CN103947606A - 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 - Google Patents
敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103947606A CN103947606A CN201410146792.3A CN201410146792A CN103947606A CN 103947606 A CN103947606 A CN 103947606A CN 201410146792 A CN201410146792 A CN 201410146792A CN 103947606 A CN103947606 A CN 103947606A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- human mammal
- luciferase
- ucp1
- gene
- 1cuiferase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000015494 Mitochondrial Uncoupling Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 53
- 108010050258 Mitochondrial Uncoupling Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- 210000000636 white adipocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 31
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 abstract 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 23
- 210000001593 brown adipocyte Anatomy 0.000 description 16
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 11
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 10
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 102000003973 Fibroblast growth factor 21 Human genes 0.000 description 4
- 108090000376 Fibroblast growth factor 21 Proteins 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 229960004586 rosiglitazone Drugs 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 210000003486 adipose tissue brown Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 2
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011690 Adiponectin Human genes 0.000 description 1
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical group [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-SSDOTTSWSA-N Photinus luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 210000000593 adipose tissue white Anatomy 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003109 clavicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000027721 electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- -1 phylaxin Proteins 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。本发明构建的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型可作为白色脂肪细胞褐色化的药物的筛选平台，可实现简单，迅速，大规模的筛选调控UCP1表达的药物；可以在不伤害非人哺乳动物的前提下，利用荧光成像仪直接活体检测UCP1的表达和分布。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。
背景技术
长期以来，一直被认为脂肪细胞的主要功能是储存能量。但随着对脂肪细胞的深入研究，脂肪细胞其它方面的功能也逐渐显露出来。研究表明脂肪细胞在免疫反应、高血压、肥胖、胰岛素抵抗等代谢疾病中都起着重要的作用。
最初，脂肪细胞被分为两类：白色脂肪细胞与褐色脂肪细胞。但随着啮齿动物腹股沟脂肪部位的beige(brown-in-white,brite)细胞的发现，褐色脂肪细胞又可以被细分为两类：经典的褐色脂肪细胞与brite/beige脂肪细胞
白色脂肪细胞内含有一个巨大的圆形脂滴，细胞核呈扁平状且位于细胞边缘。脂滴几乎占据了细胞的99%的空间。白色脂肪细胞主要是通过甘油三酯和胆固醇的形式，将能量储存于脂滴当中。但是白色脂肪细胞不仅可以储存能量，它还可以分泌脂肪细胞因子如：脂联素、瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子α等等。这些脂肪细胞因子在能量代谢调节、免疫反应等多种生理现象中发挥着重要作用。
褐色脂肪细胞的外形呈多边形，细胞核为圆形，且细胞内的脂滴呈多室分布于整个细胞中。褐色脂肪细胞含有大量的细胞质基质，并且细胞内的线粒体含量很高。因为线粒体内的细胞色素含有铁原子，所以含有大量线粒体的褐色脂肪细胞的颜色为褐色。褐色脂肪细胞不同于白色脂肪细胞的主要特征是：线粒体内膜上的解偶联蛋白1(UCP1)的表达量很高。所以，褐色脂肪细胞的主要功能就是通过UCP1来产热从而消耗能量而不产生ATP：即褐色脂肪细胞可以通过UCP1，将线粒体内的电子传递链与ATP合成解偶联，进而通过氧化磷酸化解偶联呼吸，将脂肪酸β氧化产生的能量以热量的形式散失掉。褐色脂肪细胞的非颤栗性产热功能，可以维持体温恒定，也可以以热能的方式消耗机体摄入的能量，从而降低肥胖发生的概率。
两种褐色脂肪细胞的分布是不同的，经典的褐色脂肪细胞主要分布于啮齿动物的肩胛骨区域，而Beige脂肪细胞主要分布于腹股沟区域的皮下脂肪组织中。对于人类来说，褐色脂肪细胞主要存在于婴儿体内，但是目前研究发现，成年人的颈部、锁骨上也含有相当量的褐色脂肪细胞，且它们与啮齿动物的beige脂肪细胞相似。除了分布差异外，两种褐色脂肪细胞的来源也不同。经典的褐色脂肪细胞与肌肉细胞同源；但是beige脂肪细胞存于白色脂肪组织中。研究发现，在一定条件下，冷冻，特定基因的敲除或者视黄酸（retinoid acid，RA），成纤维细胞生长因子21（FGF21）等药物的刺激，beige脂肪细胞可以由白色脂肪细胞转分化而来。因此，beige脂肪细胞的研究受到了广泛关注。筛选可以使白色脂肪细胞褐色化(即转分化为beige脂肪细胞)的药物对于人类肥胖相关代谢疾病的治疗具有重大意义。
筛选白色脂肪细胞褐色化的药物，主要需要检测UCP1的表达的变化，尤其是蛋白水平的变化。但是目前无论利用实时定量RT-PCR或者western blot的方法进行药物筛选，都费时费事费力费钱。实时定量PCR至少需要一天的时间来检测UCP1的变化，而western blot至少需要两天的时间来进行检测分析。
因此，构建一个可以快捷、准确地筛选白色脂肪细胞转分化成beige脂肪细胞的药物的平台显得尤为重要。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型在筛选白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述非人哺乳动物为小鼠。
本发明还提供了一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1)、将非人哺乳动物的解偶联蛋白1基因的最后一个外显子后的终止密码子去掉；
2)、利用序列号为SEQ ID NO:1的串联肽2A在步骤1)的去掉了终止密码子的解偶联蛋白1基因的最后一个外显子后连入荧光素酶基因；
3)、利用C57和129杂合背景的小鼠ES细胞打靶，通过同源重组构建敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型。
本发明还提供了采用上述构建方法构建得到的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型。
本发明构建的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶非哺乳动物模型采用基因敲入的方式，将荧光素酶基因插入解偶联蛋白-1的特定位点，从而能准确反应基因的变化；而现有的具有荧光素酶的动物模型通常是采用转基因的方法将某个基因的启动子加上荧光素酶再随机插入到基因组中而构建得到的，插入的位点未必准确，从而使得并不能准确反应基因的变化。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明构建的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型可作为白色脂肪细胞褐色化的药物的筛选平台，可实现简单，迅速，大规模的筛选调控UCP1表达的药物；相比较现有的其它方法，此模型只需要两个小时即可以完成一个24孔板的筛选。
2、本发明构建的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型可以在不伤害非人哺乳动物的前提下，利用荧光成像仪直接活体检测UCP1的表达和分布，从而可准确的反应表达UCP1的组织部位。
附图说明
图1为本发明实施例1中敲入有UCP1-lcuiferase的小鼠模型的构建策略；
图2是本发明实施例2中敲入有UCP1-lcuiferase的小鼠各个组织的荧光活性检测；
图3是本发明实施例3中药物FGF21和Am580在小鼠的分离的皮下脂肪组织的脂肪干细胞分化的脂肪细胞的作用检测；
图4是本发明实施例4中敲入有UCP1-lcuiferase的小鼠的活体成像图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。
实施例1敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠模型的构建方法
如图1所示，为本实施例敲入有UCP1-lcuiferase的小鼠模型的构建策略图，包括以下步骤：
1、去掉UCP1的终止密码子
UCP1具有6个外显子，将UCP1的最后一个外显子即第6个外显子后的终止密码子去掉；
2、连接荧光素酶基因
利用串联肽2A(SEQ ID NO:1，其目的是可以让荧光素酶基因随着UCP1共同翻译成蛋白，但是不与UCP1蛋白融合，因此不会影响UCP1蛋白的活性)在步骤1的去掉了终止密码子的UCP1的最后一个外显子的后边连入荧光素酶基因；连接荧光素酶基因后的序列如SEQ ID NO:2所示；
3、获得小鼠模型
利用C57和129杂合背景的小鼠(采用常规方法分离得到)ES细胞打靶，通过同源重组构建敲入有UCP1-luciferase的小鼠模型。
实施例2实施例1的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠模型的各个组织荧光素酶信号检测
包括以下步骤：
1)取一只实施例1获得的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠，断颈处死，分离各个组织；
2)每个组织分取20mg放入1.5mL离心管中，加入200uL荧光素酶信号检测缓冲液(150mM KCl，20mM HEPES，5mM Mgcl2，1mM EGTA。NaOH调节pH至7.0)，将组织研磨成匀浆；
3)低温4℃、13kpm离心20分钟；
4)取上清15uL，高糖DMEM培养基15uL和30μL试剂（Luciferase Assay System，Promega）混合加入CulturPlateTM-96白色实底96孔板（PerkinElmer）的孔中；
5)震荡10分钟；
6)荧光照度计上进行测量(荧光素酶与底物反应黄绿色闪光，发射峰560nm)。
测量结果如图2所示。从图2可以看出，主要表达解偶联蛋白1的组织——褐色脂肪组织、腹股沟脂肪组织、肾周围脂肪组织均检测到荧光活性，而其他没有表达解偶联蛋白1的组织——肾脏、肝脏、脾脏、心脏、大脑、肌肉等均没有检测到荧光活性。其中表达解偶联蛋白1最高的褐色脂肪组织荧光素酶活性最高，因此，可以反应出该敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠动物模型能够准确的反应解偶联蛋白1的组织表达情况。
实施例3实施例1的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠模型在药物FGF21和AM580刺激下由腹股沟的白色脂肪组织的脂肪干细胞分化的脂肪细胞的荧光素酶信号检测
包括以下步骤：
1、腹股沟的白色脂肪的原代脂肪间充质细胞的分离
1)取一只实施例1获得的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠，断颈处死，在75%的酒精中浸泡5分钟，然后转移到操作台中，取出腹股沟的白色脂肪；
2)用PBS清洗3次，用剪刀将脂肪组织剪碎，1g脂肪组织加入10ml胶原酶I溶液(用D-Hanks溶液配制，100ml加入0.1g胶原酶I)，放置37℃消化40分钟；
3)用250μm滤膜过滤，加入细胞培养液，然后转移到离心管中，1000rpm离心3分钟；
4)离心后的上浮层为成熟的脂肪细胞，转移到装有PBS溶液的离心管中，混匀后再次离心。再次分离的上层成熟的脂肪细胞可以收集后用于提取RNA，蛋白等；
5)第一次离心后的底部细胞为脂肪间充质细胞，弃除上清后，用新鲜的培养液悬起，铺到培养板中，第二天换液。
2、脂肪间充质细胞分化为脂肪细胞
1)步骤1中获得的脂肪间充质细胞在添加10%胎牛血清（Hyclone）高糖的DMEM（Hyclone）的培养液生长至满；
2)更换培养液为添加了MDIR(0.5mM异丁基黄嘌呤，1μM地塞米松，87nM胰岛素和0.5μM罗格列酮:IBMX+Dex+Insulin+rosiglitazone)的诱导培养液(添加10%胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，培养2天。
3)2天后，培养液更换为只添加IR（87nM胰岛素和0.5μM罗格列酮:Insulin+rosiglitazone)的诱导培养液(添加10%胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，每两天更换一次，直到细胞完全分化为脂肪细胞。
4）将培养基更换为正常的培养基（添加10%胎牛血清高糖的DMEM的培养液），同时添加药物10ng/ml FGF21和1μM AM580（视黄酸受体激动剂）刺激两天。两天后，裂解细胞，检测荧光素酶活性。
3、细胞的luciferase荧光素酶信号检测
1)以24孔细胞板的1孔为例，将细胞的培养液移除，然后用500微升的PBS清洗一遍，然后尽量移除干净PBS；
2)加入100uL荧光素酶信号检测缓冲液(150mM KCl，20mM HEPES，5mM Mgcl2，1mM EGTA。NaOH调节pH至7.0)，放置冰上裂解半小时。随后刮离细胞，转至1.5ml的EP管中。
3)低温4℃，13kpm离心20分钟。
4)取上清15uL，高糖DMEM培养基15uL和30μL试剂（Luciferase Assay System，Promega）混合加入CulturPlateTM-96白色实底96孔板（PerkinElmer）的孔中。
5)震荡10分钟。
6)荧光照度计上进行测量。
荧光素酶检测结果如图3所示。从图3可以看出，添加药物刺激后的脂肪细胞的荧光素酶活性显著上升。这两种药物是公认的能够促进解偶联蛋白1表达和白色脂肪细胞褐色化的药物。结果表明本发明的小鼠模型分离出的脂肪间充质细胞分化得到的脂肪细胞能够作为良好的药物筛选平台。
实施例4实施例1的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠模型的活体成像检测
包括以下步骤：
1)准备荧光素（D-luciferin Firefly）储存液（15mg/ml），即用DPBS充分溶解荧光素，然后用0.22微米的滤膜过滤。放置-20℃保存。
2)用阿佛丁(首先称三溴乙醇1.25g，加入2.5ml叔戊醇，再加入97.5ml超纯水，避光搅拌过夜（室温）。第二天用0.22μm滤器过滤，分装4℃避光保存)给一只敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠麻醉(重24.7克)；
3）在成像前10～15分钟前注射247微升的荧光素储存液(一只小鼠按照10微升每克的剂量注射)；
4）上荧光成像仪上进行活体成像。
活体成像图如图4所示，从图4可以看出，在小鼠背部肩胛骨处的褐色脂肪组织有明显荧光，说明本发明的敲入小鼠模型能够良好的活体反应解偶联蛋白1的表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、将非人哺乳动物的解偶联蛋白1基因的最后一个外显子后的终止密码子去掉；
2)、利用序列号为SEQ ID NO:1的串联肽2A在步骤1)的去掉了终止密码子的解偶联蛋白1基因的最后一个外显子后连入荧光素酶基因；
3)、利用C57和129杂合背景的小鼠ES细胞打靶，通过同源重组构建敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型。
2.根据权利要求1所述的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型的构建方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为小鼠。
3.权利要求1或2所述的构建方法构建得到的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型。
4.权利要求3所述的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型在筛选白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410146792.3A CN103947606B (zh) | 2014-04-11 | 2014-04-11 | 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
| PCT/CN2014/092830 WO2015154490A1 (zh) | 2014-04-11 | 2014-12-02 | 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410146792.3A CN103947606B (zh) | 2014-04-11 | 2014-04-11 | 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103947606A true CN103947606A (zh) | 2014-07-30 |
| CN103947606B CN103947606B (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=51325081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410146792.3A Expired - Fee Related CN103947606B (zh) | 2014-04-11 | 2014-04-11 | 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103947606B (zh) |
| WO (1) | WO2015154490A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015154490A1 (zh) * | 2014-04-11 | 2015-10-15 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
| CN107182940A (zh) * | 2017-05-09 | 2017-09-22 | 中国科学院动物研究所 | 一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法 |
| CN112126659A (zh) * | 2019-06-24 | 2020-12-25 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001060152A2 (en) * | 2000-02-16 | 2001-08-23 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Transgenic non-human ucp2 knockout mammal |
| EP1143007A1 (en) * | 1998-12-24 | 2001-10-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Ucp-2 promoter and use thereof |
| KR20100092108A (ko) * | 2009-02-12 | 2010-08-20 | 이화여자대학교 산학협력단 | 비공유단백질－２ 프로모터 및 루시퍼라아제 리포터 유전자가 형질도입된 형질전환 동물 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4870464B2 (ja) * | 2001-07-17 | 2012-02-08 | 帝人株式会社 | ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする物質の選択方法及び薬剤 |
| CN100410381C (zh) * | 2004-07-08 | 2008-08-13 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种hcv转基因小鼠模型及其构建方法与应用 |
| CN101684476B (zh) * | 2008-09-22 | 2012-05-02 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 转基因构建物及其在制备时空可调性肝脏损伤模型中的应用 |
| EP2566964B1 (en) * | 2010-05-07 | 2016-10-19 | Centre National De La Recherche Scientifique | Ucp1 (thermogenin) - inducing agents for use in the treatment of a disorder of the energy homeostasis |
| CN103947606B (zh) * | 2014-04-11 | 2015-09-30 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
-
2014
- 2014-04-11 CN CN201410146792.3A patent/CN103947606B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2014-12-02 WO PCT/CN2014/092830 patent/WO2015154490A1/zh active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1143007A1 (en) * | 1998-12-24 | 2001-10-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Ucp-2 promoter and use thereof |
| WO2001060152A2 (en) * | 2000-02-16 | 2001-08-23 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Transgenic non-human ucp2 knockout mammal |
| KR20100092108A (ko) * | 2009-02-12 | 2010-08-20 | 이화여자대학교 산학협력단 | 비공유단백질－２ 프로모터 및 루시퍼라아제 리포터 유전자가 형질도입된 형질전환 동물 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| GIUSEPPINA ROSE等: ""Two variants located in the upstream enhancer region of human UCP1 gene affect"", 《EXPERIMENTAL GERONTOLOGY》, 30 November 2011 (2011-11-30) * |
| JAVIER MARGARETO等: ""Up-regulation of a thermogenesis-related gene (UCP1) and down-regulation of PPARg and aP2 genes in adipose tissue: possible features of the antiobesity effects of a β3-adrenergic agonist"", 《BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY》, 15 June 2001 (2001-06-15) * |
| KEN-ICHI YAMAMOTO等: ""Transcriptional regulation of a brown adipocyte-specific gene, UCP1, by KLF11 and KLF15"", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》, 10 September 2010 (2010-09-10) * |
| TAKAYUKI MASAKI等: ""Tumor necrosis factor-K regulates in vivo expression of the rat UCP family di¡erentially"", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》, 4 January 1999 (1999-01-04) * |
| 李艳等: ""通过活体动物光学成像系统建立乳腺癌动物模型"", 《肿瘤》, 25 January 2009 (2009-01-25) * |
| 范建高等: ""非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏解偶联蛋白2表达及其与能量贮备的关系"", 《中华肝脏病杂志》, 25 May 2005 (2005-05-25) * |
| 薄海等: ""低氧复合运动对大鼠骨骼肌解偶联蛋白3表达及线粒体功能的影响"", 《中国康复医学杂志》, 15 January 2012 (2012-01-15) * |
| 马国栋等: ""有氧运动下调的脂肪肝小鼠肝脏UCP2 表达对肝脏ATP 含量及抗氧化功能的影响"", 《西安体育学院学报》, 25 January 2008 (2008-01-25) * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015154490A1 (zh) * | 2014-04-11 | 2015-10-15 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
| CN107182940A (zh) * | 2017-05-09 | 2017-09-22 | 中国科学院动物研究所 | 一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法 |
| CN107182940B (zh) * | 2017-05-09 | 2020-05-15 | 中国科学院动物研究所 | 一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法 |
| CN112126659A (zh) * | 2019-06-24 | 2020-12-25 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015154490A1 (zh) | 2015-10-15 |
| CN103947606B (zh) | 2015-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Brown adipocytes can display a mammary basal myoepithelial cell phenotype in vivo | |
| CN104043102A (zh) | 一种多肽在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途 | |
| CN103947606B (zh) | 敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用 | |
| CN107384931A (zh) | Fhl3基因在促进动物生长中的应用 | |
| CN109997787A (zh) | 一种非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法及应用 | |
| CN105671079A (zh) | 一种转人神经生长因子基因的小鼠及其制备方法和应用 | |
| CN112891540A (zh) | Ogt作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用 | |
| CN105457028B (zh) | 在骨形成中发挥调控作用的应力敏感性microRNA | |
| KR20210104680A (ko) | 인간 또는 동물 순환 종양 세포를 증폭시키기 위한 동물 모델 | |
| Chen et al. | The effect of mesenchymal stem cells, adipose tissue derived stem cells, and cellular stromal vascular fraction on the repair of acute anal sphincter injury in rats | |
| CN104755610B (zh) | 脂肪组织细胞 | |
| Liao et al. | Augmenter of liver regeneration protects the kidney against ischemia-reperfusion injury by inhibiting necroptosis | |
| CN106929511B (zh) | 一种hLeg1基因及其应用和药物 | |
| Zhang et al. | Isolation, culture, and identification of duck intestinal epithelial cells and oxidative stress model constructed | |
| CN102517333A (zh) | 自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型及其制备方法 | |
| CN109820856A (zh) | 化合物Compound C的新应用 | |
| CN110373426A (zh) | 非肥胖性糖尿病动物模型、构建方法及其应用 | |
| CN101899445A (zh) | 一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途 | |
| CN117205225B (zh) | 栀子苷在制备治疗骨髓增殖性肿瘤药物中的应用 | |
| CN101890172B (zh) | S100a16基因在制备治疗肥胖症药物中的应用 | |
| CN102296072A (zh) | 转导iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途 | |
| Qi et al. | Isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue | |
| CN114711433B (zh) | 七鳃鳗lip蛋白在制备治疗肥胖和提高抗寒能力的药品中的应用 | |
| CN103083645A (zh) | 神经调节素1及其受体作为制备或筛选抗癫痫药物靶点的用途 | |
| CN116369249B (zh) | 斑马鱼肠炎模型的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150930 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |