CN110199952A - 一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法及其应用。该动物模型构建方法包括以下步骤:选用雌性成年大鼠；饲以高脂高蛋白高糖饲料；进行被迫负重游泳，自饲以高脂高蛋白饲料的第8天起持续21天，每天被迫负重游泳3min；在进行被迫负重游泳的同时，灌服冰水21天；之后单纯给予足量高脂高蛋白高糖饲料，经过总60天造模后，如果体重、体长及Lee氏指数与正常对照比较差异显著，则造模完成。本发明解决了目前没有用于女性肥胖研究的病症动物模型和评价肥胖模型证型的不足，为规范、标准、科学地评价减肥减脂中医药研究提供了一种新的模型。具有造模方法简单、易于操作和推广、贴近临床等特点。

Description

一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法及其应用。

背景技术

中医认为七情内伤使人体中脾、胃、肝等功能失调，不能把多余的脂肪转化为热量排泄，而沉积于体内造成肥胖。具体而言水液在体内代谢过程中正常与否，与肥胖存着密切关系。脾主运化，胃主受纳，后天饮食不节，损伤脾胃，正如《素问释义》曰:“食肥则气滞而不达，故内热；食甘则中气缓而善留，故中满”。故脾气不足或运化功能失常，是产生肥胖的关键。肝为“将军之官”，主疏泄，调畅气机。《血证论》中有云:“木之性主于疏泄，食气入胃，全赖肝木之气以疏泄之，而水谷乃化；设肝之清阳不升，则不能疏泄水谷，渗泄中满之证在所不免。”情志失调，肝气郁滞，导致机体气机不畅，也是产生肥胖的一个重要因素。

脾虚湿阻、脾肾两虚、胃热湿阻、肝郁气滞、阴虚内热是单纯性肥胖临床常见证型。

为进一步深入探讨肥胖的本质及探寻其有效治疗中药,很有必要进行单纯肥胖的动物模型复制的硏究。理想的证型动物模型复制方法要求简单、客观、稳定性及重复性好，病因、表现、疗效等符合中医理论的指导。模型复制时需考虑动物的生物学特性，尽量选择与人生理、代谢、疾病特点相似，符合试验目的的动物。由于动物症状、体征采集的复杂性，故理性的动物模型不仅要求在症状体征上与人相近或相同，更希望用量化的客观指标来准确评价。

目前，还未见有用于女性肥胖研究的病症动物模型的报道。仅见有学者采用单纯高脂饮食和力竭游泳造肥胖动物模型的报道，其方法是采用高脂饮食，力竭游泳等方法损伤脾胃，制造内湿，使动物出现纳呆少饮、体重下降、稀便等表现，此类模型还存在以下明显不足之处：第一，模型制造方法的可重复性及稳定性差，缺乏统一的造模标准，不可控制因素太多，客观性和标准性差。第二，脾虚的形成是一个长期、慢性的过程,如此短的时间不能形成脾虚证型，可能也只能是一种短期的状态，易于自然恢复，与中医证型有很大的差距。第三，中医认为机体出现困倦乏力、精神萎靡等症状即可为湿，故湿在实验大鼠上往往不易判断。上述脾虚湿阻模型主要以体重、血脂指标等一般状况作为评价指标，不具特异性，难以客观化。第四，与临床有差距。比如，单纯制造高血脂，力竭的游泳,模拟出肥胖的特点，但临床上单纯高脂饮食、脾虚和劳倦内伤的情况较少见，而可能有多种因素和体质情况的原因，故本发明采用复合因素造模。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对以上现有技术的不足,本发明提供了一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法及其应用，设计了在普通全价营养饲料基础上改良的高脂高蛋白高糖饲料，发明了用6周龄雌性大鼠在高脂高蛋白高糖饲料加被迫负重游泳和灌服冰水的方法诱导60天，模拟中医饮食失节、情志失调、劳倦内伤，建立了一种用于女性肥胖病症研究的动物模型，并从三个维度进行中医证型的评价。结果表明该方法可成功复制用于女性肥胖研究的病症动物模型，而且该复制方法稳定性、重复性好，简单、客观，符合中医证型理论的指导。

本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。

首先，本发明公开了一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法。

该大鼠模型建立方法包括以下步骤:(1)选用雌性成年大鼠；(2)饲以高脂高蛋白高糖饲料，保持自由进食与自由饮水；(3)进行被迫负重游泳：自饲以高脂高蛋白饲料的第8天起持续21天，每天被迫负重游泳3min；(4)在进行被迫负重游泳的同时，灌服冰水21天；(5)负重游泳结束后给予足量高脂高蛋白高糖饲料至60天，完成模型构建。此时如果大鼠的体重、体长及Lee氏指数与正常对照比较差异显著，则可用于女性肥胖研究，造模完成。

进一步地，步骤(1)所述的大鼠，选用SPF级、6周龄、体重180±20g的SD雌性大鼠。

进一步地，步骤(2)所述的高脂高蛋白高糖饲料，以普通全价营养饲料为基础，添加黄油、胆固醇、绵砂糖，并加大鱼粉配比含量配制得到。

更进一步地，所述的普通全价营养饲料，以质量份数计，采用配方为：氯化胆碱0.1-0.3份、玉米20-30份、小麦30-40份、蜜糖酵母2-3份、磷酸氢钙1.5-2.5份、石粉0.8-1.2份、生长预混料1份、食盐0.2-0.4份、油2-3份、豆粕15-25份、鱼粉5份、酪蛋白8-12份。

更进一步地，所述的高脂高蛋白高糖饲料，以质量份数计，具体配方为：氯化胆碱0.1-0.3份、玉米20-30份、小麦30-40份、蜜糖酵母2-3份、磷酸氢钙1.5-2.5份、石粉0.8-1.2份、生长预混料1份、食盐0.2-0.4份、油2-3份、鱼粉20份、酪蛋白8-12份，另添加黄油12-18份、胆固醇0.8-1.2份、猪胆盐0.8-1.2份、绵砂糖12-18份。

更优选地，所述的高脂高蛋白高糖饲料，以质量份数计为：氯化胆碱0.2份、玉米25份、小麦35.5份、蜜糖酵母2.5份、磷酸氢钙2份、石粉1份、生长预混料1份、食盐0.3份、油2.5份、鱼粉20份、酪蛋白10份，另添加黄油15份、胆固醇1份、猪胆盐0.1份、绵砂糖15份。

进一步地，步骤(3)所述的被迫负重游泳，具体方法为：每日上午大鼠尾部以10％体重负重保险丝，放于筒壁光滑的圆桶中游泳，水温20±2℃，水深50-70cm，使大鼠不能触及圆筒底部,每天游泳时间统一为3min。

其次，本发明公开了由上述动物模型构建方法所得肥胖病症大鼠模型的一种应用。

该肥胖病症大鼠模型用于女性肥胖病症模型研究和/或减肥减脂中药的研究。

进一步地，所述的女性肥胖病症模型研究，以肥胖病症大鼠模型的三维度评价方法，对用于女性肥胖病症研究的肥胖病症大鼠模型进行证型区分；所述的三维度评价方法为：第一维度为根据人的病症四诊表现寻找大鼠一般状况指标对模型鼠进行评价，第二维度为水盐负荷试验，第三维度为血液学指标。

更进一步地，第一维度所述的对模型鼠进行评价，具体为：

(1)精神行为分为0-3级：活动迅速、眼光有神为0级；轻度异常(怠动、自发活动减少)为1级；中度异常(精神倦怠)为2级，明显异常(腹卧、攻击行为明显减少)为3级；

(2)眼睛分为0-3级：红亮有神为0级，淡红为1级，深红为2级，暗红为3级；

(3)毛色分为0-3级：白色、均匀细密、柔顺为0级，白中稍有黄色、稍乱、稍干燥为1级，白中伴大部分黄色、乱、干燥为2级，满目皆有黄色、毛枯躁为3级；

(4)粪便分为0-3级：成形、粪质柔软为0级，轻度异常(粪便稀溏、少部分不成形)为1级，中度异常(粪便稀溏、部分不成形)为2级，明显异常(粪便稀溏、完全不成形)为3级。

更进一步地，第二维度所述的水盐负荷试验，具体为：实验前12h，大鼠禁食，称量体质量，腹腔注射10％体质量的0.9％NaCl，于注射后0、1、2、4、6h时分别称量体质量，并于6h测量尿量；实验过程中禁食禁水；结果以水负荷指数表示，运用Origin 8.0软件进行计算，得出6h水负荷曲线下面积。

更进一步地，第三维度所述的血液学指标，包括肝、肾功能和血脂指标，具体为：碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、岩藻糖苷酶(AFU)、腺苷脱氨酶(ADA)、超敏C反应蛋白(hCRP)、TNF-а、IL-6、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、载脂蛋白A(APOA-1)、载脂蛋白B(APOB)、脂蛋白a(LPa)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、葡萄糖(Glu)、空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2h PG)、糖化血红蛋白(Hb A1C)。

更进一步地，所述的证型区分，根据三维度指标进行统计学分析，确定肥胖模型的证型特点。

再更进一步地，所述的证型特点为：脾虚湿阻的症候模型、而尿素肌酐结果阳性显示为脾肾两虚的症候模型、而TNF-а阳性则为胃热湿阻的症候模型、而ALT(谷丙转氨酶)，AST(谷草转氨酶),总蛋白(TP),白蛋白(ALB)为肝郁气滞证候模型、空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2h PG)、糖化血红蛋白(Hb A1C)、血脂总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)为阴虚内热证候模型。

有益效果：

(1)本发明解决了目前没有用于女性肥胖研究的病症结合动物模型和区分评价肥胖模型证型的不足，为规范、标准、科学地评价减肥减脂中医药研究提供了一种新的模型。具有造模方法简单、易于操作和推广、贴近临床等特点。

(2)本发明设计了在普通全价营养饲料基础上改良的高脂高蛋白高糖饲料，发明了高脂高蛋白高糖饲料加被迫负重游泳和灌服冰水的复合因素造模方法模拟中医饮食失节、情志失调、劳倦内伤，用6周龄雌性大鼠诱导60天，建立了一种用于女性肥胖研究的肥胖病症大鼠模型，并从三个维度进行中医证型的评价。结果表明该方法可成功复制用于女性肥胖研究的肥胖病症大鼠模型，而且该复制方法稳定性、重复性好，简单、客观，符合中医证型理论的指导。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1：用于女性肥胖研究的肥胖病症大鼠模型的构建

(1)实验动物：SPF级雌性SD大鼠100只,6周龄，体重180±20g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证编号：SCXK(湘)2016-0002。动物饲养条件：按昼夜节律自然照明，于SPF级实验动物屏障系统饲养，实验动物使用许可证编号为SCXK(赣)2017-0004。实验室温度23±2℃，相对湿度53±3％。动物自由饮水、进食，适应性饲养三天后进行试验。

(2)饲料：

正常基础维持饲料(全价营养饲料)成分为：氯化胆碱0.2％、玉米30％、小麦25.5％、蜜糖酵母2.5％、磷酸氢钙2％、石粉1％、生长预混料1％、食盐0.3％、油2.5％、鱼粉5％、豆粕20％、酪蛋白10％；

高脂高蛋白高糖饲料：以上述基础维持饲料为基础，新添加黄油、胆固醇和绵砂糖，并加大酪蛋白和鱼粉含量，而配制得到。以质量份数计，具体为：氯化胆碱0.2份、玉米25份、小麦35.5份、蜜糖酵母2.5份、磷酸氢钙2份、石粉1份、生长预混料1份、食盐0.3份、油2.5份、鱼粉20份、酪蛋白10份，另添加黄油15份、胆固醇1份、猪胆盐0.1份、绵砂糖15份。

(3)仪器：全自动生化仪(贝克曼AU480)、酶标仪(Thermo)、显微镜(IX37生物显微镜)、电子天平(AUY120岛津分析天平)。

(4)含量检测试剂盒：大鼠血脂TG、TC、LDL、HDL、ALP、TBA、AFU、ADA、hCRP、APOA-1、APOB、LPa、UREA、CREA、UA、ALT、AST、TP、ALB、GLOB、Glu、FPG、2h PG、Hb A1C含量检测试剂盒(上海科华生物技术有限公司提供)、大鼠血液IL-6、TNF-α含量检测试剂盒(上海赫湃生物科技有限公司提供)。

(5)动物分组及模型建立：动物随机分为2组,其中1组10只为正常对照，另一组90只为造模组,5只一笼,试验过程中给予正常饮水,不限制进食量。造模时间为60天。具体为：

对照组:雌性SD大鼠10只,正常成分饲料喂养。

游泳+高脂高蛋白高糖饮食+冰水组:雌性SD大鼠90只,给予特定的高脂高蛋白高糖饲料，自由进食、饮水,实验造模开始第二周起每日上午尾部以10％体重被迫负重游泳3min，同时给予冰水灌胃，持续21天。被迫负重游泳具体方法为：每日上午大鼠尾部以10％体重负重保险丝，放于高80cm、直径20cm的光滑筒壁的圆桶中游泳，水温20±2℃，水深60cm，使大鼠不能触及圆筒底部,每天游泳时间统一为3min。之后仅给予足量高脂高蛋白高糖饮食，造模总时间为60天,试验开始后次日即进行一般状况指标的观察,第61天开始检测各项指标。

(6)体重、体长资料的获取：每10d用电子天平称量大鼠体重。第61天量取体长尾长资料。

(7)一般状况观察：每天仔细观察大鼠的神态、毛发洁净度、皮毛光泽、爪色等情况。

(8)肥胖模型的建立的判断：60天造模后根据体重、体长及Lee'指数判断肥胖模型成立与否。如果体重、体长及Lee氏指数与正常对照比较差异显著，则可用于女性肥胖研究的肥胖病症大鼠模型，造模完成。

实施例2：肥胖模型的三维证型区分

(1)根据以下指标，对实施例1所建立的女性肥胖研究的肥胖病症大鼠模型，从肥胖病症大鼠模型的三维度评价与统计学分析，对用于女性肥胖研究进行证型区分。其中第一维度为根据人的病症四诊表现寻找大鼠一般状况指标对模型鼠进行评价；第二维度为水盐负荷试验；第三维度为血液学指标。

第一维度对模型鼠进行评价，具体为：

精神行为分为0-3级：活动迅速、眼光有神为0级；轻度异常(怠动、自发活动减少)为1级；中度异常(精神倦怠)为2级，明显异常(腹卧、攻击行为明显减少)为3级；

眼睛分为0-3级：红亮有神为0级，淡红为1级，深红为2级，暗红为3级；

毛色分为0-3级：白色、均匀细密、柔顺为0级，白中稍有黄色、稍乱、稍干燥为1级，白中伴大部分黄色、乱、干燥为2级，满目皆有黄色、毛枯躁为3级；

粪便分为0-3级：成形、粪质柔软为0级，轻度异常(粪便稀溏、少部分不成形)为1级，中度异常(粪便稀溏、部分不成形)为2级，明显异常(粪便稀溏、完全不成形)为3级。

第二维度为水盐负荷试验，具体为：实验前12h，大鼠禁食，称量体质量，腹腔注射10％体质量的0.9％NaCl，于注射后0、1、2、4、6h时分别称量体质量，并于6h测量尿量；实验过程中禁食禁水；结果以水负荷指数表，运用Origin 8.0软件进行计算，得出6h水负荷曲线下面积。

第三维度为血液学指标，包括肝、肾功能和血脂指标，具体为：碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、岩藻糖苷酶(AFU)、腺苷脱氨酶(ADA)、超敏C反应蛋白(hCRP)、TNF-а、IL-6、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、载脂蛋白A(APOA-1)、载脂蛋白B(APOB)、脂蛋白a(LPa)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、葡萄糖(Glu)、空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2h PG)、糖化血红蛋白(Hb A1C)。

对以上指标进行统计学分析,可以确定肥胖模型的证型特点。

(2)统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件处理，各组指标数据均以x±s表示，数据用计量资料先进行正态检验，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料先转换成正态分布再用单因素方差分析。进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

(3)一般情况观察和肥胖模型的判断

实验过程中，正常组大鼠未见明显异常；模型组所有雌性大鼠出现活动减少，腹部肥大，毛色发黄，大便含水增多、软等症状，根据体重、血脂水平及Lee'指数判断肥胖模型建成，结果见表1。

表1复合因素导致雌性大鼠肥胖的体重、lee'指数和血脂水平

(4)模型鼠的一般状况得分

根据大鼠的证候表征神态，在模型组区分为四个型M1、M2、M3、M4，结果见表2。

表2复合因素雌性大鼠肥胖模型鼠的证候积分(x±s)

(5)模型组的肝功能变化

我们检测了模型鼠的肝功能变化，发现有24只模型鼠在ALT、AST、ALP和ADA水平与其他模型鼠要增高更多，结果见表3。

表3复合因素雌性大鼠肥胖模型鼠肝功能指标的变化

(6)模型组的肾功能变化检测了模型组所有雌性大鼠的肾功能指标，结果见表4。

表4复合因素雌性大鼠肥胖模型鼠肾功能指标的变化

组别	数量	UA	CRE	BUN
					C	9	75.44±9.23	34.78±4.57	10.56±1.21
M1	24	67.07±5.38	29.83±3.65	9.01±1.14
					M2	10	91.02±7.64	51.53±3.05	15.01±1.52
M3	25	65.33±6.16	35.74±3.12	11.01±1.01
					M4	31	73.12±6.39	30.62±3.25	10.65±1.03

(7)模型组的血糖及炎症因子的变化

我们检测了血清中的血糖水平和肿瘤坏死因子与白介素-6水平，发现有66只中有25只血糖水平和炎症因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素6水平高于M2,结果见表5。

表5复合因素雌性大鼠肥胖模型鼠血糖和炎性因子指标的变化

实验分组	数量	血糖	肿瘤坏死因子-α	白细胞介素6
					C	9	5.63±0.74	126.34±5.81	217.51±9.41
M1	24	7.03±1.12	192.07±4.65	285.31±7.42
					M2	10	6.61±0.72	121.11±5.51	210.43±8.65
M3	25	9.93±0.83	259.07±8.12	361.24±12.13
					M4	31	8.12±0.92	203.05±5.27	287.07±6.53

(8)模型组水盐负荷后6h体重与尿量

组别	数量	6h水负荷曲线下面积	6h尿量
				C	9	68.46±11.89	6.20±1.26
M1	24	187.58±32.16	2.83±1.65
				M2	10	177.43±27.54	2.67±1.59
M3	25	183.45±29.13	3.13±1.32
				M4	31	179.38±31.26	2.45±1.15

本肥胖模型进行三维指标可以区分不同的症候，水盐负荷阳性结果显示90只模型均具有不同程度的脾虚湿阻的症候模型特点，而ALT(谷丙转氨酶)，AST(谷草转氨酶)，总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)为肝郁气滞证候模型(M1)，而尿素肌酐结果阳性显示为脾肾两虚的症候模型(M2)、而空腹血糖(FPG)升高合并TNF-а,白细胞介素6升高则为胃热湿阻的症候模型(M3)、空腹血糖(FPG)略有升高、低密度脂蛋白(LDL-C)为阴虚内热证候模型(M4)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。

Claims (10)

1.一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤:

(1)选用雌性成年大鼠；

(2)饲以高脂高蛋白高糖饲料，保持自由进食与自由饮水；

(3)进行被迫负重游泳：自饲以高脂高蛋白饲料的第8天起持续21天，每天被迫负重游泳3min；

(4)在进行被迫负重游泳的同时，灌服冰水21天；

(5)负重游泳结束后给予足量高脂高蛋白高糖饲料至60天，完成模型构建。

2.根据权利要求1所述的一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法，其特征在于：步骤(1)所述的大鼠，选用SPF级、6周龄、体重180±20g的SD雌性大鼠。

3.根据权利要求1所述的一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法，其特征在于：步骤(2)所述的高脂高蛋白高糖饲料，以普通全价营养饲料为基础，添加黄油、胆固醇、绵砂糖，并加大鱼粉配比含量配制得到。

4.根据权利要求3所述的一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法，其特征在于：所述的普通全价营养饲料，以质量份数计，采用配方为：氯化胆碱0.1-0.3份、玉米20-30份、小麦30-40份、蜜糖酵母2-3份、磷酸氢钙1.5-2.5份、石粉0.8-1.2份、生长预混料1份、食盐0.2-0.4份、油2-3份、豆粕15-25份、鱼粉5份、酪蛋白8-12份。

5.根据权利要求3所述的一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法，其特征在于：所述的高脂高蛋白高糖饲料，以质量份数计，具体配方为：氯化胆碱0.1-0.3份、玉米20-30份、小麦30-40份、蜜糖酵母2-3份、磷酸氢钙1.5-2.5份、石粉0.8-1.2份、生长预混料1份、食盐0.2-0.4份、油2-3份、鱼粉20份、酪蛋白8-12份，另添加黄油12-18份、胆固醇0.8-1.2份、猪胆盐0.8-1.2份、绵砂糖12-18份。

6.根据权利要求1所述的一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的被迫负重游泳，具体方法为：每日上午大鼠尾部以10％体重负重保险丝，放于筒壁光滑的圆桶中游泳，水温20±2℃，水深50-70cm，使大鼠不能触及圆筒底部,每天游泳时间统一为3min。

7.一种如权利要求1所述的动物模型构建方法、所得肥胖病症大鼠模型的应用，其特征在于：用于女性肥胖病症模型研究和/或减肥减脂中药的研究。

8.根据权利要求7所述的一种肥胖病症大鼠模型的应用，其特征在于，所述的女性肥胖病症模型研究，以肥胖病症大鼠模型的三维度评价方法，对用于女性肥胖病症研究的肥胖病症大鼠模型进行证型区分。

9.根据权利要求8所述的一种肥胖病症大鼠模型的应用，其特征在于，所述的三维度评价方法：第一维度为根据人的病症四诊表现寻找大鼠一般状况指标对模型鼠进行评价；第二维度为水盐负荷试验；第三维度为血液学指标，包括肝、肾功能和血脂指标。

10.根据权利要求8所述的一种肥胖病症大鼠模型的应用，其特征在于，所述的证型区分，根据三维度指标进行统计学分析，确定肥胖大鼠模型的证型特点。