CN105850867A - 一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非酒精性脂肪肝病动物模型的建立，具体为伴有肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗等特征的由高脂诱导的非酒精性脂肪肝病动物模型的建立。本发明选用C57BL/6小鼠，随机分模型组和对照组，适应性喂养后，模型组给予高脂饲料，对照组给予对照饲料，期间每周测量体重一次，10周后取血处死，检测常规血脂及肝功能；取鲜活肝测定组织内胆固醇与甘油三酯含量；另取肝组织做进行H.E.和油红O染色，判定NAFLD模型效果与质量。本发明采用高脂高热量饲料喂养，建立小鼠NAFLD模型，能展现出典型的NAFLD损害，并伴有肥胖，血脂异常和胰岛素抵抗等典型特征，不仅为研究其发病机制提供了方便，还能控制条件排除各种干扰，免除对人体的伤害，以提高复制成功率和缩短病程。
Description
技术领域
本发明涉及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)动物模型的建立，具体为伴有肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗等特征的由高脂诱导的非酒精性脂肪肝病动物模型的建立。
背景技术
21世纪以来，肥胖和与之相关的并发症已经成为医学界最流行和最具挑战性的疾病之一。肥胖所引起的代谢综合征，包括高脂血症，高胰岛素血症，动脉粥样硬化(AS)和脂肪肝等，其中脂肪肝又是代谢障碍疾病的综合表现。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的主要特征是肝脏中的脂质沉积，通常还会伴有肥胖、胰岛素抵抗、高血压和血脂异常。流行病学观察NAFLD在世界各地呈现出日益增多的趋势，在西方国家中被认为是最普遍的肝脏疾病，大约影响了四分之一人口的身体健康。而近年来，随着人们生活水平的提高，饮食结构的不合理，脂肪肝的发病率有逐年上升的趋势。
NAFLD作为一类代谢功能障碍型疾病，其病情演变和发展时间漫长，这很大程度上掣肘了人们得到具有合理解释性的临床数据。为了更全面了解NAFLD的发生过程，人们逐渐将注意力转至发展合适的动物模型方向来探明NAFLD形成过程。建立一个稳定可靠、病理演变过程符合的NAFLD动物模型，对研究NAFLD的发病机制及治疗方法具有极其重要的意义。
非酒精性脂肪肝动物模型大体上可分为两大类：即影响肝内脂肪酸代谢的基因敲除、突变模型以及环境因素(饮食与药物)造成肝内脂肪酸合成和氧化不平衡引发的脂肪肝模型。前者更侧重于研究具有家族史性的肝脂代谢异常，而后者更突出后天获得性的肝脂病变。总之，一个理想的动物模型应是：①形成率高，死亡率低，重复性好；②造模方法简便易行；③与所研究人类疾病特征相似；④病变有一定发展过程。
发明内容
本发明提供一种利用C57BL/6小鼠建立经高脂饲料诱导的同时伴有肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗等特征的非酒精性脂肪肝病模型的方法。
本发明选用SPF级雄性C57BL/6小鼠，所有小鼠用普通维持饲料适应性喂养1周后，在分组上，模型组与对照组均采取正态分布分组方法，即以小鼠体重为依据，将小鼠划分为高、中、低三个体重区间，将每个区间随机分配到模型组和对照组中，模型组和对照组，每组8只，模型组喂食高脂饲料，对照组喂食对照饲料，在饲养方法上采取单只单笼饲养措施，饲料定量定投，早晚各一次，维持20g/笼，保证较小的组内差异，2-3天换垫料，给笼具消毒。垫料为刨花木屑，里面含有小木块(利于小鼠磨牙)，要求高压灭菌，期间每周测量体重一次。10周后取血处死，检测常规血脂(TC、TG、FFA)及肝功能(ALT和AST)；取鲜活肝组织匀浆，测定组织内胆固醇与甘油三酯含量；另取肝组织做石蜡、冰冻切片，分别进行H.E.和油红O染色，判定NAFLD模型效果与质量。
本发明中使用单纯性高脂高热量饲料诱导诱导C57BL/6小鼠，建立非酒精性脂肪肝模型，完全模拟由于饮食结构发生改变而导致的人类非酒精性脂肪病，对于探究人类NAFLD发病机理及其应对方法有着重要的意义。同时C57BL/6小鼠为近交系小鼠，遗传背景高度相似，在一定程度上保证了模型的稳定性。
本发明中非酒精性脂肪肝小鼠模型的评价指标包括体重变化指标，葡萄糖耐受检测，血清肝功的检测，肝脏脂质水平的检测，以及肝脏组织病理学的观测等。
本发明采用高脂高热量饲料(HFD)喂养，建立小鼠NAFLD模型，这种模型能展现出典型的NAFLD损害，并伴有肥胖，血脂异常和胰岛素抵抗等典型特征，不仅为研究其发病机制提供了方便，还能控制条件排除各种干扰，免除对人体的伤害，以提高复制成功率和缩短病程。
附图说明
图1模型组和对照组小鼠体重变化曲线图，(Con：对照组；Mod：模型组)；
图2模型组和对照组小鼠造模10周后葡萄糖耐受实验曲线图，(Con：对照组；Mod：模型组)；
图3模型组小鼠肝脏病理切片图(A:H.E.染色；B:油红O染色)；
图4对照组小鼠肝脏病理切片图(a:H.E.染色；b:油红O染色)。
具体实施方式
实施例1本发明动物模型的制备。
1、实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重(22±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2011-0011】。
2、实验动物均饲养于本部屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12小时昼夜交替。
3、实验动物经适应性喂养1周后，在分组上模型组与对照组均采取正态分布分组方法，即以小鼠体重为依据，将小鼠划分为高、中、低三个体重区间，将每个区间随机分配到模型组和对照组中，模型组和对照组，每组8只，模型组喂食高脂饲料，对照组喂食对照饲料，在饲养方法上采取单只单笼饲养措施，饲料定量定投，早晚各一次，维持20g/笼，保证较小的组内差异，2-3天换垫料，给笼具消毒。垫料为刨花木屑，里面含有小木块(利于小鼠磨牙)，要求高压灭菌，动物饲料为对照饲料(MD12031)和高脂饲料(MD12032)均购自江苏美迪森生物医药有限公司。造模10周，期间自由引水，水源为SPF级的灭菌水，每周称量体重一次。
4、小鼠体重变化如图1所示，可见模型组小鼠出现类似人类的肥胖症状。
5、小鼠处死前一天，先禁食6小时，各组每只老鼠以2g/kg腹腔注射葡萄糖后，在0min、30min、60min、90min、120min，定时从尾静脉取血用欧姆龙血糖仪和试纸条测定血糖，绘制药物对血糖影响曲线。如图2所示，模型组小鼠血糖在第30min是达到最高峰，且显著大于对照组小鼠，可以判断模型组出现较大程度的胰岛素耐受境况。
6、各组同一时间全部处死，处死前禁食12小时。4％水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球法取血，过程应避免溶血的发生，全血37℃静置1小时，2000g，离心5min取血清，-80℃保存，用于血清学指标的检测。结果如表1所示。
表1血清生化指标的测定
注：*p<0.05vs control,**p<0.01vs control
7、肝脏脂质的检测，具体方法以一只小鼠为例，分别各取100mg新鲜肝组织根据试剂盒自带裂解液各加1ml进行匀浆，各自匀浆液一部分用来检测甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的含量，另一部分分别测定其蛋白含量，最后必须用每毫克蛋白浓度来校正甘油三酯(TG)和总胆固醇。甘油三酯(组织)酶法测定试剂盒(E1013)和总胆固醇(组织)含量测定试剂盒(E1015)购自北京普利莱基因技术有限公司。结果如表2所示
表2肝脏脂质变化表
注：*p<0.05vs control,**p<0.01vs control
8、肝脏组织病理学的检测，具体方法以一只小鼠为例，取肝脏同一部位，分两份。
8a、肝组织石蜡切片制作方法：肝组织→Bouin’s固定液固定24h→70％酒精溶液脱色3次(可长久保存)→依次经浓度为80％、90％、95％、100％酒精梯度脱水→两次二甲苯脱酒精→三次石蜡透明→包埋→组织块凝固→切片机切片(4μm)。
8b、石蜡切片进行常规H.E.染色。切片经常规脱蜡至水(依次经过如下溶液：二甲苯×2，无水乙醇×2，95％乙醇×2，90％乙醇，80％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，30％乙醇，蒸馏水×2，每组溶液浸泡2min)；苏木素染色15min，盐酸-乙醇分色数秒，弱碱水返蓝数秒，水洗；再经伊红染色5min，流水冲洗5min×2，常规脱水透明(与上述脱蜡步骤反序操作)。中性树胶封片，干燥过夜后，显微镜下观察并记录。
8c、肝组织冰冻切片制作方法：肝组织→4％多聚甲醛固定液固定24h→依次经10％、20％、30％蔗糖溶液(4％多聚甲醛溶液配)沉底脱水→O.C.T.包埋→液氮速冻→脱模→调节低温恒冷切片机仓内温度至-22℃→切片(10μm)。
8d、冰冻切片油红O染色方法：冰冻切片于4℃PBS溶液中固定30min，复性平衡。60％异丙醇媒浸2min，油红染液60℃染色20min，70％乙醇分色数秒，PBS漂洗3次，苏木精复染细胞核，甘油明胶封片，干燥过夜后，显微镜下观察并记录。
H.E染色显示，对照组肝组织形态完整，结构清晰，质核饱满(图4a)；模型组肝组织形态全无，脂肪严重变性，脂滴大泡和小泡交错，细胞核被挤到边缘(图3a)。油红O显示，对照组脉管周围有少量脂质浸润(图4b)，这或许与对照饲料含有10％脂肪含量有关；模型组视野被大片的红色占据，有大量脂质囤积，脂滴大而密(图3b)验证了H.E的结果。
综上所述，利用C57BL/6小鼠经高脂诱导成功建立了伴有肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗特征的非酒精性脂肪肝病动物模型。为研究NAFLD发病机理和治疗提供了一个稳定可靠的动物模型。
Claims (1)
1.一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法，其特征在于，建立模型的步骤为：
1)、选取鼠种：SPF级雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重22±2g，饲养于本部屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12小时昼夜交替，适应性喂养1周；
2)、分组与造模：适应性喂养1周后，在分组上模型组与对照组均采取正态分布分组方法，即以小鼠体重为依据，将小鼠划分为高、中、低三个体重区间，将每个区间随机分配到模型组和对照组中，模型组和对照组，每组8只，模型组喂食高脂饲料，对照组喂食对照饲料，在饲养方法上采取单只单笼饲养措施，饲料定量定投，早晚各一次，维持20g/笼，保证较小的组内差异，2-3天换垫料，给笼具消毒，垫料为刨花木屑，里面含有小木块，要求高压灭菌，造模10周，期间自由引水，水源为SPF级的灭菌水，每周称量体重一次；
3)、确定小鼠状况：小鼠处死前一天，先禁食6小时，各组每只老鼠以2g/kg腹腔注射葡萄糖后，在0min、30min、60min、90min、120min，定时从尾静脉取血测定血糖，绘制药物对血糖影响曲线，模型组小鼠血糖在第30min是达到最高峰，且显著大于对照组小鼠，可以判断模型组出现较大程度的胰岛素耐受境况；
4)、采血与检测：各组同一时间全部处死，处死前禁食12小时，4％水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球法取血，过程应避免溶血的发生，全血37℃静置1小时，2000g，离心5min取血清，-80℃保存，用于血清学指标的检测；
5)、肝脏脂质的检测：各组以一只小鼠为例，分别各取100mg新鲜肝组织根据试剂盒自带裂解液各加1ml进行匀浆，各自匀浆液一部分用来检测甘油三酯TG和总胆固醇TC的含量，另一部分分别测定其蛋白含量，最后必须用每毫克蛋白浓度来校正甘油三酯TG和总胆固醇TC；
6)、肝脏组织病理学的检测：各组以一只小鼠为例，取肝脏同一部位，分两份，一份进行石蜡切片，并对其进行H.E.染色，另一份进行冰冻切片，并对其进行油红O染色；
7)、对步骤3)—步骤6)进行分析，确定利用C57BL/6小鼠经高脂诱导成功建立了伴有肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗特征的非酒精性脂肪肝病动物模型。
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