CN103858820A - 一种小型猪2型糖尿病模型的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小型猪2型糖尿病模型的制备方法，该方法为向小型猪饲喂高脂高糖日粮，连续饲喂280～320天，所述高脂高糖日粮按重量份数比包括以下组分：全价饲料55～65份、糖25～35份，5～15份动物源性油脂。本发明的方法制备得到的小型猪2型糖尿病模型可用于筛选治疗2型糖尿病模型的药物。本发明的方法步骤简单，便于操作，成本较低，可以诱导小型猪出现糖耐量受损和胰岛素抵抗，出现2型糖尿病的临床表现，确定建模成功的判定标准，可重复性强，所得的小型猪2型糖尿病模型可用于研究、筛选治疗2型糖尿病模型的药物，具有广泛的应用前景。

Description

一种小型猪2型糖尿病模型的制备方法

技术领域

本发明涉及一种小型猪2型糖尿病模型的制备方法。 

背景技术

近年来，全球糖尿病患病率呈迅速上升的趋势，2011年世界卫生组织统计数据表明，全球的糖尿病患者已经达到3.66亿人,预计至2030年全球发病率将达4.39亿人。我国18岁及以上居民糖尿病患病率为9.7%，60岁以上老年人患病率高达19.6%，全国约有成年糖尿病患者9700万人，糖尿病已经成为影响我国人口健康尤其是老年人身体健康的主要疾病，极大增加了社会养老的成本，这个问题在今后我国老年人口比率增加的趋势下显得日益尖锐。根据发病机制的不同，糖尿病可分为1型、2型、特异型和妊娠糖尿病4类。其中，2型糖尿病（Type2Diabetesmellitus,T2DM）患者占糖尿病人总数的90%以上，不断探索T2DM治疗新方法及开发新药物具有非常重要的临床意义和社会价值。 

普遍认为2型糖尿病是由遗传、行为、环境等多种危险因素共同参与和相互作用所引起的多因子疾病，2型糖尿病的发病机制仍然不够清楚，治疗效果不理想。建立合适的2型糖尿病动物模型对研究疾病的发生机制，评估治疗药物、治疗策略的有效性和安全性具有重要意义。关于2型糖尿病动物模型的专利报道有恒河猴模型（公开号：CN103314925A）、昆明小鼠模型（公开号：CN101601863A）、大鼠模型（公开号：CN1903022A）。小型猪在解剖学、生理学、营养代谢和疾病特征等方面都与人有较大的相似性。小型猪具有生命周期长、性成熟早、繁殖快、易于饲养等特点，在生物医学研究领域中具有重要的应用价值。相比于大小鼠，小型猪与人类更加接近；相比于非人灵长类动物，小型猪没有苛刻的伦理道德和动物保护方面的要求，加上饲养和试验成本较低，小型猪成为制作2型糖尿病模型的理想动物。 

但建立大动物2型糖尿病模型，建立标准的建模方案和判定标准具有很 大的难度，获得自发性糖尿病小型猪的几率非常稀少，利用转基因技术制作模型的技术尚不成熟，且成本高昂。 

发明内容

针对上述技术问题，本发明的发明人经过创造性的劳动，发明了一种小型猪2型糖尿病模型的制备方法。 

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是： 

一种小型猪2型糖尿病模型的制备方法，包括以下步骤： 

（1）向小型猪饲喂高脂高糖日粮，连续饲喂280～320天，所述高脂高糖日粮按重量份数比包括以下组分：全价饲料55～65份、糖25～35份，5～15份动物源性油脂； 

（2）每隔30天测定小型猪的空腹静脉血液血糖浓度值，小型猪出现下述两种表现的任一种均可确诊患2型糖尿病： 

a.连续2次空腹静脉血液血糖浓度值大于6.3mmol/L； 

b.仅有1次空腹静脉血液血糖浓度值大于6.3mmol/L，进行静脉注射葡萄糖耐量试验，静脉注射葡萄糖耐量60min血糖浓度值大于6.3mmol/L。 

优选地，在步骤（1）中，向小型猪饲喂高脂高糖日粮，每天定时饲喂2次，饲喂量为小型猪体重的2～4%。 

优选地，在步骤（1）中，所述高脂高糖日粮按重量份数比包括以下组分：全价饲料60份、糖30份，10份动物源性油脂。 

优选地，在步骤（1）中，连续饲喂300天。 

优选地，在步骤（1）中，向小型猪饲喂高脂高糖日粮，饲喂量为小型猪体重的3%。 

优选地，在步骤（1）中，所述全价饲料的消化能为12.95MJ/kg，粗蛋白质质量分数比为17%；所述糖为蔗糖；所述动物源性油脂为猪油。 

本发明小型猪2型糖尿病模型的饲料，所述饲料按重量份数比包括以下组分：全价饲料55～65份、糖25～35份，5～15份动物源性油脂；其中，按重量份数比各组分优选为：全价饲料60份、糖30份，10份动物源性油脂。 

优选地，所述全价饲料的消化能为12.95MJ/kg，粗蛋白质质量分数比为 17%；所述糖为蔗糖；所述动物源性油脂为猪油。 

按前述方法制备的小型猪2型糖尿病模型在筛选治疗2型糖尿病模型的药物中的用途。 

通过以上技术方案，本发明的有益效果如下： 

本发明的方法步骤简单，便于操作，成本较低，可以诱导小型猪出现糖耐量受损和胰岛素抵抗，出现2型糖尿病的临床表现，确定建模成功的判定标准，可重复性强，所得的小型猪2型糖尿病模型可用于研究、筛选治疗2型糖尿病模型的药物，具有广泛的应用前景。 

附图说明

图1为实验期小型猪体重增长曲线； 

图2为实验期小型猪平均血糖变化曲线图； 

图3为小型猪血清胰岛素浓度变化曲线图； 

图4为小型猪胰岛素敏感指数变化曲线图； 

图5为小型猪脂肪代谢相关指标变化曲线； 

图6为未发病小型猪与2型糖尿病小型猪模型胰腺对比； 

图7为未发病小型猪与2型糖尿病小型猪模型胰腺H.E染色切片。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

预备例试验材料的准备 

4～5月龄，体重20千克的广西巴马小型猪24头，其中公猪8头，母猪16头，实验小型猪来源于广西大学巴马小型猪繁育中心。 

分组管理：公母分开饲养，公猪单栏饲养，母猪4头一栏栏饲养。 

饲喂方式：每天早晚定时、定点饲喂2次，饲喂量为体重的3%左右，自由饮水。 

高脂高糖日粮配方：按重量份数比，全价饲料60份（广西钦州澳华饲料有限公司）、蔗糖30份（市售）、精炼猪油10份（市售）；所述全价饲料的消 化能为12.95MJ/kg，粗蛋白质质量分数比为17%。 

主要试剂和仪器： 

柠檬酸钠缓冲液：柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，溶解于100mL双蒸馏水中，高压灭菌备用。 

罗氏血糖测定仪、试纸：德国罗氏诊断公司。 

其它检测均在广西医科大学附属医院西院检验科完成。 

实施例 

1.小型猪2型糖尿病模型的制备及试验指标和方法 

1.1诱导造糖尿病模型 

避免因日粮改变而造成小型猪采食量变化，实验开始阶段，小型猪的饲喂要求由常规日粮缓慢过渡到高脂高糖日粮；每顿蔗糖增量为饲喂量的1.5%，猪油增量为饲喂量的0.5%，直至增加到实验水平高脂高糖日粮。 

高脂高糖日粮饲喂量为体重的3%，每天早晚定时、定点饲喂2次，自由饮水，饲喂300d。 

1.2指标测定及方法 

在正式试验期，每隔30d前腔静脉采血一次。 

动物禁食16小时，称重，前腔静脉采血，分装两管各3mL。 

一管血样用全自动分析仪测定血清总胆固醇（T-Cho）、血清甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、血糖（Glu）含量。 

另一管于4℃离心机3000r/min离心15分钟，取血清，用人胰岛素放免试剂盒检测血清胰岛素含量。 

计算胰岛素敏感指数ISI=In[1／(FPG×FPI)]。ln为自然对数，FPG为空腹血糖，FPI为空腹胰岛素。 

1.3小型猪静脉葡萄糖耐受试验 

通过静脉葡萄糖耐受试验（IntravenousGlucoseToleranceTest,IVGTT）测试动物胰腺功能，了解血糖波动范围，为确诊小型猪2型糖尿病提供参考。 

动物禁食16小时，自由饮水。 

用吊床保定动物，安静后称量体重，并记录。 

20mL注射器耳缘静脉抽血10mL（分别用于测定血液生化、血常规和血 糖、血清胰岛素，并标记为0分钟数值）； 

用注射器推送50％葡萄糖高渗溶液，注射量为1.2mL／kg，1min内注射完成，并开始记时间。 

尾静脉留针，分别于3min、10min、30min、60min、90min和120min时抽血测定血糖值和血清胰岛素浓度。 

1.4小型猪胰腺采集及切片制作 

高脂高糖日粮饲喂300天后，选择2头动物称重，耳缘静脉注射10%Kcl10mL处死，剖腹后取胰腺，称量胰腺重量后放入10%中性福尔马林中固定24h，进行系列梯度脱水、浸蜡、包埋，然后切片，厚度4--5μm，HE染色，普通光镜下观察胰腺β细胞情况。 

2.试验结果 

2.1动物体重 

根据图1可知，饲喂高脂高糖日粮，动物的体重增加明显。 

2.2空腹血糖、血清胰岛素及胰岛素敏感指数 

饲喂高脂高糖日粮期间，24头小型猪的血糖值、血清胰岛素浓度及胰岛素敏感指数均表现出异常情况，符合糖尿病发病前期症状。 

由表1，图2～图4可知，24头小型猪实验的血糖（Glu）平均值在180天之前处于波动比较大，180天时血糖值最低，之后血糖至趋于稳定。 

血清胰岛素（INS）水平在0～180天呈上升的趋势，180天时达到最高水平，随后INS迅速降低，胰岛素分泌出现障碍。 

0～210天，小型猪的平均胰岛素敏感指数（ISI）呈下降趋势，210天时最低，之后略有上升。 

表1小型猪血糖、血清胰岛素、胰岛素敏感指数变化情况 

注：数字上标不同小写字母表示同列数据差异显著（P<0.05）。 

2.3脂肪代谢 

饲喂高脂高糖日粮，小型猪脂肪代谢相关指标出现异常。由表2、图5可知，采食高脂高糖日粮后，小型猪脂肪代谢相关指标均在实验前期逐渐升高，180天或210天时达到峰值，后期出现下降，但仍高于实验前水平。 

表2小型猪脂代谢相关指标变化 

注：数字右上角不同小写字母表示同列数据差异显著，P<0.05。 

2.4静脉葡萄糖耐受试验 

饲喂高脂高糖日粮，小型猪的静脉葡萄糖耐受试验表现出糖尿病前期临床症状。由表3可知，实验期静脉糖耐量呈逐月下降趋势(即血糖测定值逐渐升高)。 

表3小型猪静脉葡萄糖耐受试验 

（单位：mmol/L） 

注：数字右上角不同小写字母表示同行数据差异显著，P<0.05。 

2.52型糖尿病小型猪的确定 

连续监测实验期小型猪的血糖值和临床表现，连续两次（2个月）空腹血糖值值大于6.3mmol/L，或者仅有1次空腹血糖浓度值大于6.3mmol/L，则进行静脉葡萄糖耐受试验，静脉注射葡萄糖耐量60min血糖值也大于6.3mmol/L，则小型猪确定患2型糖尿病。 

实验期，24头小型猪中，最早在饲喂高脂高糖饲料150天时出现连续2个月血糖值大于6.3mmol/L的个体，到300天实验结束时共有6头小型猪表现出连续2个月血糖值大于6.3mmol/L，糖耐受性明显降低，表现出2型糖尿病症状；另外6头小型猪出现糖耐量明显降低，血糖值偏高，表现出2型糖尿病的前期症状。 

2.6患2型糖尿病小型猪胰腺组织切片 

分别处死饲喂高脂高糖日粮后患2型糖尿病和未发病的小型猪，由图6、图7可知，2型糖尿病小型猪胰腺出现萎缩，且表面覆盖大量脂肪组织；胰腺切片发现，2型糖尿病小型猪的胰岛体积和数量减少，边缘出现萎缩，表明胰腺内能分泌胰岛素的细胞数量明显减少，胰岛素分泌水平降低，导致小型猪机体胰岛素供给不足，最终发展成2型糖尿病。 

Claims (10)

1.一种小型猪2型糖尿病模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）向小型猪饲喂高脂高糖日粮，连续饲喂280～320天，所述高脂高糖日粮按重量份数比包括以下组分：全价饲料55～65份、糖25～35份，5～15份动物源性油脂；

（2）每隔30天测定小型猪的空腹静脉血液血糖浓度值，小型猪出现下述两种表现的任一种均可确诊患2型糖尿病：

a.连续2次空腹静脉血液血糖浓度值大于6.3mmol/L；

b.仅有1次空腹静脉血液血糖浓度值大于6.3mmol/L，进行静脉注射葡萄糖耐量试验，静脉注射葡萄糖耐量60min血糖浓度值大于6.3mmol/L。

2.按照权利要求1所述的小型猪2型糖尿病模型的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，向小型猪饲喂高脂高糖日粮，每天定时饲喂2次，饲喂量为小型猪体重的2～4%，自由饮水。

3.按照权利要求1所述的小型猪2型糖尿病模型的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，所述高脂高糖日粮按重量份数比包括以下组分：全价饲料60份、糖30份，10份动物源性油脂。

4.按照权利要求1所述的小型猪2型糖尿病模型的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，连续饲喂300天。

5.按照权利要求2所述的小型猪2型糖尿病模型的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，向小型猪饲喂高脂高糖日粮，饲喂量为小型猪体重的3%。

6.按照权利要求1所述的的小型猪2型糖尿病模型的制备方法，其特征在于：所述全价饲料的消化能为12.95MJ/kg，粗蛋白质质量分数比为17%；所述糖为蔗糖；所述动物源性油脂为猪油。

7.一种建立小型猪2型糖尿病模型的饲料，其特征在于，所述饲料按重量份数比包括以下组分：全价饲料55～65份、糖25～35份，5～15份动物源性油脂。

8.按照权利要求7所述的饲料，其特征在于，所述饲料按重量份数比包括以下组分：全价饲料60份、糖30份，10份动物源性油脂。

9.按照权利要求6或7所述的饲料，其特征在于：所述全价饲料的消化能为12.95MJ/kg，粗蛋白质质量分数比为17%；所述糖为蔗糖；所述动物源性油脂为猪油。

10.权利要求1～6任一所述的方法制备的小型猪2型糖尿病模型在筛选治疗2型糖尿病模型的药物中的用途。

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