CN108524553A - 一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法 - Google Patents

一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：以酵母膏和氧嗪酸钾为造模剂，对试验小鼠进行持续多天的造模试验，获得亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，其中，在所述造模试验期间，每天为试验小鼠给予酵母膏，且在所述造模试验的最后一天，在对试验小鼠给予酵母膏后，再对试验小鼠给予氧嗪酸钾；观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用。本发明以小鼠作为模型动物，同时采用长期增加尿酸前体物质的酵母膏，联用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾作为造模剂，成功构建合理且效果稳定、符合临床特点的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型。

Description

一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法
技术领域
本发明涉及高尿酸血症动物模型技术领域，特别涉及一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法。
背景技术
高尿酸血症是一类体内嘌呤代谢异常或肾脏排泄尿酸功能减弱，从而导致体内尿酸生成过多或排泄减少，进而导致血清尿酸水平过高的一类疾病，是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症，长期高尿酸血症常会诱发肾脏的损害。调查研究结果表明，随着人们生活水平的提高，高尿酸血症的发病率日益上升，高尿酸血症肾损害病例也在增加。目前治疗高尿酸血症肾损伤的药物，毒副作用很大、患者顺应性差。所以需要建立稳定合理的高尿酸血症肾损害模型用以筛选出新的高效低毒的抗高尿酸血症以及高尿酸血症肾病的药物。
目前建立高尿酸血症肾损害小鼠模型的方法主要采用增加尿酸前体物质、抑制尿酸酶活性及抑制尿酸排泄等方法，多采用大鼠进行造模。这些方法有的关注于高尿酸血症、模型制作时间偏短、并未出现明显肾损害，有的是药物自身导致的肾损害、不符合高尿酸血症肾损害临床发病机制。也就是说，现有建立高尿酸血症肾损害小鼠模型的方法不符合临床发病机制的问题。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，旨在解决现有高尿酸血症肾损害小鼠模型的方法不符合临床发病机制的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
以酵母膏和氧嗪酸钾为造模剂，对试验小鼠进行持续14～15天的造模试验，获得亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，其中，在所述造模试验期间，每天为试验小鼠给予酵母膏，且在所述造模试验的最后一天，在对试验小鼠给予酵母膏后，再对试验小鼠给予氧嗪酸钾；
观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用。
优选地，所述酵母膏和氧嗪酸钾的给药剂量对应为15～30g/kg和250～400mg/kg。
优选地，所述酵母膏和氧嗪酸钾的给药剂量对应为30g/kg和300mg/kg。
优选地，所述酵母膏的给药方式为灌胃给药，每天一次；
所述氧嗪酸钾的给药方式为腹腔注射一次。
优选地，所述酵母膏在进行灌胃给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述酵母膏配制成所述酵母膏混悬液；
所述氧嗪酸钾在进行腹腔注射给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述氧嗪酸钾配制成氧嗪酸钾混悬液；
其中，所述羧甲基纤维素钠水溶液中的羧甲基纤维素钠的质量浓度为0.5％。
优选地，所述造模试验的试验时间为14天。
优选地，所述试验小鼠为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为18～30g。
优选地，所述试验小鼠的饲养条件为：饲养环境温度22～26℃，饲养环境湿度40～70％。
优选地，观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用的步骤，具体包括：
在所述造模试验期间，每天对试验小鼠进行称重，并计算相对体重，分析所述造模剂对试验小鼠体重的影响；
在最后一次对试验小鼠使用所述造模剂后1h，从试验小鼠的眼部采集血液样品，将所述血液样品在室温条件下静置1～2h后离心，收集血清，测定所述血清的生化指标，分析所述造模剂对试验小鼠血清生化指标的影响；以及，
在所述造模试验结束后，摘取试验小鼠的全肾组织，作为肾组织样品，将所述肾组织样品用10％的福尔马林溶液固定，然后经过脱水、石蜡包埋、切片以及HE染色处理后，使用光学显微镜观察所述肾组织样品的病理变化并拍照，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用；
其中，所述血样中的生化指标包括尿酸、尿素氮以及肌酐的浓度水平。
本发明提供的技术方案中，以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，同时，采用长期增加尿酸前体物质的酵母膏，同时联用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾，对试验小鼠进行造模试验，通过酵母膏和氧嗪酸钾两种造模剂的协同作用，制备出类似于人体高尿酸血症肾损害发病机制的模型，14～15天即可成功构建合理且效果稳定、符合临床特点的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，该模型符合高尿酸血症肾损害的临床特点，而且对试验小鼠的一般生长情况无明显副作用，为研究高尿酸血症的病理机制以及筛选抗高尿酸血症肾损害药物提供了一种理想的动物模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中各组小鼠相对体重的计算结果图；
图2为本发明实施例1中空白组小鼠肾组织样品的肾髓质的观测结果图；
图3为本发明实施例1中空白组小鼠肾组织样品的肾小管的观测结果图；
图4为本发明实施例1中模型A组小鼠肾组织样品的肾皮质的观测结果图；
图5为本发明实施例1中模型A组小鼠肾组织样品的肾髓质的观测结果图；
图6为本发明实施例1中模型B组小鼠肾组织样品的肾皮质的观测结果图；
图7为本发明实施例1中模型B组小鼠肾组织样品的肾髓质的观测结果图；
图8为本发明实施例2中各组小鼠相对体重的计算结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：以酵母膏和氧嗪酸钾为造模剂，对试验小鼠进行持续多天的造模试验获得亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，其中，在所述造模试验期间，每天为试验小鼠给予酵母膏，且在所述造模试验的最后一天，在对试验小鼠给予酵母膏后，再对试验小鼠给予氧嗪酸钾；观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用。
以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，有利于建立与人体高尿酸血症肾损害发病过程类似的高尿酸血症模型。所述试验小鼠可选择生长状况良好、体质健康的小鼠作为试验对象，具有廉价易得、来源广泛且易于饲养的优点，在本实施例中优选为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为18～30g，更优选为25～30g。SPF级昆明小鼠是医学生物研究中常用的试验动物，标准化程度高、便于给药且采样容易，而优选为雄性小鼠，其更为健壮，在试验过程中可以尽量避免由于小鼠自身体质不足而导致的试验误差，而且符合临床高尿酸血症肾病高发于男性患者的特点。
进一步地，在所述造模试验期间，应该为所述试验小鼠提供适宜的饲养环境，例如设置一定的环境温度和湿度等，一般来说，小鼠的适宜饲养温度为20～30℃、湿度为40～70％，而在本实施例中，所述试验小鼠的饲养条件优选为为：饲养环境温度22～26℃，饲养环境湿度40～60％，且所述试验小鼠为自由采食和饮水，在此种饲养条件下，所述试验小鼠的生长状况更佳，有利于所述造模试验的顺利进行。
对试验小鼠给予酵母膏，其正常的嘌呤代谢受到大量含丰富蛋白质类的酵母的影响，致使嘌呤代谢紊乱，诱发高尿酸血症，由于血尿酸浓度的升高出现肾小管功能异常，渐至肾小球的损害而造成肾功能受损。尿酸酶为嘌呤代谢酶，可以将尿酸转化成尿囊素排出体外，而氧嗪酸钾是尿酸酶抑制剂，通过抑制尿酸酶活性，抑制尿酸分解，使小鼠血尿酸水平升高。采用酵母膏和氧嗪酸钾联用作为造模剂，对试验小鼠进行造模试验，通过两种机制造模剂的协同作用，制备出类似于人体高尿酸血症肾损害发病过程的模型。一般建立动物模型时，造模剂的给药方式可以是将造模剂加入到饲料中进行饲喂，也可以采用药物灌服或者注射的方式进行，在本实施例中，所述酵母膏的给药方式为灌胃给药，在所述造模试验期间每天一次；所述氧嗪酸钾的给药方式为腹腔注射给药，仅在所述造模试验的最后一天给药一次。采用灌胃给药和腹腔注射给药的方式，相较于将造模剂加入到饲料中饲喂小鼠的方法，其更能够精确控制造模剂的用量，而且针对不同种类的药物，分别采用灌胃给药和腹腔注射给药的方式，便于小鼠对所述造模剂的吸收或利用，使所述造模剂对所述试验小鼠的肾功能产生影响而成功建立亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型。
所述造模剂的给药剂量太低，使所述试验小鼠产生肾损害的时间较长，而所述造模剂的给药剂量太大，不仅无法使所述试验小鼠产生效果更好的高尿酸血症肾损害模型，反而容易造成药物的浪费或者对所述试验小鼠产生其他的副作用。在本实施例中，所述酵母膏和氧嗪酸钾的给药剂量对应为15～30g/kg和250～400mg/kg，其中，所述给药剂量按照所述试验小鼠的体重进行计算，即所述试验小鼠的每千克体重对应的酵母膏和氧嗪酸钾的给药量为15～30g和250～400mg。进一步地，所述酵母膏和氧嗪酸钾的给药剂量对应为30g/kg和300mg/kg。
所述酵母膏和氧嗪酸钾在进行灌胃给药或腹腔注射给药时，一般需要都是将药物配制成药物溶液或药物混悬剂进行，以利于药物在动物体内的吸收，而由于所述酵母膏和氧嗪酸钾的水溶性较差，优选为将上述两种药物配制成药物混悬液的方式进行。另外，在配制药物混悬液时，通常会加入助悬剂(指能增加分散介质的粘度以降低微粒的沉降速度或增加微粒亲水性的附加剂)，以使药物颗粒能够均分分散在溶剂中而形成稳定的药物混悬剂。在本实施例中，所述酵母膏在进行灌胃给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述酵母膏配制成酵母膏混悬液；所述氧嗪酸钾在进行腹腔注射给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述氧嗪酸钾配制成氧嗪酸钾混悬液，其中，所述羧甲基纤维素钠水溶液中的羧甲基纤维素钠的质量浓度为0.5％。由于所述酵母膏和氧嗪酸钾的水溶性较差，通过使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为药物混悬液的助悬剂，其性质稳定、受pH值影响小，有利于使上述两种药物顺利配制成稳定的药物混悬剂，进而便于进行灌胃给药或腹腔注射。需要注意的是，所述酵母膏混悬液和氧嗪酸钾混悬液在使用时需要摇匀后再进行灌胃或者腹腔注射。
所述造模试验的试验时间应该根据所述造模试验过程中，所述造模剂对所述试验小鼠肾功能产生的影响而定，试验时间过短，所述造模剂对所述试验小鼠肾功能的影响不显著，无法建立效果稳定的高尿酸血症模型，而在能够成功建立所述高尿素血症肾损害模型的前提下，所述造模试验的试验时间当然应该尽量简短以降低试验成本、减少不必要的工作量。在本实施例中，所述造模试验的试验时间为14～15天，更优选为14天。通过以小鼠作为模型动物，采用酵母膏和氧嗪酸钾联用作为造模剂，在所述造模试验过程中，每天对试验小鼠使用所述酵母膏混悬液灌胃一次，然后在所述造模试验的最后一天，完成酵母膏灌胃后，对试验小鼠进行氧嗪酸钾腹腔注射，即可成功建立效果稳定的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型。
可选地，观测试验小鼠的体重以及肾功能的变化，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用的步骤，具体包括：
在所述造模试验期间，每天观察所述试验小鼠的一般生长情况(例如采食、饮水情况是否正常，是否出现腹泻等状况)并称重，计算所述试验小鼠相对体重，分析所述造模剂对所述试验小鼠的一般生长状况和体重的影响，其中，所述试验小鼠相对体重的计算方式为：相对体重(％)＝(给药后每天体重/给药前体重)*100。通过所述试验小鼠体重变化的观测，判断所述造模试验除诱导小鼠发生肾损害之外，是否还会对小鼠产生其他的不良反应。
在最后一次对试验小鼠使用所述造模剂后1h(即最后一次对试验小鼠进行次黄嘌呤和乙胺丁醇混合灌胃、以及氧嗪酸钾腹腔注射后1h)，从试验小鼠的眼部(例如眼球或眼眶等部位)采集血液样品，将所述血液样品在室温条件下静置1～2h后离心，收集血清，测定所述血清的生化指标，包括尿酸、尿素氮以及肌酐的浓度水平(分别按照尿酸测定试剂盒、尿素氮测定试剂盒和肌酐测定试剂盒的操作说明书进行测定)，分析所述造模剂对试验小鼠血清生化指标的影响。人体在发生高尿酸血症时，血清生化指标最明显的表现在于：血清尿酸水平和尿素氮水平显著升高。通过尿酸、尿素氮和肌酐水平的测定，可以明确判断出所述造模试验是否成功诱导所述试验小鼠产生高尿酸血症。
另外，人体在发生高尿酸血症时，会使肾组织出现严重损伤，因此，观测所述试验小鼠的肾组织病理变化，也可以作为判断所述亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型构建是否成功的参考因素。在所述造模试验结束后，摘取试验小鼠的全肾组织，作为肾组织样品，将所述肾组织样品用10％的福尔马林溶液固定，然后经过脱水、石蜡包埋、切片以及HE染色(苏木精-伊红染色法，hematoxylin-eosin staining，简称HE染色)处理后，使用光学显微镜观察所述肾组织样品的病理变化并拍照，观察所述试验小鼠肾组织的损伤情况，并结合上述测定的血清生化指标的变化情况，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用，进而判断所述造模试验是否成功构建成所述亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型。
本发明提供的技术方案中，以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，同时，采用长期增加尿酸前体物质的酵母膏，同时联用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾，对试验小鼠进行造模试验，通过酵母膏和氧嗪酸钾两种造模剂的协同作用，制备出类似于人体高尿酸血症肾损害发病过程的模型，14～15天即可成功构建合理且效果稳定、符合临床特点的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，该模型的重复性好，与人体高尿素血症肾损害发病机制相似，而且对模型动物的一般生长情况无明显副作用，为研究高尿酸血症的病理机制以及筛选抗高尿酸血症肾损害药物提供了一种理想的动物模型。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建
1、模型动物选取：SPF级雄性昆明种小鼠30只，体重为25～30g，由华中科技大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(鄂)2016-0009，饲养环境温度为22～26℃、湿度为40～70％，小鼠自由采食和饮水。
2、药物溶液配制：将酵母膏(批号20160628，购自北京奥博星生物技术责任公司)采用0.5％的CMC-Na水溶液，配制成酵母膏浓度为1.5g/mL的酵母膏混悬液；将氧嗪酸钾盐(批号P137112，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)采用0.5％的CMC-Na水溶液，配制成氧嗪酸钾浓度为20mg/mL的氧嗪酸钾混悬液；以及，将酵母膏和腺嘌呤(批号Y26J8C40561，购自上海源叶生物科技有限公司)采用0.5％的CMC-Na水溶液，配制成酵母膏浓度为1.5mg/mL、腺嘌呤浓度为5mg/mL的混合悬液，备用；
3、造模试验：将30只试验小鼠按体重分层随机分为三组，每组10只，分别为空白组、模型A组和模型B组，进行造模试验，各组小鼠均提供相同量的饮用水和饲料，小鼠均为自由饮食。在造模试验期间，空白组每天早上灌胃CMC-Na水溶液(浓度为0.5％)；模型A组的小鼠每天早上灌胃30g/kg的酵母膏，连续给药14天，并在最后一天灌胃后腹腔注射300mg/kg的氧嗪酸钾；模型B组的小鼠每天早上灌胃30g/kg酵母膏和100mg/kg腺嘌呤的混合悬液，连续给药14天，并在最后一天灌胃后腹腔注射300mg/kg的氧嗪酸钾。
4、指标观测：包括各组小鼠的体重变化、小鼠血清生化指标变化以及肾组织样品的病理变化，观测方法和结果如下：
(1)小鼠体重变化
在造模试验期间，每天观察小鼠的一般生长情况并称重，计算小鼠相对体重(％)＝(给药后每天体重/给药前体重)*100，然后采用SPSS 24.0统计软件进行数据统计，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有极显著统计学意义。造模试验期间各组小鼠相对体重的计算和统计结果如图1所示。
由图1中的结果可知，模型A、B组小鼠体重均呈上升趋势，但与空白组相比，均无统计学差异(P>0.05)；在造模第14d，模型A组与模型B组相比体重显著增加(P<0.05)。
(2)血样生化指标变化
在最后一次使用造模剂对小鼠进行诱导处理后1h，从各组小鼠的眼球采集血液样品，在室温下静置1～2h后，以3500r/min的转速离心10min(采用上海安亭科学仪器厂的TGL-16C台式离心机进行)，收集血清，冻存在-20℃温度下，作为血样备用。然后按照尿酸测定试剂盒(尿酸酶比色法，批号20171201，购自南京建成生物工程研究所)、尿素氮测定试剂盒(脲酶法，批号20171103，购自南京建成生物工程研究所)和肌酐测定试剂盒(批号20171102，购自南京建成生物工程研究所)的操作说明书，测定所述血样中的尿酸、尿素氮和肌酐的浓度水平，测定结果如下表1所示(表1中，与空白组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01)。
表1实施例1中各组小鼠血样生化指标的变化(n＝10)
组别 尿酸(mg/L) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(μmol/L)
空白组 26.6±3.4 5.6±0.8 101.3±14.8
模型A组 87.1±17.0## 13.0±1.9## 131.5±14.9##
模型B组 81.7±10.1## 11.8±1.6## 120.6±10.5##
由表1中的测定结果可知，与空白组相比，模型A组和模型B组小鼠血清尿酸、尿素氮以及肌酐值均极显著升高(P<0.01)。此结果表明两种造模方法均可制备小鼠高尿酸血症肾损害模型。
(3)肾组织样品病理变化
在造模试验结束后，摘取各组小鼠的全肾组织，作为肾组织样品，将肾组织样品用10％的福尔马林溶液固定，然后经过脱水(采用ASP 200S全自动脱水机进行)、石蜡包埋、切片(采用德国徕卡公司的RM2016轮转式切片机进行)以及HE染色处理(采用5300全自动染封一体机进行)后，使用光学显微镜(尼康公司，Eclipse ci光学显微镜)观察所述肾组织样品的病理变化并拍照(标尺＝50μm，放大200倍)，拍摄结果如图2至7所示，其中，图2和图3分别为空白组小鼠肾组织样品的肾髓质和肾小管的观测结果图，图4和图5分别为模型A组小鼠肾组织样品的肾皮质和肾髓质的观测结果图，图6和图7分别为模型B组小鼠肾组织样品的肾皮质和肾髓质的观测结果图。
由图2至图7中的结果可知，空白组小鼠肾组织样品的肾髓质皮质分界清晰，肾小球毛细血管襻结构清晰，肾小管上皮细胞结构正常，肾小管刷状缘排列整齐规则，未见明显炎症反应；模型A组肾皮质中部分肾小管上皮细胞脱落(图4中A处所示)，部分近曲小管内可见嗜酸性不溶性蛋白(图4中B处所示)，肾髓质中未见明显盐类结晶，说明模型组肾脏有一定程度损害，此造模方式能够建立高尿酸血症肾损害小鼠模型；模型B组肾皮质中肾小球毛细血管襻结构清晰，肾小管无明显异常，肾髓质小管中多见盐类结晶(图7中C处所示)。(此处需要说明的是，图2至图7中，虚线圆形标记并不是光学显微镜所观测结果直接显示的，而使为了便于区分肾组织样品发生的病理变化而另外添加的标记。)
人体产生的尿酸约有2/3经肾脏随尿液排出，因此，高尿酸血症可导致肾功能的减退。高尿酸血症引起的肾实质损害有三种类型：(1)痛风性肾病，是由于长期轻中度高尿酸血症所致的肾脏损害，主要表现为痛风石沉积于皮髓质交界处及髓质深部呈慢性间质性炎症，导致肾脏缩小、瘢痕化；(2)尿酸性肾病，是大量尿酸盐结晶短时间沉积于肾脏集合管、肾盂及输尿管并堵塞肾小管，引起肾小管近端扩张，导致肾功能亚急性、严重损伤，引发亚急性肾功能衰竭；(3)尿酸结石，是由尿酸盐结晶形成的结石沉积于肾乳头和集合管内引起结石性梗阻。
尿酸是大多数动物体内嘌呤代谢的终产物，主要由黄嘌呤氧化酶(XOD)催化次黄嘌呤与黄嘌呤而产生，文献中常用以下方法建立高尿酸血症肾损害小鼠模型：(1)抑制尿酸分解，尿酸酶为嘌呤代谢酶，可以将尿酸转化成尿囊素排出体外。氧嗪酸钾是尿酸酶抑制剂，通过抑制尿酸酶活性，使小鼠血尿酸水平升高。大鼠、小鼠等啮齿类动物体内存在尿酸酶，但人体内没有此酶，故采用氧嗪酸钾制备高尿酸血症肾损害模型，即使造模成功此方法也与人类高尿酸血症发病机制不尽相符。(2)增加尿酸的前体物质，如腺嘌呤、酵母膏、次黄嘌呤等。给予大剂量的腺嘌呤可以增强体内黄嘌呤氧化酶活性以及促进谷酰胺磷酸核糖焦磷酸转移酶的合成，加快尿酸的生成，同时异常高浓度的腺嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下转变为极难溶于水的2，8-二羟基腺嘌呤，沉积于肾小管，引起肾小管阻塞，进而导致血清尿酸、肌酐、尿素氮显著上升。给予酵母膏，正常的嘌呤代谢受到大量含丰富蛋白质类的酵母的影响，致使嘌呤代谢开始紊乱，从而诱发高尿酸血症，由于血尿酸浓度的升高出现肾小管功能异常，渐至肾小球的损害而造成肾功能受损；给予次黄嘌呤，它在黄嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸前体物质黄嘌呤，进而形成尿酸。(3)抑制尿酸排泄，乙胺丁醇其代谢产物吡嗪酸可抑制肾小管对尿酸的分泌，从而抑制肾脏对尿酸的排泄使血尿酸升高。
本发明实施例中联用尿酸前体物质(酵母膏或腺嘌呤)和尿酸酶抑制剂(氧嗪酸钾)，观察不同造模机制对病理模型的影响，采用30g/kg酵母膏+300mg/kg氧嗪酸钾联合、以及30g/kg酵母膏+100mg/kg腺嘌呤+300mg/kg氧嗪酸钾联用连续14d造模，结果表明小鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平均明显升高，肾脏病理组织观察发现酵母膏+氧嗪酸钾联用组肾小管上皮细胞脱落，部分近曲小管内可见嗜酸性不溶性蛋白，酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸钾联用组小鼠肾髓质小管中多见盐类结晶，两种造模方法均可造成显著的肾功能损害，但是酵母膏+氧嗪酸钾组小鼠体重较酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸钾组显著增加，而且腺嘌呤可导致大鼠慢性肾功能疾病，其造模引起的肾脏病变也并非全因高尿酸血症引发，故采用酵母膏和氧嗪酸钾联用14d的造模方式更为合适。
实施例2别嘌醇对亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的验证
1、模型动物选取：SPF级雄性昆明种小鼠30只，体重为18～22g，由华中科技大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(鄂)2016-0009，饲养环境温度为22～26℃、湿度为40～60％，小鼠自由采食和饮水。
2、药物溶液配制：将酵母膏(批号20160628，购自北京奥博星生物技术责任公司)、氧嗪酸钾盐(批号P137112，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)和别嘌醇(批号Y27O8C46913，购自上海源叶生物科技有限公司)，均采用0.5％的CMC-Na水溶液作为溶媒，分别配制成酵母膏浓度为3g/mL的酵母膏混悬液、氧嗪酸钾浓度为20mg/mL的氧嗪酸钾混悬液以及别嘌醇浓度为0.5mg/mL的别嘌醇混悬液，备用；
3、验证试验：选取30只试验小鼠，适应性喂养2天后，按体重分层随机分为三组，每组10只，分别为空白组、模型组和别嘌醇组，进行造模试验，各组小鼠均提供相同量的饮用水和饲料，小鼠均为自由饮食。在造模试验期间，别嘌醇组的小鼠隔天灌胃5mg/kg的别嘌醇一次，空白组和模型组的小鼠每天早上灌胃等体积的CMC-Na水溶液(浓度为0.5％)一次，然后模型组和别嘌醇组的小鼠在分别灌胃CMC-Na水溶液和灌胃别嘌醇后1h，灌胃30g/kg的酵母膏一次，连续给药14天，最后一天灌胃酵母膏后，腹腔注射300mg/kg的氧嗪酸钾一次；其中，灌胃体积为0.1mL/10g，腹腔注射体积为0.15mL/10g。
4、指标观测：包括各组小鼠的体重变化、小鼠血清生化指标变化以及肾组织样品的病理变化，观测方法和结果如下：
(1)小鼠体重变化
在造模试验期间，每天观察小鼠的一般生长情况并称重，计算小鼠相对体重(％)＝(给药后每天体重/给药前体重)*100，然后采用SPSS 24.0统计软件进行数据统计，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有极显著统计学意义。造模试验期间各组小鼠体重变化率的计算及统计结果如图8所示。
由图8中的结果可知，模型组、别嘌醇组体重均呈上升趋势，与空白组比较，模型组、别嘌醇组小鼠体重均无统计学差异(P>0.05)，说明采用酵母膏和氧嗪酸钾联合造模对小鼠体重无影响。
(2)血样生化指标变化
在最后一次使用造模剂对小鼠进行诱导处理后1h，从各组小鼠的眼眶采集血液样品，在室温下静置1～2h后，以3500r/min的转速离心10min(采用上海安亭科学仪器厂的TGL-16C台式离心机进行)，收集血清，冻存在-20℃温度下，作为血样备用。然后按照尿酸测定试剂盒(尿酸酶比色法，批号20171201，购自南京建成生物工程研究所)、尿素氮测定试剂盒(脲酶法，批号20171103，购自南京建成生物工程研究所)和肌酐测定试剂盒(批号20171102，购自南京建成生物工程研究所)的操作说明书，测定所述血样中的尿酸、尿素氮和肌酐的浓度水平，测定结果如下表2所示(表2中，##表示与空白组比较，P＜0.01；**表示与模型组比较，P＜0.01)。
表2实施例2中各组小鼠血样生化指标的变化(n＝10)
组别 尿酸(mg/L) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(μmol/L)
空白组 26.34±3.89 9.68±1.32 47.58±17.53
模型组 76.88±14.89## 16.38±2.36## 46.56±16.36
别嘌醇组 29.14±5.53** 15.58±2.28 51.96±20.44
别嘌醇可抑制黄嘌呤氧化酶，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转化为尿酸，即尿酸合成减少，进而降低血中尿酸浓度，减少尿酸盐在骨、关节及肾脏的沉着，是抑制尿酸合成的药物，在本实施例中，选取别嘌醇作为阳性药物，验证利用本发明实施例中模型组所构建的高尿酸血症肾损害模型是否成功。结合表2中的测定结果可知，与空白组比较，模型组小鼠血清尿酸及尿素氮水平极显著升高(P<0.01)，说明采用酵母膏联合氧嗪酸钾造模能够建立稳定的高尿酸血症肾损害模型；与模型组比较，别嘌呤组小鼠血清尿酸极显著降低(P<0.01)，说明对于此造模方式，阳性药别嘌醇能有效降低其血清尿酸水平，也说明模型制备成功。
综上所述，本发明提供的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，同时，采用长期增加尿酸前体物质的酵母膏，同时联用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾，对试验小鼠进行造模试验，通过酵母膏和氧嗪酸钾两种造模剂的协同作用，制备出类似于人体高尿酸血症肾损害发病过程的模型，成功构建出合理且效果稳定、符合临床特点的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，其小鼠的血清尿素水平显著升高，小鼠肾功能异常，肾脏病理学组织检查均有不同程度的损害，该模型的重复性好，与人体高尿素血症肾损害发病机制相似，而且对模型动物的一般生长情况无明显副作用，为研究高尿酸血症的病理机制以及筛选抗高尿酸血症肾损害药物提供了一种理想的动物模型。而且，模型组的小鼠血清尿酸的方差比较小，表明模型效果稳定且较容易重复，有利于用作药物筛选的模型。此外，本方法中所采用的模型动物和造模剂均廉价易得，且在14～15天内可诱导出小鼠亚急性高尿酸血症肾损害模型，试验周期短，有利于降低试验成本。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
以酵母膏和氧嗪酸钾为造模剂，对试验小鼠进行持续14～15天的造模试验，获得亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，其中，在所述造模试验期间，每天为试验小鼠给予酵母膏，且在所述造模试验的最后一天，在对试验小鼠给予酵母膏后，再对试验小鼠给予氧嗪酸钾；
观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用。
2.如权利要求1所述的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述酵母膏和氧嗪酸钾的给药剂量对应为15～30g/kg和250～400mg/kg。
3.如权利要求2所述的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述酵母膏和氧嗪酸钾的给药剂量对应为30g/kg和300mg/kg。
4.如权利要求1所述的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述酵母膏的给药方式为灌胃给药，每天一次；
所述氧嗪酸钾的给药方式为腹腔注射一次。
5.如权利要求4所述的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述酵母膏在进行灌胃给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述酵母膏配制成所述酵母膏混悬液；
所述氧嗪酸钾在进行腹腔注射给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述氧嗪酸钾配制成氧嗪酸钾混悬液；
其中，所述羧甲基纤维素钠水溶液中的羧甲基纤维素钠的质量浓度为0.5％。
6.如权利要求1所述的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述造模试验的试验时间为14天。
7.如权利要求1所述的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述试验小鼠为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为18～30g。
8.如权利要求7所述的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述试验小鼠的饲养条件为：饲养环境温度22～26℃，饲养环境湿度40～70％。
9.如权利要求1所述的亚急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用的步骤，具体包括：
在所述造模试验期间，每天对试验小鼠进行称重，并计算相对体重，分析所述造模剂对试验小鼠体重的影响；
在最后一次对试验小鼠使用所述造模剂后1h，从试验小鼠的眼部采集血液样品，将所述血液样品在室温条件下静置1～2h后离心，收集血清，测定所述血清的生化指标，分析所述造模剂对试验小鼠血清生化指标的影响；以及，
在所述造模试验结束后，摘取试验小鼠的全肾组织，作为肾组织样品，将所述肾组织样品用10％的福尔马林溶液固定，然后经过脱水、石蜡包埋、切片以及HE染色处理后，使用光学显微镜观察所述肾组织样品的病理变化并拍照，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用；
其中，所述血样中的生化指标包括尿酸、尿素氮以及肌酐的浓度水平。
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