CN107899001B - Notch配体蛋白在制备治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制药物方面及早期预后判断方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Notch配体蛋白在制备治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制药物方面及早期预后判断方面的应用，尤其是在制备促进化疗导致骨髓抑制后的造血干细胞、髓系前体细胞及骨髓血窦内皮细胞的增殖和/或改善化疗导致骨髓抑制后的造血微环境药物方面的应用。本发明通过采用多种遗传修饰小鼠和改良Notch配体蛋白，从整体人和动物、细胞和分子水平回答了Notch信号在化疗骨髓抑制造血重建中对造血干细胞、髓系祖细胞与血窦内皮细胞功能和重塑的调控作用及机制，建立Notch信号途径通过造血微环境干预骨髓失稳态后造血重建的可能性，为化疗后骨髓抑制患者的早期预后判断及治疗提供新思路、新靶点和新解决方案。

Description

Notch配体蛋白在制备治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制药物方面 及早期预后判断方面的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，本发明还涉及恶性肿瘤化疗后造血重建的预后判断和治疗，具体地，涉及一种Notch配体蛋白在制备治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制药物方面及早期预后判断的应用。

背景技术

世界卫生组织(WHO)在《全球癌症报告》中提到，中国新增癌症病例数高居全世界第一位。不可否认，传统化疗在癌症患者治疗体系中的地位依旧非常重要，序贯化疗显著提高了恶性肿瘤患者的无事件生存率及总体生存率，尤其对于化疗可根治的白血病、淋巴瘤、生殖系统肿瘤等。

研究表明，大约50％的实体瘤及80％的血液肿瘤患者在治疗过程中会发生急性造血功能抑制，接近10％的患者死于后者引发的并发症。造血恢复延迟直接导致治疗方案实施延迟或减量，降低了患者治疗的相对剂量强度(RDI)。当 RDI小于85％时会明显降低疗效，小于65％时患者几乎没有获益，特别是淋巴瘤、乳腺癌、肺癌及卵巢癌等化疗敏感的肿瘤，甚至可能出现无效治疗。相比急性骨髓抑制，化疗所引起的远期骨髓毒性以及造血微环境损害常具有隐匿性，甚至遗传性，存在外周血象与骨髓储备不一致的现象，故临床上部分肿瘤患者在治疗后期表现出化疗耐受性降低、造血恢复周期延长、自体移植前造血干细胞(HSC)动员障碍等特点。此时若继续给予造血生长因子过度刺激和消耗造血干/祖细胞，更容易诱发严重贫血、骨髓增生异常综合征(MDS)、恶性转变 (如AML)等长期损伤。然而，参与恶性肿瘤化疗后骨髓重建过程中造血干细胞及造血微环境失稳态和重塑的细胞和分子机制尚不完全清楚，临床上缺乏有效的防治药物和预后评判指标。

如何克服化疗诱发的短期和长期骨髓毒性反应，实现早期预警和严苛意义上的长生存，是医学界亟待解决的问题之一。

在生理情况下，人体每天有大量造血细胞再生与衰老，造血稳态的维持依赖于造血干细胞的自我更新和多系分化，HSC是所有血液细胞的来源，主要定植在骨髓造血干细胞龛，即定植在造血微环境。

造血微环境是骨髓中容纳干细胞、调控其行为的细胞和细胞外基质的微环境，通过细胞接触、生长因子和信号分子等方式，为造血细胞提供空间营养和信号转导，调控静息和应激状态下HSC的自我更新、多能分化、发育生存、增殖归巢和衰老死亡等，维持造血的动态平衡。

骨髓血窦内皮细胞是构成造血干细胞龛的重要支架细胞，与造血干细胞关系密切。在功能上，血窦内皮细胞是连接血液和骨髓的重要桥梁，其表达的受体、配体、粘附分子以及血管内分泌因子等是造血重建的必要条件。首先，HSC 表面的CD44、P-选择素配体、整合素α4β1与血窦内皮细胞表面的透明质酸、P- 选择素、E-选择素及VCAM-1等分子相互作用，完成HSC的归巢、定植及植入。其次，血窦内皮细胞依靠其表面受体及可溶性血管内分泌因子(如VEGFR-2、 PTN等)，调节HSC的自我更新和成熟分化。再次，骨髓组织中大量的窦状血管为内皮细胞与HSC的相互作用提供了足够的表面空间。静息状态下，造血干细胞大多以静息态定居于小动脉血窦内皮细胞周围，由NG2⁺nestin^bright血管周细胞及交感神经共同包绕维持其稳态，参与的信号分子主要包括金属蛋白酶-9 (MMP9)、组织蛋白酶G、趋化因子(如CXCL12等)、细胞因子(如KITL 等)、粘附分子、信号通路(如TGF-β)等。当外界毒性药物、电离辐射、炎性刺激、氧化应激、贫血、缺氧、衰老等应激发生时，HSC被诱导、招募、迁移至Lepr⁺血管周细胞niche，以维持HSC的增殖、重建和再生。其中化/放疗所致的骨髓抑制具有相似性及时间-剂量依赖性，主要影响细胞的自我更新、增殖、凋亡、分化、成熟、迁移和衰老等，具体表现为骨髓造血细胞空虚、血管网紊乱、窦状血管萎缩等。

造血干细胞与血窦内皮细胞在造血稳态和重塑中发挥重要作用，但分子机制不明。近年来，Notch信号途径参与应激状态下HSC重塑的调控逐渐被重视。研究发现，射线易选择性促进造血龛内HSC表达致癌基因ICN1。Varnum-Finney 等利用条件性敲除小鼠证实，Notch2缺失不利于5-FU化疗小鼠短期和长期造血恢复，HSC趋向髓系分化。最近《StemCell》报道，电离辐射触发的造血干/祖细胞长期、遗传毒性主要由C/EBPα介导，而Notch配体detal like 1能逆转上述效应。但是，这些零星报道均未能提供造血失稳尤其是化疗治疗导致造血失稳的有效解决途径，Notch信号作为发育调控的经典信号，在包括造血、血管、神经干细胞在内的多种组织细胞的分化发育中发挥关键调控作用。既往关于Notch 信号调控造血的研究多集中于造血干细胞胚胎发育和体外扩增，未见任何关于 Notch信号在化疗造血损伤重建中对HSC与血窦内皮细胞的调控作用及相关机制研究，限制了药物靶点的发现和治疗药物的研发，因此亟需探讨通过Notch 干预造血失稳的可能性，为治疗提供新思路和新靶点。

目前存在的难点有：①缺乏系统的体内研究：Notch信号途径在造血发育和 HSC扩增中发挥重要作用，其证据主要来自体外实验。②缺乏直接证据：Notch 信号参与造血稳态维持，但对成年活体造血失稳态后重塑的研究不足。③缺乏有效的Notch信号激活剂：国际上现有的Notch重组配体蛋白不能有效介导 Notch受体胞外段内吞。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于填补现有治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制方面的药物技术不足以及预后指标匮乏，提供Notch配体蛋白在制备治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制药物方面及早期预后判断方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

通过采用临床恶性肿瘤患者序贯化疗以及造血干细胞移植前清髓性化疗前/ 后血液标本检测、造血细胞RBP-J失去功能遗传修饰小鼠、内皮细胞ICN1获得功能遗传修饰小鼠和新型Notch配体活化蛋白，从整体人和动物、细胞和分子水平回答Notch信号在化疗骨髓抑制中对造血干细胞与血窦内皮细胞的调控作用，阐明造血重建中Notch信号影响造血干细胞、髓系祖细胞与骨髓血窦内皮细胞功能和重塑的细胞和分子基础并揭示其机制，探讨Notch信号途径通过造血微环境干预骨髓失稳态后造血重建的可能性，为化疗后骨髓抑制患者的早期预后判断及治疗提供新思路、新靶点和新解决方案。

具体地，本发明提供了Notch配体蛋白在制备治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制药物治疗方面和/或早期预后判断方面的应用。

尤其是应用于制备早期预测恶性肿瘤患者化疗后造血重建的新预后靶点药物或试剂方面。可通过检测Notch信号激活程度来早期预判临床上恶性肿瘤患者化疗导致骨髓抑制后预后良好或不良。

尤其是应用于制备促进化疗导致骨髓抑制后的长期造血干细胞重建药物方面。

尤其是应用于制备促进化疗导致骨髓抑制后的造血干细胞增殖重建药物方面。

尤其是应用于制备促进化疗导致骨髓抑制后的髓系前体细胞增殖重建药物方面。

以及优选应用于制备改善化疗导致骨髓抑制后的造血微环境药物方面。

本发明提供了根据上述研究结果筛选得到的信号，用于预测肿瘤化疗导致骨髓抑制患者的预后以及治疗肿瘤化疗导致的骨髓抑制。

优选地，所述Notch配体蛋白为Notch配体活化蛋白DIR。

本发明具有以下优点：

本发明提供了Notch配体蛋白在制备治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制药物方面及早期预后判断方面的应用，尤其是提供了检测恶性肿瘤患者化疗(包括大剂量化疗、造血干细胞移植前清髓性化疗)导致骨髓抑制后的血液样品中表达变化的Notch信号途径的核心分子及下游分子，能够早期反映造血重建良好或不良方面的应用，提供了一种新的预后预测靶点。本发明提供了Notch配体蛋白在制备依赖激活造血细胞Notch信号促进造血干细胞和髓系细胞重建方面的应用；提供了Notch信号激活剂Notch配体蛋白在制备促进化疗导致骨髓抑制后造血重塑的药物作用机制方面的应用。

本发明同时提供了一种Notch信号途径的骨髓造血细胞敲除在化疗导致骨髓抑制后检测造血干细胞和其他谱系细胞恢复的新研究模型，以及Notch信号途径的骨髓内皮细胞激活在化疗导致骨髓抑制后检测造血干细胞和其他谱系细胞恢复的新研究模型。

本发明确立了Notch信号途径参与化疗导致骨髓抑制后造血重建的新理论。

基于本发明设计思路，本发明提供了一种治疗化疗导致骨髓抑制的新方法，其包括改良的Notch配体重组蛋白的优化克隆、原核表达、纯化浓缩、表达标签检测、内皮粘附能力检测、体外活性检测及体内活性检测。

总之，本发明中，申请人克服了现有恶性肿瘤患者骨髓重塑调控存在的理论盲区和技术不足，提供了Notch重组配体蛋白在制备治疗肿瘤化疗导致骨髓抑制药物方面的应用，以及早期预后评估方面的应用。创造性地发现在治疗和改善化疗导致骨髓抑制方面的机制中，Notch配体活化蛋白并非基于促进造血干细胞的自我更新或抑制造血干细胞的凋亡，而是促进了造血干细胞的增殖；配体蛋白触发Notch信号激活后的下游信号通路并非依赖于Notch经典下游通路，而是与造血微环境相互调控，倾向性的激活了血管内皮细胞相关的信号通路；更为重要的是，本发明不仅仅局限于对于造血干细胞体内重塑的机制研究成果应用，而且首次提出了Notch配体活化蛋白在改善造血微环境方面的显著应用贡献，采用内皮细胞特异性激活Notch信号转基因小鼠作为研究模型，相比于既往的体内或体外研究，该模型更能反映造血细胞和造血微环境的层面因素以及化疗后造血重塑的真实状况；最后，本发明从多物种层面(人、动物、细胞、分子)、多研究角度(造血细胞Notch敲除、内皮细胞Notch激活、造血细胞 Notch激活)、多模型(环磷酰胺化疗模型、氟尿嘧啶化疗模型、顺铂化疗模型) 完整的阐明了化疗骨髓抑制中Notch配体活化蛋白的治疗作用以及Notch信号途径的预警作用。本发明揭示了化疗骨髓抑制后，Notch信号途径对造血干细胞功能失调、谱系重塑失稳及造血微环境紊乱的调控作用、内在机理和应用途径；揭示了Notch信号串联骨髓血窦内皮细胞与造血干细胞的潜在机制；为干预造血失稳提供了新思路、新靶点和新治疗方案，具有重要的理论意义和潜在的实践价值。

附图说明

图1用于筛选恶性肿瘤患者化疗时Notch信号分子表达的技术路线图。

图2用于确立Notch信号途径参与化疗骨髓抑制后造血重建的正性调控作用的技术路线图。

图3用于确立Notch信号途径参与化疗骨髓抑制后造血重建的机制研究的技术路线图。

图4化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞Notch信号途径相关分子的表达。

图5序贯化疗和造血干细胞移植前清髓性化疗患者造血细胞Notch信号激活程度与造血恢复的关联分析。

图6剔除造血细胞经典Notch信号途径对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞的影响。

图7剔除造血细胞经典Notch信号途径对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠谱系重塑的影响。

图8激活内皮细胞Notch信号途径对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞的影响。

图9 Notch配体活性蛋白D1R质粒构建的结构示意图。

图10本发明改良的内皮细胞靶向的Notch配体活性蛋白D1R的优选克隆及表达纯化。

图11 Notch配体活性蛋白D1R体外生物学活性的鉴定。

图12 Notch配体活性蛋白D1R体内生物学活性的鉴定。

图13激活造血细胞Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠脾脏和集落形成的影响。

图14激活造血细胞Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞亚型重塑的影响。

图15激活造血细Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠髓系祖细胞亚型重塑的影响。

图16骨髓移植实验观察激活造血细胞Notch信号后对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞生物学功能的影响。

图17激活造血细胞Notch信号对氟尿嘧啶化疗骨髓抑制小鼠造血重建尤其造血干细胞重建的影响。

图18激活造血细胞Notch信号对氟尿嘧啶化疗骨髓抑制小鼠髓系重塑的影响。

图19激活造血细胞Notch信号对氟尿嘧啶化疗骨髓抑制小鼠淋系重塑的影响。

图20激活造血细胞Notch信号对顺铂化疗小鼠造血重建尤其造血干细胞重建的影响。

图21激活造血细胞Notch信号对顺铂化疗小鼠髓系重塑的影响。

图22激活造血细胞Notch信号对顺铂化疗小鼠淋系重塑的影响。

图23造血细胞特异性激活Notch信号途径对化疗小鼠造血干细胞增殖和凋亡的影响。

图24流式细胞术分析C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓 Ly6G⁺CD11b⁺细胞BrdU表达的流式代表图(左)和百分比统计图(右)。**P<0.01， n＝4。

图25流式细胞术分析C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓 Ly6G⁺CD11b⁺细胞AnnexinV和PI表达的流式代表图。

图26造血细胞特异性激活Notch信号途径对化疗小鼠造血干细胞血管内皮细胞相关分子表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利的限制；为了更好地说明本发明的实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

实施例1化疗对造血干细胞Notch信号途径相关分子表达的研究实验

(1)化疗小鼠造血干细胞Notch信号途径相关分子的表达分析

①小鼠化疗骨髓抑制模型的建立：取8周龄C57BL/6野生雄性小鼠，腹腔注射环磷酰胺、氟尿嘧啶、顺铂等化疗药物建立多种化疗骨髓抑制模型，对照组腹腔注射等量的生理盐水。化疗后第3、5、7、9天尾静脉取外周血10μL，血常规分析仪检测白细胞、血红蛋白和血小板的数目，达(含)Ⅱ度以上骨髓抑制提示建模成功。②造血干细胞Notch信号途径相关分子的表达检测：化疗后第7天分离骨髓造血干细胞，利用实时定量RT-PCR检测Notch配体Delta like 1以及Notch信号下游分子Hes1、Hes5、Hey1、Hey2的表达变化，所需引物和 PCR扩增条件已经确定。实验结果见附图4所示。附图4为化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞Notch信号途径相关分子的表达检测图。附图4中，A表示实时定量RT-PCR检测化疗骨髓抑制小鼠第7天LSK(Lin^-Scal-1⁺c-Kit⁺)细胞中Notch 信号下游分子Hes1、Hes5、Hey1、Hey2的表达。B表示实时定量RT-PCR检测化疗骨髓抑制小鼠第7天LSK(Lin^-Scal-1⁺c-Kit⁺)细胞中Notch配体Delta like 1 的表达。n＝4。n.s：P＞0.05，无统计学意义；Dll：Delta like 1缩写。

(2)序贯化疗和造血干细胞移植前清髓性化疗患者造血细胞Notch信号激活程度与造血恢复的关联分析

①临床标本的收集：收集临床上健康志愿者、普通病房序贯化疗患者及层流移植病房异基因造血干细胞移植患者治疗前后的血液标本及正常对照标本各 20例，采用红细胞裂解液冰上裂解红细胞获取单个核细胞，PBS重悬后取少量细胞离心甩片至载玻片，4％PFA后固定制备免疫荧光染色标本，剩余细胞提取 RNA检测Notch信号下游分子Hes1、Hes5、Hey1、Hey2在DNA水平的表达。②化疗骨髓抑制后Notch信号激活程度与患者造血恢复的相关性分析：利用活化形式的Notch1胞内段抗体ICN1以及Hochest核染色抗体进行免疫荧光双标染色，统计化疗前、化疗后2周、化疗后6周ICN1的入核表达数据；详细记录患者的性别、年龄、疾病类型、治疗方案、剂量、三系恢复/植入时间、急/慢性移植物抗宿主疾病、KPS评分等信息，对患者的预后进行分类评估；分析化疗前、化疗后Notch信号激活程度与患者造血恢复及预后是否具有相关性。实验结果见附图5所示。附图5为序贯化疗和造血干细胞移植前清髓性化疗患者造血细胞Notch信号激活程度与造血恢复的关联分析图。附图5中，A表示免疫荧光双标染色检测化疗前后患者外周血单个核细胞中Notch活化片段ICN1在胞内的激活情况。B表示实时定量RT-PCR检测化疗前后患者外周血单个核细胞中 Notch信号下游分子Hes1、Hes5、Hey1、Hey2的表达。*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001，n＝20。Ctrl：健康志愿者；Poor：预后不良的化疗患者；Good：预后良好的化疗患者。

实施例2骨髓造血细胞剔除经典Notch信号对化疗骨髓抑制小鼠造血影响的研究实验

(1)双转基因小鼠的交配和鉴定

①交配：将MxCre转基因小鼠与RBP-J^flox/+转基因小鼠交配，得到杂合子对照小鼠MxCre；RBP-J^flox/+以及纯合子敲除小鼠MxCre；RBP-J^flox/flox。②鉴定：取 3周龄子鼠剪取鼠尾1cm，放置于含蛋白酶K的消化液中55℃恒温消化过夜，按照常规酚-氯仿抽提方法得到小鼠基因组DNA，用普通PCR方法进行基因型鉴定，所需引物和PCR扩增条件已经确定。

(2)在骨髓造血细胞中诱导RBP-J的基因剔除

①剔除：取4～5周龄MxCre；RBP-J^flox/flox纯合子以及MxCre；RBP-J^flox/+杂合子转基因小鼠，腹腔注射IFN-α的诱生剂poly:I-C诱导Cre重组酶表达，隔天1 次，注射4次，继予每周1次，注射2次，共计注射6次，早期诱导骨髓造血细胞RBP-J的剔除。②基因剔除效率测定：分离小鼠骨髓单个核细胞或造血干细胞以及脾脏单个核细胞，提取基因组DNA，用SphI酶切后进行电泳、转移和 Southern杂交分析基因剔除效率，所需DNA探针和条件已经确定。

(3)RBP-J基因剔除小鼠化疗骨髓抑制模型的建立和细胞组织学分析

①建模：在诱导成功的双转基因小鼠(cKO)和对照小鼠(Ctrl)上建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型。②生存分析及血常规分析：建模成功后，每日早、晚观察小鼠生命体征及状态，记录死亡动物组别、数目、死亡日期，绘制生存曲线。隔日鼠尾取外周血10μL，利用血常规分析仪统计白细胞及五分类、红细胞、血红蛋白和血小板的数目，绘制变化曲线。③造血细胞形态学和数量分析：建模后第7天取基因剔除小鼠和对照小鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞、脾脏细胞及外周血细胞，裂解红细胞后利用台盼蓝染色在显微镜下计数并统计分析；骨髓细胞和外周血细胞采用载玻片常规涂片，行瑞氏-吉姆萨染色，倒置显微镜下分类计数并采图，对结果进行统计学分析。实验结果见附图6A所示。附图6为剔除造血细胞经典Notch信号途径对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞的影响图。附图6中，A表示台盼蓝染色分析环磷酰胺化疗后第7天RBP-J基因剔除小鼠骨髓(左)、脾脏(中)及外周血(右)单个核细胞的绝对数统计图。 *P<0.05，n＝4。BM：bone marrow，骨髓；SP：spleen，脾脏；PB：Peripheral blood，外周血；Ctrl：对照小鼠；cKO：骨髓造血细胞RBP-J基因剔除小鼠。

(4)RBP-J基因剔除小鼠化疗骨髓抑制模型造血细胞的表型分析

①造血干细胞的分析：建模后第7天采集双侧股骨和胫骨骨髓单个核细胞， ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合Lin、Scal-1、c-Kit 等多种流式抗体染色，鉴定并分析造血干细胞的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、 SPSS等软件进行数据分析和采图统计。实验结果见附图6B所示。附图6为剔除造血细胞经典Notch信号途径对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞的影响图。附图6中，B表示流式细胞术和台盼蓝染色分析环磷酰胺化疗后第7天 RBP-J基因剔除小鼠骨髓和脾脏LSK细胞的流式代表图(左)和绝对数统计图 (右)。*P<0.05，**P<0.01，n＝4。LSK：Lin^-Scal-1⁺c-Kit⁺，造血干细胞。

②造血谱系的分析：建模后第7天采集双侧股骨和胫骨骨髓、脾脏、外周血和胸腺单个核细胞，ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合Ly6G、CD11b、B220、CD3等多种流式抗体染色，鉴定并分析髓系、B 淋巴细胞系、T淋巴细胞系等的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、SPSS等软件进行采图、数据分析和统计。实验结果见附图7所示。附图7为剔除造血细胞经典Notch信号途径对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠谱系重塑的影响图。附图7 中，A表示流式细胞术和台盼蓝染色分析环磷酰胺化疗后第7天RBP-J基因剔除小鼠胸腺和外周血T淋巴细胞的流式代表图(左)和百分比统计图(右)。B 表示流式细胞术和台盼蓝染色分析环磷酰胺化疗后第7天RBP-J基因剔除小鼠骨髓和脾脏髓系细胞的流式代表图(左)和百分比统计图(右)。*P<0.05，n＝4。 Th：thymus，胸腺。

实施例3化疗骨髓抑制后Notch信号途径调控造血干细胞与血窦内皮细胞对话的研究实验

(1)双转基因小鼠的交配和鉴定

①交配：将Cdh5Cre-ERT转基因小鼠与Rosa-NICD^flox/+转基因小鼠交配，得到对照小鼠Cdh5Cre-ERT；Rosa-NICD^+/+(Ctrl)以及过表达小鼠Cdh5Cre-ERT； Rosa-NICD^flox/+(NICD)。②鉴定：取3周龄子鼠剪取鼠尾1cm，放置于含蛋白酶K的消化液中55℃恒温消化过夜。按照常规酚-氯仿抽提方法得到小鼠基因组 DNA，用普通PCR进行基因型鉴定，所需引物和PCR扩增条件已经确定。

(2)在内皮细胞中诱导ICN1的基因激活

①诱导激活：取6周龄Cdh5Cre-ERT；Rosa-NICD^+/+对照组以及Cdh5Cre-ERT； Rosa-NICD^flox/+过表达组转基因小鼠，腹腔注射他莫昔芬诱导Cre重组酶表达，每日1次，注射5次，继予隔日1次，注射2次，共计注射7次，诱导内皮细胞ICN1的激活。②基因激活效率测定：初次注射后2周分离小鼠骨髓血窦内皮细胞体外培养，提取基因组DNA，用SphI酶切后进行电泳、转移和Southern 杂交分析基因剔除效率，所需DNA探针和条件已经确定。

(3)激活内皮细胞Notch信号对化疗骨髓抑制模型的建立和细胞组织学分析

①建模：在诱导成功的双转基因小鼠(NICD)和对照小鼠(Ctrl)上建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型。②造血细胞组织形态学分析：建模后第7天取基因剔除小鼠和对照小鼠双侧股骨和胫骨骨髓及外周血，载玻片常规涂片行瑞氏- 吉姆萨染色；取股骨37℃脱钙处理21天，石蜡包埋，切片，常规处理后行H&E 染色，采图记录，并对结果进行统计学处理。

(4)内皮细胞ICN1激活转基因小鼠化疗骨髓抑制模型造血细胞的表型分析

①造血干细胞的分析：建模后第7天采集双侧股骨和胫骨骨髓单个核细胞， ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合Lin、Scal-1、c-Kit 等多种流式抗体染色，鉴定并分析造血干细胞的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、 SPSS等软件进行数据分析和采图统计。实验结果见附图8所示。附图8为激活内皮细胞Notch信号途径对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞的影响图。附图8中，表示流式细胞术和台盼蓝染色分析环磷酰胺化疗后第7天内皮细胞 ICN1激活转基因小鼠骨髓和脾脏LSK细胞的流式代表图(左)和绝对数统计图 (右)。*P<0.05，n＝4。②造血谱系的分析：建模后第7天采集双侧股骨和胫骨骨髓、外周血单个核细胞，ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合Ly6G、CD11b、B220、CD3等多种流式抗体染色，鉴定并分析髓系、淋系、B淋巴细胞系、T淋巴细胞系等的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、SPSS 等软件进行采图、数据分析和统计。

实施例4干预Notch信号途径对化疗骨髓抑制小鼠造血失稳的治疗作用研究实验

本发明成功构建和表达了改良Notch配体活性蛋白。以Notch信号途径和造血微环境的血窦内皮细胞为切入点，以精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸(RGD)特异识别内皮细胞表面的整合素分子αVβ3为基础，N端借助His标签精简优化结构，中段连接Delta like 1保守且必需的DSL结构域，C端利用RGD九肽锚定血窦内皮细胞，设计并成功克隆构建了原核表达载体，获得了高纯度且具有生物学活性的D1R活化蛋白。DIR的结构示意图见附图9所示。附图9为Notch配体活性蛋白D1R质粒构建的结构示意图。

(1)构建和纯化Notch配体活性蛋白D1R

①表达载体的构建：以本发明人既往构建的pET32a-D1R质粒为模板，上游引物加入Nde I酶切位点和His标签(HHHHHH)序列，下游引物加入Sal I 酶切位点和RGD九肽(CRGDCGVRY)序列，进行PCR扩增获得mouse Detal like 1-126-224(NM_007865.3)的多核苷酸序列。琼脂糖凝胶电泳回收克隆产物，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌XL-10，挑选单菌落，提取质粒，酶切鉴定并测序。测序正确后，采用Nde I和Sal I双酶切pMD18-T-D1R和pET22b(+)，连接、转化、酶切鉴定并测序得到Notch重组配体原核表达载体pET22b(+)-D1R。实验结果见附图10A所示。附图10为本发明改良的内皮细胞靶向的Notch配体活性蛋白D1R的优选克隆及表达纯化图。附图10A中，A表示PCR产物DNA 凝胶电泳成像图，利用普通PCR方法扩增获得D1R的DNA片段，大小为355bp (黑色箭头所示)。M：DNA Marker。②蛋白的表达和纯化：热休克法将表达质粒转化大肠杆菌BL21，挑菌接种，转接，IPTG诱导蛋白表达。4℃离心收集菌体，冰浴超声裂菌，TrionX-100破膜静置，收集上清及沉淀行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色检测D1R融合蛋白表达。按照Invitrogen ProBond^TM纯化手册，8 mol/L尿素变性包涵体蛋白，镍离子螯合珠亲合层析，透析缓冲液逐步复性，PBS 透析获得重组蛋白。产物经PEG-20000浓缩，无菌过滤，BCA法定量，分装保存。实验结果见附图10B所示。附图10为本发明改良的内皮细胞靶向的Notch 配体活性蛋白D1R的优选克隆及表达纯化图。附图10中，B表示纯化蛋白产物 SDS-PAGE蛋白电泳图，D1R蛋白大小为13.287Kd(黑色箭头所示)，1号泳道为超声裂解沉淀，2-4号泳道为尿素梯度洗涤上清，5号和6号泳道为蛋白洗脱上清，7号泳道为透析产物。M：蛋白Marker。

(2)Notch重组活性蛋白的体外生物学活性检测

①内皮靶向性的分析：100μLPBS或D1R包被96孔板4℃过夜，取对数生长期小鼠脑血管内皮细胞系b.End.3细胞悬液(5×10⁵/mL)均匀种入，37℃孵箱培养20min，4％PFA后固定30min，结晶紫染色20min，显微镜观察并采图，结晶紫脱色液脱色，酶标仪A620检测，数据统计分析。此外，将b.End.3与PBS 或D1R室温共孵育30min，His-Tag单标4℃避光染色20min，流式细胞仪 FACS^calibur结合His抗体鉴定内皮细胞D1R蛋白的结合情况。②Notch信号激活的分析：常规制备b.End.3细胞爬片，与D1R蛋白或PBS共孵育，4％PFA后固定，采用活化形式的Notch1胞内段抗体ICN1和核染色液Hoechst双标进行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜采图，定量，统计学分析Notch信号激活情况。常规制备对数生长期b.End.3细胞爬片，等体积D1R、PBS或D1R+GSI共培养24h，4％PFA后固定，室温封闭30min，一抗4℃孵育12h，二抗室温避光孵育 2h，Hoechst染核15min，甘油封片，激光共聚焦显微镜观察并采图统计。实验结果见附图11所示。附图11为Notch配体活性蛋白D1R体外生物学活性的鉴定图。附图11中，A表示流式细胞术分析b.End.3细胞共孵育后His-Tag抗体表达的典型流式结果图。B表示结晶紫染色的典型结果图，右下角为酶标仪检测 620nm吸光光度值的统计图。C表示免疫荧光染色分析b.End.3细胞共孵育后 Notch信号活化片段ICN1核表达的典型结果图，右下角为免疫荧光定量分析结果的统计图。D表示实时定量RT-PCR检测不同浓度D1R与b.End.3细胞共培养后Notch下游靶基因Hes1和Hey1的表达。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001， n＝6。GSI：γ分泌酶抑制剂。

(3)造血细胞特异性激活Notch信号模型小鼠的建立及Notch重组活性蛋白的体内生物学活性检测

①建模：取8周龄C57BL/6野生雄性小鼠建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型， 2h后腹腔注射4mg/kg剂量的D1R，对照组注射等量PBS，每24h注射一次，连续注射7～14天。②造血细胞Notch信号激活的分析：首次注射D1R后第7 天，分离小鼠股骨，37℃脱钙处理21天，采用ICN1抗体和核染色液Hoechst 双标进行免疫荧光染色，体内原位观察骨髓造血细胞Notch信号途径的激活情况。实验结果见附图12A所示。分离小鼠双侧股骨和胫骨骨髓单个核细胞，ACK 缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，磁珠分选Lin^-造血干/祖细胞，按常规分子生物学方法获取RNA提取物，以实时定量RT-PCR方法检测Notch信号下游基因Hes1、Hes5的表达，在体内明确Notch配体活性蛋白D1R的生物学活性。实验结果见附图12B所示。附图12为Notch配体活性蛋白D1R体内生物学活性的鉴定图。附图12中，A表示免疫荧光染色分析C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠 D1R治疗第7天股骨造血细胞Notch信号活化片段ICN1核表达的典型结果图。 B表示实时定量RT-PCR检测C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓Lin^-造血干/祖细胞Notch下游靶基因Hes1和Hes5的表达。*P<0.05，**P<0.01， n＝6。

(4)激活造血细胞Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血重建的影响

①生存分析及血常规分析：建模成功后，每日早、晚观察小鼠生命体征及状态，记录死亡动物组别、数目、死亡日期，绘制生存曲线。隔日鼠尾取外周血10μl，利用血常规分析仪统计白细胞及五分类、红细胞、血红蛋白和血小板的数目，绘制变化曲线。②造血细胞形态学分析：首次注射D1R后第7、14天取小鼠双侧股骨和胫骨骨髓和外周血，载玻片推片行瑞氏-吉姆萨染色，分类计数并采图，对结果进行统计学分析。③造血组织形态学分析：首次注射D1R后第7、14天取小鼠的股骨，37℃脱钙处理21天，肝脏、脾脏、淋巴结等组织称重、拍照、记录、统计，多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规处理后行H&E 染色，采图、定量，对结果进行统计学处理。实验结果见附图13A所示。④造血恢复的分析：首次注射D1R后第7天无菌条件下获取双侧股骨和胫骨骨髓单个核细胞，裂红，按照

完全培养基使用说明书进行集落形成实验，置于37℃孵箱中培养14～16天，倒置显微镜下进行分类计数，采图，统计。实验结果见附图13B所示。附图13为激活造血细胞Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠脾脏和集落形成的影响图。附图13中，A表示C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天脾脏的代表图。B表示集落形成实验分析C57BL/6小鼠D1R治疗第7天骨髓不同造血细胞集落形成的统计图(左)和光镜代表图(右)。 *P<0.05，n＝3。⑤造血干细胞及干细胞亚型重塑的分析：首次注射D1R后第7 天获取双侧股骨和胫骨骨髓单个核细胞，ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用磁珠分选、流式细胞术结合Lin、Scal-1、c-Kit、CD150、CD48等多种抗体染色，鉴定并分析造血干/祖细胞(LSK)、长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)、多能造血祖细胞(MPP)等的免疫表型，采用Cellquest、 FlowJo、SPSS等软件进行采图分析和数据统计。实验结果见表1和附图14所示。表1为激活造血细胞Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血重建的影响结果。表1中，表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓、脾脏及外周血单个核细胞的绝对数，骨髓、脾脏LSK细胞的绝对数，骨髓、脾脏及外周血髓系细胞的绝对数，以及脾脏/体重比、肝脏/体重比的统计表。*P<0.05，**P<0.01，n＝6。

表1激活造血细胞Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血重建的影响结果

附图14为激活造血细胞Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞亚型重塑的影响图。附图14中，表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6 环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)、多能造血祖细胞(MPP)的流式代表图(上)和绝对数统计图(下)。*P<0.05，n＝4。LT-HSC：Long term-hematopoietic stem cell；ST-HSC： Short term-hematopoietic stem cell；MPP：Multipotent progenitor。⑥髓系祖细胞亚型重塑的分析：首次注射D1R后第7天采集双侧股骨和胫骨骨髓、脾脏和外周血单个核细胞，ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用磁珠分选、流式细胞术结合Ly6G、CD11b、B220、CD3、Lin、Sca-1、c-Kit、CD34、CD16/32 等多种流式抗体染色，鉴定并分析共同髓系祖细胞(CMP)、粒/单系祖细胞 (GMP)、巨核/红系祖细胞(MEP)、髓系细胞、B淋巴细胞系、T淋巴细胞系等的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、SPSS等软件进行采图分析和数据统计。实验结果见表1和附图15所示。附图15为激活造血细Notch信号对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠髓系祖细胞亚型重塑的影响图。附图15中，表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓共同髓系祖细胞(CMP)、粒/单系祖细胞(GMP)、巨核/红系祖细胞(MEP)的流式代表图(上)、绝对数统计图(左下)和GMP百分比统计图(右下)。**P<0.01，n＝4。 n.s：P＞0.05，无统计学意义；CMP：Commonmyeloid progenitor；GMP： Granulocyte/monocyte progenitor；MEP：Megakaryocyte-erythrocyte progenitors。

(5)激活造血细胞Notch信号对化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞生物学功能的影响

对HSC归巢、植入和短期造血重建能力的影响：初次骨髓移植实验。取8 周龄C57BL/6-GFP雄性转基因小鼠建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型，2h后腹腔注射4mg/kg剂量的D1R，对照组注射等量PBS，每24h注射一次，连续注射7 天。无菌条件下取C57BL/6-GFP建模小鼠骨髓单个核细胞，尾静脉移植给8周龄经⁶⁰Coγ射线10Gy致死剂量电离辐照的C57BL/6雄性野生小鼠，每日早、晚观察并记录死亡动物组别、数目、死亡日期，绘制移植后3个月的生存曲线。每周鼠尾取外周血10μL，利用血常规分析仪统计白细胞及五分类、红细胞、血红蛋白和血小板的数目，分析HSC的归巢和植入情况。移植后第3个月采集骨髓和外周血单个核细胞，运用磁珠分选、流式细胞术结合Lin、Scal-1、c-Kit、 Ly6G、CD11b、B220、CD3等多种抗体染色，分析造血干细胞、髓系、B淋巴细胞系、T淋巴细胞系等的重建情况。实验结果见附图16所示。附图16为骨髓移植实验观察激活造血细胞Notch信号后对环磷酰胺化疗骨髓抑制小鼠造血干细胞生物学功能的影响图。附图16中，A表示C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠 D1R治疗第7天取骨髓细胞，移植给经致死剂量辐照的C57BL/6-GFP转基因小鼠，移植后第3个月流式细胞术和台盼蓝染色分析骨髓和外周血GFP(+)的单个核细胞、髓系细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞的绝对数统计图。B表示流式细胞术和台盼蓝染色分析骨髓GFP(+)的LSK细胞的流式代表图(上)和绝对数统计图(下)。C表示流式细胞术分析骨髓和外周血GFP(+)的单个核细胞、髓系细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞的流式代表图。*P<0.05，**P<0.01，n＝6 和n＝10。GFP：绿色荧光蛋白。

(6)激活造血细胞Notch信号对氟尿嘧啶化疗骨髓抑制小鼠造血重建的影响

①建模：取8周龄C57BL/6野生雄性小鼠建立氟尿嘧啶化疗骨髓抑制模型， 2h后腹腔注射4mg/kg剂量的D1R，对照组注射等量PBS，每24h注射一次，连续注射7天。②造血细胞数量分析：首次注射D1R后第7天取建模小鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞、脾脏细胞及外周血细胞，裂解红细胞后利用台盼蓝染色在显微镜下计数并统计分析。实验结果见附图17A所示。③造血干细胞的分析：首次注射D1R后第7天取建模小鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞和脾脏细胞，ACK 缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合Lin、Scal-1、c-Kit等多种流式抗体染色，鉴定并分析造血干细胞的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、 SPSS等软件进行采图分析和数据统计。实验结果见附图17B所示。附图17为激活造血细胞Notch信号对氟尿嘧啶化疗骨髓抑制小鼠造血重建尤其造血干细胞重建的影响图。附图17中，A表示台盼蓝染色分析C57BL/6氟尿嘧啶化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓(左)、脾脏(中)及外周血(右)单个核细胞的绝对数统计图。B表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6氟尿嘧啶化疗小鼠D1R 治疗第7天骨髓髓系祖细胞(Lin^-c-Kit⁺Sca-1^-)和脾脏LSK细胞的流式代表图(左)和绝对数统计图(右)。*P<0.05，**P<0.01，n＝4。④髓系重塑的分析：首次注射D1R后第7天取建模小鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞、脾脏细胞及外周血细胞，ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合Ly6G、 CD11b等多种流式抗体染色，鉴定并分析髓系细胞的免疫表型，采用Cellquest、 FlowJo、SPSS等软件进行采图分析和数据统计。实验结果见附图18所示。附图18为激活造血细胞Notch信号对氟尿嘧啶化疗骨髓抑制小鼠髓系重塑的影响图。附图18中，表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6氟尿嘧啶化疗小鼠 D1R治疗第7天骨髓、脾脏和外周血髓系细胞的流式代表图(左)和绝对数统计图(右)。*P<0.05，**P<0.01，n＝4。⑤淋系重塑的分析：首次注射D1R后第 7天取建模小鼠脾脏细胞及外周血细胞，ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合B220、CD3等多种流式抗体染色，鉴定并分析B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、SPSS等软件进行采图分析和数据统计。实验结果见附图19所示。附图19为激活造血细胞Notch信号对氟尿嘧啶化疗骨髓抑制小鼠淋系重塑的影响图。附图19中，表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6氟尿嘧啶化疗小鼠D1R治疗第7天脾脏和外周血 B淋巴细胞的流式代表图(左)和绝对数统计图(右)。**P<0.01，***P<0.001， n＝4。

(7)激活造血细胞Notch信号对顺铂化疗骨髓抑制小鼠造血重建的影响

①建模：取8周龄C57BL/6野生雄性小鼠建立顺铂化疗骨髓抑制模型，2h 后腹腔注射4mg/kg剂量的D1R，对照组注射等量PBS，每24h注射一次，连续注射7天。②造血细胞数量分析：首次注射D1R后第7天取建模小鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞、脾脏细胞及外周血细胞，裂解红细胞后利用台盼蓝染色在显微镜下计数并统计分析。实验结果见附图20A所示。③造血干细胞的分析：首次注射D1R后第7天取建模小鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞和脾脏细胞，ACK 缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合Lin、Scal-1、c-Kit等多种流式抗体染色，鉴定并分析造血干细胞的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、 SPSS等软件进行采图分析和数据统计。实验结果见附图20B所示。附图20为激活造血细胞Notch信号对顺铂化疗小鼠造血重建尤其造血干细胞重建的影响图。附图20中，A表示台盼蓝染色分析C57BL/6顺铂化疗小鼠D1R治疗第7 天骨髓(左)、脾脏(中)及外周血(右)单个核细胞的绝对数统计图。B表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6顺铂化疗小鼠D1R治疗第7天脾脏LSK 细胞的流式代表图(左)和绝对数统计图(右)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001， n＝4。④髓系重塑的分析：首次注射D1R后第7天取建模小鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞、脾脏细胞及外周血细胞，ACK缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合Ly6G、CD11b等多种流式抗体染色，鉴定并分析髓系细胞的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、SPSS等软件进行采图分析和数据统计。实验结果见附图21所示。附图21为激活造血细胞Notch信号对顺铂化疗骨髓抑制小鼠髓系重塑的影响图。附图21中，表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6顺铂化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓、脾脏和外周血髓系细胞的流式代表图(左)和绝对数统计图(右)。*P<0.05，**P<0.01，n＝4。⑤淋系重塑的分析：首次注射D1R后第7天取建模小鼠脾脏细胞、胸腺细胞及外周血细胞，ACK 缓冲液冰上裂红，制备单细胞悬液，运用流式细胞术结合B220、CD3、CD4、 CD8等多种流式抗体染色，鉴定并分析B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫表型，采用Cellquest、FlowJo、SPSS等软件进行采图分析和数据统计。实验结果见附图22所示。附图22为激活造血细胞Notch信号对顺铂化疗骨髓抑制小鼠淋系重塑的影响图。附图22中，A表示流式细胞术和台盼蓝染色分析C57BL/6顺铂化疗小鼠D1R治疗第7天外周血B淋巴细胞的流式代表图(左)和绝对数统计图(右)。B代表流式细胞术分析C57BL/6顺铂化疗小鼠D1R治疗第7天外周血和胸腺T淋巴细胞的流式代表图。C代表流式细胞术和台盼蓝染色分析 C57BL/6顺铂化疗小鼠D1R治疗第7天外周血和胸腺T淋巴细胞的绝对数统计图(左)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝4。

实施例5化疗骨髓抑制后造血重建中Notch信号途径调控造血干细胞、髓系前体细胞与骨髓血窦内皮细胞功能和重塑的研究实验

(1)Notch信号途径调控造血干细胞增殖和凋亡的细胞学机制

①激活Notch信号对化疗小鼠造血干细胞增殖的影响：取8周龄C57BL/6 野生雄性小鼠建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型，2h后腹腔注射4mg/kg剂量的 D1R，对照组注射等量PBS，每24h注射一次，连续注射7天。同时，隔天给予腹腔注射BrdU蛋白，并在小鼠饮用水中掺入BrdU蛋白。第7天采集骨髓单个核细胞，裂红，磁珠分选Lin^-细胞，利用Scal-1、c-Kit、Brdu和PI等多种流式抗体染色，流式细胞术检测造血干细胞增殖情况并统计分析。实验结果见附图23A所示。附图23为造血细胞特异性激活Notch信号途径对化疗小鼠造血干细胞增殖和凋亡的影响图。附图23中，A表示磁珠分选和流式细胞术分析 C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓LSK细胞BrdU表达的流式代表图(左)和百分比统计图(右)。**P<0.01，n＝4。②激活Notch信号对化疗小鼠造血干细胞凋亡的影响：取8周龄C57BL/6野生雄性小鼠建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型，2h后腹腔注射4mg/kg剂量的D1R，对照组注射等量PBS，每24h注射一次，连续注射7天。首次注射D1R后第7天采集骨髓单个核细胞，裂红，磁珠分选Lin^-细胞，利用Scal-1、c-Kit、AnnexinV和PI等多种流式抗体染色，流式细胞术检测造血干细胞凋亡情况并统计分析。实验结果见附图23B 所示。附图23为造血细胞特异性激活Notch信号途径对化疗小鼠造血干细胞增殖和凋亡的影响图。附图23中，B表示磁珠分选和流式细胞术分析C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓LSK细胞AnnexinV和PI表达的流式代表图。

(2)Notch信号途径调控髓系细胞增殖和凋亡的细胞学机制

①激活Notch信号对化疗小鼠髓系细胞增殖的影响：取8周龄C57BL/6野生雄性小鼠建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型，2h后腹腔注射4mg/kg剂量的D1R，对照组注射等量PBS，每24h注射一次，连续注射7天。同时，隔天给予腹腔注射BrdU蛋白，并在小鼠饮用水中掺入BrdU蛋白。第7天采集骨髓单个核细胞，裂红，利用Ly6G、CD11b等多种流式抗体染色，流式细胞术检测髓系前体细胞的增殖情况并统计分析。实验结果见附图24所示。附图24为造血细胞特异性激活Notch信号途径对化疗小鼠骨髓髓系前体细胞增殖和凋亡的影响图。附图24表示流式细胞术分析C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓 Ly6G⁺CD11b⁺细胞BrdU表达的流式代表图(左)和百分比统计图(右)。**P<0.01， n＝4。Myeloid：骨髓Ly6G⁺CD11b⁺髓系前体细胞。②激活Notch信号对化疗小鼠髓系细胞凋亡的影响：取8周龄C57BL/6野生雄性小鼠建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型，2h后腹腔注射4mg/kg剂量的D1R，对照组注射等量PBS，每24h 注射一次，连续注射7天。首次注射D1R后第7天采集骨髓单个核细胞，裂红，利用Ly6G、CD11b等多种流式抗体染色，流式细胞术检测髓系前体细胞的凋亡情况并统计分析。实验结果见附图25所示。附图25为造血细胞特异性激活Notch 信号途径对化疗小鼠骨髓髓系前体细胞增殖和凋亡的影响图。附图25表示流式细胞术分析C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓Ly6G⁺CD11b⁺细胞 AnnexinV和PI表达的流式代表图。

(3)Notch信号途径调控化疗骨髓抑制后造血重建的分子机制

造血细胞特异性激活Notch信号途径对化疗小鼠造血干细胞血管内皮细胞相关分子表达的影响：取8周龄C57BL/6野生雄性小鼠建立环磷酰胺化疗骨髓抑制模型，2h后腹腔注射4mg/kg剂量的D1R，对照组注射等量PBS，每24h注射一次，连续注射7天。首次注射D1R后第7天采集骨髓单个核细胞，裂红，磁珠分选结合流式细胞术分选LSK细胞，提取细胞的RNA，利用实时定量RT-PCR 检测血管内皮细胞相关分子Vash1、Coll8al-s的表达变化。实验结果见附图26 所示。附图26为造血细胞特异性激活Notch信号途径对化疗小鼠造血干细胞血管内皮细胞相关分子表达的影响图。附图26中，表示实时定量RT-PCR检测 C57BL/6环磷酰胺化疗小鼠D1R治疗第7天骨髓LSK细胞中血管内皮细胞相关分子Vash1、Coll8al-s的表达。*P<0.05，**P<0.01，n＝4。

Claims (1)

1.检测Notch信号下游分子Hes1、和/或Hes5、和/或Hey1、和/或Hey2的试剂在制备肿瘤化疗导致骨髓抑制的早期预后判断产品中的应用；所述早期预后判断为肿瘤化疗导致骨髓抑制患者的造血恢复情况。

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