CN101899445A - 一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途，构建hM HS21/45vav-iASPPsv质粒，将此质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度。通过显微注射的方法把转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv注射入C57小鼠受精卵内，植入假孕小鼠子宫内，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，自尾部提取DNA使用PCR检测目的基因iASPPsv的整合。采用分子生物学、实验动物学等方法获得了造血系统特异性高表达iASPPsv转基因小鼠模型，成功建立检测造血干祖细胞增殖、定向分化、迁移和凋亡等方面的实验方法，为进一步阐述正常造血干祖细胞向肿瘤细胞转化的机制研究以及靶向治疗奠定了基础。

Description

一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及小鼠模型，具体涉及一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途。

背景技术

目前，恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最严重疾病之一。随着社会经济的发展，肿瘤的发病率呈上升趋势。所以针对各种肿瘤的预防、发病机制、诊断、治疗和预后的相关研究成为迫切亟待解决的问题。越来越多的研究发现，肿瘤的发生可能起源于最初的肿瘤干细胞，而肿瘤干细胞的可能来源于调控异常的正常干细胞，这两者之间的转化研究，对各种肿瘤的预防、发病机制、诊断、治疗和预后的相关研究为肿瘤的治疗，预防提供了新的思路，成为目前临床与基础研究的热点课题。多能造血干细胞的生长发育与分化成各系功能血细胞的过程受许多不同基因表达调控，当这些调控信号或造血干祖细胞所处的微环境的发生改变，都可能对造血干细胞的功能和发育产生影响。造血干祖细胞受到遗传学损伤累积，引起增殖失控，分化与凋亡之间的平衡被打破后就可能会导致恶性血液系统肿瘤的发生。造血细胞的增殖失控、分化能力的丧失将可能导致细胞的恶性转化及白血病的发生。

p53作为迄今为止发现的最重要的抑癌基因，被称作“基因组的护卫者”，通过激活下游p21、14-3-3σ表达引起受损细胞周期停滞启动修复损伤，防止肿瘤发生。p53突变后的细胞，常常引起染色体不稳定，发生癌变的机率增加。在超过一半罹患实体肿瘤的患者中存在p53缺失或点突变，但在血液系统恶性疾病中仅有15％。之前研究发现，除p53基因本身的异常外，恶性肿瘤的发生发展过程中还与p53的调节异常有关，譬如肉瘤患者中常见的MDM2异常，该基因是一个p53的拮抗基因，作为泛素连接酶，通过负反馈的方式促进p53泛素化，加速p53降解。但是，这种蛋白降解的方式在白血病患者中仅个别存在，许多白血病特异性的融合蛋白，如AML1-ETO、PML-RARα等融合蛋白通过增加p53募集组蛋白脱乙酰化酶，使p53脱乙酰化，造成p53易于降解，降低p53的稳定性，从而逃逸p53依赖的肿瘤监视机制。上述研究提示急性白血病不仅有别于其他恶性实体肿瘤，而且本身有很大的异质性，部分患者可能存在p53的其他调节途径异常，导致p53功能的缺失。

ASPP(Apoptosis Stimulating Proteins of P53)是新近发现的一类p53凋亡调控蛋白，主要包括ASPP1、ASPP2和iASPP(inhibitor ASPP)，分别由PPP1R13B、TP53P2和PPP1R13L编码。该家族蛋白C端都包含有如下三个结构：锚蛋白重复序列，SH3结构域和脯氨酸富集区。ASPP蛋白通过锚蛋白重复序列，SH3结构域结构区与目的蛋白如P53家族蛋白结合，P53与ASPP的结合位点，如第181位精氨酸突变，也是人类乳腺和宫颈癌P53的高突变位点。

根据其对P53的调控作用又可分为两类，一类为P53正性调控分子，包括ASPP1和ASPP2，两者N端序列高度同源，它们主要表达于哺乳动物细胞胞浆并且在功能上极为相似，与p53蛋白结合后，能促进p53对Bax等凋亡相关基因的转录，促进p53的促凋亡作用。与P53相互作用时，更倾向于与P53DNA结合区结合。另一类为负性调节分子，即iASPP，它在N端结构上不同于前两者。与P53结合时，与P53脯氨酸富集区的亲和力大于其DNA结构域，它是该家族中唯一同时表达于线虫与哺乳动物细胞的蛋白，线虫iASPP(Ce-iASPP)与人的iASPP具有38％的同源性，Ce-iASPP可在人的细胞系中发挥相同的调节功能，提示该蛋白对调节p53凋亡功能的重要性。随着研究的深入，我们最近的研究表明，还存在着一种截短型的ASPP家族负性调控因子，iASPPsv(iASPP splice variant)，分子量为407个氨基酸，除了N端的52个氨基酸的差别外，其余序列与全长型iASPP完全一致，该蛋白也仅表达于细胞核，通过293T细胞转染实验证明，其SH3结构域非核定位所必需。这两个ASPP家族负性调控因子的定位也不同：iASPP主要表达于细胞浆，iASPPsv则在细胞核，iASPP的N末端是该蛋白在胞浆表达和负性调节功能必不可少的序列。iASPPsv定位于细胞核内，且核定位作用并不依赖于其SH3结构域，可以在细胞内与p53结合并抑制p53对其靶基因Bax和p21的转录。采用RNA干扰的方法抑制iASPP癌基因在p53野生型白血病细胞系Nalm6中的表达，发现siRNA干扰片段处理白血病细胞株Nalm6细胞，使iASPP mRNA表达水平下调，细胞分化抗原CD20表达升高，细胞凋亡增加，并且提高了对细胞毒药物的敏感性。iASPPsv可以使骨髓集落形成细胞数目增多，提示iASPPsv可能通过影响造血干细胞的凋亡、增殖和自我更新等功能，促进了造血干细胞发生恶变。近年研究表明：许多肿瘤的发生和致病可能都依赖于一小群肿瘤干细胞，这群肿瘤干细胞持续生长，并向其他部位播散。目前认为肿瘤干细胞主要起源于正常的干祖细胞，正常的干祖细胞获得并积累突变使癌基因激活和(或)抑癌基因失活，最终，正常的干祖细胞演变为肿瘤干细胞。但是，iASPPsv在造血干祖细胞的自我更新、定向分化，以及正常造血干祖细胞向肿瘤干细胞的转化过程中发挥了何种作用，是否会导致小鼠发生肿瘤，如果发生肿瘤，这些肿瘤细胞是否起源于干祖细胞，目前均不清楚。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途，构建转基因的载体是插入人iASPPsv的表达质粒，线性化转基因载体，纯化后通过显微注射技术将带有目的基因的核酸注射入C57小鼠受精卵中，使外源基因整合入小鼠基因组中，检测其对造血干祖细胞自我更新、定向分化及是否有肿瘤发生等功能的影响。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：

1)载体构建：自pcDNA3.0-FLAG-iASPPsv中，PCR扩增iASPPsv，引入所需的Not I和Sfi I酶切位点：

上游引物为5’-GCAGGCCCGTACGGCCATGTGCTGGTTG-3’下划线为引入Sfi I酶切位点

下游引物为5’-CAGCGCGGCCGCCTAGACTTTACTCCTTTG-3’划线为引入Not I酶切位点

反应条件为98℃预变性1min，98℃10s，68℃4min，27个循环后4℃保存，扩增片段长度为1245bp，PCR扩增后加入A尾，电泳定量并进行胶回收纯化，连接入pMD18-T载体中，转化E.coli DH5α菌株，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经Sfi I和Not I双酶切鉴定后，测序正确的克隆，经SfiI和NotI双酶切得到iASPPsv片段，胶回收纯化，hM HS21/45vav经Sfi I和Not I双酶切，纯化定量，与自pMD18-T-iASPPsv载体Sfi I和Not I双酶切纯化所得的iASPPsv片段连接，转化DH5α感受态细胞后挑取克隆，Sfi I和Not I双酶切鉴定已插入目的片段，构建hM HS21/45vav-iASPPsv质粒；

2)转基因载体的线性化与纯化：将构建hM HS21/45vav-iASPPsv质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度，得到纯化的转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv；

3)小鼠模型制备：把转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv注射入C57小鼠受精卵内，植入假孕小鼠子宫内，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，自尾部提取DNA使用PCR检测目的基因iASPPsv的整合，得到转导iASPPsv癌基因的阳性首建鼠；

4)建立iASPPsv转基因鼠系：将整合外源目的基因首建鼠与6-8周龄正常野生型C57BL/6J小鼠交配、传代，提取子代鼠尾基因组DNA，PCR鉴定携带遗传自父代的外源基因整合情况，获取研究所需阳性子代iASPPsv转基因小鼠。

用于将转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv注射入C57小鼠受精卵内是采用显微注射方法。

用上述方法构建的转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型。

所述的转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型在肿瘤的靶向治疗中的应用。

Western-blot检测iASPPsv的表达情况，发现这目的癌基因(蛋白)在骨髓，胸腺，脾脏中特异性高表达，在肝脏，肾脏等非造血系统中表达量没有明显变化。定期尾静脉取血，查血象及白细胞分类。流式细胞术分析该转基因小鼠骨髓中造血干祖细胞比例和数量变化，竞争移植实验、极限稀释实验和连续移植实验比较该小鼠骨髓细胞的造血重建能力，检测该小鼠骨髓造血干祖细胞抗凋亡能力指标。血象有异常改变后，处死小鼠，解剖查看肝、脾、淋巴结等器官肿大情况。各器官组织进行病理检测，流式分析显示细胞表型。

本发明的有益效果是：iASPPsv转基因小鼠模型中短期造血干细胞(ST-HSCs)数量增加，但减少了共同髓系祖细胞(CMP)或粒单核细胞系祖细胞(GMP)数量。在竞争移植实验中表现出强于野生型小鼠的增殖能力。小鼠模型骨髓细胞在极限稀释实验中，对致死剂量照射受体小鼠骨髓重建能力强于野生型小鼠。小鼠模型随着骨髓细胞的衰老，在连续移植实验中对致死剂量照射受体小鼠骨髓重建能力稍弱于野生型小鼠。小鼠模型的骨髓造血干祖细胞，受到放射源照射时具有较强的抗凋亡能力，上述骨髓细胞多见断裂DNA双链，累积较多遗传学损伤。小鼠模型可见肿瘤高发，主要是急性乳腺癌和白血病两种恶性肿瘤，乳腺癌肿瘤细胞具有二次移植能力。可以为白血病的靶向治疗提供新的靶向分子iASPPsv。，为白血病的靶向治疗提供新的动物模型，从而进一步研究和阐述淋巴细胞白血病的发病机制。

附图说明

图1是PCR扩增iASPPsv片断的凝胶电泳分析(M：DL2,000 Maker)。

图2是pMD18-T-iASPPsv质粒克隆及Not I和SfiI双酶切鉴定(M：DL 15,000 Maker；P：Plasmid；C：Not I和Sfi I双酶切)。

图3是iASPPsv连入pMD18-T载体，正向测序结果。

图4是iASPPsv连入pMD18-T载体，反向测序结果。

图5是hM HS21/45vav-iASPPsv质粒克隆及NotI和Sfi I双酶切鉴定(M：DL15,000 Maker)。

图6是PCR扩增检测转基因小鼠iASPPsv整合情况(M：DL2,000 Maker)。

图7是Western-blot检测iASPPsv在阳性转基因小鼠的蛋白水平表达。

图8是分选WT小鼠骨髓中LISK、LSK细胞过程(LISK：lin^-，c-kit^hi，Sca-1^-；LSK：lin^-，c-kit^hi，Sca-1^hi)。

图9是iASPPsv与WT小鼠骨髓LSK细胞、长期造血干细胞(LT-HSC)与短期造血干细胞(ST-HSC)比例。

图10是iASPPsv与WT小鼠骨髓LISK细胞比例变化。

图11是iASPPsv与WT小鼠骨髓中各系祖细胞比例变化。

图12是iASPPsv转基因、对照组WT小鼠竞争移植重建造血实验。

图13是iASPPsv组连续移植实验死亡小鼠组织病理切片结果(a.b.脾增生减低，多见吞噬红细胞现象，含铁血黄素沉着；c.肝脂肪变性)。

图14是iASPPsv转基因、WT对照组小鼠1×10⁶个骨髓细胞的第5次连续移植实验受体小鼠生存曲线。

图15是4.5Gy辐射后iASPPsv与WT小鼠骨髓LSK(lin^-，c-kit^hi，Sca-1^hi)造血干祖细胞的早期凋亡情况。

图16是4.5Gy辐射后iASPPsv与WT小鼠骨髓LSK(lin^-，c-kit^hi，Sca-1^hi)造血干祖细胞的晚期凋亡情况。

图17是iASPPsv、WT小鼠骨髓细胞4.5Gy照射后磷酸化H2AX染色野生型对照组(a.野生型对照组小鼠，b.iASPPsv小鼠组)。

图18是iASPPsv与WT小鼠骨髓中LSK(lin^-，c-kit^hi，Sca-1^hi)造血干祖细胞Transwell迁移实验。

图19是iASPPsv与WT小鼠骨髓细胞归巢体内实验。

图20是乳腺癌小鼠解剖外观、外周血、脾脏细胞形态及组织病理切片结果(a.c.可见小鼠肝脾肿大；b.乳腺癌瘤块；d.外周血瑞氏染色；e.和f.脾细胞瑞氏-吉姆萨染色；g.脾造血活跃，粒、红、巨核三系造血细胞均可见；h.乳头状腺癌)。

图21是乳腺癌细胞二次移植小鼠后组织病理切片结果(a.b.瘤细胞呈腺样结构排列乳腺癌；c.肝灶性坏死，炎细胞浸润)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

实施例1携带iASPPsv的转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv的构建与纯化

利用高保真PrimeSTAR HotStar’ DNA多聚酶，自pcDNA3.0-FLAG-iASPPsv中，PCR扩增iASPPsv，引入所需的Not I和Sfi I酶切位点，上游引物和下游引物分别为5’-GCAGGC CCGTACGGCCATGTGCTGGTTG-3’(下划线为引入Sfi I酶切位点)和5’-CAGCGCGGCCGCCTAGACTTTACTCCTTTG-3’(下划线为引入Not I酶切位点)，反应条件为98℃预变性1min，98℃10s，68℃4min，27个循环后4℃保存，扩增片段长度为1245bp，PCR扩增后加入A尾，电泳定量(图1)并进行胶回收纯化，连接入pMD18-T载体中，转化E.coli DH5α菌株，在LB平皿中进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经Sfi I和Not I双酶切鉴定后(图2)，送测序(图3、4)。测序正确的克隆，经SfiI和NotI双酶切得到iASPPsv片段，胶回收纯化。hM HS21/45vav经Sfi I和Not I双酶切，纯化定量，与自pMD18-T-iASPPsv载体Sfi I和Not I双酶切纯化所得的iASPPsv片段连接，转化DH5α感受态细胞后挑取克隆，Sfi I和Not I双酶切鉴定已插入目的片段(图5)。构建hM HS21/45vav-iASPPsv质粒，将此质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度至50ng/μl，即获得显微注射所需的转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv。

实施例2iASPPsv转基因动物模型的建立及表型的鉴定

hM HS21/45vav-iASPPsv纯化后，即可用显微注射法等方法使其整合入真核动物基因组，如C57BL/6J小鼠基因组中，其步骤简述如下：

1)准备假孕母鼠(养母)：选取数只2月龄以上适龄雌性小鼠可育雌鼠作为受体鼠，与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母，第二天上午9:00前观察受体鼠，有精栓者拿出隔离备用。

2)受精卵的准备：选取7-8周龄雌性小鼠可育雌鼠，每只小鼠腹腔注射马血清PMSG(10 IU)，47-48小时后，每只小鼠腹腔注射绒毛膜促性腺激素(HCG)(0.8IU)，促使超排卵，处理后与可育雄鼠交配。次日，断颈处死供体鼠，手术取出整个输卵管，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出，收集受精卵备用，放入透明质酸酶(0.3mg/M2)液中；

3)基因导入：仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5％CO₂，37℃培养箱培养。

在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。

安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。

在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使上述纯化获得的转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv溶液缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大后退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5％CO₂，37℃培养箱培养。

4)胚胎移植：将已转入基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管内，将受体麻醉，注射计量为1％戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。自背部手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸-个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卯管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤，使胚胎在养母体内发育成熟；

手术后19-21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，自尾部提取DNA使用PCR检测目的基因iASPPsv的整合。

5)对幼鼠的鉴定：幼鼠断乳后自尾部提取DNA，使用PCR的方法，鉴定外源基因是否整合，整合目的序列的幼鼠称为首建鼠(founder)。Western-blot检测iASPPsv的表达情况，发现这目的基因(蛋白)在骨髓，胸腺，脾脏组织中特异性高表达，在肝脏，肾脏等非造血系统中表达量没有明显变化。共获得iASPPsv转基因首建鼠4只小鼠分别选iASPPsv的两只不同首建鼠进行后续的造血干祖细胞生物学相关研究。

实施例3 iASPPsv子代阳性小鼠的PCR筛选鉴定及小鼠模型的建立

显微注射目的核酸受精卵发育繁殖小鼠，剪取出生后3周龄小鼠的1cm左右鼠尾，提取基因组DNA(酚-氯仿-异戊醇法抽提基因组DNA)，PCR检测外源目的基因整合情况。共鉴定得到5只iASPPsv组阳性转基因首建鼠，分别以I-0，II-0，III-0，IV-0，V-0编号(图6)。将整合外源目的基因首建鼠与6-8周龄正常野生型C57BL/6J小鼠交配、传代，提取子代鼠尾基因组DNA，PCR鉴定子代携带的外源基因整合情况，检测上游引物和下游引物分别为5’-CTGTCCTCTGATGGGCTCTTG-3’和5’-CTCGGGTCGTTCATCTCCTTC-3’，反应条件为94℃预变性5min，94℃30s，65℃2min，28个循环后72℃延伸7min，4℃保存，扩增片段长度为638bp。将繁育得到的第一代小鼠定义为研究的F1代，F1代繁育的子代小鼠定义为F2代。检测PCR电泳结果显示iASPPsv转基因小鼠F1子代阳性率约为41.7％。

实施例4 Western blot对转基因小鼠造血系统中iASPPsv表达的鉴定

收集1×10⁷小鼠骨髓、脾脏、胸腺等组织细胞，PBS洗涤后悬浮于细胞裂解液中裂解细胞，冰上放置30min，4℃12,000g离心10min，收集上清。以Bicinchoninic Acidassay法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳的分离胶与浓缩胶的浓度分别为10％和4％。待测细胞裂解液和蛋白分子量标准首先加入4×变性凝胶上样缓冲液，100℃煮沸3min。然后依次加入上样孔中。电泳开始时电流为10mA/cm凝胶，染料进入分离胶后，电流加大至20mA/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。取下凝胶，用转移缓冲液浸泡数5min，然后进行转膜。用半干蛋白转移装置将蛋白转移到硝酸纤维素滤(NC)膜上，按转移蛋白的常规方法进行，电转4h。转移结束后去除滤纸。把凝胶转移至考马斯亮蓝染液的托盘中染色，以检查蛋白转移是否完全。将转移上蛋白的NC膜浸在5％脱脂奶4℃封闭2h，将膜与抗iASPP抗体(1∶1000稀释)孵育过夜后，然后用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次15min。将膜与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶2000稀释)共同孵育1h，PBS T缓冲液洗膜3次，每次15min。最后以化学发光显色，胶片曝光压片。结果显示iASPPsv在iASPPsv转基因阳性小鼠骨髓、胸腺和脾脏等造血组织中特异性高表达，在小鼠的肝脏、肾脏等其他组织中表达量很低(图7)，说明我们分别成功构建并获得造血组织特异性高表达目的蛋白iASPPsv的转基因小鼠。

实施例5iASPPsv转基因小鼠造血干祖细胞功能的研究

5.1流式细胞仪分析iASPPsv转基因小鼠骨髓造血干祖细胞数量和比例

1)取6-8周龄阳性C57iASPPsv转基因小鼠骨髓，分别待检测分析的各管小鼠骨髓细胞，计数，取5×10⁶细胞，调整细胞体积至100μl依次加入下列抗体，冰上避光30min：Mouse Lineage Cell Detection Cocktail-Biotin，FITC抗小鼠Sca-1(Ly-6A/E)抗体，APC抗小鼠CD117(c-Kit，cKit)抗体，PE抗小鼠CD135(Flk-2/Flt-3，Ly-72)抗体；PBS/D-Hanks洗细胞离心后，5μl Streptavi din-APC/Cy7，冰上避光30min；PBS/D-Hanks洗细胞离心后，重悬细胞至500μl PBS/D-Hanks，流式细胞仪分析，长期造血干细胞(LT-HSCs)表面标志：lin^-，c-kit^hi，Sca-1^hi，Flk2^-；短期造血干细胞(LT-HSCs)表面标志：lin^-，c-kit^hi，Sca^hi，Flk2⁺(图8)。结果显示癌基因iASPPsv可以增加小鼠骨髓细胞中短期造血干细胞的数量和比例，野生型和iASPPsv转基因小鼠骨髓中短期造血干细胞比例(％)分别是0.09±0.012、0.412±0.092，iASPPsv转基因小鼠骨髓中ST-HSCs比例增加了约四倍(图9)。

2)造血共同髓系祖细胞(CMP)、粒单核细胞系祖细胞(GMP)，红系巨核系祖细胞(MEP)各系比例分析：取待分析小鼠骨髓细胞，分别标记、冰上避光30min：Mouse Lineage Cell Detection Cocktail-Biotin，FITC抗小鼠Sca-1(Ly-6A/E)抗体，APC抗小鼠CD117(c-Kit，cKit)抗体，PE抗小鼠CD135(Flk-2/Flt-3，Ly-72)抗体，PE-Cy7抗小鼠CD127(IL-7Receptor，IL-7R)抗体，PerCP-Cy5.5抗小鼠CD16/32-blocksFc binding抗体；PBS/D-Hanks洗细胞离心后，5μl Streptavidin-APC/Cy7，冰上避光30min；PBS/D-Hanks洗细胞离心后，重悬细胞至500ul PBS/D-Hanks，流式细胞仪分析，CMP表面标志：lin^-，c-kit^hi，Sca-1^lo，CD34⁺，IL-7R^-，FcrR^1o；GMP表面标志：lin^-，c-kti^hi，Sca-l^lo，CD34⁺，IL-7R^-，FcrR^hi；MEP表面标志：lin^-，c-kit^hi，Sca-l^lo，CD34^-，IL-7R^-，FcrR^1o。结果显示癌基因iASPPsv小鼠骨髓细胞造血共同髓系祖细胞(CMP)比例(％)，从正常小鼠的0.102±0.005减少到0.05±0.035，粒单核细胞系祖细胞(GMP)的数量也由0.094±0.019减至0.044±0.026；但是对红系巨核系祖细胞(MEP)的比例和数量变化不大，在iASPPsv和野生型小鼠比例(％)分别为是0.264±0.017、0.362±0.134(图10、图11)。

5.2iASPPsv对小鼠骨髓细胞增殖能力的影响

受体小鼠遗传背景为CD45.1，接受9.5Gy致死剂量照射后，分别将6-8周龄的iASPP或iASPPsv转基因阳性小鼠骨髓细胞与年龄相似遗传背景CD45.1的正常野生型C57BL6J小鼠骨髓细胞等比例混合，经尾静脉注射移植入致死剂量照射的受体小鼠中，分别在骨髓移植后4、8、12、16周取将上述移植受体小鼠尾血细胞进行分析。通过等比例竞争移植实验结果显示，高表达iASPPsv的小鼠骨髓细胞具有明显的增殖优势。移植后4周，流式细胞仪分析上述三组小鼠外周血CD45.1阳性、CD45.2阳性细胞比例分析发现，转入癌基因iASPPsv的小鼠骨髓细胞增殖优势显著，是相同条件下正常野生型骨髓细胞增殖能力的3.87倍，随着移植时间的延长，虽然iASPPsv组小鼠骨髓细胞在竞争移植早期也表现出较强的增殖优势，但在移植后第16周，骨髓重建能力明显减弱，增殖能力仅为正常组骨髓细胞的1.53倍(图12)。

5.3iASPPsv小鼠骨髓造血重建实验

在小鼠骨髓细胞非竞争性极限稀释的造血重建实验中，分别取0.5×10⁵个/50μl、1.0×10⁵个/100μl、1.5×10⁵个/150μl、2.0×10⁵个/200μl的遗传背景均为CD45.2的iASPPsv转基因小鼠或者野生型对照组小鼠骨髓细胞，经尾静脉回输到遗传背景为CD45.1的接受致死剂量照射受体小鼠，各个不同数量骨髓细胞每组注射10只小鼠。观察移植后的4周、3个月，来源于两组小鼠的不同数量骨髓细胞对受体小鼠的骨髓重建能力的影响。结果显示在移植后第4周时，接受1.0×10⁵个/100μl野生型小鼠骨髓移植的受体小鼠中，有80％以上受体小鼠因骨髓造血不能重建而死亡，而接受相同数量的iASPPsv转基因小鼠骨髓移植的受体小鼠死亡率约50％，证明iASPPsv转基因组小鼠骨髓细胞的造血重建能力较野生型小鼠优势明显。

骨髓细胞连续移植实验是通过将1×10⁶细胞/100μl骨髓细胞回输到致死剂量照射受体小鼠，重建其骨髓造血，并且在移植后14-16周后，再进行下一轮新的移植实验，即将造血获得重建的受体小鼠的1×10⁶细胞/100μl骨髓细胞回输到新的致死剂量照射小鼠，完成新一轮的造血重建实验。该实验可以很好的评估供体小鼠骨髓中造血干细胞(HSCs)增殖、定向分化与骨髓造血重建的能力，正常野生型小鼠的骨髓细胞通常可以完成4、5代受体小鼠的造血重建。结果显示间隔14-16周以上、连续4代的连续移植实验，证实iASPPsv的1×10⁶小鼠骨髓细胞可以完成4代以上80％小鼠的造血重建，但是当移植到第5代受体小鼠时，iASPPsv骨髓细胞组受体小鼠从第10天开始因为急性放射病相继死亡(图13)；相同条件下野生型对照组小鼠在第五次移植时也相继死亡，说明1×10⁶iASPPsv或野生型小鼠骨髓细胞不能完成第5代受体鼠骨髓造血重建(图14)。

实施例6 iASPPsv增强小鼠骨髓干祖细胞修复功能，抑制辐射诱导的凋亡

分析受到4.5Gy铯源照射12小时后，小鼠造血干祖细胞的凋亡情况的实验中，首先分选出骨髓中LSK造血干祖细胞后，标记耦合荧光PE染料的Annexin V、7-ADD，在1h内进行流式细胞仪检测，分析造血干细胞和造血祖细胞凋亡情况。当细胞发生凋亡时细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜的胞浆一侧转移至外侧，在存在的情况下，可与Annexin-V结合，7-AAD被用于鉴别存活细胞和非存活细胞，有完整细胞膜的存活细胞可排出7-AAD，而死亡或受损细胞的细胞膜可使7-AAD渗入，因此Annexin-V阳性而7-AAD阴性的细胞为正在发生凋亡，处于早期凋亡阶段细胞；Annexin-V和7-AAD双阳性细胞可以是凋亡的晚期阶段正在发生坏死，也可能是已经死亡，在本实验中划分为晚期凋亡。结果显示iASPPsv具有抑制辐射诱导的造血干祖细胞凋亡的作用，尤其对早期凋亡的作用更加明显(图15)。其中，正常野生型对照、iASPPsv小鼠骨髓LSK细胞在受到4.5Gy照射后12小时，细胞发生早期凋亡的比例分别是29.9％、6.49％，iASPPsv抗早期凋亡能力明显增强；但抗晚期凋亡的能力类似，分别为17.14％、14.71％，差异不明显(图16)。

磷酸化的H2AX参与DNA损伤修复，H2AX具有响应DNA损伤的作用，当H2AX被暴露在电离辐射下时，H2AX保守的羧基端的尾部Ser139残基被迅速磷酸化，形成磷酸化H2AX，即γ-H2AX。磷酸化H2AX在细胞周期检测点调控、基因组稳定的维持和肿瘤抑制中起着重要作用，是DNA双螺旋断裂标志之一，为细胞内募集的修复分子提供锚定位点。在对上述辐射后小鼠骨髓细胞磷酸化H2AX染色荧光共聚焦显微镜结果显示，与野生型对照组相比，iASPPsv转基因实验组小鼠骨髓H2AX磷酸化作用明显增强，修复能力更明显，通过磷酸化H2AX染色可以看到这些小鼠的骨髓细胞中出现大量修复位点，这些小鼠骨髓细胞累积了更多的遗传学损伤(图17)。Western-blot检测结果也显示iASPPsv转基因小鼠骨髓细胞H2AX磷酸化水平较野生型对照组小鼠增加。

实施例7 iASPPsv增强小鼠骨髓干祖细胞归巢迁移能力

通过Transwell体外实验和小鼠竞争移植实验比较iASPPsv转基因小鼠骨髓造血干祖细胞的归巢能力，首先，先分选获得Transwell实验所需的骨髓造血干祖LSK细胞，接种至孔径大小5.0μm的聚碳酸酯膜上室，在NIH 3T3上清的趋化作用5小时后比较iASPPsv转基因小鼠与野生型小鼠LSK细胞迁移能力。结果显示iASPPsv转基因小鼠造血干祖细胞在NIH 3T3细胞上清的趋化作用下迁移率10.57％，野生型小鼠迁移率约为4.40％，差异明显，即iASPPsv小鼠骨髓LSK细胞迁移率是野生型小鼠的2.41倍。为了进一步证实iASPPs对造血干祖细胞迁移能力变化具有细胞选择性，在相同的条件下，比较了iASPPsv小鼠全骨髓细胞的迁移能力，iASPPsv组小鼠全骨髓小鼠迁移率分别是9.71％，与野生型对照组小鼠全骨髓细胞的迁移率9.24％，无明显差异(P＞0.05)(图18)。

通过小鼠骨髓细胞等比例竞争移植的体内实验比较iASPPsv与野生型小鼠骨髓细胞归巢能力。先将遗传背景CD45.1受体小鼠致死剂量照射清髓，再将CD45.2iASPPsv转基因小鼠骨髓细胞与野生型CD45.1C57小鼠骨髓细胞等比例混合，尾静脉注射移植入照射清髓的CD45.1受体小鼠，移植后16个小时、40个小时，分析受体小鼠骨髓中CD45.2细胞的归巢情况。结果显示移植后16小时，iASPPsv转基因小鼠和野生型小鼠骨髓细胞归巢率分别是46.58％、31.18％。移植后40小时，iASPPsv和野生型小鼠骨髓中CD45.2细胞分别是52.75％和50.16％，说明在移植后40小时，iASPPsv转基因小鼠及野生型小鼠骨髓细胞已基本完成骨髓归巢(图19)。iASPPsv转基因小鼠骨髓细胞体内归巢能力是野生型小鼠的1.49倍，体外transwell实验LSK干祖细胞迁移能力较野生型对照组提高2.41倍。

实施例8 iASPPsv小鼠肿瘤发病情况

将阳性iASPPsv转基因首建鼠与野生型小鼠交配后鉴定的阳性F1、F2子代阳性iASPPsv转基因小鼠饲养在SPF级动物合格环境下饲养，定期经尾静脉取血，查血象、白细胞分类。血象有异常改变后，处死小鼠，研究有无肝、脾、淋巴结肿大，及细胞表型改变。结果显示iASPPsv转基因小鼠首建鼠F0及其子代F1小鼠可见乳腺癌的发生(图20)，乳腺癌小鼠可见肝脾肿大、多个巨型瘤块，发生肺脏、股骨沟淋巴结转移，中位生存期是14.5个月。说明癌基因iASPPsv通过影响造血干祖细胞自我更新与定向分化、使其凋亡功能缺失增加了小鼠肿瘤的发生。

小鼠外周血涂片、1×10⁵BMMNC甩片，瑞氏染色普通光学显微镜下观察。取发病小鼠肝、脾、骨髓、胸腺、肾等组织器官石蜡包埋切片，进行HE染色：①取小鼠肿瘤组织块，10％中性福尔马林固定24小时，常规石蜡包埋，4μm切片；②切片常规用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇至水洗：二甲苯I  5min→二甲苯II 5mi n→100％乙醇2min→95％乙醇2min→80％乙醇2min→75％乙醇2min→蒸馏水水洗2min；③苏木素染色5min，自来水洗5min；④盐酸乙醇分化30sec，自来水洗3min；⑤弱碱性水溶液返蓝60sec，自来水洗10min；⑥伊红染色2min，蒸馏水洗2次；⑦常规脱水、透明、封片：75％乙醇2min→80％乙醇2min→95％乙醇2min→100％乙醇2min→二甲苯I 5min→二甲苯II 5min→中性树胶封片。普通光学显微镜观察、摄片。结果显示相关组织均有肿瘤细胞浸润(图16、17)。

实施例9 发病小鼠iASPPsv基因表达的鉴定

提取C57移植小鼠脾单个核细胞RNA及蛋白质，用RT-PCR及WesternBlot方法检测小鼠造血系统内iASPPsv的表达情况。用分光光度计测定A₂₆₀/A₂₈₀，计算RNA含量，并经12g/L琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整。20μL逆转录反应体系含2μg总RNA，4μLRT缓冲液，50pmol/L oligo(dT)₁₆，1μmol/L dNTPs，0.1μmol/L DTT，15U RNA酶抑制剂(Takara)，200U MLV(Invitrogen)，于65℃水浴5min，冰浴5min，37℃水浴60min，70℃15min终止反应，所得cDNA-20℃保存备用。上游引物和下游引物分别为5’-CTGTCCTCTGATGGGCTCTTG-3’和5’-CTCGGGTCGTTCATCTCCTTC-3’，反应条件为94℃预变性5min，94℃30s，65℃2min，28个循环后72℃延伸7min，4℃保存，扩增片段长度为638bp，结果显示iASPPsv在白血病小鼠中无论是转录阶段还是翻译阶段均高表达，在野生型对照组无表达。

实施例10发病小鼠肿瘤细胞二次移植能力的鉴定

为确定发病小鼠肿瘤细胞的二次移植能力，取上述iASPPsv小鼠乳腺癌组织分离成单个细胞后(2×10⁶)皮下接种到半致死剂量照射后的CD45.1受体小鼠，每只原代小鼠的乳腺癌细胞移植4只受体小鼠。受体小鼠外周血白细胞明显增高，可见原始幼稚细胞。第二代小鼠乳腺癌细胞移植后6-8周左右发病，接种部位皮下可见黄豆大小左右肿瘤，发生乳腺癌小鼠平均移植后生存期为92d。组织病理及细胞表型与第一代发病鼠一致，流式细胞仪分析细胞表面标CD45.2细胞阳性率是95.83％，说明iASPPsv组乳腺癌小鼠肿瘤细胞有可传代性(图21)。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (4)

1.一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：

1)载体构建：自pcDNA3.0-FLAG-iASPPsv中，PCR扩增iASPPsv，引入所需的Not I和Sfi I酶切位点：

上游引物为5’-GCAGGCCCGTACGGCCATGTGCTGGTTG-3’下划线为引入Sfi I酶切位点

下游引物为5’-CAGCGCGGCCGCCTAGACTTTACTCCTTTG-3’划线为引入Not I酶切位点

反应条件为98℃预变性1min，98℃10s，68℃4min，27个循环后4℃保存，扩增片段长度为1245bp，PCR扩增后加入A尾，电泳定量并进行胶回收纯化，连接入pMD18-T载体中，转化E.coli DH5α菌株，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经Sfi I和Not I双酶切鉴定后，测序正确的克隆，经SfiI和NotI双酶切得到iASPPsv片段，胶回收纯化，hM HS21/45vav经Sfi I和Not I双酶切，纯化定量，与自pMD18-T-iASPPsv载体Sfi I和Not I双酶切纯化所得的iASPPsv片段连接，转化DH5α感受态细胞后挑取克隆，Sfi I和Not I双酶切鉴定已插入目的片段，构建hM HS21/45vav-iASPPsv质粒；

2)转基因载体的线性化与纯化：将构建hM HS21/45vav-iASPPsv质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度，得到纯化的转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv；

3)小鼠模型制备：把转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv注射入C57小鼠受精卵内，植入假孕小鼠子宫内，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，自尾部提取DNA使用PCR检测目的基因iASPPsv的整合，得到转导iASPPsv癌基因的阳性首建鼠；

4)建立iASPPsv转基因鼠系：将整合外源目的基因首建鼠与6-8周龄正常野生型C57BL/6J小鼠交配、传代，提取子代鼠尾基因组DNA，PCR鉴定携带遗传自父代的外源基因整合情况，获取研究所需阳性子代iASPPsv转基因小鼠。

2.根据权利要求1所述的转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型的制备方法，其特征在于，用于将转基因载体hM HS21/45vav-iASPPsv注射入C57小鼠受精卵内是采用显微注射方法。

3.用权利要求1或2所述的方法构建的转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型。

4.权利要求3所述的转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型在肿瘤的靶向治疗中的应用。

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