CN105963309A - 一种非酒精性脂肪性肝炎转化成肝癌的实验动物模型 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种非酒精性脂肪性肝炎转化成肝癌的实验动物模型。特别的，涉及一种非酒精性慢性脂肪性肝炎(NASH)以及慢性脂肪性肝炎发展成慢性肝纤维化，肝硬化以及肝细胞肝癌(HCC)的大、小鼠模型，该模型可用于慢性脂肪肝，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，肝细胞性肝癌，代谢性疾病，糖尿病，糖尿病并发症的相关机制的体内实验、新药研发，以及在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化和肝癌发病机制的研究和药物研发中具有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，特别是涉及一种制作试验大、小鼠非酒精性脂肪性肝炎转化成肝癌的动物模型的方法。本发明所构建的动物模型可用于慢性脂肪肝，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，肝细胞性肝癌，代谢性疾病，糖尿病，糖尿病并发症的相关机制的体内实验，新药研发，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化和肝癌发病机制的研究和药物研发中，具有极高的应用价值。
背景技术
非酒精性脂肪肝炎转化成肝癌是目前导致全世界致死性肝脏疾病中的主要肝疾病之一。一种快速，有效，低死亡率的啮齿类动物的非酒精性脂肪肝炎转化成肝癌模型是目前该类疾病的病因学，病理学和药学研究所必需的。
目前所采用的用于NASH、肝纤维化、肝硬化以及肝癌动物体内实验的大、小鼠模型按其构建方法的不同分为化学毒物诱导大、小鼠模型、物理损伤大、小鼠模型、病理性饮食诱导大、小鼠模型等，这些方法均存在着以下问题：
(1)化学毒物诱导大、小鼠模型是将四氯化碳经过口服，腹腔注射或静脉注射致使肝细胞产生急性或慢性坏死又发肝脏纤维化性修复。虽然可以诱导出肝癌，但所需时间超长，大大增加了研究时间和经费。同时，化学诱导与人类实际的NASH的发病机理相差甚远，不具备NASH研究和新药开发所需的基本模型参数。
(2)物理损伤大、小鼠模型是将肝胆管人为进行结扎导致机械性肝内胆汁淤积引起肝脏进行性损伤、肝纤维化、肝硬化。但其模型适用于肝纤维化的研究和药物开发，但是仍不具备NASH的基本病变和发病机理，基本不适用于NASH的实验研究。
(3)病理性饮食诱导大、小鼠模型是通过高脂食物饲喂动物诱导脂肪肝、NASH和肝纤维化的。该模型虽然更接近于人类NASH，但是试验周期超长，不利于实验研究，基本不被采纳。
因此，我们的团队建立了一种模拟人类NASH的大、小鼠非酒精性肝炎转化成肝癌的模型，弥补了现有模型的诸多弊端，为非酒精性肝炎转化成肝癌疾病研究提供了一个稳定，可靠和有效的动物模型。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种制作大、小鼠非酒精性肝炎转化成肝癌的模型的方法，在实验大、小鼠上建立与人类NASH和肝癌疾病高度相似的疾病模型用于肝癌疾病的病因学，病理学和药学评价的模型。开发一种简单易行、能广泛推广、可真实模拟NASH，NASH转化成肝癌的自然发生过程、模型稳定的方法。
为解决上述问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种非酒精性脂肪性肝炎转化成肝癌的实验动物模型的大、小鼠模型的构建方法，包括步骤为：(1)动物种系包括但不限于实验性小鼠即C57BL/6种系，Balb/c种系；实验性大鼠即Sprague Dawley(SD)远交系大鼠；(2)在大、小鼠出生时给予一定剂量的STZ诱导新生大、小鼠的胰岛组织部分损伤(小鼠诱导STZ单次注射，STZ剂量为每只新生鼠100-400微克，大鼠诱导STZ两次注射，首次STZ剂量为每只新生鼠500-1000微克，第二次STZ剂量为每只新生鼠200-400微克)引发二型糖尿病临床表现。；(3)哺乳期结束后给予动物高脂饲养；(4)动物可以在短时间内出现脂肪肝，NASH，肝纤维化以及肝癌；(5)定期的动物肝功能检测用于监测NASH的临床进程；(6)定期的动物肝脏病理检测判定NASH的不同病理变化时期包括，脂肪肝期，脂肪性肝炎期，脂肪性肝炎伴随肝纤维化期，NASH转化肝癌的早起病理变化期，肝癌进展期，以及肝癌晚期的时间和空间的病理过程。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明一个较佳实施例中，以C57BL/6小鼠为例，提供一种制作非酒精性脂肪性肝炎转化成肝癌的动物模型的方法，包括步骤为：
(1)C57BL/6小鼠配种怀孕。
(2)仔鼠出生后24小时背部皮下一次性注射STZ(每只动物200微克)。
(3)仔鼠哺乳期4周。哺乳期间母鼠正常标准饲料饲育。
(4)哺乳期4周结束后，雌雄鼠分笼饲养，每笼4-6只；60％的高脂饲料饲育。
(5)STZ注射小鼠(雌雄分开)定期执行安乐死，分别检测动物血生化，肝功以及肝脏病理，鉴定NASH的不同时期。同时判定肝细胞肝癌的发病时期以及与NASH的相关性。
在本发明一个较佳实施例中，以SD大鼠为例，提供一种制作非酒精性脂肪性肝炎转化成肝癌的动物模型的方法，包括步骤为：
(1)SD大鼠配种怀孕。
(2)仔鼠出生后24小时背部皮下第一次注射STZ(每只动物500微克)，出生后第五天背部皮下第几次注射STZ(每只动物250微克)。
(3)仔鼠哺乳期4周。哺乳期间母鼠正常标准饲料饲育。
(4)哺乳期4周结束后，雌雄鼠分笼饲养，每笼4-6只；60％的高脂饲料饲育。
(5)STZ注射大鼠(雌雄分开)定期执行安乐死，分别检测动物血生化，肝功以及肝脏病理，鉴定NASH的不同时期。同时判定肝细胞肝癌的发病时期以及与NASH的相关性。
本发明的有益效果是：本发明的制作非酒精性肝炎转化成肝癌模型的方法，该方法符合目前人类NASH和肝癌的发病基本理念。能真实模拟NASH的病理过程，以及NASH转化成肝癌的临床病理过程。模型成功率高，稳定性好，死亡率低，填补了该领域动物模型的空白。此外，本模型可观察到糖尿病早期肝脏的病理改变，高脂饮食后加速NASH的形成，特别是肝纤维化的形成。NASH中后期转化成肝细胞肝癌的全部病理过程，为人类NASH和肝癌的研究，特别是新药研发提供了不可缺少的动物模型。
附图说明
图1：本发明的STZ注射部位图。
图2：小鼠幼鼠母乳饲养4周，高脂(HFD)饲养0周。A：小鼠大体肝脏；B：小鼠肝脏组织学HE染色，可见肝细胞变性，炎细胞浸润；C：小鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见极少量纤维化，分布于汇管区和中央静脉区域。
图3：小鼠高脂(HFD)饲养1周。A：小鼠大体肝脏；B：小鼠肝脏组织学HE染色，可见肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；C：小鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见少量纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域。
图4：小鼠高脂(HFD)饲养4周。A：小鼠大体肝脏；B：小鼠肝脏组织学HE染色，可见严重肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；C：小鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见明确纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域。
图5：小鼠高脂(HFD)饲养6周。A：小鼠大体肝脏；B：小鼠肝脏组织学HE染色，可见严重肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；部分肝细胞异样增生C：小鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见明确纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域；D：HE染色，肝组织内单发肝癌结节。
图6：小鼠高脂(HFD)饲养8周。A：小鼠大体肝脏，多发性大小不一的肝癌结节；B：小鼠肝脏组织学HE染色，可见严重肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；部分肝细胞异样增生C：小鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见明确纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域；D：HE染色，肝组织内肝癌结节。
图7：小鼠高脂(HFD)饲养16周。A：小鼠大体肝脏，巨大肝癌结节；B：小鼠肝脏组织学HE染色，可见严重肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；部分肝细胞异样增生C：小鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见明确纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域；D：HE染色，肝组织内肝癌结节。
图8：小鼠高脂(HFD)饲养后不同时期血糖水平。
图9：小鼠高脂(HFD)饲养后不同时期血清转氨酶变化。
图10：小鼠高脂(HFD)饲养后不同时期血清碱性磷酸酶变化。
图11：小鼠肝脏NAS评分。
图12：大鼠高脂(HFD)饲养4周。A：大鼠大体肝脏；B：大鼠肝脏组织学HE染色，可见严重肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；C：大鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见明确纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域。
图13：大鼠高脂(HFD)饲养6周。A：大鼠大体肝脏；B：大鼠肝脏组织学HE染色，可见严重肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；部分肝细胞异样增生C：大鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见明确纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域；D：HE染色，肝组织内单发肝癌结节。
图14：大鼠高脂(HFD)饲养8周。A：大鼠大体肝脏；B：大鼠肝脏组织学HE染色，可见严重肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；部分肝细胞异样增生C：大鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见明确纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域；D：HE染色，肝组织内肝癌结节。
图15：大鼠高脂(HFD)饲养12周。A：大鼠大体肝脏；B：大鼠肝脏组织学HE染色，可见严重肝细胞脂肪变性，炎细胞浸润；部分肝细胞异样增生C：大鼠肝脏组织学天狼星红染色，可见明确纤维化，分布于汇管区，中央静脉区和肝细胞索之间区域；D：HE染色，肝组织内肝癌结节。
图16：大鼠高脂(HFD)饲养后不同时期血糖水平。
图17：大鼠高脂(HFD)饲养后不同时期血清转氨酶变化。
图18：大鼠高脂(HFD)饲养后不同时期血清碱性磷酸酶变化。
图19：大鼠肝脏NAS评分。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种制作非酒精性慢性脂肪性肝炎(NASH)以及慢性脂肪性肝炎发展成慢性肝纤维化，肝硬化以及肝细胞肝癌(HCC)的大、小鼠模型的方法，包括如下步骤：向新出生的大、小鼠(包括雌雄新生鼠)给与背部皮下单次(或多次)注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(小鼠100-400微克/新生鼠，大鼠500-1000微克/新生鼠)，结束母鼠哺乳后开始动物试验用高脂饲料饲养，从而构建NASH鼠模型伴有肝纤维化，肝硬化以及HCC。
2.如权利要求(1)所述的大、小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠包括但不限于C57BL/6系列雌、雄小鼠，Balb/c雌、雄系列小鼠，Sprague Dawley(SD)远交系大鼠。
3.如权利要求(1)所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述STZ剂量投与剂量为小鼠100-400微克/新生鼠，大鼠500-1000微克/新生鼠，但不限于此剂量。
4.如权利要求(1)所述的大、小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述STZ注射方法为新生鼠单次(或多次)背部皮下注射，但不限于此部位和注射次数。
5.如权利要求(1)所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述动物实验用高脂饲料为32～60Kcal％脂肪的高脂纯化饲料。
6.如权利要求(1)-(4)任一权利要求所述的大、小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域的用途。
7.如权利要求(1)-(4)任一权利要求所述的大、小鼠模型的构建方法构建获得的NASH模型，NASH伴有肝纤维化，NASH伴有肝硬化，NASH伴有HCC的大、小鼠模型在基础研究，筛选，预防或治疗NASH，肝纤维化，肝硬化和肝癌的药物研发中的用途。
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