KR20100092108A

KR20100092108A - 비공유단백질－２ 프로모터 및 루시퍼라아제 리포터 유전자가 형질도입된 형질전환 동물

Info

Publication number: KR20100092108A
Application number: KR1020090011305A
Authority: KR
Inventors: 김양하; 이막순
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-12
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2010-08-20

Abstract

본 발명은 UCP-2(uncoupling protein-2) 프로모터 및 리포터 유전자가 형질도입된 동물에 관한 것으로서, 구체적으로는 항비만 및 지방 연소와 관련된 기능성 식품/소재의 유효성 평가를 위한 체지방 조절 및 지방연소와 관련된 UCP-2 프로모터와 리포터 유전자인 루시퍼라아제 유전자가 삽입된 형질전환 생쥐에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 모델은 항비만 및 지방 연소와 관련된 기능성 식품/소재의 유효성 평가에 유용하게 이용될 수 있다.

형질전환 동물, 비공유단백질-2, 프로모터, 루시퍼라아제, 기능성 식품/소재, 유효성 평가

Description

비공유단백질－２ 프로모터 및 루시퍼라아제 리포터 유전자가 형질도입된 형질전환 동물{Transgenic Animal with UCP-2 Promoter and Luciferase Reporter Gene}

본 발명은 UCP-2(uncoupling protein-2) 프로모터 및 리포터 유전자가 형질도입된 형질전환 동물에 관한 것이다.

비만은 에너지 섭취 및 소비의 불균형으로 인해 여분의 에너지가 지방으로 전환되어 체내에 비정상적으로 축적된 상태를 말하며, 이로 인해 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 심혈관계 질환 등 여러 가지 질병의 위험도가 증가한다. 미국질병통제예방센터(CDC)가 공개한 '전국건강ㆍ영양조사(NHANES, The National Health and Nutritional Examination Survey)'에 따르면 미국인들의 66%가 과다 체중, 34%가 비만으로(CDC-NHNES) 이미 심각한 영양문제로 대두하였으며, 근래 우리나라의 비만 인구 또한 계속 증가하고 있는 추세로 체중감량에 관심이 높아지고 있는 실정이다. 최근 들어 항 비만 및 체중조절용 기능성 식품 및 소재에 대한 관심이 국내뿐만 아 니라 세계적으로 관심이 증가하고 있으며, 비만을 예방, 개선할 수 있는 기능성 식품 및 천연물질 소재에 대한 많은 연구들이 진행되고 있다. 그러나 항비만 및 지방연소와 관련된 생리활성을 가지는 기능성 식품/소재에 대한 관심이 고조되고 있으나 그 유효성을 과학적으로 평가할 수 있는 형질전환 동물은 없는 실정이다.

형질전환 마우스는 특정 DNA를 생쥐에 삽입, 제거 및 과 발현(over-expression)시켜 생체 내 유전자 기능 연구 및 질환 동물 모델 제작에 이용된다. 형질전환 생쥐 생산 기술은 의학계만 편중되어 있으며 주로 질환 동물 모델 개발을 위한 형질전환 마우스 개발 연구가 이루어지고 있다. 현재, 비만, 내분비 교란, 당뇨병, 지질대사, 근육대사 및 성장 연구 등을 위한 다양한 종류의 질환모델 형질전환 동물들이 개발되어 있다. 그러나 기능성 식품의 효능 평가는 약물의 효능 평가와는 달리 질환이 없는 건강한 상태에서 그 효능이 평가되어야 하므로 현재 다양하게 개발된 질환모델 형질전환 마우스를 일방적으로 사용할 수 없다.

비만과 관련된 유전자인 비공유 단백질(uncoupling protein; UCP)은 미토콘드리아에서 산화적 인산화에 의한 ATP 합성을 감소시키고 열 발생을 증가해 체온 조절, 에너지 소비 및 비만의 중요한 조절인자로 보고되고 있다(Rousset S et al, Diabetes, 53:S130-S135, 2004; Surwit RS et al, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 95:4061-4065, 1998). 비공유 단백질에는 UCP-1, UCP-2 및 UCP-3가 있으며, UCP-1은 갈색지방조직에서, UCP-3는 골격근에서 주로 발현된다. 이와 달리 UCP-2는 대부분의 모든 조직 폭넓게 발현되고 특히 지방조직에서 많이 발현되며 전체적인 에너지 대사를 조절하는 역할을 하고 있다.

이에, 본 발명자들은 체지방 조절 및 지방연소와 관련된 UCP-2 프로모터와 리포터 유전자인 루시퍼라아제 유전자가 삽입된 형질전환 생쥐를 제작하고, 상기 형질전환 생쥐가 항비만 효능이 이미 알려진 기능성 식품/소재의 유효성 평가에 유용한 형질전환 동물임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 UCP-2(uncoupling protein-2) 프로모터 및 리포터 유전자가 형질도입된 형질전환 동물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 동물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 형질전환 동물로부터 유래한 형질전환 수정란을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 동물을 이용한 항비만 효능 평가 대상 식품/소재의 유효성 평가 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 C57BL/6J 계통, UCP-2(uncoupling protein-2) 프로모터 및 상기 UCP-2 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 형질도입된 항비만 기능성 식품/소재의 유효성 평가용 형질전환 동물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) UCP-2 프로모터 및 상기 UCP-2 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 벡터를 선형화하여 동물의 수정란에 미세주입하는 단계;

3) 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 새끼를 생산시키는 단계;

4) 상기 새끼를 C57BL/6J 정상 생쥐(wild-type)와 역교배(back-cross)하는 단계; 및,

5) 단계 4)에서 태어난 생쥐 중 UCP-2 프로모터 및 리포터 유전자가 게놈 DNA에 도입된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 C57BL/6J 계통, UCP-2 프로모터 및 리포터 유전자가 형질도입된 항비만 기능성 식품/소재의 유효성 평가용 형질전환 동물을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 동물로부터 유래한, UCP-2 프로모터 및 리포터 유전자가 형질도입된 형질전환 수정란을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 형질전환 동물을 이용한 항비만 효능 평가 대상 식품/소재의 유효성 평가 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 C57BL/6J 계통, UCP-2(uncoupling protein-2) 프로모터 및 상기 UCP-2 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 형질도입된 항비만 기능성 식품/소재의 유효성 평가용 형질전환 동물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 C57BL/6J 계통 UCP2-Luc 형질전환 생쥐에 2배 정도 비만을 유도한 후, 항비만 기능성 식품/소재에 대한 항비만 효능평 가를 수행하였다. 기능성 식품 소재인 녹차 폴리페놀(polyphenol) EGCG(epigallocatechin gallate)를 비만이 유도된 형질전환 생쥐에 0.2% 또는 0.5%씩 각각 섭취한 결과, 비만 유도된 정상 생쥐, 형질전환 생쥐 및 EGCG 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐 간 에너지 섭취량에는 차이가 없었으나(도 4b 참조), 0.2% EGCG 식이 섭취 형질전환 생쥐에서 5.9%, 0.5% EGCG 식이 섭취 형질전환 생쥐에서 17.7% 감소하였다(도 4a 참조). 또한, 혈장 내 중성지방(Triglyceride), 총 콜레스테롤(total cholesterol) 및 렙틴(leptin) 함량은 EGCG 식이를 섭취하지 않은 형질전환 생쥐에 비해 유의하게 감소하였고(도 5 참조), 루시퍼라아제 활성도는 EGCG 식이를 섭취하지 않은 비만 유도된 형질전환 생쥐에 비해, 0.2% EGCG 식이 섭취 및 0.5% EGCG 식이 섭취한 형질전환 동물의 간에서 각각 1.9배와 2.6배, 백색지방 조직에서 각각 2.4배와 3.8배 유의하게 증가하였고, 갈색지방 조직과 골격근 조직에서는 증가하는 경향을 보였으며, 비장, 신장, 폐, 뇌 등의 조직에서는 루시퍼라아제 활성이 측정되지 않았다(도 6 참조).

또한, 마늘(Allium sativum) 소재의 항비만 효능평가를 수행한 결과, 마늘 식이를 섭취한 실험동물의 에너지 섭취량은 실험군간 차이가 없었으며 체중감소는 마늘 식이를 섭취하지 않은 형질전환 생쥐에 비하여, 2% 마늘 식이 섭취 형질전환 생쥐에서 10.8%, 5% 마늘 식이 섭취 형질전환 생쥐에서 18.6% 감소하였다(도 7 참조). 또한, 마늘 식이를 섭취한 형질전환 생쥐에서 마늘 식이를 섭취하지 않은 형질전환 생쥐에 비해 혈장 중성지방, 총 콜레스테롤 및 렙틴 농도가 유의하게 감소하였고(도 8 참조), 마늘 식이를 섭취하지 않은 비만 유도된 형질전환 생쥐에 비 해, 2% 마늘 식이 섭취 및 5% 마늘 식이 섭취한 형질전환 동물의 간에서 각각 1.8배와 2.7배, 백색지방 조직에서 각각 2.0배와 5.2배, 갈색지방 조직에서 각각 1.2배와 2.2배, 골격근 조직에서 각각 1.3배와 2.3배 유의하게 증가하였으며, 비장, 신장, 폐, 뇌 등의 조직에서는 루시퍼라아제 활성이 측정되지 않았다(도 9 참조).

상기 결과를 바탕으로, 본 발명의 UCP-2 및 리포터 단백질을 공동-발현하는 형질전환 동물은 항비만 기능성 식품/소재의 유효성 평가에 동물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 UCP-2 프로모터는 지방세포 게놈 DNA 유래 UCP-2 프로모터이다.

상기 리포터 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나, 생물발광 반응을 나타내는 루시퍼라아제(luciferase); 형광 반응을 나타내는 녹색 형광성 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광성 단백질(EGFP), 적색 형광성 단백질(RFP), 증강된 적색 형광성 단백질(ERFP), 청색 형광성 단백질(BFP), 증강된 청색 형광성 단백질(EBFP), 황색 형광성 단백질(YFP), 증강된 황색 형광성 단백질(EYFP), 남색 형광성 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광성 단백질(ECFP); 및 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 원리를 이용한 효소활성화 이미징 프로브의 기질을 특이적으로 분해할 수 있는 활성 효소, 예를 들면 β-락탐아제(Lactamase)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, FRET 원리를 이용한 효소활성화 이미징 프로브의 기질의 N-말단 및 C-말단에는 방출 파장이 상이한 두 개의 형광 단백질 또는 형광 색소가 결합될 수 있고, 바람직하게는 β-락탐아제의 기질은 CCF2(CytoBlast™)이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 리포터 단백질로는 루시퍼라아제가 사용되었 고, UCP-2 프로모터와 함께 도입된 루시퍼라아제의 활성을 측정함으로써, UCP-2 프로모터의 활성을 간접적으로 측정할 수 있었다(도 6 및 도 9 참조).

또한, 본 발명은

2) 상기 벡터를 동물의 수정란에 형질도입하는 단계;

본 발명의 구체적인 실시예에서, 특히 지방조직에서 많이 발현되며, 체지방 조절 및 지방연소와 관련된 UCP-2 프로모터를 지방세포의 게놈 DNA로부터 수득하여, 상기 프로모터와 리포터 유전자인 루시퍼라아제 유전자가 연결된 벡터를 수득하였다(도 1 참조). 상기 재조합 벡터에 제한효소를 처리하여 UCP-2 프로모터와 리포터 유전자인 루시퍼라아제 유전자가 연결된 재조합 선형 DNA를 수득하여, 이를 수정란에 미세주입하였다. 상기 UCP-2 프로모터 및 리포터 유전자가 주입된 형질 전환 수정란들을 대리모(FVB/n strain 마우스)에 이식하여 태어난 산자의 루시퍼라아제 도입 여부를 PCR 방법으로 확인한 결과(도 2 참조), 총 3마리의 Founder 생쥐를 확인하였다(도 3 참조). 상기 Founder 생쥐를 C57BL/6J 정상 생쥐와 F6 세대까지 역교배 하여, C57BL/6J 계통 UCP2-Luc 형질전환 생쥐를 제작하였다.

상기 단계 2)의 동물은 마우스 또는 랫트일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 단계 2)의 형질도입 방법은 당업계에 주지된 각종 형질도입 방법에 따라 동물 세포의 크로모좀 내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 형질도입 방법의 예를 들면, 동물의 수정란에 융합 유전자를 미세주입하는 방법 또는 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법 등을 들 수 있으며, 벡터를 선형화하여 미세주입하는 것이 바람직하다. 또한, 단계 4)의 역교배는 F6 세대까지 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 아울러, 상기 단계 3)의 개체 선별은 꼬리 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환 수정란은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2008년 12월 16일자로 기탁번호 KCTC11443BP로 기탁된 것을 특징으로 한다.

아울러, 본 발명은

1) 상기 형질전환 동물에 비만 식이를 급여하여 비만을 유도하는 단계;

2) 단계 1)의 비만 유도된 형질전환 동물에 항비만 효능 평가 대상 식품/소재를 포함하는 식이를 급여하여 사육하는 단계;

3) 단계 2)의 형질전환 동물의 리포터 유전자로부터 발현한 리포터 단백질의 활성을 측정한 후, 대조군인 항비만 효능 평가 대상 식품/소재를 포함하는 식이를 섭취하지 않은 비만 유도된 형질전환 동물에서의 활성과 비교하는 단계를 포함하는 상기 항비만 효능 평가 대상 식품/소재의 유효성 평가 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, UCP-2 및 루시퍼라아제 리포터 단백질을 공동-발현하는 형질전환 동물은 항비만 효능이 이미 알려진 녹차 폴리페놀 EGCG 또는 마늘 식이를 섭취한 결과, 정상 생쥐와 비교하여 항비만 효능 효과가 좋아진 것을 확인할 수 있었다(도 4 내지 도 9 참조). 이에 본 발명의 형질전환 동물은 항비만 효능이 알려진 기능성 식품/소재의 유효성 평가에 유용하게 이용될 수 있다.

단계 1)의 비만 유도는 고지방 식이를 6 내지 10 주간 급여하여, 정상 체중에 비해 체중이 1.5 배지 2.2 배 증가하도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 단계 2)의 항비만 효능이 알려진 기능성 식품/소재는 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직한 예로는 녹차 폴리페놀 EGCG 및 마늘 등이 있으며, 당업계에서 항비만 효능이 있는 것으로 알려진 모든 식품/소재는 모두 이용될 수 있는 것이 자명하다.

또한, 단계 3)의 리포터 단백질 활성은 형질전환 동물의 장기를 적출한 후 측정하는 방법 또는 살아있는 상태로 측정하는 방법으로 수행될 수 있다. 장기를 적출한 후 측정하는 방법은 1) 생물발광 반응의 경우 루시노미터기(lucinometer)를 이용하여 측정될 수 있고, 2) 형광 반응의 경우 형광 현미경을 이용하여 측정될 수 있고, 3) FRET의 경우 형광 반응의 경우와 마찬가지로 형광 현미경을 이용하여 측정될 수 있다. 또한, 살아있는 상태로 측정하는 방법은 1) 생물발광 반응의 경우 CCD 카메라가 장착된 IVIS Bioluminescence and Fluorescence Imaging System(발광형광 이미징 시스템; Xenogen, 미국)을 이용하여 측정될 수 있고, 2) 형광 반응의 경우 CCD 카메라가 장착된 Fiber Based Flourescene Optical Animal Image System(화이버 형광 실험동물 영상분석기; Benjamin A Flusberg et al., NATURE METHODS, 2(12): 941-950, 2005)을 이용하여 측정될 수 있고, 3) FRET의 경우 형광 반응의 경우와 동일 장치를 이용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 단계 3)의 리포터 단백질은 루시퍼라아제 이며, 상기 동물의 간, 백색지방 조직, 갈색지방 조직 및 골격근에서의 루시퍼라아제의 활성을 측정함으로써 항비만 효능 평가 대상 식품/소재의 유효성을 평가할 수 있었다.

본 발명의 형질전환 모델은 항비만 및 지방 연소와 관련된 기능성 식품/소재의 유효성 평가에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> UCP2 - Luc 유전자 재조합

<1-1> UCP -2 프로모터(또는 UCP2P) 유전자 수득

3T3-지방세포(ATCC, USA)로부터 게놈 DNA 추출 키트(Puregene, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 게놈 DNA를 분리하였다.

상기 게놈 DNA를 주형으로 하고 Taq 중합효소(Takara, 일본)를 이용하여, 제한효소 KpnⅠ과 NheⅠ 인식부위를 포함하는 -1800/+30 bp 크기의 UCP2 프로모터를 수득하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머(5'-GCG CGA GCT CAC TGT GGG TGT ATG TGT GTG-3') 및 서열번호 2의 역방향 프라이머(5'-GCG CCT CGA GTG CCA ATA CTA AAA AGG GAA-3')를 이용하여 하기 조건으로 PCR을 수행하였다: 변성 95℃ 1분, 어닐링 62℃ 2분, 신장 70℃ 2분으로 30 회. PCR 산물은 전기영동 하여 1.8 kb DNA를 Gel extraction kit(Qiagen, USA)를 사용하여 회수한 후, pGEM-T easy 벡터(Promega, USA)와 3:1의 비율로 T4 DNA 라이게이즈(Promega, USA)를 이용하여 클로닝하였다.

상기 재조합된 pGEM-T easy 벡터는 다카라 유전자 해석 센터(한국)에 염기서열 분석을 의뢰한 결과, 상기 PCR 산물이 UCP2 프로모터임을 확인하였다. 또한, 상기 재조합된 pGEM-T easy 벡터를 제한효소 KpnⅠ과 NheⅠ을 처리하여, 3.0 kb 및 1.8 kb의 단편을 확인하였다. 상기 3.0 kb 단편은 재조합되지 않은 pGEM-T easy 벡터를 나타낸다.

<1-2> UCP2- Luc 의 재조합 벡터

실시예 1-1의 방법으로 수득한 재조합된 pGEM-T easy 벡터를 제한효소 KpnⅠ과 NheⅠ(Takara, Japan)으로 처리 후, 전기영동하여 1.8 kb의 단편을 추출하여 수득하였다. 이후 제한효소 KpnⅠ과 NheⅠ으로 처리된, 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 4.8 kb의 pGL3-basic 벡터(도 1a)와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 약 16℃에서 14시간 동안 배양하여, 도 1a의 UCP2 프로모터 및 루시퍼라아제 유전자가 연결된 벡터를 수득하였다.

상기 UCP-2 프로모터 및 루시퍼라아제 유전자가 연결된 벡터를 제한효소 KpnⅠ으로 처리한 후, 전기영동 하여 6.6 kb로 크기를 확인하였고, KpnⅠ과 NheⅠ처리를 통해서 4.8 kb와 1.8 kb의 크기를 확인하였다.

<1-3> UCP2- Luc 선형 DNA

미세 주입할 DNA 제작에 사용되는 시료 및 기구는 모두 멸균하여 사용하였다. 형질전환 생쥐 제작을 위한 미세주입(microinjection)에 사용될 선형 DNA의 대량 제작을 위해, 상기 UCP-2 프로모터 및 루시퍼라아제 유전자가 연결된 벡터를 제한효소 Kpn I과 Sal I(Takara, Japan)으로 처리하여 2.8 kb와 3.8 kb를 자른 다음, 항생제 저항성 염기서열 (Amp^r)부위 2.8kb를 제외한 UCP-2 프로모터와 루시퍼 라아제 유전자가 포함된 3.8 kb를 회수하였다. 회수된 DNA 단편을 1/2 부피의 페놀과 1/2 부피의클로르포름-아이소아밀알콜(Invitrogen, USA)으로 섞어주고 30초간 볼텍싱 한 후, 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리한 다음, DNA가 용해되어 있는 상층액을 회수하였다. 상기 페놀 추출법을 3회 실시 후 에탄올로 DNA를 침전시켜 순수한 DNA를 회수하였다. 이때 회수된 DNA를 농도가 2-4 ng/㎕가 되도록 미세주입용 용액(10 mM Tris·HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4)으로 조정한 다음, DNA 용액을 각각의 1.5 ㎖ 튜브에 50 ㎕씩 분주하여 -20℃에 보관하였다.

< 실시예 2> 형질전환 생쥐 생산

<2-1> 수정란의 준비

교잡종 자성생쥐(Charls River, Japan)의 다배란 유기를 위하여 PMSG(Prenant Mares Serum Gonadotropin ; Serotropin, Japan)와 HCG(Human Chorionic Gonadotropin : Sigma, USA)를 48시간 간격으로 각각 5 IU 씩 복강 내에 주사한 다음, 동일계통의 웅성생쥐(Charls River, Japan)와 1:2로 합사 시켜 자연교미를 유도하였다. 다음날 아침, 질전의 유무를 확인하여 질전이 있는 개체만을 골라서 경추 탈구법(cervical dislocaton method)으로 도살한 다음 난관을 절취하였다. 절취된 난관의 팽대부를 주삿바늘로 터트려 난구세포괴(cumulus cell mass)를 회수하며, 회수된 난구세포괴를 300 unit/㎖의 하일루로니다아제(hyaluronidase; Sigma, USA) 용액에 2-3분 처리한 후 15,000 rpm으로 약 3분간 원심처리 함으로 핵막의 관찰을 용이하게 하였다.

<2-2> 재조합 유전자의 미세 주입

실시예 1-3에서 준비한 선형 외래 유전자의 미세주입은 미세조작기(micromanipulator: Leitz, Germany)를 이용하여 수정란의 웅성 전핵에 주입하였는데, 이때 핵막의 용이한 관찰과 실험의 편리함을 도모하기 위하여 DIC system(Leitz, Germany)을 갖춘 도립현미경 하에서 실험을 수행하였다. 외래유전자가 핵 내에 주입되는지의 여부는 웅성전핵의 팽창(swelling)으로 확인하였다. 상기 방법으로 준비한 외래유전자가 주입된 수정란들은 CO₂ 배양기 내에서 2세포기(2 cell)까지 배양한 후 건강한 상태의 수정란을 선별하여 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2008년 12월 16일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC11443BP).

<2-3> 수정란 이식

상기 실시예 2-2에서 준비한 건강한 상태의 수정란을 선별하여 대리모(FVB/n stain 마우스; Charls River, Japan)에 이식하였다. 먼저 마취제(Avertin; Aldrich, USA)를 생쥐 체중의 10 g당 0.5 ㎎의 양으로 복강 내에 주사(IP)하여 전신 마취를 하였다. 이때, 마취가 확실히 이루어지지 않았을 경우에는 0.1 cc를 더 투여하는데, 대리모의 상태를 철저히 고려한 후 사용하였다. 마취가 확실히 이루어지고 난 뒤, 가친의 배측 정중선을 약 1 ㎝정도 절개하고 난소 및 난관을 들어내어 각각의 난관에 수정란을 이식한 후 난관의 팽대부가 약간 부풀러 오른 것을 확인하였다. 그 후 복강 내에 난관과 난소를 다치지 않게 잘 넣고 근육층과 표피를 봉합하였다.

<2-4> 형질전환 확인

상기 2-3의 대리모로부터 태어난 산자의 외래유전자 발현여부는 삽입된 루시퍼라아제 외래유전자의 도입 여부를 확인함으로써 수행하였다.

우선, 산자의 꼬리를 약 0.5 cm 정도 잘라내어 proteinase K가 함유된 용해 완충 용액(Puregene, USA)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 꼬리 게놈 DNA를 추출하였다. 이후, 상기 루시퍼라아제의 PCR의 최적 조건을 확립하기 위해, 0.1 pg 내지 100 ng의 다양한 농도의 상기 꼬리 게놈 DNA를 주형 DNA로 하여 상기 루시퍼라아제 유전자를 증폭할 수 있도록 제작된 서열번호 3의 정방향 프라이머(5'-TGTACACGTTCGTCACATCT-3') 및 서열번호 4의 역방향 프라이머(5'-GCAGACCAGTAGATCCAGAG-3')를 이용하여, 1X PCR 완충용액, 200 μM dNTPs 및 1U Hotstart taq 중합효소(바이오니아, 한국)를 이용하여 하기 조건에서 PCR을 수행하였다: 초기 변성 95 ℃에서 15 분, 변성 95 ℃에서 1분, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1분씩 25 회 반복, 증폭단계는 72 ℃에서 10 분. 상기 PCR 산물을 전기영동 하였다.

그 결과, 상기 PCR 산물은 420 bp 이었으며, 최적의 PCR을 위해 주형 DNA의 농도는 1 ng/㎕로 결정하였다(도 2).

상기 최적 농도를 이용하여 상기 방법으로 산자의 꼬리 게놈 DNA를 분석한 결과, 외래 유전자가 발현되는 총 3마리의 founder 생쥐를 확인하였다(도 3).

<2-5> C57BL /6J 계통 UCP2- Luc 형질전환 생쥐 제작

UCP2-Luc-FVB/n-heterozygote 생쥐의 founder(F0) 3 마리로부터 유전적 배경을 C57BL/6J 계통으로 만들기 위해 F6 세대까지 C57BL/6J 정상 생쥐(wild-type)와 역교배(back-cross) 하였다. 각각의 태어난 생쥐는 실시예 2-4의 방법으로 PCR을 수행하여 외래 유전자가 발현되는(transgene positive) 개체를 선별하여 F6 세대의 UCP2-Luc 형질전환 생쥐를 확보하였다.

< 실시예 3> UCP2- Luc 형질전환 생쥐를 이용한 기능성 식품/소재의 항비만 유효성 평가

<3-1> 통계분석

모든 실험결과는 SPSS 12.0(Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계 분석하였다. 분석수치는 실험군 당 평균과 표준오차로 나타내었고, 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 Tukey's multiple range test에 의하여 P<0.05수준에서 유의성을 검증하였다.

<3-2> 녹차 폴리페놀 EGCG 의 항비만 효능 평가

UCP2-Luc 형질전환 생쥐를 이용하여 기능성 식품 소재인 녹차 폴리페놀(polyphenol) EGCG(epigallocatechin gallate)의 항비만 효능평가를 수행하였다. 최근 많은 연구자는 녹차 폴리페놀 EGCG가 인간(Hase T et al ., J Oleo Sci 50:599-605, 2001) 및 동물에서 항비만 효능이 있음을 보고하였다(Klaus S et al., Int J Obes 29:615-623. 2005; Makoto K et al ., Biosci Biotechnol Biochem 69:2455-2458, 2005; Moon H et al ., Chem Biol Interact 167:85-98, 2007; Murase T et al ., Int J Obes Relat Metab Disord 26:1459-1464, 2002; Wolfram S et al ., Ann Nutr Metab 49:54-63, 2002).

<3-2-1> 형질전환 생쥐 사육 및 식이

생후 약 6주령의 C57BL/6J UCP2-Luc 수컷 형질전환(transgenic) 생쥐와 정상 C57BL/6J 생쥐(wild-type)를 실험동물은 온도 20±2℃, 습도 60±5%로 유지되는 동물 사육실에서 1주간 예비 사육하였다. 이후, 고지방 식이(45% fat diet)를 8주간 주어 비만을 유도하여, 약 2배 정도 체중이 증가하였다. 비만 유도 후 비만 대조군은 고지방 식이를 공급하여 사육하고 실험군은 비만 대조군과 동일한 식이를 공급하면서 EGCG 식이(0.2% 및 0.5%)를 8주간 공급하였다. 이때, 동물들이 자유로이 EGCG 식이를 섭취하도록 하였다.

그 결과, 에너지 섭취량은 비만 유도된 정상 생쥐, 형질전환 생쥐 및 EGCG 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐 간 차이가 없었으며(도 4b), EGCG 식이 섭취에 의한 체중감소는 EGCG 식이를 섭취하지 않은 형질전환 생쥐에 비하여, 0.2% EGCG 식이 섭취 형질전환 생쥐에서 5.9%, 0.5% EGCG 식이 섭취 형질전환 생쥐에서 17.7% 감소하였다(도 4a).

<3-2-2> 형질전환 생쥐 희생과 장기 채취

기능성 식품/소재 효능 평가 실험이 끝난 UCP2-Luc 형질전환 생쥐는 12시간 절식시킨 다음, 디에틸 에테르(diethyl ether; Duksan, 한국)로 마취시켰다. 부고환 지방, 간, 비장, 콩팥, 심장, 폐, 갈색 지방, 뇌 및 근육조직을 적출한 후 무게를 측정한 후 액체질소에 담가 급속 동결시킨 후 -70℃의 냉동고에 보관하였다.

<3-2-3> 혈장 중성지방, 렙틴 ( leptin ) 농도 측정

혈장의 중성 지방 농도는 glycerol phosphate oxidase 효소법을 이용한 분석 Kit(아산 제약, 한국)로 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 혈장 렙틴 농도는 leptin 효소면역정량(enzyme-linked immunosorbent assay) kit(R&D Systems, UK)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 혈장 내 중성지방(triglyceride), 총 콜레스테롤(total cholesterol) 및 렙틴(leptin) 함량은 EGCG 식이를 섭취하지 않은 형질전환 생쥐에 비해 EGCG 섭취한 형질전환 생쥐에서 유의하게 감소하였다(도 5).

<3-2-4> 루시퍼라아제 활성 측정

실시예 3-1-2에서 적출한 각각의 조직을 용해 완충용액(promega, USA)을 사용하여 적출한 조직을 용해한 후, 제조사의 방법에 따라 단백질을 추출하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 Luciferase Reporter Assay System(promega, USA)을 이용하여 Turner Designs TD 20/20 luminometer(Turner Designs, USA)에서 측정하였다. 지방조직 양의 표준화를 위한 단백질 함량은 BCA protein assay(Pierce, USA)에 의해 측정하였다.

그 결과, EGCG 식이를 섭취하지 않은 비만 유도된 형질전환 생쥐에 비해, EGCG 식이 섭취한 형질전환 생쥐에서의 루시퍼라아제 활성도는 0.2% EGCG 식이 섭취 및 0.5% EGCG 식이 섭취한 형질전환 동물의 간에서 각각 1.9배와 2.6배, 백색지방 조직에서 각각 2.4배와 3.8배 유의하게 증가하였고, 갈색지방 조직과 골격근 조직에서는 증가하는 경향을 보였으며, 비장, 신장, 폐, 뇌 등의 조직에서는 루시퍼 라아제 활성이 측정되지 않았다(도 6).

<3-3> 마늘의 항비만 효능 평가

UCP2-Luc 형질전환 생쥐를 이용하여 마늘(Allium sativum) 소재의 항비만 효능평가를 수행하였다. 마늘(garlic)의 생리활성은 항균작용(Kim YS et al ., Kor J Food Sci Technol 28:730-735, 1996; Lim SW et al ., Kor J Food Sci Technol 29:348-354, 1997), 항암(Kim ES et al ., J Food Sci Nutr 2:180-190, 1997), 콜레스테롤 저하 효과(Chi MS, Proc Soc Exp Biol Med 171:174-178, 1982; Qureshi AA et al ., Lipids 18:343-348, 1983) 등이 있는 것으로 이미 알려져 있다. 최근 연구에서는 고지방 식이로 비만을 유도한 동물에서 마늘이 체중 및 지방조직 감소와 혈중지질 저하 효과가 있음을 보고하였다(Kang SA et al ., J Food Sci Nutr 11:48-53, 2006).

EGCG 식이 대신에, 2% 혹은 5% 마늘이 첨가된 실험식이를 사용한 것 외에 실시예 3-2-1과 동일한 방법으로 형질전환 생쥐를 사육 및 식이 한 결과, 에너지 섭취량은 비만 유도된 정상 생쥐, 형질전환 생쥐 및 마늘 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐 간 차이가 없었으며, 체중감소는 마늘 식이를 섭취하지 않은 형질전환 생쥐에 비하여, 2% 마늘 식이 섭취 형질전환 생쥐에서 10.8%, 5% 마늘 식이 섭취 형질전환 생쥐에서 18.6% 감소하였다(도 7). 이때, 동물들이 자유로이 EGCG 식이를 섭취하도록 하였다.

실시예 3-2-2의 방법으로 형질전환 생쥐를 희생하여 장기를 채취한 후, 실시예 3-2-3의 방법으로 혈장 중성지방, 총 콜레스테롤 및 렙틴 농도를 측정한 결과, 함량이 마늘 식이를 섭취하지 않은 형질전환 생쥐에 비해 마늘 식이를 섭취한 형질전환 생쥐군에서 유의하게 감소하였다(도 8).

또한, 실시예 3-2-4의 방법으로 루시퍼라아제 활성을 측정한 결과, 마늘 식이를 섭취하지 않은 비만 유도된 형질전환 생쥐에 비해, 2% 마늘 식이 섭취 및 5% 마늘 식이 섭취한 형질전환 동물의 간에서 각각 1.8배와 2.7배, 백색지방 조직에서 각각 2.0배와 5.2배, 갈색지방 조직에서 각각 1.2배와 2.2배, 골격근 조직에서 각각 1.3배와 2.3배 유의하게 증가하였으며, 비장, 신장, 폐, 뇌 등의 조직에서는 루시퍼라아제 활성이 측정되지 않았다(도 9).

도 1은 UCP2-Luc 재조합 유전자를 포함하는 벡터의 개열지도 및 전기영동 결과를 나타낸 도이다:

a: 개열지도; 및,

b: 전기영동.

도 2는 형질전환 생쥐 선별을 위한 루시퍼라아제 PCR 최적 조건 확립을 위한 전기영동 결과를 나타낸 도이다:

레인 1: 100 bp 사이즈 마커;

레인 2-8: UCP2-Luc 플라스미드 DNA; 100 ng - 0.1 pg;

레인 9: 음성 대조군 1(negative control 1; NC1) 증류수; 및,

레인 10: 음성 대조군 2(negative control 2; NC2) C57BL/6J 정상 생쥐 게놈 DNA.

도 3은 생쥐 게놈 내에 UCP2-Luc 재조합 유전자가 삽입된 Founder(F0) 형질전환 생쥐를 선별하기 위한 PCR 결과를 나타낸 도이다:

Marker: 100 bp 사이즈 마커;

NC1: 음성 대조군 1 증류수;

NC2: 음성 대조군 2C57BL/6J 정상 생쥐 게놈 DNA; 및,

PC: 양성 대조군(positive control) UCP2-Luc 플라스미드 DNA 1 pg.

도 4는 EGCG 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐의 몸무게 증가량과 에너지 섭취량 변화를 나타낸 도이다:

a: 몸무게 증가량; 및,

b: 에너지 섭취량 변화.

도 5는 EGCG 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐의 혈장 내 중성지방, 총 콜레스테롤 및 렙틴 변화를 나타낸 도이다:

a: 혈장 내 중성지방;

b: 총 콜레스테롤; 및,

c: 렙틴 변화.

도 6은 EGCG 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐의 조직별 루시퍼라아제 활성도 변화를 나타낸 도이다.

도 7은 마늘 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐의 몸무게 증가량과 에너지 섭취량 변화를 나타낸 도이다:

a: 몸무게 증가량; 및,

b: 에너지 섭취량 변화.

도 8은 마늘 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐의 혈장 내 중성지방, 총 콜레스테롤 및 렙틴 변화를 나타낸 도이다:

a: 혈장 내 중성지방;

b: 총 콜레스테롤; 및,

c: 렙틴 변화.

도 9는 마늘 식이를 섭취한 UCP2-Luc 형질전환 생쥐의 조직별 루시퍼라아제 활성도 변화를 나타낸 도이다.

<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Transgenic Animal with UCP-2 Promoter and Luciferase Reporter Gene <130> 8P-05-79 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for UCP2 promoter cloning <400> 1 gcgcgagctc actgtgggtg tatgtgtgtg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for UCP2 promoter cloning <400> 2 gcgcctcgag tgccaatact aaaaagggaa 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Luciferase gene cloning <400> 3 tgtacacgtt cgtcacatct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Luciferase gene cloning <400> 4 gcagaccagt agatccagag 20

Claims

C57BL/6J 계통, UCP-2(uncoupling protein-2) 프로모터 및 상기 UCP-2 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 형질도입된 항비만 기능성 식품/소재의 유효성 평가용 형질전환 동물.
제 1항에 있어서, 상기 UCP-2 프로모터는 지방세포 유래 UCP-2 프로모터인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 생물발광 반응을 나타내는 루시퍼라아제(luciferase); 형광 반응을 나타내는 녹색 형광성 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광성 단백질(EGFP), 적색 형광성 단백질(RFP), 증강된 적색 형광성 단백질(ERFP), 청색 형광성 단백질(BFP), 증강된 청색 형광성 단백질(EBFP), 황색 형광성 단백질(YFP), 증강된 황색 형광성 단백질(EYFP), 남색 형광성 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광성 단백질(ECFP); 및 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 원리를 이용한 효소활성화 이미징 프로브의 기질을 특이적으로 분해할 수 있는 활성 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
제 3항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라아제를 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
1) UCP-2 프로모터 및 상기 UCP-2 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 벡터를 동물의 수정란에 형질도입하는 단계;

3) 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 새끼를 생산시키는 단계;

4) 상기 새끼를 C57BL/6J 정상 생쥐(wild-type)와 역교배(back-cross)하는 단계; 및,

5) 단계 4)에서 태어난 생쥐 중 UCP-2 프로모터 및 리포터 유전자가 게놈 DNA에 도입된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 C57BL/6J 계통, UCP-2 프로모터 및 리포터 유전자가 형질도입된 항비만 기능성 식품/소재의 유효성 평가용 형질전환 동물을 생산하는 방법.
제 5항에 있어서, 단계 2)의 동물은 마우스 또는 랫트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 단계 4)의 역교배는 F6 세대까지 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 형질전환 동물로부터 유래한, UCP-2 프로모터 및 리포터 유전자가 형질도입된 형질전환 수정란.
제 8항에 있어서, 기탁번호 KCTC11443BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 형질전환 수정란.
1) 제 1항의 형질전환 동물에 비만 식이를 급여하여 비만을 유도하는 단계;

2) 단계 1)의 비만 유도된 형질전환 동물에 항비만 효능 평가 대상 식품/소재를 포함하는 식이를 급여하여 사육하는 단계;

3) 단계 2)의 형질전환 동물의 리포터 유전자로부터 발현한 리포터 단백질의 활성을 측정한 후, 대조군인 항비만 효능 평가 대상 식품/소재를 포함하는 식이를 섭취하지 않은 비만 유도된 형질전환 동물에서의 활성과 비교하는 단계를 포함하는 상기 항비만 효능 평가 대상 식품/소재의 유효성 평가 방법.
제 10항에 있어서, 단계 2)의 항비만 효능 평가 대상 식품/소재는 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
제 10항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 생물발광 반응을 나타내는 루시퍼라아제(luciferase); 형광 반응을 나타내는 녹색 형광성 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광성 단백질(EGFP), 적색 형광성 단백질(RFP), 증강된 적색 형광성 단백질(ERFP), 청색 형광성 단백질(BFP), 증강된 청색 형광성 단백질(EBFP), 황색 형광성 단백질(YFP), 증강된 황색 형광성 단백질(EYFP), 남색 형광성 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광성 단백질(ECFP); 및 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 원리를 이용한 효소활성화 이미징 프로브의 기질을 특이적으로 분해할 수 있는 활성 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
제 12항에 있어서, 리포터 단백질은 루시퍼라제인 것을 특징으로 하는 평가 방법.
제 10항에 있어서, 단계 3)의 리포터 단백질 활성은 형질전환 동물의 장기를 적출한 후 측정하는 방법 또는 살아있는 상태로 측정하는 방법으로 수행될 수 있는 것을 특징으로 하는 평가 방법.