CN113826582A - 急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模及评价方法 - Google Patents

急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模及评价方法 Download PDF

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Abstract

发明公开了一种湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的制备方式及其评价方法，包括以下步骤a、选用180±20g健康的雄性SPF级SD大鼠，饲以高脂高蛋白高糖饲料，自由进食，自由饮用200g•l‑1蜂蜜水，猪脂和白酒隔日交替灌胃连续21天，同时置于人工气候箱中8小时/天，持续21天获得湿热证模型；b、取步骤a获得的湿热证大鼠模型，在大鼠右踝关节两侧骨突部位进针，斜向下45°方向插入至胫骨肌腱内侧，向肢体远端方向注射MSU悬浮液制备湿热证急性痛风性关节炎大鼠模型；从三个维度通过检测大鼠指标对湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型进行评价区分，证明该法成功的建立了一种湿热证急性痛风性关节炎大鼠病证结合模型。

Description

急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模及评价方法
技术领域
本发明属于中医领域的关于病症动物模型构建技术领域，具体的说，公开了一种湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模及评价方法。
背景技术
古代医家对GA的病因病机和症状做出了探讨，为后世医学家提供了理论依据。传统医学将GA纳入痹证，《素问·痹论篇》明确指出“风、寒、湿三气”为其外因，认为风寒湿邪滞留经脉乃其病机。《丹溪心法》中指出“彼痛风者，大率因血得热……寒凉外搏，热血得寒，污浊凝涩，所以作痛”。《丹溪心法·痛风附肢节痛》指出“遍身骨节疼痛，状如虎咬，或赤肿灼热，痛有常处，或浑身壮热”，这与GA急性发作症状非常吻合。
古代医家将GA视为“富贵病”“帝王将相病”，现在随着中国经济水平的提高，人们的饮食和生活条件均发生了结构性的改变，因此GA的患病率逐年上升。94版《中医病症诊断疗效标准》根据病因病机将GA症型概括为四型：湿热蕴结型、瘀热阻滞型、痰浊阻滞型、肝肾阴虚型，其中湿热蕴结型的主症为患处卒然红肿热痛、拒按，触之灼热，得热则剧、得凉则舒，兼症伴口渴，舌红，苔黄腻，脉滑数。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模及评价方法。
具体的技术方案为：
一种湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模方法，包括如下步骤：
S1.选用180±20g、6周龄、健康的雄性SPF级SD大鼠，饲以高脂高蛋白高糖饲料，自由进食，自由饮用200g·l-1蜂蜜水，猪脂和白酒隔日交替灌胃连续21天，其中白酒选用40-60°之间，本实施例选用52°红星二锅头，同时置于人工气候箱中8小时/天，所述人工气候箱的温度为32±2℃，相对湿度95％，21天后获得湿热证大鼠模型；
S2.取步骤S1获得的湿热证大鼠模型，在大鼠右踝关节两侧骨突部位进针，斜向下45°方向插入至胫骨肌腱内侧，向肢体远端方向注射MSU悬浮液，制备湿热证急性痛风性关节炎大鼠病证结合模型；
S3.所述步骤S2中的湿热证急性痛风性关节炎大鼠模型造模完成后，右踝关节出现红、肿、热、痛体征，三足跛行步态，红外热成像分析踝关节温度升高，CatWalk XT10.5动物步态分析及炎性因子与正常对照比较差异显著，则湿热证急性痛风性关节炎病证结合模型造模成功。
所述高脂高蛋白高糖饲料的成分为，按重量份表示，氯化胆碱0.2份，玉米25份，小麦35.5份，蜜糖酵母2.5份，磷酸氢钙2份，石粉1份，食盐0.3份，油2.5份，鱼粉20份，酪蛋白10份，另添加黄油15份，胆固醇1份，猪胆盐0.1份，绵砂糖15份。
所述步骤S2中，所述MSU悬浮液的制备方法为：用400ml超纯水加入4.5ml浓度为0.5mol·l-1的NaOH溶液中，煮沸后加入2g尿酸搅拌溶解；待温度降至60℃时用NaOH调PH至8.9，冷却，然后放置4℃冰箱冷藏过夜，盛入蒸发皿中经60℃干燥烘箱干燥，经高温灭菌后得到尿酸钠晶体粉末，用刮勺将其从蒸发皿中刮取下来用碾钵碾碎后用孔径250um的金属网筛过滤，然后用无菌EP管收集；并通过从急性痛风发作患者手足部位取出的痛风石在光学显微镜下与我们制备获取的MSU晶体鉴定是否一致，要最大程度的模拟人体内的痛风石的状态。用万分之一天平称取所需用量，以无菌生理盐水配成浓度为20mg·mL-1MSU混悬液，涡旋振荡，直至混悬液能被6号注射器针头吸取。
所述置于人工气候箱高温高湿环境的具体要求为：每日上午9点至下午5点将大鼠置于温度为32±2℃，相对湿度95％的人工气候箱中，每天统一时间为8小时。
一种湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的评价方法，选用以下指标，从三个维度对建立的湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型进行湿热证的证验证：
第一维，根据人的证候诊断的四诊合参表现寻找大鼠一般状况指标对模型鼠进行定性评价，包括大鼠的证候表征神态，症状评分为：
I.精神状态
精神正常：喜动喜嗅，眼光有神，0分；
轻度异常：轻度倦怠，打斗减少，1分；
中度异常：精神倦怠，2分；
精神萎靡：弓背，蜷卧，自发活动明显减少，目无光彩，3分；
II毛色
米白色，均匀细密，柔顺有光泽，0分；
白中稍有黄色，稍乱，稍干燥，1分；
白中伴大部分黄色，乱，干燥，2分；
满目皆有黄色，毛枯躁，脏乱，3分；
III粪便
成形，粪质正常0分；
轻度异常：粪便软，含水量增加，可见反光，1分；
中度异常：粪便稀溏，部分不成形，2分；
明显异常：粪便稀溏，完全不成形，3分；
IV尿色
清亮透明,0分；
轻度异常：尿色清亮稍黄，1分；
中度异常：尿色淡黄，尿量减少，2分；
重度异常：尿色深黄，尿量明显减少，3分；
V阴囊颜色
正常没有松弛，0分；
阴囊颜色正常或略偏红，阴囊褶皱消失，1分；
阴囊颜色潮红，松弛下垂2分。
第二维为定量评价，确定以第1、8、15、21天中同一时刻用电子天平将每只大鼠称量三次并取平均值作为该大鼠该天体重数据；
第三维为微观指标和滑膜病理学改变，血清学指标：a.“湿”相关指标，水液代谢异常指标：大鼠尿液水通道蛋白-2(AQP2)；b.“热”相关指标，热休克蛋白70(HSP70)的测定；3.免疫-炎症反应指标检测，白细胞介素1β(IL-1β)；
S5.对以上指标进行观察及统计学分析，建立该病证结合大鼠模型“病”和“证”的评价体系：采用SPSS 20.0统计软件处理，各组指标数据均以(x±s)表示，数据用计量资料先进行正态检验，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料先转换成正态分布再用单因素方差分析；进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.本发明提供了建立一种湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的制备方式，设计了在普通纯化饲料基础上改良的高脂高蛋白高糖饲料，发明了高脂高蛋白高糖饲料加隔日灌服猪脂和白酒及被迫置于高温高湿的人造环境中模拟中医饮食失节、高温高湿的气候环境并选用6周龄雄性SD大鼠诱导21天，建立湿热证模型，其次通过大鼠右踝关节注射MSU晶体，建立了急性痛风性关节炎模型，二者合并从而制备了一种湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型。并从三个维度进行湿热证型和疾病的评价，结果表明该方法可成功复制湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型，而且该复制方法稳定性、重复性好，简单、客观，符合中医证型理论的指导；
2.本发明通过加强挖掘动物行为学的改变从而实现中医望闻问切在动物病证结合模型评价体系的运用解决了目前没有用于湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的不足，为规范、标准、科学的评价中医药提供了一种新方法，具有造模方法简单、易于操作和推广，贴近临床的特点。
附图说明
图1为对照组和模型组的体重变化对比图；
图2为对照组和模型组踝关节滑膜变化对比图；
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
本发明公开了一种湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模方法，包括如下步骤：
S1.选用180±20g、6周龄、健康的雄性SPF级SD大鼠，饲以高脂高蛋白高糖饲料，自由进食，自由饮用200g·l-1蜂蜜水，猪脂和白酒隔日交替灌胃连续21天，其中白酒选用40-60°之间，本实施例选用52°红星二锅头，同时置于人工气候箱中8小时/天，所述人工气候箱的温度为32±2℃，相对湿度95％，21天后获得湿热证大鼠模型；
S2.取步骤S1获得的湿热证大鼠模型，在大鼠右踝关节两侧骨突部位进针，斜向下45°方向插入至胫骨肌腱内侧，向肢体远端方向注射MSU悬浮液，制备湿热证急性痛风性关节炎大鼠病证结合模型；
S3.所述步骤S2中的湿热证急性痛风性关节炎大鼠模型造模完成后，右踝关节出现红、肿、热、痛体征，三足跛行步态，红外热成像分析踝关节温度升高，CatWalk XT10.5动物步态分析及炎性因子与正常对照比较差异显著，则湿热证急性痛风性关节炎病证结合模型造模成功；
S4.选用以下指标，从三个维度对建立的湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型进行湿热证的证验证：
第一维，根据人的证候诊断的四诊合参表现寻找大鼠一般状况指标对模型鼠进行定性评价，包括大鼠的证候表征神态，症状评分为：
I.精神状态
精神正常：喜动喜嗅，眼光有神，0分；
轻度异常：轻度倦怠，打斗减少，1分；
中度异常：精神倦怠，2分；
精神萎靡：弓背，蜷卧，自发活动明显减少，目无光彩，3分；
II毛色
米白色，均匀细密，柔顺有光泽，0分；
白中稍有黄色，稍乱，稍干燥，1分；
白中伴大部分黄色，乱，干燥，2分；
满目皆有黄色，毛枯躁，脏乱，3分；
III粪便
成形，粪质正常0分；
轻度异常：粪便软，含水量增加，可见反光，1分；
中度异常：粪便稀溏，部分不成形，2分；
明显异常：粪便稀溏，完全不成形，3分；
IV尿色
清亮透明,0分；
轻度异常：尿色清亮稍黄，1分；
中度异常：尿色淡黄，尿量减少，2分；
重度异常：尿色深黄，尿量明显减少，3分；
V阴囊颜色
正常没有松弛，0分；
阴囊颜色正常或略偏红，阴囊褶皱消失，1分；
阴囊颜色潮红，松弛下垂2分。
第二维为定量评价，确定以第1、8、15、21天中同一时刻用电子天平将每只大鼠称量三次并取平均值作为该大鼠该天体重数据；
第三维为微观指标和滑膜病理学改变，血清学指标：a.“湿”相关指标，水液代谢异常指标：大鼠尿液水通道蛋白-2(AQP2)；b.“热”相关指标，热休克蛋白70(HSP70)的测定；3.免疫-炎症反应指标检测，白细胞介素1β(IL-1β)；
S5.对以上指标进行观察及统计学分析，建立该病证结合大鼠模型“病”和“证”的评价体系：采用SPSS 20.0统计软件处理，各组指标数据均以(x±s)表示，数据用计量资料先进行正态检验，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料先转换成正态分布再用单因素方差分析；进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
所述高脂高蛋白高糖饲料，是证模型诱导的重要因素，在普通纯化饲料的基础上增加酪蛋白和鱼粉的含量，增加黄油和胆固醇，增加绵砂糖配制而成；其配方正常饲料：成分为氯化胆碱0.2份，玉米30份，小麦25.5份，蜜糖酵母2.5份，磷酸氢钙2份，石粉1份，生长预混料1份，食盐0.3份，油2.5份，鱼粉5份，豆粕20份，酪蛋白10份；高脂高蛋白高糖饲料的成分为，氯化胆碱0.2份，玉米25份，小麦35.5份，蜜糖酵母2.5份，磷酸氢钙2份，石粉1份，食盐0.3份，油2.5份，鱼粉20份，酪蛋白10份，另添加黄油15份，胆固醇1份，猪胆盐0.1份，绵砂糖15份，上述含量均为重量份。
所述步骤S2中，MSU悬浮液制备是“病”模型诱导的关键，其制备方法为：用400ml超纯水加入4.5ml浓度为0.5mol·l-1的NaOH溶液中，煮沸后加入2g尿酸搅拌溶解；待温度降至60℃时用NaOH调PH至8.9，冷却，然后放置4℃冰箱冷藏过夜，盛入蒸发皿中经60℃干燥烘箱干燥，经高温灭菌后得到尿酸钠晶体粉末，用刮勺将其从蒸发皿中刮取下来用碾钵碾碎后用孔径250um的金属网筛过滤，然后用无菌EP管收集；并通过从急性痛风发作患者手足部位取出的痛风石在光学显微镜下与我们制备获取的MSU晶体鉴定是否一致，要最大程度的模拟人体内的痛风石的状态。用万分之一天平称取所需用量，以无菌生理盐水配成浓度为20mg·mL-1MSU混悬液，涡旋振荡，直至混悬液能被6号注射器针头吸取。
4.根据权利要求1所述的湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的评价方法，其特征在于：所述置于人工气候箱高温高湿环境的具体要求为：每日上午9点至下午5点将大鼠置于温度为32±2℃，相对湿度95％的人工气候箱中，每天统一时间为8小时。
实施例1：
1.材料
1.1实验动物：SPF级雌性SD大鼠55只，6周龄，体重180±20g，由江西中医药大学实验动物科学技术中心提供，试验动物许可证编号：SYXK(赣)2017-0004。动物饲养条件：按昼夜节律自然照明，于SPF级实验动物屏障系统饲养，温度23±2℃，相对湿度3±3％。动物自由饮水、进食，适应性饲养一周后进行造模。
1.2饲料：正常基础维持饲料：成分为氯化胆碱0.2份，玉米30份，小麦25.5份，蜜糖酵母2.5份，磷酸氢钙2份，石粉1份，食盐0.3份，油2.5份，鱼粉5份，豆粕20份，酪蛋白10份；高脂高蛋白高糖饲料，在上述基础维持饲料基础上添加黄油、鱼粉和糖，具体成分为氯化胆碱0.2份，玉米25份，小麦35.5份，蜜糖酵母2.5份，磷酸氢钙2份，石粉1份，生长预混料1份，食盐0.3份，油2.5份，鱼粉20份，酪蛋白10份，另添加黄油15份，胆固醇1份，猪胆盐0.1份，绵糖15份。
1.3仪器：人工气候箱(MGC-350-HP-2上海一恒)、全自动生化仪(贝克曼AU480)、酶标仪(Thermo)、显微镜(IX37生物显微镜)、电子天平(AUY120岛津分析天平)、步态分析仪(CatWalk XT10.5)。
1.4大鼠动脉血血清学检测包括：a.包括“湿”相关指标，水液代谢异常指标：大鼠尿液水通道蛋白-2(AQP2)；b.“热”相关指标，热休克蛋白70(HSP70)的测定；c.免疫-炎症反应指标检测，白细胞介素1β(IL-1β)。
2.病证结合模型构建及分组
健康SD雄性大鼠55只，适应性喂养1周后按随机数字表法随机分为4组：正常对照组，湿热对照组，痛风对照组，模型组，除正常对照组10只外其余各组每组各15只。
正常对照组：在正常温湿度(温度23±2℃，相对湿度55±3％)环境下普通饲料喂养，自由饮水21d；
湿热对照组：给大鼠饲以高脂高蛋白高糖饲料，并在高脂高蛋白高糖饲料喂养的基础上，加用200g·l-1蜂蜜水自由饮用，且隔日上午按大鼠体质量灌服油脂1.5ml/100g，并与油脂隔日灌服52°白酒(红星二锅头)(前两次为0.5ml/100g，3-4次予0.8ml/100g，5-7次予1ml/100g，过程中根据动物状态进行调整)，油脂和白酒隔日交替，共持续21d，其中每日上午8点放入人工气候箱中[温度为(32±2)℃，相对湿度95％，八小时；
痛风对照组：在正常温湿度(温度23±2℃，相对湿度55±3％)环境下正常基础维持饲料喂养，自由饮水21d。在第18d上午大鼠进食前，用1ml一次性无菌注射器配5ml注射器针头，在大鼠右踝关节后外侧，用手触摸，感受两侧骨突部位。从肢体近端两骨突间进针，斜向下45°方向插入至胫骨肌腱内侧，向肢体远端方向注射MSU悬浮液，将0.2ml浓度为200mg·ml-1尿酸钠溶液注入到踝关节腔内，制备急性痛风性关节炎模型(注射MSU前首先以大鼠踝关节中点为界±1cm去除腿部毛发并且用记号笔绕踝关节中点一圈划线)。
模型组：饲养方式与湿热对照组相同，即给大鼠饲以高脂高蛋白高糖饲料，并在高脂高糖饲料喂养的基础上，加用200g·l-1蜂蜜水自由饮用，且隔日上午按大鼠体质量灌服油脂1.5ml/100g，并与油脂隔日灌服52°白酒(红星二锅头)(前两次为0.5ml/100g，3-4次予0.8ml/100g，5-7次予1ml/100g，过程中根据动物状态进行调整)，油脂和白酒隔日交替，共持续21d，其中每日上午8点放入人工气候箱中[温度为(32±2)℃，相对湿度95％]8小时；在第18d上午大鼠进食前，用1ml一次性无菌注射器配5ml注射器针头，在大鼠右踝关节后外侧，用手触摸，感受两侧骨突部位。从肢体近端两骨突间进针，斜向下45°方向插入至胫骨肌腱内侧，向肢体远端方向注射MSU悬浮液，将0.2ml浓度为200mg·ml-1尿酸钠溶液注入到踝关节腔内。通过上述复合多因素造模方式制备湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型。
3.观察指标
3.1一般状况观察
仔细观察大鼠的精神状态、毛发洁净度、皮毛光泽、粪便、尿液、阴囊形态等情况；
3.2体重的测量
确定以第1、8、15、21天同一时刻用电子天平每只大鼠称量三次并取平均值作为该大鼠该天体重。
3.3从三个维度对“证”和“病”的评价
造模21天完成后，通过三个维度的指标对湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的制备方式及其评价方法进行检测及评估，所述病证结合模型的判定通过观察右踝关节出现红、肿、热、痛体征，三足跛行步态，红外热成像分析踝关节温度升高，CatWalkXT10.5动物步态分析及检测炎性因子确认模型成功后，选用以下指标从以下三个维度对所建立的湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的制备方式及其评价方法进行“病”和“证”的验证：
第一维，根据人的证候诊断的四诊合参表现寻找大鼠一般状况指标对模型鼠进行定性评价，包括大鼠的证候表征神态，症状评分为：
I.精神状态
精神正常：喜动喜嗅，眼光有神，0分；
轻度异常：轻度倦怠，打斗减少，1分；
中度异常：精神倦怠，2分；
精神萎靡：弓背，蜷卧，自发活动明显减少，目无光彩，3分；
II毛色
米白色，均匀细密，柔顺有光泽，0分；
白中稍有黄色，稍乱，稍干燥，1分；
白中伴大部分黄色，乱，干燥，2分；
满目皆有黄色，毛枯躁，脏乱，3分；
III粪便
成形，粪质正常0分；
轻度异常：粪便软，含水量增加，可见反光，1分；
中度异常：粪便稀溏，部分不成形，2分；
明显异常：粪便稀溏，完全不成形，3分；
IV尿色
清亮透明,0分；
轻度异常：尿色清亮稍黄，1分；
中度异常：尿色淡黄，尿量减少，2分；
重度异常：尿色深黄，尿量明显减少，3分；
V阴囊颜色
正常没有松弛，0分；
阴囊颜色正常或略偏红，阴囊褶皱消失，1分；
阴囊颜色潮红，松弛下垂2分。
第二维为定量评价，确定以第1、8、15、21天中同一时刻用电子天平将每只大鼠称量三次并取平均值作为该大鼠该天体重数据；
第三维为微观指标和滑膜病理学改变，血清学指标：a.“湿”相关指标，水液代谢异常指标：大鼠尿液水通道蛋白-2(AQP2)；b.“热”相关指标，热休克蛋白70(HSP70)的测定；3.免疫-炎症反应指标检测，白细胞介素1β(IL-1β)；
3.4统计学分析
采用SPSS 20.0统计软件处理，各组指标数据均以(x±s)表示，数据用计量资料先进行正态检验，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料先转换成正态分布再用单因素方差分析。进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
4.结果
4.1一般情况观察和体重变化分析
正常对照组:喂养期间精神状态好，活动正常，毛色柔顺亮泽，双目炯炯有神，体重增加平稳，饮食、大小便均正常。
湿热对照组：大鼠出现活动力减弱，毛发粗糙疏松、毛色暗淡，前7d体重逐渐增加随后增势缓慢，具体变化趋势见图1，且饮食减少尤其在14d后大部分出现精神倦怠、嗜睡，毛发枯槁潮湿结成呈缕状发结如穗、掉毛，阴囊松弛下垂，体重及饮食均减少，大便较正常组约1/3大小、量少甚至不成型、溏便。
痛风对照组：注射MSU后大鼠烦躁不安精神萎靡，反应迟钝。模型组：逐渐出现和湿热组类似症状，随后合并痛风组造模的症状。
4.2大鼠的证候表征神态评分
根据大鼠的证候表征神态，对各个组别在造模结束后进行不同证候表征评分，结果见表1。
表1各组大鼠证候积分
Figure BDA0003300731060000103
Figure BDA0003300731060000101
4.3大鼠“湿”证候指标AQP2水平比较
我们检测了各组大鼠血清中的AQP2水平，发现湿热对照组和模型组水平与正常对照组相比较低，且具有统计学意义，结果见表2。
表2各组大鼠AQP2水平比较(ng/ml)
Figure BDA0003300731060000102
4.4大鼠“热”证候指标HSP70水平比较
我们检测了各组大鼠血清中的HSP70水平，发现湿热对照组、痛风对照组及模型组水平与正常对照组相比较高，且具有统计学意义，结果见表3。
表3各组大鼠HSP70水平比较(ng/ml)
Figure BDA0003300731060000111
4.5大鼠免疫-炎症反应指标IL-1β水平比较
我们检测了各组大鼠血清中的IL-1β水平，发现痛风对照组和模型组水平明显高于正常对照组，且具有统计学意义，结果见表4。
表4各组大鼠IL-1β水平比较(pg/ml)
Figure BDA0003300731060000112
4.6红外热成像探测踝关节温度改变
我们检测了正常对照组和模型组大鼠左右踝关节的体温变化，发现正常对照组左右踝关节体温无明显变化，模型组右踝关节明显高于左踝关节，具体见图2。
图2右踝关节平均体温E3：28.79，左踝关节平均体温E4：23.25。
4.7 CatWalk XT10.5动物步态分析
表5模型组大鼠造模前后步态分析
Figure BDA0003300731060000121
4.8大鼠踝关节滑膜组织的病理学
我们对比了正常对照组和模型组踝关节滑膜变化，发现正常对照组滑膜上皮排列完整，未见增生，无炎症细胞浸润，软骨表面光滑完整；见图2中A。模型组见滑膜细胞增生，滑膜组织不完整，关节破坏严重，可见大量炎症细胞浸润，呈现明显的关节炎病理变化，提示造模成功；见图2中B。
注：A(正常对照组)，B(模型组)。
在本案例中，通过使用现代化仪器和量表评估大鼠体重变化、建立证候表征评分、红外热成像探测踝关节温度改变、大鼠进行步态分析以及动物血清血指标和滑膜病理实现了大鼠行为学和表征向中医望闻问切的转化。
综上所述：本发明提供了一种湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的制备方式及其评价方法，该法不仅稳定性好与痛风患者临床表象高度相似，且从“证”和“病”两方面均提出了规范、标准、科学的病症结合模型评价方法。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.选用180±20g、6周龄、健康的雄性SPF级SD大鼠，饲以高脂高蛋白高糖饲料，自由进食，自由饮用200g•l-1蜂蜜水，猪脂和白酒隔日交替灌胃连续21天，其中白酒选用40-60°之间，本实施例选用52°红星二锅头，同时置于人工气候箱中8小时/天，所述人工气候箱的温度为32±2℃，相对湿度95%，21天后获得湿热证大鼠模型；
S2.取步骤S1获得的湿热证大鼠模型，在大鼠右踝关节两侧骨突部位进针，斜向下45°方向插入至胫骨肌腱内侧，向肢体远端方向注射MSU悬浮液，制备湿热证急性痛风性关节炎大鼠病证结合模型；
S3.所述步骤S2中的湿热证急性痛风性关节炎大鼠模型造模完成后，右踝关节出现红、肿、热、痛体征，三足跛行步态，红外热成像分析踝关节温度升高，CatWalk XT10.5动物步态分析及炎性因子与正常对照比较差异显著，则湿热证急性痛风性关节炎病证结合模型造模成功。
2.根据权利要求1所述的湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模方法，其特征在于，所述高脂高蛋白高糖饲料的成分为，按重量份表示，氯化胆碱0.2份，玉米25份，小麦35.5份，蜜糖酵母2.5份，磷酸氢钙2份，石粉1份，食盐0.3份，油2.5份，鱼粉20份，酪蛋白10份，另添加黄油15份，胆固醇1份，猪胆盐0.1份，绵砂糖15份。
3.根据权利要求1所述的湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型的造模方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述MSU悬浮液的制备方法为：用400ml超纯水加入4.5ml浓度为0.5mol•l-1的NaOH溶液中，煮沸后加入2g尿酸搅拌溶解；待温度降至60℃时用NaOH调PH至8.9，冷却，然后放置4℃冰箱冷藏过夜，盛入蒸发皿中经60℃干燥烘箱干燥，经高温灭菌后得到尿酸钠晶体粉末，用刮勺将其从蒸发皿中刮取下来用碾钵碾碎后用孔径250um的金属网筛过滤，然后用无菌EP管收集；并通过从急性痛风发作患者手足部位取出的痛风石在光学显微镜下与我们制备获取的MSU晶体鉴定是否一致，要最大程度的模拟人体内的痛风石的状态；用万分之一天平称取所需用量，以无菌生理盐水配成浓度为20mg•mL-1MSU混悬液，涡旋振荡，直至混悬液能被6号注射器针头吸取。
4.根据权利要求1所述的湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的造模方法，其特征在于：所述置于人工气候箱高温高湿环境的具体要求为：每日上午9点至下午5点将大鼠置于温度为32±2℃，相对湿度95%的人工气候箱中，每天统一时间为8小时。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的湿热证急性痛风性关节炎病证结合大鼠模型的评价方法，其特征在于：
选用以下指标，从三个维度对建立的湿热证急性痛风性关节炎病症结合大鼠模型进行湿热证的证验证：
第一维，根据人的证候诊断的四诊合参表现寻找大鼠一般状况指标对模型鼠进行定性评价，包括大鼠的证候表征神态，症状评分为：
I．精神状态
精神正常：喜动喜嗅，眼光有神，0分；
轻度异常：轻度倦怠，打斗减少，1分；
中度异常：精神倦怠，2分；
精神萎靡：弓背，蜷卧，自发活动明显减少，目无光彩，3分；
II毛色
米白色，均匀细密，柔顺有光泽，0分；
白中稍有黄色，稍乱，稍干燥，1分；
白中伴大部分黄色，乱，干燥，2分；
满目皆有黄色，毛枯躁，脏乱，3分；
III粪便
成形，粪质正常 0分；
轻度异常：粪便软，含水量增加，可见反光，1分；
中度异常：粪便稀溏，部分不成形，2分；
明显异常：粪便稀溏，完全不成形，3分；
IV尿色
清亮透明,0分;
轻度异常：尿色清亮稍黄，1分；
中度异常：尿色淡黄，尿量减少，2分；
重度异常：尿色深黄，尿量明显减少，3分；
V阴囊颜色
正常没有松弛，0分；
阴囊颜色正常或略偏红，阴囊褶皱消失，1分；
阴囊颜色潮红，松弛下垂 2分；
第二维为定量评价，确定以第1、8、15、21天中同一时刻用电子天平将每只大鼠称量三次并取平均值作为该大鼠该天体重数据；
第三维为微观指标和滑膜病理学改变，血清学指标：a. “湿”相关指标，水液代谢异常指标：大鼠尿液水通道蛋白-2（AQP2）；b.“热”相关指标，热休克蛋白70（HSP70）的测定；3.免疫-炎症反应指标检测，白细胞介素1β（IL-1β）；
S5. 对以上指标进行观察及统计学分析，建立该病证结合大鼠模型“病”和“证”的评价体系：采用SPSS 20.0 统计软件处理，各组指标数据均以(x±s) 表示，数据用计量资料先进行正态检验，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料先转换成正态分布再用单因素方差分析；进行组间比较，以 P＜0.05为差异有统计学意义。
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US20170002413A1 (en) * 2014-01-17 2017-01-05 The University Of Tokyo Molecule associated with onset of gout, and method and kit for evaluating diathesis of uric acid-related diseases and inflammation-related diseases, and inspection object and drug
CN110199952A (zh) * 2019-07-16 2019-09-06 江西中医药大学 一种用于女性肥胖研究的动物模型构建方法及其应用

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