CN104043102A - 一种多肽在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多肽在治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途，涉及炎症和自身免疫性疾病及其他和核因子-κB（NF-κB）活化异常有关疾病的药物的应用。该多肽具有抑制核因子-κB活化，并阻断核因子-κB介导的多个参与炎症过程的炎症因子的表达和产生，达到抑制炎症细胞的增殖和炎症细胞参与的炎症过程的生物效应。应用该多肽及衍生物，或通过转染相应的cDNA在细胞内表达该多肽，能达到有效抑制炎症细胞增殖及炎症过程的作用，在制备炎症，自身免疫病及有关疾病的治疗药物、及诊断试剂的中具有独特的使用价值。

Description

一种多肽在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途

技术领域

本发明属于医学生物工程领域，涉及一种多肽在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途。 

背景技术

核因子-κB（NF-κB）是调节细胞基因转录的关键因子之一，活化后的核因子-κB（NF-κB）可直接启动和调节众多参与炎症反应、免疫反应相关基因的转录，调控大量细胞因子、黏附分子的表达，在机体的炎症、免疫反应等方面发挥重要作用。免疫功能失调引起的炎症和炎症相关性疾病（病毒感染，休克，过敏性疾病，炎症和自身免疫病）严重危害人类健康。大量研究表明，这些疾病的发生与发展和NF-κB的活化有密切关系，因此研究表明，通过调控NF-κB的活化，从而对多种疾病的临床治疗发挥良好的干预作用，寻找有效抑制NF-κB活化的化合物和药物就意味着寻找这些疾病的治疗手段。然而目前现代医学和药物所应用的抑制NF-κB活性的多种措施，由于效价、特异性、副反应、可行性等多方面的问题，临床应用往往受到限制。目前人们正加紧研发以NF-κB和它介导的信号转导通路为药物靶点的新化合物用于治疗多种疾病特别是炎症性疾病药物。 

NF-κB是一种能与免疫球蛋白轻链基因的增强子B序列(GGGACTYrcc)特异性结合的核蛋白，因首先发现其参与B细胞免疫球蛋白的K轻链转录调控而命名。NF-κB家族成员中，由p50／p65亚基形成的二聚体具有NF-κB分子主要的生物活性。在细胞未受刺激的状态下，NF-κB与一类被称为NF-KB抑制因子(IKB)的家族抑制蛋白结合，使NF-κB二聚体无法从细胞质向细胞核内转移，阻止NF-κB结合到相关基因序列，从而抑制NF-κB的调节蛋白质表达的生物活性。当细胞受到各种内源性、外源性的配体以及机械性、化学性等刺激后，IKB不再和NF-κB结合，NF-κB从胞质移位到核内，并经过多个蛋白质激酶的磷酸化激活，激活后的NF-κB并结合到靶基因的启动子或增强子区域的NF-κB结合序列，调节（增加或减少）靶基因转录和蛋白合成。 

NF-κB可诱导许多因子转录，如细胞因子、趋化因子、黏附分子、生长因子、免疫受体、促／抑凋亡蛋白、补体、病毒、iNOS、COX-2等，特别是NF-KB和多种炎症性因子的表达和产生密切相关，比如：白介素1(IL-1)，白介素2(IL-2)，白介素6(IL-6)，白介素8(IL-8)，肿瘤坏死因子A(TNF-A)，内皮细胞黏附分子如自细胞黏附分子-1(ELAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等。所以，NF-κB 对免疫功能的调节非常关键，而NF-κB的活化在这一过程中起着至关重要的作用。 

虽然目前炎症发病的详细机制仍不明确，多数研究认为免疫功能紊乱在炎症疾病发病中起关键作用，同时也发现NF-κB的活化在大多数炎症疾病中存在，所以NF-κB的活化过程目前已成为治疗炎症疾病的靶点，而能阻断NF-κB生物活性的抑制剂具有良好的调节炎症过程的作用。细胞内外的多种刺激可通过多种信号通路激活NF-κB，活化的NF-κB可以调节多种基因的表达，对多种细胞内过程特别是机体免疫反应起着非常重要的作用，我们可以通过调节这些信号通路来抑制NF-κB的活化，从而调节多种炎症因子的产生和分泌，使炎症反应减轻或消除，从而达到治疗多种疾病的目的。所以，开发具有以NF-κB激活的信号通路中任何一个环节为靶点的细胞内阻断剂，以此来获得靶向性强、副作用小的药物，为治疗多种疾病新药开发新的途径。 

目前研究已证实PI3K（三磷酸肌醇-3-激酶）参与了NF-κB的活化和免疫反应过程，所以抑制PI3K的活性是一个切实可行的抑制NF-κB信号转导从而达到治疗NF-κB活化异常引起的疾病特别是炎症相关疾病的方法，目前也有多种PI3K抑制剂正在进行临床前或临床研究应用于治疗NF-κB异常激活比如炎症性疾病，但是，由于目前开发的PI3K抑制剂存在抑制特异性低等问题，体内毒性和副作用大，严重影响了PI3K抑制剂应用于治疗NF-kB异常活化相关疾病药物中。 

PI3K由多个亚型成员构成，其中p55PIK就是PI3K家族成员，以前研究结果证明p55PIK参与了激活NF-κB信号转导，特别是高表达p55PIK促进了NF-κB信号转导活化，比如p65蛋白质的磷酸化。所以，如果能阻断p55PIK信号转导是可以阻断NF-κB活化，从而影响NF-κB介导的生物学功能。 

发明内容

本发明的目的提供一种抑制NF-κB活化的信号通路的多肽，该多肽具备抑制NF-κB活化的信号通路特别是降低NF-κB中p65亚基的磷酸化的生物学功能，从而调节NF-κB转录因子结合目的基因的能力，影响NF-κB目的基因产物蛋白质的转录和表达。由于NF-κB参与了多种疾病过程，所以该多肽可以有效治疗由于NF-κB异常活化相关疾病特别是炎症。除炎症外，该多肽还可以用于治疗其他由于NF-κB参与的疾病比如：病毒感染，休克，神经退化性疾病，过敏性疾病和自身免疫病等。 

上述抑制NF-κB活化的信号通路的多肽的氨基酸序列为：甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸，简称P15多肽。P15多肽具备抑制NF-κB活化的信号通路特别是降低NF-κB中p65亚基的磷酸化的生物学功能，从而调节NF-κB转录因子结合目的基因的能力，影响 NF-κB目的基因产物蛋白质的转录和表达。由于NF-κB参与了多种疾病过程，所以该多肽可以有效治疗由于NF-κB异常活化相关疾病特别是炎症。除炎症外，该多肽还可以用于治疗其他由于NF-κB参与的疾病比如：病毒感染，休克，过敏性疾病和自身免疫病等。 

本发明提供的是P15多肽在治疗NF-κB异常活化疾病（如病毒感染，休克，过敏性疾病和自身免疫病）的药物中的应用，和P15多肽现已公开的阻断PCNA结合DNA聚合酶，从而阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的用途并不相同。（建议保留，这点很重要，审查员百分百可以查到原来的P15专利，此处先行说明，对以后答辩可以埋下伏笔） 

在研究中，我们发现了一个多肽片段在细胞中抑制了NF-κB中p65亚基蛋白质的磷酸化。该多肽片段的序列为：甲硫氨酸－脯氨酸－酪氨酸－丝氨酸－苏氨酸－谷氨酸－亮氨酸－异亮氨酸－苯丙氨酸－酪氨酸－异亮氨酸－谷氨酸－甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸；（见《氨基酸和核苷酸序列表》），在以后该多肽称为P15，由于NF-κB的p65蛋白质的磷酸化改变了NF-κB转录因子和其目的基因的结合及NF-κB的目的基因的转录水平，从而改变了这些目的基因编码的蛋白质的表达和产生。由于这些蛋白质很多参与了多种细胞过程特别是免疫过程和炎症过程，所以P15多肽片段是NF-κB信号通路的抑制剂。根据这一结果，我们设想，如果在细胞中表达P15，这一多肽能抑制NF-κB的p65和/或其他蛋白的磷酸化，从而抑制了NF-κB介导的信号转导通路。 

证明上述模型的关键之处在于把P15多肽导入细胞中，再观察P15多肽对NF-κB介导的信号转导通路（比如p65磷酸化）和NF-κB调节目的基因（比如肿瘤坏死因子A，TNF-α）表达和产生的影响。为达到这一目的，我们采用分子生物学的手段，制造一个DNA构建体，这一构建体编码含有P15多肽片段的融合蛋白，再把这种构建体转入培养的人细胞中，然后观察表达P15多肽片段的细胞中NF-κB中p65亚基的磷酸化和细胞中编码TNF蛋白质的信使RNA量的变化。另外，我们还通过人工合成的方式，生产一个由具有穿透细胞膜的多肽片段和P15多肽构成的PTD-P15融合多肽；PTD的序列为：精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸。在培养的细胞中加入PTD-P15融合多肽，再观察进入细胞的P15多肽对NF-κB P65亚基的磷酸化和细胞产生和分泌的TNF-α的影响。为了观察P15多肽对动物模型中炎症发生和发展的影响，我们通过注射PTD-P15融合多肽，观察PTD-P15融合多肽能否抑制动物模型中炎症的发生和发展。 

实验结果表明，在几种不同的培养细胞系中表达P15多肽或加入PTD-P15融合多肽，P15降低了NF-κB p65亚基的磷酸化，导致这些细胞的NF-κB转录因子结合目的基因（比如NF-κB的一个主要目的基因TNF-α），抑制了NF-κB的活化其他几个证明NF-κB活化的观察指标都显著降低，证 明了P15多肽具有抑制NF-κB活化能力，是一个NF-κB信号通路抑制剂；同时，注射PTD-P15融合多肽能够抑制动物模型中炎症的发生和发展。 

P15多肽在应用时，可采用能穿膜的融合多肽的形式，制成注射剂、外用喷剂，外用涂抹液，外用膏剂等，或制备成脂质体包裹融合多肽的口服药剂，此外，还可将P15多肽的核酸序列与质粒构建载体、或插入病毒内，然后制备成可以直接在细胞内表达的注射剂。 

需要说明的是，P15多肽在制备成穿膜融合多肽时，不限于和PTD这一种多肽片段进行构建，还可以采用其他具有穿膜功能的多肽片段，都属于P15多肽的应用范围。 

本发明的有益效果：与现有抑制NF-κB激活的方法相比，本发明的优点如下： 

①P15降低了NF-κB p65的活化，从而抑制了NF-κB结合目的基因的作用，导致NF-κB调节的目的基因的转录水平的改变，由于NF-κB调节的目的基因编码的蛋白质参与了多种生物过程和多种疾病的发生和发展，P15的发明为治疗肿瘤和其他细胞生长异常疾病新药的设计和筛选，提供了一种新的方法和途径。同时，PTD-P15融合多肽能有效地抑制炎症，证明P15多肽在穿透细胞膜后仍具有抑制NF-κB激活的生物学效应，也说明具有穿膜功能的多肽或分子也可能用于帮助具有生物学活性P15穿透细胞膜。 

②P15多肽毒副作用低，抗原性弱，实验结果也发现P15多肽对细胞凋亡没有明显的影响，所以对正常细胞没有明显的杀伤作用。由PTD-P15融合多肽加入培养细胞和应用于动物体内，也没有观察到明显的毒性。 

③在细胞中表达P15多肽和PTD-P15融合多肽能有效抑制多种人类和鼠类肿瘤细胞中NF-κB的激活和动物模型中炎症疾病，证明P15在由于NF-κB异常激活导致疾病特别是炎症的治疗方面具有高效、广谱等优点。 

④PTD-P15融合多肽分子量小，能化学合成，便于大规模直接应用于临床，同时也可用其他的方法（比如用质粒及病毒载体）把P15多肽投人到细胞内，以达到治疗NF-κB活化相关疾病的目的。 

附图说明

图1为P15减少NF-κB信号通路中p65蛋白质磷酸化的免疫印迹照片。 

图2a～2f为P15多肽抑制TNF-α，白介素1（IL-1β）和白介素6（IL-6）炎症因子表达的对比数据图； 

图2a为TNF-αmRNA的表达水平对比图； 

图2b为IL-1βmRNA的表达水平对比图； 

图2c为IL-6mRNA的表达水平对比图； 

图2d为TNF-α的浓度对比图； 

图2e为IL-1β的浓度对比图； 

图2f为IL-6的浓度对比图。 

图3为小鼠注射LPS诱导的死亡试验中小鼠存活率对比图。 

图4为小鼠鼻炎试验中鼻腔组织病理切片的对比图。 

具体实施方式

下面借助具体实验及其数据结果对本发明进行论证说明，但应该说明的是，这些例子并不对本发明加以限制。P15多肽在下列实验中证明其抑制NF-κB信号转导和激活的生物学作用和P15在制备治疗NF-κB活化相关疾病（如炎症等）药物的用途，包括但不限于下列实验。 

试验例1：在pEGFP质粒中引入编码P15多肽的cDNA，DNA构建体表达P15-GFP融合蛋白的检测 

pEGFP-N1质粒载体购于美国Clontech公司，质粒包含编码绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA，用EcoRI-BamHI（购于美国Promega公司）酶切质粒，酶切后的质粒在琼脂糖胶中分离、纯化，用于以后的连接反应。从胶中回收DNA片段的试剂盒来自德国Qiagen公司。 

编码P15多肽的cDNA来源于人工合成的双链DNA，其序列为： 

单链1： 

5’TTTTGAATTCATGCCCTATTCGACAGAACTGATATTTTATATTGAAATGGATCCTGGATCC； 

单链2： 

5’TTTTGGATCCAGGATCCATTTCAATATAAAATATCTGTTCTGTCGAATAGGGCATGAATTC。 

两个单链混合后，结合成双链DNA，产物经过纯化后（纯化用的试剂盒来自德国Qiagen公司），用EcoRI-BamHI酶切；再用琼脂糖胶纯化，然后和酶切纯化后的载体pEGFP-N1进行连接反应（连接试剂盒来自美国Promega公司）。转化细菌后（感受态细菌来自美国Promega公司），选出阳性克隆，其cDNA序列的正确性通过核酸序列测定得到证实后，大规模纯化制备质粒（大规模纯化试剂盒来自美国Promega公司），用于以后的实验。这种质粒在真核细胞分别表达一个P15和GFP的融合蛋白，表达的P15连接在GFP的N未端，该融合蛋白称为P15-GFP。 

转染试剂盒购于美国Invitrogen（目录号为11668），转染实验也按照生产厂家提供的使用说明完成。COS7细胞培养在10%小牛血清DMEM营养液中。转染48小时后，COS7细胞用生理盐水（PBS）洗两次，加入细胞裂解液裂解细胞，用超声波破坏DNA后，加入适量的2-巯基乙醇和溴酚蓝，于沸水中处理5分钟，置于冰上保存，随后上样于质量浓度为12%的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的蛋白转移到尼龙膜上，此膜用抗GFP抗体（购于美国Invitrogen，目录号为R970）检测融合蛋白的产生，结果证实了P15-GFP在细胞中的表达。 

试验例2：P15多肽的表达减少NF-κB中p65的磷酸化 

因为NF-κB中p65蛋白质536位丝氨酸的磷酸化增加p65调控多个炎症因子的转录和表达，p65的第536位丝氨酸磷酸化（p-p65^Ser536）是NF-κB活化的标志，所以测定NF-κB p65磷酸化水平是常用的检查NF-κB信号转 导通路活化的指标之一。用THP1细胞（人单核白血病细胞系，购自美国ATCC）检测P15多肽对细胞中NF-κB p65蛋白质磷酸化（p-p65^Ser536）的影响。THP1细胞在含质量浓度为10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液，37℃、5%（体积）C0₂/95%（体积）空气培养条件下培养于10厘米细胞培养皿中。能识别p65蛋白质中536位丝氨酸磷酸化位点（p-p65^Ser536）的特异性抗体和识别p65蛋白质的对照抗体均来自Santa Cruz biotechnology，inc. 

实验质粒：pEGFP-P15（表达P15-GFP融合蛋白） 

对照质粒：pEGFP-N1 

试验步骤：将用于转染的质粒和脂质体转染试剂（购自购于美国Invitrogen）混合后，室温放置15分钟，分别加入培养于RPMI1640营养液的THP1细胞中（细胞密度约为50%）在37℃中培养5小时，再加质量浓度为10%胎牛血清，继续培养48小时。我们用上述质粒转染THP1细胞，两天后，采用流式细胞仪把转染了DNA的GFP阳性细胞挑选出来，分析这些细胞的中NF-κB中p65磷酸化的水平（p-p65^Ser536）。 

试验结果表明：表达P15能抑制细胞中NF-κB中p65磷酸化水平。 

试验例3：人工合成由具有穿膜功能的多肽和P15多肽组成的PTD-P15融合多肽 

P15多肽并不能自由通透细胞膜，为了进一步观察P15对NF-κB介导的信号转导通路及多个炎症因子合成和产生的影响，我们人工合成能穿透细胞膜的P15融合多肽。该融合多肽被称为PTD-P15融合多肽， 

PTD-P15融合多肽的氨基酸序列为：精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸； 

其中，P15片段的氨基酸序列为：甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸； 

具有穿透细胞膜功能的PTD多肽片段氨基酸序列为：精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸。 

同时设计和合成一个对照多肽，其氨基酸序列为：天门冬氨酸-精氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-丙氨酸-甘氨酸-苏氨酸-甲硫氨酸。 

试验例4：PTD-P15融合多肽抑制NF-κBp65蛋白质的磷酸化。 

因为NF-κB中p65蛋白质536位丝氨酸的磷酸化增加p65调控多个炎症因子的转录和表达，p65蛋白质中563位丝氨酸磷酸化(p-p65^Ser536)是NF-κB活化的标志，所以测定NF-κB p65磷酸化水平是常用的检查NF-κB信号转导通路活化的指标之一。人外周血白细胞（采集用正常志愿者）培养于培养皿中，分别加入试验例3中合成的对照多肽、PTD-P15融合多肽，细胞培养过夜后，收集细胞，用免疫印迹法检查细胞中NF-κB中p65蛋白质中536位的丝氨酸磷酸化水平，免疫印迹照片如图1所示，纵向来看：a为空白对照、b为对照多肽、c为P15多肽；横向来看：X为磷酸化p65（p-p65^Ser536）水平、Y为p65蛋白质水平、Z为GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）水平。结果显示PTD-P15融合多肽能减少p65磷酸化，所以，PTD-P15融合多肽能抑制细胞中NF-κB的活化，而已阻断了NF-κB介导的信号转导。 

试验例5：PTD-P15融合多肽影响多个炎症因子的产生和表达的实验。 

因为NF-κB调节血液白细胞中多个炎症因子的转录和表达，所以测定血液白细胞产生和分泌炎症因子是常用的检查NF-κB信号转导通路活化的指标之一。 

收集健康人外周血5毫升，分离其中的白细胞，采用脂多糖（LPS）刺激人外周白细胞表达多种炎症因子，再加入PTD-P15融合多肽，检测其对多个炎症因子（TNF-α，白介素1和白介素6）表达（mRNA）和产生的影响。 

试验步骤：分离的外周白细胞分成6组，分别在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃，5%（体积）CO2/95%（体积）空气培养条件下培养于10厘米细胞培养皿，其中一组培养细胞中加入对照多肽（空白对照组）用以对照，另外5组分别添加融合多肽、融合多肽及LPS、LPS、对照多肽及LPS。添加融合多肽的时机为加入LPS（100微克/毫升）2小时后，加入PTD-P15融合多肽（浓度100微克/毫升），培养24小时收取细胞培养液和细胞，测定培养液中的炎症因子（TNF-α，白介素1和白介素6），收集细胞的mRNA，利用定量RT-PCR分析细胞中mRNA表达。结果如图2a～2f所示，图中编号及对应的组别为，01为对照、02为融合多肽、03为融合多肽+LPS、04为LPS、05为对照多肽+LPS、06为对照多肽。 

结果表明：PTD-P15融合多肽抑制细胞中LPS诱导的炎症因子的表达和产生。 

试验例6：PTD-P15融合多肽抑制LPS诱导的炎症小鼠死亡的实验。 

因为脂多糖（LPS）可以激活炎症细胞的增殖和炎症因子的产生和分泌，引起动物的炎症反应，大剂量的脂多糖注射动物腹腔可以导致动物严重的全身炎症反应，从而导致动物的死亡。取6-8周雌性BABL/c小鼠随机分为3组，各组小鼠分别通过尾静脉注射0.2毫升溶剂，对照多肽、PDT-P15多 肽（多肽注射量为75毫克/公斤体重），24小时后，每组的半数动物（10只）通过腹腔注射脂多糖（LPS，50毫克/公斤体重，购自Sigma公司，从大肠杆菌菌株Escherichia coli0111:B5中分离纯化，活性为1×10⁵EU/mg），组中的其他动物不做任何处理，2小时后，取250微升小鼠血液用作有关血液中炎症因子（TNF-a）浓度测定，动物放回动物房，每天观测各组动物存活情况，共观测10天，小鼠存活结果用相应的计算机统计软件分析。小鼠注射成分、注射量及生存率见表1。 

表1小鼠注射成分、注射量及生存率表 

结果表明，注射PDT-P15多肽对小鼠的血液炎症因子和生存无明显影响，注射LPS后，小鼠血液炎症因子浓度明显升高，同时小鼠死亡频繁发生，显示LPS可以在小鼠体内引起严重的炎症反应导致小鼠死亡，相比，注射PTD-P15多肽的小鼠血液炎症因子浓度比较低，同时，小鼠的死亡减少，注射PTD-P15多肽对小鼠注射LPS诱导的死亡试验影响的结果见图3，图中横轴代表LPS注射后的时间（hour），纵轴代表小鼠存活率（%），11为对照，12为PTD-P15多肽，13为对照多肽，14为空白对照+LPS，15为PTD-P15+LPS，16为对照多肽+LPS。结果显示，与对照组相比，注射PTD-P15治疗的小鼠LPS注射导致的死亡减少，PTD-P15降低LPS诱导的TNF-a产生，减少LPS引起动物死亡。 

试验例7：PTD-P15多肽抑制小鼠鼻炎模型中发炎部位的TNF-a水平和炎症细胞侵润的实验。 

炎症疾病中，发炎部位炎症因子(比如TNF-a)的产生和炎症细胞的聚集是炎症反应的标志。为观察PTD-P15多肽对炎症模型中的炎症的影响，我们首先在小鼠中建立鼻炎的疾病模型，再应用多肽于小鼠鼻腔后，检测炎症部位的TNF-a的量和炎症细胞的侵润。取6-8周雌性BABL/c小鼠通过皮下注射0.2毫升含有佐剂(氢氧化铝)和卵清白蛋白溶剂，注射每两星期重复一次，4个星期后，在小鼠的鼻腔滴入2滴0.2％卵清白蛋白溶液，每天两次，2个星期后，可以观察到小鼠鼻腔严重的炎症症状。此时，动物分为2组，分别滴入0.1％对照多肽和0.1％PTD-P15多肽溶液，每天3次，连续处理7天，处死动物，采集小鼠鼻腔组织，做病理切片，检测炎症部位的TNF-a量和炎症细胞的侵润，切片照片如图4所示，图中①为对照多 肽处理组的TNF-a染色切片照片，②为PTD-P15多肽处理组的TNF-a染色切片照片，③为对照多肽处理组的白细胞染色切片照片，④PTD-P15多肽处理组的白细胞染切片色照片。 

结果表明，对照多肽处理组小鼠鼻炎的发炎部位中含有大量的TNF-a，并伴随大量的炎症细胞的侵润，而应用PTD-P15多肽溶液的小鼠炎症部位的TNF-a明显减少，炎症细胞的侵润也明显减少。结果证实PTD-P15治疗炎症的良好效果。 

序列表

Claims (6)

1.P15多肽在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途，所述P15多肽的氨基酸序列为：甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸，该多肽通过抑制核因子-κB的活化，从而阻断核因子-κB介导的信号转导通路，影响核因子-κB结合DNA有关基因序列而改变多个参与炎症过程的蛋白质因子的表达和产生。

2.根据权利要求1所述P15多肽在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途，其特征在于：所述疾病包括哺乳动物的病毒感染、炎症和自身免疫性疾病，及其他和核因子-κB异常活化有关的疾病。

3.P15多肽的核苷酸编码序列在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途。

4.根据权利要求3所述P15多肽的核苷酸编码序列在制备治疗NF-κB异常活化疾病药物中的用途，其特征在于：所述疾病包括哺乳动物的病毒感染、炎症和自身免疫性疾病，及其他和核因子-κB异常活化有关的疾病。

5.PTD-P15融合多肽在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途，所述PTD-P15融合多肽的氨基酸序列为：精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸。

6.根据权利要求5所述PTD-P15融合多肽在制备治疗核因子-κB异常活化疾病药物中的用途，其特征在于：所述疾病包括哺乳动物的病毒感染、炎症和自身免疫性疾病，及其他和核因子-κB活化异常有关的疾病。