CN107197823A - 一种非酒精性脂肪肝的大鼠模型建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由高脂高糖饮食致大鼠肥胖诱导非酒精性脂肪肝的模型建立方法,属于医学肝脏疾病研究领域。本发明利用高脂高糖饮食致大鼠肥胖来诱导非酒精性脂肪肝的形成,然后通过肝脏B超测定,体重、肝功、血脂代谢等方法检测。本发明建立的大鼠肝脏非酒精性脂肪肝的模型建立操作简单,模拟人群非酒精性脂肪的形成。该非酒精性脂肪肝模型的建立为深入研究非酒精性脂肪肝发病机制,各种治疗药物的初步筛选等提供了一个可靠的动物模型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地说,涉及一种由高脂高糖饮食致大鼠肥胖诱导非酒精性脂肪肝的模型建立方法。
背景技术
非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是排除酒精和其他明确因素造成的肝损伤,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要特征的临床病理综合征[1]。目前NAFLD人群患病率为10.3%,发达国家则超过30%,肥胖人群患病率达到75%,随生活方式的改变患病率还在上升,肥胖程度越高,患NAFLD的可能性越大,全世界目前估计约有10亿人患不同形式的脂肪肝,据研究报道,NAFLD的发病原因除了与肥胖、2型糖尿病、胰岛素抵抗、药物所致的肝损伤有关,高脂高糖饮食等不良饮食习惯等因素也越来越受到重视。
发明内容
为了研究和学习非酒精性脂肪肝的病理特征,制备其大鼠模型,本发明提供了一种由高脂高糖饮食致大鼠肥胖诱导非酒精性脂肪肝的模型建立方法,包括以下步骤:
步骤1:SPF级SD大鼠40只,雌雄各半,体重150g±10g,购买第三军医大学医学实验动物中心(合格证号:(SCXK(渝)2012-0005))。适应性饲养一周后随机分为两组,分别为高脂高糖饲料造模组(造模组)、普通饲料对照组(对照组)。
步骤2:按照配方进行制备高脂高糖饲料和普通饲料。对造模组给予高脂高糖饲料饲养,对照组给予普通饲料饲养。每日按8g/100g干饲料投放饲料,自由摄食、饮水。普通组饲料:63.02%碳水化合物,24.93%蛋白质,12.05%脂肪;高脂高糖组饲料:66.14%碳水化合物,10.33%蛋白质,23.53%脂肪;饮水为Spring纯水系统所制去离子水。
步骤3:每日早八点对大鼠以5ml/kg进行空腹灌胃玉米油。玉米油为山东鲁花牌非转基因物理压榨玉米油。
步骤:4:饲养至第10周每组随机抽取4只大鼠进行肝脏B超测定是否有脂肪肝形成。动物房备皮后送至遵义市第一人民医院行彩色超声检查,检查由主治医师进行并报告结果。结果包括有无脂肪肝及肝斜径,肝斜径测量方法如下:参考《超声医学》第六版,2014,388。实验大鼠10%水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉后取仰卧位,以肝右静脉和肝中静脉汇入下腔静脉的右肋缘下肝脏测量肝脏右叶为标准测量切面测量。测量位置为:测量点分别置于肝右叶前、后缘之肝包膜处,测量其最大垂直距离即为肝斜径。
步骤5:饲养大鼠至90天时、隔夜空腹称重后麻醉剖杀取材,取腹主动脉全血静置两小时后离心全自动血生化分析,取肝脏于10%的多聚甲醛中固定,以石蜡包埋,连续切片,HE染色镜下观察肝脏组织病理学改变。
本发明实验为一种由高脂高糖饮食致大鼠肥胖诱导非酒精性脂肪肝的模型的建立。在饲养大鼠的过程以5ml/kg体重进行玉米油灌胃,模拟人群高脂高糖不良饮食习惯的生活方式、诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立,与人群非酒精性脂肪肝的的发生、发展较为接近。且实验动物非酒精性脂肪肝相关症状和机体内环境改变也与人类相似,动物模型稳定性较好,更有助于非酒精性脂肪肝的机制及药物治疗研究。实验对象选择SD大鼠,种属纯正,是动物实验中最为常见的大鼠类别,该动物模型可向外界提供一定的参考。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本发明的一部分,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明高脂高糖饮食与玉米油灌胃致非酒精性脂肪肝大鼠体重变化趋势图;
图2是本发明高脂高糖饮食与玉米油灌胃致大鼠非酒精性脂肪肝肝脏B超图;
图3是本发明高脂高糖饮食与玉米油灌胃致大鼠非酒精性脂肪肝肝脏视觉检查照片;
图4是本发明高脂高糖饮食与玉米油灌胃致非酒精性脂肪肝大鼠肝HE染色镜下病理学检测。
具体实施方式
本发明提供了一种由高脂高糖饮食致大鼠肥胖诱导非酒精性脂肪肝的模型建立方法,包括以下步骤:
步骤1:SPF级SD大鼠40只,雌雄各半,体重150g±10g,购买第三军医大学医学实验动物中心(合格证号:(SCXK(渝)2012-0005))。适应性饲养一周后随机分为两组,分别为高脂高糖饲料造模组(造模组)、普通饲料对照组(对照组)。
步骤2:按照配方进行制备高脂高糖饲料和普通饲料。对造模组给予高脂高糖饲料饲养,对照组给予普通饲料饲养。每日按8g/100g干饲料投放饲料,自由摄食、饮水。普通组饲料:63.02%碳水化合物,24.93%蛋白质,12.05%脂肪;高脂高糖组饲料:66.14%碳水化合物,10.33%蛋白质,23.53%脂肪;饮水为Spring纯水系统所制去离子水。
步骤3:每日早八点对大鼠以5ml/kg进行空腹灌胃玉米油。玉米油为山东鲁花牌非转基因物理压榨玉米油。
步骤:4:饲养至第10周每组随机抽取4只大鼠进行肝脏B超测定是否有脂肪肝形成。动物房备皮后送至遵义市第一人民医院行彩色超声检查,检查由主治医师进行并报告结果。结果包括有无脂肪肝及肝斜径,肝斜径测量方法如下:参考《超声医学》第六版,2014,388。实验大鼠10%水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉后取仰卧位,以肝右静脉和肝中静脉汇入下腔静脉的右肋缘下肝脏测量肝脏右叶为标准测量切面测量。测量位置为:测量点分别置于肝右叶前、后缘之肝包膜处,测量其最大垂直距离即为肝斜径。
步骤5:饲养大鼠至90天时、隔夜空腹称重后麻醉剖杀取材,取腹主动脉全血静置两小时后离心全自动血生化分析,取肝脏于10%的多聚甲醛中固定,以石蜡包埋,连续切片,HE染色镜下观察肝脏组织病理学改变。
本发明中,诱导大鼠单纯高脂高糖饮食2型糖尿病模型详述如下:
(1)B超检测 大鼠灌胃至第10周每组随机抽取4只大鼠,动物房备皮后送至遵义市第一人民医院行彩色超声检查,检查由主治医师进行并报告结果。结果包括有无脂肪肝及肝斜径,肝斜径测量方法如下:参考《超声医学》第六版,2014,388。实验大鼠10%水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉后取仰卧位,以肝右静脉和肝中静脉汇入下腔静脉的右肋缘下肝脏测量肝脏右叶为标准测量切面测量。测量位置为:测量点分别置于肝右叶前、后缘之肝包膜处,测量其最大垂直距离即为肝斜径。
(2)肝脏视觉检查 剖杀大鼠时,开腹后行肉眼观察肝脏大体形态、大小,颜色,食指、中指并拢,以指腹触摸感受肝脏质地,取血后取肝脏触摸肝脏切面。与对照组比较,普通饮食组低、中剂量组肝脏大小无肉眼可见区别,肝脏呈深红色,质软,肝韧带附近无明显脂肪组织,高剂量则呈现出轻度包膜紧张,切面轻微油腻感。
(3)肝脏指数 灌胃饲养90天后隔夜空腹称重后麻醉大取完整肝脏于生理盐水中洗净,用滤纸擦干称重并计算肝体指数。肝脏系数=肝湿重/末次体重×100% 。
(4)肝功变化 取腹主动脉全血静置两小时离心取上清液于遵义医学院附属医院检验科全自动生化分析仪做肝功能检测。
(5)肝脏组织病理学改变取肝脏组织于10%多聚甲醛中固定、石蜡包埋、连续石蜡切片,苏木精染色并用中性树脂封片在在光镜下观察肝脏组织病理学改变。
非酒精性脂肪肝模型建造成功的标准:
实验性啮齿类大、小鼠非酒精性脂肪肝模型建立成功的金标准为肝脏细肝脏细胞有脂肪泡大面积的脂肪样变性。
统计学方法 数据录入SPSS18.0进行统计分析,结果描述以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,有差异再用SNK法进行两两比较,检验水准α=0.05,p<0.05表示差异有统计学意义。
结果分析
(1)体重:在1周、4周、8周、12周、13周体重均无统计学差异,但随着时间变化造模组体重均大于对照组的趋势,及高脂高糖组体重与普通饲料组体重差值增大。如图1所示。
(2)B超结果 本发明B超超声结果显示,对照组没有发现明显的强回声区域,提示没有脂肪肝形成。造模组发现有明显的回声区域,提示有脂肪肝形成,如图2所示。
(3)肝脏视觉检查 剖杀大鼠时,开腹后肉眼观察肝脏大体形态、大小,颜色,食指与中指并拢以指腹触摸感受肝脏质地,取血后取肝脏触摸肝脏切面。与对照组比较,普通饮食组低、中剂量组肝脏大小无肉眼可见区别,肝脏呈深红色,质软,肝韧带附近无明显脂肪组织,高剂量则呈现出轻度包膜紧张,切面轻微油腻感,如图3所示。
(4)肝脏指数 造模组肝体指数稍大于对照组。却无统计学差异。
(5)肝功变化 区腹主动脉全血静置两小时离心取上清液于遵义医学院附属医院检验科全自动生化分析仪做肝功能检测。见表1所示。
表1是本发明高脂高糖饮食致大鼠肥胖诱导大鼠非酒精性脂肪肝肝功生化检测:
表1 肝功生化检测
(6)肝脏组织病理学改变 肝脏组织HE染色镜下观察组织病理学改变时发现,对照组对照组汇管区无明显炎性细胞浸润,细胞间极少量充血,未发现明显的脂肪病变,而造模组可发现明显大泡性脂肪变肝细胞逐渐增多,如图4所示。
应当指出,综上所述仅是本发明的优选实验方法,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本实验原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种非酒精性脂肪肝的大鼠模型建立方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:购买SPF级SD大鼠40只,适应性饲养一周后随机分为两组,分别为高脂高糖的造模组、普通的对照组;
步骤2:按照配方进行制备高脂高糖饲料和普通饲料,对造模组给予高脂高糖饲料饲养,对照组给予普通饲料饲养;每日按 饲料/体重=8g/100g 投放饲料,自由摄食、饮水;
步骤3:每7天定时对大鼠体重进行空腹监测;
步骤4:每日早8点对大鼠按体重每kg进行空腹灌胃玉米油5ml;
步骤5:饲养到第10周对每组随机抽取4只大鼠进行肝脏B超检测是否有脂肪肝形成;
步骤6:饲养大鼠至第90天,隔夜禁食麻醉后剖杀,取肝脏进行HE染色镜下检验造模是否成功。
2.根据权利要求1所述大鼠模型建立方法,其特征在于,所述步骤2中饲料配方为:
普通组饲料:63.02%碳水化合物,24.93%蛋白质,12.05%脂肪;
高脂高糖组饲料:66.14%碳水化合物,10.33%蛋白质,23.53%脂肪。
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