний пептид 43-55") 64-82 Азвр-Аїа-І еи-Тпг-Азп-АІа-МаІ-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Азр-Меї-Рго-Авп-Аїа-Ї ец-Зег-АІа ("Пептид 64-82")

Випробували дві геморфінові послідовності, геморфін 10 (амінокислоти 32-41 послідовності бета-ланцюгу) та 7/0 геморфін 7 (амінокислоти 33-40), які виявились активними.

Згадані послідовності виглядають наступним чином:

Геморфін 10 І еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр- Тиг-СІп-Агд-Рпе

Геморфін 7 МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгтр-Тиг-СІп-Ага

З метою перевірки активності цих послідовностей, пробу на мітотичну активність СЕО-МІХ було проведено, як /5 описано у Прикладі 14. Як показано у Таблицях 17-19, усі згадані пептиди у цій пробі продемонстрували свою активність. ю вімево 19

Пептидизя сч 25 о с з сч -

Петидбіяу 019 - зв м

Гемофнт! 10 « 7 щ аблиця - г»

Циклічний пептид яз й овивнею де коюни -І 1ТВипробувано у дозі 1ООнг/мл ве Приклад 21: Фрагмент пептиду, який було одержано з альфа-ланцюгу гемоглобіну людини розщепленням за - допомогою мурашиної кислоти, є активним.

Альфа-ланцюг гемоглобіну людини має сайт розщеплення мурашиною кислотою між амінокислотними іме) позиціями 94 та 95 (Авзр-Рго). Розщеплення здійснювали шляхом інкубування альфа-ланцюгу очищеного с гемоглобіну людини (як у Прикладі 16) у концентрації Тмг/мл у 7095 мурашиній кислоті впродовж 72 годин при 372. Фрагмент 1-94 було очищено від нерозщепленого альфа-ланцюгу та фрагменту 95-141 засобами НРІС з оберненою фазою, як у Прикладі 16; фракції визначались за допомогою ЗО5З-РАСЕ (як у Прикладі 22).

Ідентичність очищеного білкового фрагменту 1-94 було підтверджено засобами електророзпорошувальної іонізаційної мас-спектрометрії. іФ) З метою визначення пригнічувальної активності цього фрагменту відносно стовбурових клітин було ко використано пробу на мітотичну активність СЕО-МІХ, як у Прикладі 14: 5

Фрагмент 1-943 (в) б5

2Альфа-ланцюг очищеного нерекомбінантного гемоглобіну людини, як у Прикладі 16 (1ООнг/мл),

ЗОчищений, розщеплений мурашиною кислотою білок, як у наведеному Прикладі (1ООнг/мл)

Приклад 22: Експресія альфа-ланцюгу гемоглобіну людини, поліпептиду 1-141, поліпептиду 1-97, пептиду 43-55 та пептиду с(43-55) у Е.соїї, як злитих білкв убіквітину

Гени для пептидів 43-55 ("р13") та с43-55 ("р15") (як у Прикладі 20) було синтезовано шляхом ренатурації відповідних олігонуклеотидів, відповідно до оптимального використання кодону Е.соїї | Андерсен (Апдегззеп) та 70 Карленд (Кипапа), Місго. Кеміемув 54: 198-210, 1990). Ген для альфа-ланцюгу інтактного гемоглобіну людини ("р!417) було одержано програмуванням набору оолігонуклеотидів для ампліфікації за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (РСК) з пулу КкДНК кісткового мозку людини (компанія Сіопіесі, Пало Альто,

Каліфорнія). Ген для фрагменту 1-97 ("р1-97") було одержано РСК ампліфікацією плазміди, до складу якої входить ген р141, після відповідного субклонування.

Вищезгадані гени було експресовано, як злиті білки убіквітину |див. патенти США Мо5132213, 5196321 та 5391490 та РСТ УМО 91/17245). Штам-хазяїн, Е.соїї ОНБАРТО (компанія І Ме Тесппоіодіев, Іпс., Гейтерсбург,

Мериленд), було трансформовано вектором експресії убіквітину, РОБИ, до складу якого входить відповідно синтезований ген (див. перед тим). РОЗИ є похідним рО578/КВ5К, який експресує убіквітин людини (Фіг.22А)

ІГочалі (Носпшії) та інші, ВіоФесппоіоду 6: 1321-5, 1988). Летчер (Іоеєіївспег) та інші ЮШВС 266: 11213-11220, 19911 модифікували рОЗ78/ВВ5ІЇ вирізуванням послідовностей хлорамфеніколацетилтрансферази (САТ) з плазміди Гочалі та повторним лігуванням згаданої плазміди (Фіг.228). Синтетичний ген убіквітину було сконструйовано парною ренатурацією синтетичних олігонуклеотидів, оброблених кіназою, які кодують убіквітин людини, з застосуванням кодону, оптимізованого для бактеріальної експресії. Після цього було сконструйовано рОБЗОВ шляхом вставки синтетичного гену убіквітину, який складався з зібраних олігонуклеотидів, до с дефосфорильованого гідролізату Ват НІ-ВоіїЇ Кленова дериватизованого рО578/ВВ8Ї. Було показано, що Ге) утворена плазміда, РОБИ (Фіг.22С), експресувала убіквітин у Е.соїї на високому рівні.

Плазміду, до складу якої входив роО7, та плазміду, до складу якої входив р141, було сконструйовано вставкою продуктів РСК, гідролізованих АЙ ІІ-Реї І які кодують білок рО7 або білок р141 та ділянку з'єднання злиттям при прямому клонуванні, до рОБИБ, яку було гідролізовано АЇЙ ІІ та Рв І. Подібним же со чином, плазміду, до складу якої входив р13, та плазміду, до складу якої входив р15, було сконструйовано с вставкою оброблених кіназою та ренатурованих олігонуклеотидів, які несуть відповідні "липкі" кінці та кодують пептид та ділянку з'єднання злиттям, до РОБИ, гідролізованої АТ І-Раї І. --

Трансформанти відбирали за допомогою 100Омкг/мл ампіциліну, 5мкг/мл неоміцину; колонії з'являлись через « два дні при 302С. Трансформанти перевірялись за допомогою РОК на інсерційному сайті. Після цього колонії, які 39 включали вставку відповідного розміру, відбирали для експресування злитого білку відповідного розміру в засобами ЗО5-РАСЕ (див. далі). Злиття убіквітину надпродукувалось доданням трансформувального фактору

ІРТО, який титрує репресор Іас, шляхом видалення його з промотору РОЗИ (до складу ОНБА РО входить активований ген Іасід на факторі ЕР", який вибирають за допомогою 1Омкг/мл неоміцину). «

З клонів, які демонстрували надпродукований індукований злитий білок убіквітину, було одержано плазмідну З

ДНК, яку секвенували за допомогою методу дидеоксидування з застосуванням набору Зедцепазе Мегвіоп 2.0 Кії с (компанія Опітей Зіагез Віоспетіса!). Після цього позитивні клони заморожували і зберігали у гліцерині при "з -8020. Позитивні клони підтримували на планшетах І В, які вміщували ампіцилін (1ООмкг/мл), неоміцин (1Омкг/мл) та 195 глюкози, при температурі 3092. їх пересівали штрихом щотижнево (до 10 пасажів), після чого з 15 замороженої маточної ампули для серійної культури відбирали свіжий штрих для забезпечення аутентичності -1 штаму.

З метою одержання білку для проведення проб, з окремих колоній інкубуванням впродовж ночі (16-20 годин) т. на живильному середовищі 2хУТ з ампіциліном (1О0Омкг/мл), неоміцином (1Омкг/мл) та 195 глюкози у 250мл - ролерних колбах вирощували 100Омл стартерні культури. Культури у ролерних колбах підтримували при 302 та 50 250об/хв у ролерному термостаті компанії Мем/ Вгипезм/ісК. Наступним ранком культуру за допомогою живильного іме) середовища розводили до 1л. Клітини, доданням ІРТО, були індуковані до 1мММ (кінцеве розведення) при с оптичній густині ОЮОво0-0,5 і їх збирали центрифугуванням при оптичній густині ОО с00-0,8. Зібрані клітини ресуспендували у гіпотонічному буфері для лізису (МбО0мкл 5О0ММ Трис-буферу, рНІ10,0). Бактеріальні клітини було лізовано шляхом піддання суспензії трьом циклам заморожування-відтаювання (баня з сухого в льоду-етанолу для заморожування та 602 для відтаювання). Після цього згадану суспензію піддавали обробці ультразвуком впродовж 10 хвилин та центрифугували при 120009 впродовж 10 хвилин. Одержаний супернатант

Ф) було позначено, як "51". Дебріс було ресуспендовано у 50ММ Трис-буфері, рН1о та 25505 (додецилсульфат ко натрію) трициновому буфері насичення (компанія Момех, Сан Дієго, Каліфорнія) (1:1). Після цього згадану суміш нагрівали при 9593 впродовж 15 хвилин та центрифугували при 120009 впродовж 10 хвилин. Частину осаду, 60 придатну для повторного розчинення подібним чином, було позначено "Р1". Частину осаду, яку було одержано з грануляту, що залишився, було позначено "Р2". Р2 ресуспендували у такому ж самому буфері насичення, що призначався і для РІ. Проби 51, Р1 та Р2 аналізувались засобами БО5-РАСЕ. 5ОЗ-РАСЕ гелі проганяли з застосуванням системи двох трицинових буферів на установці Міпіде! з 10-2090 трициновими гелями (компанія Момех). Як анодний (нижній) буфер було використано 0,2М Трис-буфер, рно,0. 65 Катодний (верхній) буфер мав наступний склад: 0,1М Трис-буфер, 0,1М Трицин, 0,195 ЗО5, рНВ, 25. Було використано промисловий маркер молекулярної маси "Мийі-Магк" (компанія Момех). Убіквітин великої рогатої худоби, який було використано, як стандарт, було закуплено від компанії Зідта. Гелі проганяли при постійному струмі 4мА доти, доки маркер-фарбник не досягав дна гелевого блоку. Гелі фарбували 0,2595 Кумасі синім К250 (компанія бідта) у розчині оцтова кислота:метанол (1095:4095) та знебарвлювали у тому ж розчині без фарбника.

Більшу частину (27095) інтактного р141-злитого білку убіквітину було знайдено у осаді (РІ та Р2) після центрифугування бактеріального лізату. У гострому контрасті, більшу частину ( 270905) роО7-злитого білку убіквітину було знайдено у розчинній фракції (51). Цим підтверджується, що наслідком видалення С-кінцевої гідрофобної ділянки є продукт з поліпшеними характеристиками розчинності. Подібним же чином, пептиди р13 та р15 також знаходились у розчинній фракції. 70 Фермент ОСН-ІЇ З убіквіназу |Рекштайнер М. (КескКвієїпег М.) (Видавець) ОбБідийіп, Ріепит Ргевв (Нью-Йорю) 1988; Вілкінсон (УМіКіпзоп) та інші, Зсіепсе 246: 670-73, 1989| було експресовано у реЗЕТ (компанія

Іпмйгодеп, Сан-Дієго, Каліфорнія), який було використано для трансформування штаму-хазяїну ВІ 21/ОЕЗ.

ОСНА-ЇЗ є убіквітин-специфічною протеазою, яка розщеплює С-кінцевий подовжуючий сегмент убіквітину. Її було частково очищено з бактеріальних лізатів осадженням за допомогою 3595 (у відношенні маси до об'єму) /5 бульфату амонію. Точний відсоток використаного сульфату амонію контролювали засобами 505-РАСЕ за появою смуги 25,5КД. Супернатант діалізували проти 50мММ Трис-буферу, рН7 4 та випробували проти субстрату злитого білку убіквітину. Активний супернатант поділяли на аліквотні проби та заморожували при -202б. До складу типової реакційної суміші входило Змкл лізату, їмкл 1М ОТТ (дитіотреїтол), їмкл ОСН-Ї З (дивись перед тим) та б5мкл реакційного буферу (50ММ Трис-буфер, рН7,4). Реакцію проводили при кімнатній температурі

Впродовж 20 хвилин. Для великомасштабного гідролізування, ЗООмкл лізату змішували з 100мкл 1М ОТТ, 20мкл

СН-ЇЗ та 580мкл реакційного буферу.

Пептиди або білки, які входили до складу розчинної (51) фракції, піддавали додатковому очищенню засобами НРІС з оберненою фазою, як у Прикладі 16; фракції контролювали засобами ЗО5-РАСЕ і їх ідентичність підтверджували засобами електророзпорошувальної іонізаційної мас-спектрометрії (див. далі). с

Очищені пептиди або білки піддавались ферментативному розщепленню за допомогою ОСН-Ї З, як вказувалось перед тим, внаслідок чого одержували кінцевий продукт, позбавлений убіхінону. Після цього цей розщеплений о матеріал піддавали повторному очищенню засобами НРІ С з оберненою фазою. Після очищення здійснювали

ЗО5-РАСЕ і ідентичність кінцевого продукту підтверджували засобами електророзпорошувальної іонізаційної мас-спектрометрії. с

Альтернативою розщепленню іп міго за допомогою ОСН-Ї З, як описано перед тим, є коекспресія ферменту, який розщеплює убіквітин, у тих же самих бактеріях, у яких відбувається необхідне злиття убіквітину. З цією с метою було використано вектор (р/Т184), який експресує убіквіназу ОВРІ |ТГобіас (Торіаз) та Варшавський «- (МагепаузКу), УВС 266: 12021-12028, 1991). Бактерії, які сумісно експресують злитий білок убіквітину р9о7 та

ИВРІ, демонстрували повне розщеплення злитого білку іп мімо: бактерії, які коекспресують злитий білок в Убіквітину рі41 та ОВРІ, демонстрували часткове (приблизно, 7095) розщеплення злитого білку. Білок ро7, ча розщеплений іп мімо, очищали осадженням за допомогою сульфату амонію з наступним підданням НРІС з оберненою фазою, як описано перед тим.

З метою підтвердження ідентичності експресованих та очищених поліпептидів, вдавались до електророзпорошувальної іонізаційної мас-спектрометрії за допомогою приладу МО Віоїеспй ВІО-О з « квадрупольним аналізатором. Для калібрування приладу було використано міоглобін. Головним компонентом, 8 с одержаним з очищеним ро7, був окремий пік з молекулярною масою 10339 Дальтон; це добре співпадає з й вирахованою молекулярною масою 10347, що підтверджує ідентичність рекомбінантного фрагменту ро7. «» Приклад 23: Рекомбінант р1-97 зберігає пригнічувальну активність відносно стовбурових клітин

Для визначення біоактивності рекомбінанту р1-97 було застосовано пробу на мітотичну активність СЕО-СЕММ, як у Прикладі 18: -І е - м ша 00000006

І ен

ТМононуклеарні клітини кісткового мозку людини ?2Альфа-ланцюг очищеного нерекомбінантного гемоглобіну людини, як у Прикладі 16 (1ООнг/мл)

ЗОчищений рекомбінантний р9о7, як у Прикладі 22 (10Онг/мл)

ГФ) Приклад 24: Альфа-ланцюг гемоглобіну людини та пептид 43-55 пригнічують мітотичний цикл СЕО-МІХ іп мімо

ГФ у мишей, оброблених тестостероном або 5-фторурацилом (5Е))

З метою визначення пригнічувальної активності пептиду 43-55 іп мімо відносно стовбурових клітин, мишей во лінії В602Е попередньо обробляли пропіонатом тестостерону, як описано у Прикладі 1, або за допомогою 5.

Зокрема, мишам у День 0 внутрішньоочеревинно впорскували пропіонат тестостерону (1ООмг/кг маси тіла). У альтернативному варіанті, мишам у День 0 впорскували 5Р) (200Омкг/кг маси тіла).

Через 24 години (День 1) інтравенозно впорскували різні дози пептиду 43-55 або носія. Кістковий мозок збирали у День 2 і пробу на мітотичну активність СРО-МІХ здійснювали, як у Прикладі 14. Зокрема, мишей б забивали і з стегнових кісток готували суспензії окремих клітин кісткового мозку. Згадані клітини один раз промивали і доводили їх концентрацію у живильному середовищі Фішера до 5х1Обклітин/мл. Для кожного варіанту експериментальних умов до кожної з двох поліпропіленових пробірок додавали один мілілітр клітин.

Згадані пробірки інкубували при 372С впродовж З годин без ("Контроль") або з ("Експериментальна") відповідною концентрацією експериментальної речовини. У кінці інкубування до половини пробірок було додано по ЗОмкг/мл цитозинарабінозиду ("Агас") компанія Зідта), у той час, як до інших пробірок була додана така ж кількість живильного середовища Фішера. Згадані пробірки додатково інкубували впродовж 1 години при 372С, після чого їх вкладали на лід та двічі промивали холодним живильним середовищем Фішера.

Концентрацію клітин доводили до 5хЮ?-105/мл у живильному середовищі Фішера і 0,5мл клітинної суспензії додавали до 5мл метилцелюлозного живильного середовища Меїййпосиїї М3430 (компанія (ет Сеї! Тесппоіодієв, 70 Ванкувер, Британська Колумбія). Згадану суміш енергійно перемішували за допомогою вихрової мішалки і вносили по 1мл до кожної з п'яти З5мм чашок. Згадані ЗоОмм чашки були, у свою чергу, розміщені у критій 150мм чашці з однією відкритою Збмм чашкою, у якій знаходилась стерильна вода. Колонії СЕО-МІХ підраховували за допомогою інвертованого фазо-контрастного мікроскопа після 7 днів інкубування при 372С.

Різниця у кількості колоній між пробірками, які було оброблено живильним середовищем, та пробірками, які 175 було оброблено Агас, представляє відсоток клітин, які знаходяться у стані мітотичної активності за згаданих умов відповідно до формули: фе - 876, (10095) а де а - кількість СРО-МІХ з пробірки, яку було інкубовано лише з живильним середовищем

Ь - кількість СЕО-МІХ з пробірки, яку було інкубовано з Агас сч о

Пептид звів? 0109 2Кількість, яку було впорскнуто інтравенозно миші масою 20 грам (ее) сч -

З зе Альфатанцюг гемоглобіну людини (ВОНО? 010 т 1Тварини, яких було піддано попередній обробці БЕ ч с ч Приклад 25: Пептид 43-55 є активним, як інгібітор стовбурових клітин у разі біотинілювання на М-кінцевому ни РНе (Рпедз) або йодування на Рпедз або Рпедв

Пептид 43-55 було синтезовано за допомогою способу твердофазного синтезування пептидів (компанія

Атегісап Рерііде Со., Саннівейл, Каліфорнія). Пептидні аналоги було синтезовано з йодом у пара-позиції Рпелз - або Рпедв. Біотинільований Пептид 43-55 було синтезовано шляхом зв'язування СООН біотину вуглецевим їз лінкером Су до М-кінцевого МН» РНедз. - ще со Петид азни 8

Приклад 26: Морфін пригнічує мітотичну активність мишачих СЕО-МІХ іп міго

Морфін випробували у пробі на мітотичну активність СЕО-МІХ з застосуванням кісткового мозку мишей лінії і) Ваїр/с, як у Прикладі 24: іме) во

Апесра-ланцю" темотовну тюдини Сооними) 0 (10-9М) 15 в пом) 32

Приклад 27: Опіатні пептиди ОАМОО та БА ВА пригнічують мітотичну активність мишачих СЕРО-МІХ іп міго рАМСО та ПРАГА випробували у пробі на мітотичну активність СРО-МІХ з застосуванням кісткового мозку мишей лінії Ваї!р/с, як у Прикладі 24:

РАМСО (10 5М) 15 (10-7мМ о то о ем) Зв (10-7м) о (10-9М) ЗА

Приклад 28: Ноціцептин пригнічує мітотичну активність мишачих СЕО-МІХ іп міго

Ноціцептин випробували у пробі на мітотичну активність СЕО-МІХ з застосуванням кісткового мозку мишей лінії ВаїЇБ/с, як у Прикладі 24:

Петидазвв нм 8 шт (10-9М) с о

Приклад 29: Налоксон антагонізує пригнічувальну активність альфа- та дельта-ланцюгів гемоглобіну людини, геморфіну 10 та пептиду 43-55

Пробу на мітотичну активність СРО-МІХ було проведено, як у Прикладі 24. Експериментальні речовини випробували самі по собі або у присутності налоксону (1072-10-7М). Налоксон сам по собі у згаданих 00 концентраціях не впливав на результати проби. сч - з зв в Апефа-ланцю темотлобіну людини ПОбнумт 0

Пептид яз вв оним 116 «

З о Геможфнсо Соню 0 с- т "стен нпюе нет 1Застосовано з кінцевою концентрацією 10-5М - г - мо со

Приклад 30: Налоксон у низьких концентраціях пригнічує мітотичний цикл мишачих СРО-МІХ

Пробу на мітотичну активність СЕО-МІХ було проведено, як у Прикладі 24. щі о во Апесфе-ланцюг гемоглобіну людини ПОбнтмт 0

Іелокон ПОТОМ) Со

Приклад 31: Антагоніст СТОР опіатного мю-релептору антагонізує пригнічувальну активність альфа-ланцюгу гемоглобіну людини, пептиду 43-55 та пептиду 64-82 65 СТОР (Н-О-Рпе-Сув-Туг-О-Ттр-Огп-Тиг-Реп-Тиг-МНо з дисульфідним зв'язком між Сузо та Реп;) є аналогом соматостатину, який є специфічним антагоністом опіатного мю-рецептору. Експериментальні речовини випробувались самі по собі або у присутності СТОР (10-7М). СТОР сам по собі у згаданій концентрації не впливав на результати проби, однак антагонізував пригнічення мітотичного циклу клітин, обумовлене альфа-ланцюгом гемоглобіну або пептидом 43-55. о Апесфра-ланцюг гемоглобіну людини Побнтмт 0

Петидазвв соми 00000018 ;

Приклад 32: Попередня обробка альфа-ланцюгом гемоглобіну людини оппідвищує кількість пізніх групоутворювальних клітин

Пробу на утворення груп клітин було проведено, як описано Племахером та колегами |Племахер (Ріоетаснег) та інші, Віооа 74: 2755-63, 1989; ван дер Сліж (мап дег 5іці)ї5) та інші, Ехр. Нетай!. 18: 893-6, 1990; Племахер та інші, Віоод 78: 2527-33, 1991; Племахер та інші, У. Тізв. Сці. Меїй. 13: 63-68, 1991; Даун (ЮОом/п) та Племахер, Ехр. Нетаїйо). 21: 213-21, 1993). За допомогою проби на утворення груп клітин визначають появу груп клітин у моношарі клітин строми. Первинні стовбурові клітини не утворюють колоній у м'якому агарі, однак утворюють групи клітин у присутності моношару строми. Клітини, які утворюють групи Ге клітин, називають "групоутворювальними клітинами" (САЕС). Більш диференційовані (наприклад, ЗМ-СЕС) (5) клітини- попередники утворюють тимчасові групи клітин, які з'являються і потім зникають впродовж декількох перших тижнів культивування, у той час, як первинні стовбурові клітини (наприклад, довгоіснуючі репопуляційні клітини) утворюють групи клітин, які з'являються лише після 4-5 тижнів культивування. Таким чином, САЕС, утворені на 7-14 день культивування є збагаченими СРО-СОМ, САРЕС, утворені на 28-35 день культивування є (ее) збагаченими СЕРО-МІХ та САБС, утворені на 28-35 день культивування є збагаченими довгоїснуючими сч репопуляційними клітинами.

Мишей лінії В6О2Е4 обробляли пропіонатом тестостерону, як у прикладі 24. Наступного дня видаляли «- кістковий мозок та інкубували впродовж 4 годин з або без альфа-ланцюгу гемоглобіну людини « (10онг/10 клітин), після чого згадані клітини кісткового мозку висівали з метою використання у пробі на утворення груп клітин. Застосована проба представляє собою обмежене розведення культур декстерівського о типу (ТВМС) у 96-лункових планшетах. Культури готували вирощуванням лінії клітин мишачої строми ЕВМО-1

ІБрімз (Вгеетв) та інші, І еикетіа 11: 142-50, 1977| до злиття; 9б-лункові планшети зі злитими моношарами зберігали при 3392С до постановки проби. Клітини мишачого кісткового мозку готували у вигляді суспензії « окремих клітин і наступні розведення клітин висівали у лунки на О0,2мл живильного середовища І ТВМС (компанія 740 Віет Сеї/ Тесппоіодієз, Ванкувер): 27000; 9000; 3000; 1000; 333. Двадцять лунок було засіяно кожним в) с розведенням для кожного варіанту умов та розподілено на два планшети. "» Частоту групоутворювальних клітин (САБС) вираховували, як описувалось перед тим (Племахер та інші, " Віоосд 78: 2527-33, 1991; Племахер та інші, 9. Тівв. Си. Мей. 13: 63-68, 1991; Брімз та інші, ІейКетіа 8: 1095-104, 1994). Результати представлено на Фіг.23. Попереднє інкубування клітин у стані мітотичної активності з альфа-ланцюгом гемоглобіну людини підвищує пропорцію пізніх САЕС, приблизно, у 5 разів. - Обробка клітин, які не знаходяться у стані мітотичної активності альфа-ланцюгом гемоглобіну людини ефекту не ї» має.

Приклад 33: Альфа-ланцюг гемоглобіну людини та пептид 43-55. циклічний пептид 43-55 та пептид 64-82 - пригнічують мітотичний цикл СРО-ЗЕММ крові пупкового канатику людини

ГІ 20 Пробу на мітотичну активність СРЕО-ЗЕММ крові пупкового канатику людини було проведено, як у Прикладі 19. Зокрема, мононуклеарні клітини було виділено з клітин крові пупкового канатику людини та доведено до со концентрації 2-4х10"клітин/мл у живильному середовищі ІМОМ (живильне середовище Дульбекко, модифіковане за способом Іскова) для культур тканин, доповненому 10956 ЕВ5, 10Онг/мл ліганду з набору та 10Онг/мл 1-3 людини. Згадані клітини було інкубовано впродовж 48 годин при 3720.

Після інкубування клітини промивали та ресуспендували у вільному від сироватки ІМОМ при концентрації

ГФ) 10бклітин/мл. Один мл клітин додавали до кожної з двох поліпропіленових пробірок на кожний варіант умов та з пробу на мітотичну активність проводили, як у Прикладі 24 для мишачого кісткового мозку. Після інкубування з

АгасС клітини промивали холодним ІМОМ і доводили концентрацію до 10000-20000 клітин на О,бмл ІМОМ та во змішували з бмл Меїйпосий Н4433 (компанія біет Сеї|Ї Тесппоіодіев) У альтернативному варіанті, використовували метилцелюлозне живильне середовище Меїпосиії Н 4435 (5іет СеїЇ Тесппоіодіев). У цьому випадку концентрацію клітин доводили до 2500-5000 клітин на О,5мл ІМОМ. Згадані клітини висівали, як у

Прикладі 24. і колонії СРЮ-СЕММ підраховували на 14-18 день. бо Обробка Уо забиття

Апесфа-ланцюг гемоглобіну людини ПОбнтмт 0 (1Онг) 12 9 (100нг) 5 (1Онг) (9) (10онг) 11 то оон з

Приклад 34: Альфа-ланцюг гемоглобіну людини та пептид 43-55 пригнічують мітотичну активність

СЕРО-СЕММ кісткового мозку дорослої людини

СсОЗ34" стовбурові клітини було одержано від компанії Роїеїїс Тесппоіодіеєз (Гейтерсбург, Мериленд) після очищення від клітинного мозку людини за допомогою колонки СеїІРго. Клітини інкубували впродовж 48 годин з лігандом з набору та ІІ -3 та використовували у пробі на мітотичну активність СЕО-СЕММ, як у Прикладі 26. 2

Апесфечтанцює темоторну людини тнту 0

Пептид язБ(нми) 1

Приклад 35: СРО-СЕММ у мобілізованій периферичній крові людини знаходяться М активному мітотичному с стані і піддаються пригніченню альфа-ланцюгом гемоглобіну людини, пептидом 43-55. ОАМОО або морфіном Ге)

Периферичну кров було одержано від пацієнтів з раком грудної залози, яких було піддано мобілізації периферійних стовбурових клітин за допомогою циклофосфаміду та 5-С5Е за стандартними протоколами.

Еритроцити видаляли за допомогою Рісої! Нурадце (клітини, за допомогою ІМОМ, розводили 1:1, 20мл об'ємом нашаровували на 1бмл РісоїЇ та центрифугували при 8009 впродовж 30 хвилин; мононуклеарні клітини видаляли со у інтерфазі та двічі промивали ІМОМ). У одному випадку мононуклеарні клітини до постановки проби зберігали с замороженими у рідкому азоті. Мононуклеарні клітини висівали для проби на мітотичну активність СЕО-ЗЕММ, як у Прикладі 26, за виключенням того, що їх висівали у концентрації 2,5-5х109 клітин на чашку. - « з5 в (Альфе-ланцюг гемоглобіну людини (Обнимлу 0) « 4 2 с

І г»

Петмидазев сом 0000100 15 т Мевфн сом 19 » - бАмсосовму 11 з 50 со

Петидазввсснмі 0010 о

Я

КЛІТИН, ЯКІ зберігались у замороженому стані перед постановкою проби 60 Приклад 36: Високі дози альфа- або бета-ланцюгу гемоглобіну людини. міоглобіну, пептиду 1-97. пептиду 43-55. пептиду 64-82, ноціцептину або СА! БА стимулюють мітотичну активність мишачих стовбурових клітин, які знаходяться у стані покою

Для стимулювання стовбурових клітин у стані покою застосовували ланцюги гемоглобіну, міоглобін та пептиди у дозах мікрограм на мілілітр. Клітини кісткового мозку було одержано від мишей лінії В6О2Р»., які не бо піддавались обробці, та випробувано у пробі на мітотичну активність СРО-МІХ, як у Прикладі 24. Стовбурові клітини, виділені з мишей лінії В6С2Е., які не піддавались обробці, як правило, знаходяться у стані незначної мітотичної активності, у разі якщо вона не була стимульована (наприклад, за допомогою пропіонату тестостерону (порівняй Приклад 1) або за допомогою хіміотерапевтичного засобу, наприклад, 5РІ (порівняй

Приклад 4)). то (ланцюг гемоглобіну людини Пмкомлу 0 й

Жентоль 11111119 см (10-3М) м шт (1о-Зм) с см -

У ПН з м « 4 З с (1Омкг/мл) 1 ;» з в. г а ко 20 Приклад 37: Інтравенозне введення високих доз альфа-ланцюгу гемоглобіну людини стимулює мітотичну активність мишачих стовбурових клітин, які знаходяться М неактивному стані со Альфа-ланцюг гемоглобіну людини впорскували інтравенозно мишам лінії В6О2Е, які не піддавались обробці. Через 24 години мишей забивали, збирали кістковий мозок зі стегнових кісток і проводили пробу на мітотичну активність СЕО-МІХ, як у Прикладі 24. о з Контроль обробці че піддавався 10

Середовище (контроль впорскування) 0 бо

Приклад 38: Налоксон антагонізує стимулювальну активність високої дози альфа-ланцюгу гемоглобіну людини, пептиду 43-55 відносно стовбурових клітин 5

Обробка Уо забиття т С Альсфасланцюг гемоглобіну людини (Обнімл)нналоксн! 0 і

Незважаючи на те, що цей винахід було описано на прикладах переважних варіантів втілення, слід розуміти, що фахівцям у цій галузі техніки будуть очевидними варіанти та модифікації цього винаходу. Внаслідок цього, 70 передбачається, що пункти формули винаходу охоплюють усі еквівалентні варіанти, які входять в обсяг цього винаходу, який ними заявляється.

Claims (29)

1. Формула винаходу то 1. Спосіб стимулювання проліферації стовбурових клітин, який включає введення гемопоетичних клітин у контакт з ІМРКОЇ. у кількості, ефективній щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, причому ІМРКОЇ. вибраний з групи, до якої входять пептиди, що мають такі послідовності: РПпе-Рго-Нівз-РПе-Авр-І еш-Зег-Ніз-СІу-Зег-АІа-СІп-Маї, Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув (де два Сув-залишки утворюють дисульфідний зв'язок) Азр-Аїа-І ен-Тпг-Азп-АІа-МаІ-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Азр-Мег-Рго-Авп-Аїа-Ї ец-Зег-Аїа, Рпе-І ец-СіІу-Рпе-Рго-ТнНг, Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, сч Г еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СіІп-Ага, Геи-Ма!І-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СІп, (о) Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТНАг, Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр, Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго, со МаїіІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТАг-Сіп, Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-РНе, с Туг-Рго-Ттр-Тиг-СіІп-Ага, «- Туг-Рго-Тгтр-Тиг-СіІп та Туг-Рго-Тгр-ТНг, «І причому згадана кількість ІМРКОЇ,, ефективна щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, являє М собою таку кількість, що є еквімолярною 10-100 мг/кг альфа-ланцюга гемоглобіну людини.
2. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що здійснюють введення гемопоетичних клітин у контакт з ІМРКОЇ. та опіатною сполукою.
3. З. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що згадана опіатна сполука вибрана з групи, до якої входять « 20 морфін, еторфін, кодеїн, героїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, левалорфан, гідрокодон, оксикодон, -о налорфін, налоксон, налтрексон, бупренорфін, бутанорфанол, налбуфін, меперидин, альфапродин, с дифеноксилат, фентаніл, ОЗАМОО, ВАГ ДА та ноціцептин. :з»
4. 4. Спосіб лікування раку у ссавця, який страждає на нього, що включає такі стадії: а) застосування променевої терапії та/або хіміотерапії, та 415 Б) введення ІМРКОЇ у кількості, ефективній щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, причому -1 ІМРКОЇ. вибраний з групи, до якої входять пептиди, що мають такі послідовності: РПпе-Рго-Нівз-РПе-Авр-І еш-Зег-Ніз-СІу-Зег-АІа-СІп-Маї, т» Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув - (де два Суз-залишки утворюють дисульфідний зв'язок) Азр-Аїа-І ен-Тпг-Азп-АІа-МаІ-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Азр-Мег-Рго-Авп-Аїа-Ї ец-Зег-Аїа, іме) Рпе-І еи-СІу-Рпе-Рго-ТНг, «со Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, Г еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СіІп-Ага, Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр- ТАг-Сіп, Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТНАг, Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр, ГФ) Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго, г МаїіІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТАг-Сіп, Туг-Рго-Тгтр-Тиг-СІп-Аго-РНе, во Туг-Рго-Тгр-Тиг-СіІп-Ага, Туг-Рго-Тгр-ТАг-СіІп та Туг-Рго-Тгр-Тнг, причому згадана кількість ІМРКОЇ,, ефективна щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, являє собою таку кількість, що є еквімолярною 10-100 мг/кг альфа-ланцюга гемоглобіну людини. ве
5. 5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що додатково вводять опіатну сполуку.
6. 6. Спосіб за п. 4 або 5, який відрізняється тим, що стадії а) та Б) повторюють один або більше разів.
7. 7. Спосіб за п. 4 або 5, який відрізняється тим, що стадію а) здійснюють перед стадією б).
8. 8. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що опіатна сполука вибрана з групи, до якої входять морфін, еторфін, кодеїн, героїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, левалорфан, гідрокодон, оксикодон, налорфін, налоксон, налтрексон, бупренорфін, бутанорфанол, налбуфін, меперидин, альфапродин, дифеноксилат, фентаніл, ОЗАМОО, ВАГА та ноціцептин.
9. 9. Спосіб стимулювання поділу стовбурових клітин у ссавця, що зазнав дії агента, який пошкоджує або знищує стовбурові клітини, який включає введення ІМРКОЇ у кількості, ефективній щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, причому ІМРКОЇ. вибраний з групи, до якої входять пептиди, що мають такі 70 послідовності: РПпе-Рго-Нівз-РПе-Авр-І еш-Зег-Ніз-СІу-Зег-АІа-СІп-Маї, Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув (де два Суз-залишки утворюють дисульфідний зв'язок) Авр-Аїа-І еи-Тиг-Авзп-АІа-Ма!І-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Азр-МеїРго-Авп-Аїа-Ї ец-зег-Аїа, РІе-Іен-СтІу-Рпе-Рго-ТНг, Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-РНе, Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СіІп-Ага, Геи-Ма!І-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СІп, Геи-Ма!І-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТНг, Г еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттгр, Геи-Ма!І-Ма!І-Туг-Рго, Ма!І-МаІ-Туг-Рго-Тгтр-ТАг-Сіп, Туг-Ро-Ттр-Тиг-СіІп-Аго-РНе, Туг-Ро-Тгтр-Тиг-СіІп-Ага, сч Туг-Рго-Ттр-Тиг-СіІп та Туг-Ро-Тгтр-Тнг, і) причому згадана кількість ІМРКОЇ,, ефективна щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, являє собою таку кількість, що є еквімолярною 10-100 мг/кг альфа-ланцюга гемоглобіну людини.
10. 10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що додатково вводять опіатну сполуку. со зо
11. 11. Спосіб за п. 9У або 10, який відрізняється тим, що згаданим агентом є противірусний агент або протинеопластичний агент. с
12. 12. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що опіатна сполука вибрана з групи, до якої входять морфін, «- еторфін, кодеїн, героїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, левалорфан, гідрокодон, оксикодон, налорфін, налоксон, налтрексон, бупренорфін, бутанорфанол, налбуфін, меперидин, альфапродин, дифеноксилат, « фентаніл, ОЗАМОО, ВАГА та ноціцептин. ї-
13. 13. Спосіб підтримування гемопоетичних стовбурових клітин ссавця ех мімо, який включає введення гемопоетичних клітин у контакт з ІМРКОЇ. у кількості, ефективній щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, причому ІМРКОЇ. вибраний з групи, до якої входять пептиди, що мають такі послідовності: РПпе-Рго-Нівз-РПе-Авр-І еш-Зег-Ніз-СІу-Зег-АІа-СІп-Маї, « Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув з с (де два Суз-залишки утворюють дисульфідний зв'язок) . Азр-Аїа-І ен-Тпг-Азп-АІа-МаІ-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Азр-Мег-Рго-Авп-Аїа-Ї ец-Зег-Аїа, и? Рпе-Іец-Сіу-Рпе-Рго-ТНг, Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, Г еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СіІп-Ага, -І Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр- ТАг-Сіп, Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТНАг, ве Г ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр, - Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго, МаїіІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТАг-Сіп, ю Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, с Туг-Рго-Ттр-Тиг-СіІп-Ага, Туг-Рго-Тгтр-Тиг-СіІп та Туг-Рго-Тгр-ТНг, причому згадана кількість ІМРКОЇ,, ефективна щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, являє собою таку кількість, що є еквімолярною 10-100 мг/кг альфа-ланцюга гемоглобіну людини. (Ф)
14. 14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що здійснюють введення гемопоетичних клітин у контакт з ка ІМРКОГ. та опіатною сполукою.
15. 15. Спосіб за п. 13 або 14, який відрізняється тим, що гемопоетичні клітини вибрані з групи, до якої бо Входять клітини кісткового мозку, клітини периферичної крові, мобілізовані клітини периферичної крові, клітини печінки зародка та клітини крові пупкового канатика.
16. 16. Спосіб за п. 14, де опіатна сполука вибрана з групи, до якої входять морфін, еторфін, кодеїн, героїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, левалорфан, гідрокодон, оксикодон, налорфін, налоксон, налтрексон, бупренорфін, бутанорфанол, налбуфін, меперидин, альфапродин, дифеноксилат, фентаніл, ОАМОО, ВАГА та 65 ноціцептин.
17. 17. Спосіб лікування мієлопроліферативного захворювання, гіпопроліферації гемопоетичних або епітеліальних стовбурових клітин у ссавця, який страждає на це, який включає введення стимулювальної кількості ІМРКОЇ,, причому ІМРКОЇ. вибраний з групи, до якої входять пептиди, що мають такі послідовності: РПпе-Рго-Нівз-РПе-Авр-І еш-Зег-Ніз-СІу-Зег-АІа-СІп-Маї, Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув (де два Суз-залишки утворюють дисульфідний зв'язок) Азр-Аїа-І ен-Тпг-Азп-АІа-МаІ-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Азр-Мег-Рго-Авп-Аїа-Ї ец-Зег-Аїа, Рпе-І ец-СіІу-Рпе-Рго-ТнНг, Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, 70 Г еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СіІп-Ага, Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр- ТАг-Сіп, Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТНАг, Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр, Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго, МаїіІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТАг-Сіп, Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, Туг-Рго-Ттр-Тиг-СіІп-Ага, Туг-Рго-Ттр-ТАг-Сіп та Туг-Ро-Тгр-ТНг, причому згадана стимулююча кількість ІМРКОЇ. являє собою таку кількість, що є еквімолярною 10-100 мг/кг альфа-ланцюга гемоглобіну людини.
18. 18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що додатково вводять опіатну сполуку.
19. 19. Спосіб за п. 17 або 18, який відрізняється тим, що мієлопроліферативним захворюванням є мієлодиспластичний синдром або апластична анемія. с
20. 20. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що опіатна сполука вибрана з групи, до якої входять морфін, еторфін, кодеїн, героїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, левалорфан, гідрокодон, оксикодон, налорфін, (8) налоксон, налтрексон, бупренорфін, бутанорфанол, налбуфін, меперидин, альфапродин, дифеноксилат, фентаніл, ОЗАМОО, ВАГА та ноціцептин.
21. 21. Спосіб проведення генної терапії ссавця, який включає: со зо а) видалення гемопоетичних клітин у згаданого ссавця, Б) обробку згаданих гемопоетичних клітин ех мімО такою кількістю ІМРКОЇ, яка є ефективною щодо с стимулювання стовбурових клітин, «- с) трансфікування або інфікування згаданих гемопоетичних клітин певним заздалегідь визначеним геном, а) введення згаданих трансфікованих гемопоетичних клітин ех мімо у контакт з такою кількістю ІМРКОЇ, яка « з5 є ефективною щодо пригнічення стовбурових клітин, ча е) трансплантування згаданому ссавцю гемопоетичних клітин зі стадії 4, та ТІ) факультативно - лікування ссавця іп мімО з використанням ІМРКОЇ у кількості, ефективній щодо пригнічення або стимулювання стовбурових клітин, причому ІМРКОЇ. вибраний з групи, до якої входять пептиди, що мають такі послідовності: « РПпе-Рго-Нівз-РПе-Авр-І еш-Зег-Ніз-СІу-Зег-АІа-СІп-Маї, з с Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув . (де два Суз-залишки утворюють дисульфідний зв'язок) и?» Азр-Аїа-І ен-Тпг-Азп-АІа-МаІ-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Азр-Мег-Рго-Авп-Аїа-Ї ец-Зег-Аїа, Рпе-І ец-СіІу-Рпе-Рго-ТнНг, Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, -І Г еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СіІп-Ага, Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр- ТАг-Сіп, ве Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТНАг, - Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр, Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго, ю маі-уаі-туг-Рго-Тгр-Тнг-Зіп, с Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, Туг-Рго-Ттр-Тиг-СіІп-Ага, Туг-Рго-Ттр-ТАг-Сіп та Туг-Ро-Тгр-ТНг, причому згадана кількість ІМРКОЇ,, ефективна щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, являє Ф) собою таку кількість, що є еквімолярною 10-100 мг/кг альфа-ланцюга гемоглобіну людини, а згадана кількість ка ІМРКОЇ,, ефективна щодо пригнічення проліферації стовбурових клітин, являє собою таку кількість, що є еквімолярною 0,1-1,0 мг/кг альфа-ланцюга гемоглобіну людини. 60
22. 22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що обробку здійснють як ІМРКОЇ, так і опіатною сполукою.
23. 23. Спосіб за п. 21 або 22, який відрізняється тим, що здійснють введення у контакт як з ІМРКОЇ, такі з опіатною сполукою.
24. 24. Спосіб за будь-яким з пп. 21-23, який відрізняється тим, що здійснють лікування з використанням як ІМРКОЇ,, так і опіатної сполуки. 65 25. Спосіб будь-яким з пп. 22-24, який відрізняється тим, що опіатна сполука вибрана з групи, до якої входять морфін, еторфін, кодеїн, героїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, левалорфан, гідрокодон,
25. оксикодон, налорфін, налоксон, налтрексон, бупренорфін, бутанорфанол, налбуфін, меперидин, альфапродин, дифеноксилат, фентаніл, ОЗАМОО, ВАГ ДА та ноціцептин.
26. 26. Спосіб розмноження стовбурових клітин ех мімо, який включає введення гемопоетичних клітин у контакт із такою кількістю ІМРКОЇ, яка є ефективною щодо стимулювання стовбурових клітин, причому ІМРКОЇ. вибраний з групи, до якої входять пептиди, що мають такі послідовності: РПпе-Рго-Нівз-РПе-Авр-І еш-Зег-Ніз-СІу-Зег-АІа-СІп-Маї, Сув-РПпе-Рго-Ніз-РПпе-Азвр-І ец-Зег-Нів-сїу-Зег-АІа-СІп-МаІ-Сув (де два Суз-залишки утворюють дисульфідний зв'язок) 70 Азр-Аїа-І ен-Тпг-Азп-АІа-МаІ-АІа-Ніз-МаІ-Азр-Азр-Мег-Рго-Авп-Аїа-Ї ец-Зег-Аїа, Рпе-І ец-СіІу-Рпе-Рго-ТнНг, Геи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, Г еи-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Ттр-ТАг-СіІп-Ага, Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр- ТАг-Сіп, Г ени-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТНАг, Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр, Ї ен-МаІ-МаІ-Туг-Рго, МаїіІ-МаІ-Туг-Рго-Тгр-ТАг-Сіп, Туг-Рго-Ттр-Тиг-СІп-Аго-Рпе, Туг-Рго-Ттр-Тиг-СіІп-Ага, Туг-Рго-Тгтр-Тиг-СіІп та Туг-Ро-Тгр-ТНг, причому згадана кількість ІМРКОЇ,, ефективна щодо стимулювання проліферації стовбурових клітин, являє собою таку кількість, що є еквімолярною 10-100 мг/кг альфа-ланцюга гемоглобіну людини. сч
27. 27. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що здійснюють введення гемопоетичних клітин у контакт з ІМРКОЇГ. та опіатною сполукою. і)
28. 28. Спосіб за п. 26 або 27, який відрізняється тим, що гемопоетичними клітинами є клітини, вибрані з групи, до якої входять клітини кісткового мозку, клітини периферичної крові, мобілізовані клітини периферичної крові, клітини печінки зародка та клітини крові пупкового канатика. со зо
29. 29. Спосіб за п. 27, який відрізняється тим, що опіатна сполука вибрана з групи, до якої входять морфін, еторфін, кодеїн, героїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, левалорфан, гідрокодон, оксикодон, налорфін, с налоксон, налтрексон, бупренорфін, бутанорфанол, налбуфін, меперидин, альфапродин, дифеноксилат, "пр фентаніл, ОЗАМОО, ВАГА та ноціцептин.

    «

    м. ші с з -І щ» - з 50 ІЧ е) Ф) іме) 60 б5