CN109997787A - 一种非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法及应用，有效解决非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌的转化提供稳定、可靠和有效的造模大鼠，为NASH、肝纤维化、肝硬化、HCC发生发展机制的动物实验和新药研发提供技术支持的问题，将体重250‑300g的成年SD雄性大鼠，适应性喂养1周，投喂高脂CDAA饲料，在饮用水中加入二乙基亚硝胺诱导，观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重；从第一次投喂高脂CDAA饮食和饮用水内加入DEN开始计算，连续培育饲4‑16周，即得到非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠，本发明易操作、用时短、稳定有效，为研制和开发治疗非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的新药提供造模和技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及医用动物培育，特别是一种非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法及应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝炎（简称NASH）发病率高，危害性大，是向肝纤维化、肝硬化、乃至肝细胞性肝癌（简称HCC）发展的重要环节。NASH-HCC是目前导致致死性肝脏疾病的主要原因之一。然而临床仍然没有比较规范的NASH-HCC的预防方法及治疗措施。造模方法在探索疾病的发病机制、评价诊断、筛选防治药物等领域均有重要作用。一种稳定高效、周期短，低死亡率的最佳的模拟人类疾病NASH-HCC的动物造模方法是研究其发病机制和治疗方案的重要技术手段。
目前用于研究NASH、肝纤维化、肝硬化、HCC的造模动物主要有化学毒物诱导、物理损伤、病理性饮食、基因敲除等。这些技术均存在着以下问题：
（1）化学毒物诱导是将DEN或四氯化碳（CCl4）经消化道、腹腔注射诱导大鼠或小鼠，致使肝细胞急性或慢性损伤，导致肝纤维化、肝硬化和肝癌形成，虽然可以诱导肝癌发生，但无法完全模拟人类从单纯性脂肪肝、NASH到HCC的自然演变过程，不具备NASH-HCC研究和新药开发所需的基本模型参数。
(2)物理损伤造模是将大鼠或小鼠的肝胆管人为结扎，导致机械性肝内胆汁淤积，引起肝脏进行性损伤、肝纤维化、肝硬化、肝癌形成。但其造模通常用于肝纤维化、肝硬化的基础研究和药物研发，仍不适合NASH-HCC研究和新药开发所需的基本模型参数。
（3）病理性饮食诱导造模是通过高脂、胆碱缺乏、高果糖饮食饲养大鼠或小鼠，诱导脂肪肝、NASH和HCC形成。该模型虽然接近人类NASH-HCC的病理过程，但周期长，不是所有动物最终都会出现HCC，观察需要约大于24个月时间，不利于实验研究。
(4)基因敲除诱导肝癌造模是通过敲除抑癌基因联合。该种造模可以形成脂肪肝、肝纤维化、NASH和HCC，但是基因敲除方法成本昂贵，且不易操作，不利于实验顺利进行。
目前尚无理想的NASH向HCC转化用于造模的动物，因此提供一种非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化大鼠的培育方法是非常必要的，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法及应用，可有效解决非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌的转化提供稳定、可靠和有效的造模大鼠，为NASH、肝纤维化、肝硬化、HCC发生发展机制的动物实验和新药研发提供技术支持的问题。
本发明解决的技术方案是，一种非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法，包括以下步骤：
（1）、将体重250-300g的成年SD雄性大鼠，置于室温18-22℃、湿度50%-70%的笼子中，在12小时的光照/黑暗周期，适应性喂养1周，测定大鼠体重；
（2）、喂养1周，测定体重后的大鼠开始投喂高脂CDAA饲料，在饮用水中加入二乙基亚硝胺（简称DEN）诱导，浓度为71.05 ug/L，一周内其中 5天为二乙基亚硝胺饮用水，另 2 天为普通饮水（自来水或干净的井水、河水），连续培育4-16周，饲养期间自由饮食水；
所述的高脂CDAA饲料，其中，以重量计：脂肪32%、碳水化合物55%、蛋白质13%，胆碱为0；所述的碳水化合物为淀粉、糊精、糖，脂肪为玉米油和氢化植物油，蛋白质为氨基酸预混料，热量为4.3千卡/g；
（3）、饲养期间每天观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重；
（4）、从第一次投喂高脂CDAA饮食和饮用水内加入DEN开始计算，连续培育饲4-16周，即得到非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化（NASH-HCC）的大鼠（模型）。
所述方法培育的大鼠在制备研究非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化动物模型中的应用，其中，饲养4周的大鼠为制备非酒精性脂肪性肝炎造模的应用，饲养8周、12周的大鼠为制备肝硬化造模的应用，饲养16周的大鼠为制备肝细胞癌造模的应用；
所述的动物模型为用于研究和开发非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的发生、发展机制的动物试验和新药研发中的应用；
所述方法培育的大鼠在基础研究、预防和治疗NASH、肝纤维化、肝硬化、HCC代谢性疾病造模中的应用。
本发明采用CDAA饮食和加入DEN的饮用水联合应用，诱导培育非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化（NASH-HCC）大鼠，该大鼠可有效用于制备非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的动物模型，这种大鼠制成的动物模型符合NASH向HCC转化的病理过程，易操作、用时短、稳定有效，为研制和开发治疗非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的新药提供造模和技术支持，有巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明三组大鼠体重变化结果（空白组，CDAA组，模型组，4周，8周，12周，16周）曲线图。
图2为本发明三组大鼠肝重变化结果（空白组，CDAA组，模型组，4周，8周，12周，16周）曲线图。
图3为本发明三组大鼠ALT变化结果（空白组，CDAA组，模型组，4周，8周，12周，16周）曲线图。
图4为本发明三组大鼠AST变化结果（空白组，CDAA组，模型组，4周，8周，12周，16周）曲线图。
图5为本发明三组大鼠AFP变化结果（空白组，CDAA组，模型组，4周，8周，12周，16周）曲线图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法，包括以下步骤：
（1）、将体重250-300g的成年SD雄性大鼠20只，第一组：空白对照组4只，第二组： CDAA+普通饮水8只，第三组： CDAA+DEN饮水8只，分别置于相同条件下的温室内的笼子中，温室的室温20℃、湿度60%，在12小时的光照/黑暗周期，适应性喂养1周，测定大鼠体重；
（2）、喂养1周，测定体重后的大鼠同时开始投喂相同的高脂CDAA饲料，在饮用水中加入二乙基亚硝胺（简称DEN）诱导，浓度为71.05 μg/L，一周内其中 5天为二乙基亚硝胺饮用水，另 2 天为普通饮水（自来水或干净的井水、河水），连续培育4-16周，饲养期间自由饮食水；
（3）、饲养期间每天观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重；
（4）、从第一次投喂高脂CDAA饮食和饮用水内加入DEN开始计算，连续培育饲4-16周，即得到非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化（NASH-HCC）的大鼠（模型），其中：
第4周停止培育，作为制备非酒精性脂肪性肝炎造模的大鼠；
第8周停止培育，作为制备早期肝硬化造模的大鼠；
第12周停止培育，作为制备肝硬化造模的大鼠；
第16周停止培育，作为制备肝细胞癌造模的大鼠。
所述方法培育的大鼠在制备非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化动物模型中的应用。
本发明培育方法简单，易操作，培育时间短，效率高，方法稳定可靠，所培育的大鼠有效用于非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的动物造模，为NASH、肝硬化、HCC发生发展机制的动物实验模型、预防和治疗非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的新药研发提供技术支持，并经试验，效果非常好，有关试验资料如下：
一、选用20只体重250-300g的成年SD雄性大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在温度、湿度和通风可控的笼子中，保持12小时的光照/黑暗周期适应性喂养一周；
二、适应性喂养1周后根据处理因素共分为三组，第一组：空白对照组4只，第二组：CDAA+普通饮水8只，第三组：模型组8只，CDAA+DEN（浓度71.05ug/L， 一周 5天，另 2 天改为普通饮水）
三、配置71.05μg/L的DEN溶液，DEN溶液由上海麦克林生化科技有限公司购买，商品名称是二乙基亚硝胺，DEN溶液的浓度为99%（体积百分比浓度）。
四、适应性喂养1周后开始投喂高脂CDAA饲料（32%脂肪热量、碳水化合物55%、蛋白质13%，胆碱为0）、饮用水加入DEN（浓度为71.05μg/L， 一周 5天，另 2 天改为普通饮水）诱导，饲养期间自由饮食水，连续培育饲4-16周；
五、饲养期间每天观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重；
六、从第一次投喂高脂CDAA饮食和饮用水内加入DEN开始计算，每4周断颈处死各组大鼠各2只，空白组处死1只，打开腹腔，取肝脏组织，直到第16周。取血后分离血清， 利用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶( ALT) 和谷草转氨酶( AST)和甲胎蛋白（AFP） 含量。将肝组织用4％多聚甲醛液固定， 自动石蜡包埋机中石蜡包埋，4℃保存。厚度为4μm。 常规苏木素-伊红染色，中性树胶封片后进行病理学镜检。
生化结果：图1、2为三组大鼠的体重和肝脏重量。研究结果表明模型组大鼠体重和肝脏重量持续上升。图3、4、5为三组大鼠肝功能和AFP研究结果。研究结果表明模型组大鼠肝功能酶学改变明显，且指标持续上升，AFP指标也持续上升，较空白组和CDAA组偏高。
病理结果：脂肪变性伴炎症浸润（1-4周）：肝组织结构基本正常，肝小叶存在，腺泡二区三区肝细胞呈大泡型脂肪变性，脂变范围＞80%，平均每 200倍视野见 5个坏死灶；早期肝硬化（5-8周）：早期结节性肝硬化活动期，局灶细胞非典型增生。结节内肝细胞脂肪变性的范围降低；肝硬化（9-12周）：肝小叶结构破坏，肝硬化伴局部肝细胞异型增生；肝细胞癌（13-16周）：肿瘤细胞呈片状巢状排列，坏死的背景中可见散在的异型细胞，细胞核大，深染。染色质增粗。病理性核分裂像可见。
空白组：整个饲养过程中肝组织正常，肝小叶结构清晰。肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列。肝板排列整齐，未见坏死灶。
CDAA组：4周时开始出现典型的非酒精性脂肪性肝炎病理学特征，肝小叶结构存在。腺泡二区三区肝细胞呈大泡型脂肪变性。脂肪变性的肝细胞周围可见多个点灶状坏死。4到16周的脂肪变性范围分别为80%、70%、90%、80%，未见肝硬化和肝细胞异性增生。
实验表明，大鼠模型所显示的非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的发病机理与实际情况相一致，表明用于非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠造模成功，并经反复试验均取得了相同或相近似的结果，表明培育方法稳定可靠，具有很强的实际应用价值。
本发明采用高脂CADD+DEN饮水饲育，符合目前人类NASH-HCC的发病基本理念。能真实模拟人类NASH的病理过程。稳定性好，死亡率低，周期短。为人类NASH-HCC的研究，特别是新药研发提供了技术支持，有巨大的经济和社会效益。
Claims (5)
1.一种非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将体重250-300g的成年SD雄性大鼠，置于室温18-22℃、湿度50%-70%的笼子中，在12小时的光照/黑暗周期，适应性喂养1周，测定大鼠体重；
（2）、喂养1周，测定体重后的大鼠开始投喂高脂CDAA饲料，在饮用水中加入二乙基亚硝胺诱导，浓度为71.05 ug/L，一周内其中 5天为二乙基亚硝胺饮用水，另 2 天为普通饮水，连续培育4-16周，饲养期间自由饮食水；
所述的高脂CDAA饲料，其中，以重量计：脂肪32%、碳水化合物55%、蛋白质13%，胆碱为0；所述的碳水化合物为淀粉，糊精，糖，蛋白质为氨基酸预混料，脂肪为玉米油和氢化植物油，热量为4.3千卡/g；
（3）、饲养期间每天观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重；
（4）、从第一次投喂高脂CDAA饮食和饮用水内加入DEN开始计算，连续培育饲4-16周，即得到非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠。
2.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将体重250-300g的成年SD雄性大鼠20只，随机分为3组，即第一组：空白对照组4只，第二组： CDAA+普通饮水8只，第三组： CDAA+DEN饮水8只，分别置于相同条件下的温室内的笼子中，温室的室温20℃、湿度60%，在12小时的光照/黑暗周期，适应性喂养1周，测定大鼠体重；
（2）、喂养1周，测定体重后的大鼠同时开始投喂相应的高脂CDAA饲料，在饮用水中加入二乙基亚硝胺诱导，浓度为71.05 μg/L，一周内其中 5天为二乙基亚硝胺饮用水，另 2 天为普通饮水，连续培育4-16周，饲养期间自由饮食水；
（3）、饲养期间每天观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重；
（4）、从第一次投喂高脂CDAA饮食和饮用水内加入DEN开始计算，连续培育饲4-16周，即得到非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的大鼠，其中：
第4周停止培育，作为制备非酒精性脂肪性肝炎造模的大鼠；
第8周停止培育，作为制备早期肝硬化造模的大鼠；
第12周停止培育，作为制备肝硬化造模的大鼠；
第16周停止培育，作为制备肝细胞癌造模的大鼠。
3.权利要求1或2所述方法培育的大鼠在制备研究非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化动物模型中的应用，其中，饲养4周的大鼠为制备非酒精性脂肪性肝炎造模的应用，饲养8周、12周的大鼠为为制备肝硬化造模的应用，饲养16周的大鼠为制备肝细胞癌造模的应用。
4.权利要求1或2所述方法培育的动物模型为用于研究和开发非酒精性脂肪性肝炎向肝细胞癌转化的发生、发展机制的动物试验和新药研发中的应用。
5.权利要求1或2所述方法培育的大鼠在基础研究、预防和治疗NASH、肝硬化、HCC代谢性疾病造模中的应用。
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