CN102106476A - 一种高脂饲料及在构建非酒精性脂肪肝动物模型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高脂饲料及在构建非酒精性脂肪肝动物模型中的应用，所述的高脂饲料由如下质量百分比的原料组成：大鼠育成饲料80.5％，鸡蛋10％，猪油7％，胆固醇2％，三号胆盐0.5％。本发明构建的模型可相继出现非酒精性脂肪肝临床病程进展的前三阶段：单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、纤维化。该模型用于研究非酒精性脂肪肝的发病发展机理、进行预防与治疗不同阶段的非酒精性脂肪肝的研究，尤其用于筛选预防和治疗非酒精性脂肪肝纤维化的新药、用于筛选预防和治疗非酒精性脂肪肝纤维化的措施、用于客观评价预防和治疗各个阶段非酒精性脂肪肝的方法。

Description

一种高脂饲料及在构建非酒精性脂肪肝动物模型中的应用

技术领域

本发明涉及医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种高脂饲料，以及该高脂饲料在构建非酒精性脂肪肝动物模型中的应用，构建的非酒精性脂肪肝动物模型可用于研究非酒精性脂肪肝发病发展机理以及非酒精性脂肪肝纤维化的预防和治疗方法。

背景技术

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪蓄积和脂肪变性为特征的临床病理综合症。根据肝组织病理学改变程度进行分类，可分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化。单纯性脂肪肝仅表现为肝细胞的脂肪变性。在肝细胞脂肪变性基础上发生肝细胞炎症即为脂肪性肝炎。在脂肪性肝炎的基础上，肝细胞周围发生了纤维化改变，形成肝纤维化。肝纤维化继续发展则病变为脂肪性肝硬化。

近年来，随着人类生活水平的提高和饮食结构的变化，NAFLD的发病率呈逐年上升趋势，且发病呈低龄化。越来越多的证据表明，部分NAFLD并不是一种良性的、静止的病变，它可在较短期内发展为不可逆的肝损害，其肝纤维化的发生率高达25％。因此，积极探索非酒精性脂肪肝的有效预防治疗措施，已成为目前广受关注的肝病医学难题。

动物模型是研究人类疾病的重要手段。非酒精性脂肪肝发病发展机理尚未清楚，也无有效地、理想的治疗方法，特别是目前没有非酒精性脂肪肝临床病理发展阶段的动物模型，使医药学家难以对非酒精性脂肪肝进行深入系统的实验研究。因此，建立有临床病理发展阶段的非酒精性脂肪肝动物模型，是进一步深入研究非酒精性脂肪肝的发病机理、进行预防和治疗非酒精性脂肪肝的研究，尤其是筛选预防和治疗非酒精性脂肪肝肝纤维化的新药、筛选预防和治疗非酒精性脂肪肝肝纤维化的措施、客观评价预防和治疗各个阶段非酒精性脂肪肝的方法的前提和基础。

以SD大鼠为实验动物构建NAFLD动物模型的方法为目前最常用的方法，但该方法成模时间较长，模型TG血症难以出现或不稳定；另外，以SD大鼠为实验动物，模型停滞在脂肪性肝炎模型阶段，因而无法利用该模型建立临床诊断病程进展的系统血清学诊断指标。以上种种缺陷限制了该方法用于NAFLD病因机理研究及药物评价。

采用普通的动物饲料饲养大鼠等常规的实验动物，模型也仅停滞在脂肪性肝炎模型阶段，无法构建非酒精性脂肪性肝纤维化动物模型。

目前开发一种与人类疾病特征相似、病变有一定发展过程并最终可形成肝纤维化，形成时间短、重复性好、成本低、简便易行的非酒精性脂肪肝动物模型造模方法，以及构建非酒精性脂肪肝动物模型所需的动物和饲料迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一种高脂饲料以及该高脂饲料在构建非酒精性脂肪肝动物模型中的应用，以单纯的高脂饮食来构建非酒精性脂肪肝动物模型，操作简单，易于操作。

一种高脂饲料，由如下质量百分比的原料组成：大鼠育成饲料80.5％，鸡蛋10％，猪油7％，胆固醇2％，三号胆盐0.5％。

所述的大鼠育成饲料、鸡蛋、猪油、胆固醇和三号胆盐均选用市售产品。

所述的高脂饲料的制备方法为：将鸡蛋(带壳)捣碎，与大鼠育成饲料、猪油、胆固醇和三号胆盐混合均匀，得到高脂饲料。

所述的高脂饲料可用于构建非酒精性脂肪肝动物模型。

所述的用高脂饲料构建非酒精性脂肪肝动物模型的方法为：

选取长爪沙鼠，将长爪沙鼠自由采食高脂饲料，得到非酒精性脂肪肝动物模型。

所述的长爪沙鼠优选为成年雄性长爪沙鼠。

所述的用高脂饲料构建非酒精性脂肪肝动物模型的方法优选为：

将长爪沙鼠自由采食高脂饲料12天～16天，得到非酒精性单纯性脂肪肝动物模型；继续自由采食高脂饲料28天，得到非酒精性脂肪性肝炎动物模型；再继续自由采食高脂饲料98天，得到非酒精性脂肪性肝纤维化动物模型。

本发明发现采用特定的动物：长爪沙鼠自由采食高脂饲料，其肝脏可相继形成非酒精性脂肪肝临床病理进展的前三个阶段：逐步由单纯性脂肪肝，演变为脂肪性肝炎，最后形成纤维化。在2、6、16周时，由肝脏切片后苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，即HE染色)和胶原纤维特殊染色(即Mallory三色染色)可观察到分别形成单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、纤维化。16周时模型组羟脯氨酸含量较正常对照组明显升高，差异有统计学意义，也说明模型组动物肝脏有胶原纤维的产生。由此说明本发明方法建立了非酒精性脂肪肝纤维化长爪沙鼠动物模型。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明操作简单，易于控制，构建的动物模型，可用于研究非酒精性脂肪肝发病发展机理以及预防和治疗不同阶段的非酒精性脂肪肝的方法，尤其用于筛选预防和治疗非酒精性脂肪肝纤维化的新药、用于筛选预防和治疗非酒精性脂肪肝纤维化的措施、用于客观评价预防和治疗各个阶段非酒精性脂肪肝的方法。

附图说明

图1为实施例1中实验2周时正常对照组动物的肝脏切片HE染色结果图；

图2为实施例1中实验2周时模型组动物的肝脏切片HE染色结果图；

图3为实施例1中实验6周时正常对照组动物的肝脏切片HE染色结果图；

图4为实施例1中实验6周时模型组动物的肝脏切片HE染色结果图；

图5为实施例1中实验16周时正常对照组动物的肝脏切片HE染色结果图；

图6为实施例1中实验16周时模型组动物的肝脏切片HE染色结果图；

图7为实施例1中实验16周时正常对照组动物的肝脏切片Mallory三色染色结果图；

图8为实施例1中实验16周时模型组动物的肝脏切片Mallory三色染色结果图；

图9为实施例1中模型组与正常对照组动物的肝脏羟脯氨酸含量变化图。

具体实施方式

实施例1

选取健康雄性成年长爪沙鼠作为实验动物，随机分为模型组和正常对照组。正常对照组连续自由采食普通大鼠育成饲料(浙江省实验动物饲料生产基地提供)。模型组连续自由采食高脂饲料建立NAFLD模型。高脂饲料由如下质量百分比的原料组成：普通大鼠育成饲料(浙江省实验动物饲料生产基地提供)80.5％、鸡蛋10％、猪油7％、胆固醇2％、三号胆盐(杭州微生物试剂有限公司)0.5％；高脂饲料的制备方法为：将鸡蛋(带壳)捣碎，与普通大鼠育成饲料、猪油、胆固醇和三号胆盐混合均匀，得到高脂饲料。于自由采食第2周、6周、16周末，处死实验动物。将肝最大叶中部组织用体积百分浓度为10％的甲醛水溶液固定后制备石蜡切片，进行HE染色和Mallory三色染色观察病理变化。另切肝右叶0.5g，盲样检测羟脯氨酸含量(GB/T 9695.23-2008)。

检测结果发现：正常对照组动物2、6、16周时肝脏细胞形态、小叶结构及汇管区均未见异常；正常对照组动物16周时肝脏细胞无纤维化。

模型组动物实验2周时，HE染色结果显示30～60％(质量百分比)肝细胞脂肪变性，形成非酒精性单纯性脂肪肝动物模型；羟脯氨酸含量较正常对照组无明显升高；模型组动物实验6周时，HE染色结果显示肝细胞脂肪变性进一步加剧，脂变细胞排列混乱，索状结构消失，门管区有轻度炎症，形成非酒精性脂肪性肝炎动物模型；羟脯氨酸含量较正常对照组无明显升高；模型组动物实验16周时，HE染色结果显示75～90％(质量百分比)肝细胞脂肪变性，腺泡III带广泛的气球样肝细胞，Mallory三色染色结果显示窦周细胞中度桥接纤维化；羟脯氨酸含量较正常对照组明显升高，差异有统计学意义；动物形成非酒精性脂肪性肝纤维化动物模型。

Claims (5)

1.一种高脂饲料，其特征在于，由如下质量百分比的原料组成：大鼠育成饲料80.5％，鸡蛋10％，猪油7％，胆固醇2％，三号胆盐0.5％。

2.根据权利要求1所述的高脂饲料在构建非酒精性脂肪肝动物模型中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用方法为：

选取长爪沙鼠，将长爪沙鼠自由采食高脂饲料，得到非酒精性脂肪肝动物模型。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的长爪沙鼠为成年雄性长爪沙鼠。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用方法为：

将长爪沙鼠自由采食高脂饲料12天～16天，得到非酒精性单纯性脂肪肝动物模型；继续自由采食高脂饲料28天，得到非酒精性脂肪性肝炎动物模型；再继续自由采食高脂饲料98天，得到非酒精性脂肪性肝纤维化动物模型。

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