CN108785312A - 一种急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：以次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾为造模剂，对试验小鼠进行持续多天的造模试验，获得急性高尿酸血症肾损害小鼠模型；观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用。本发明以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，同时，采用尿酸前体物质次黄嘌呤、减少尿酸排泄物质乙胺丁醇和尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾三者的联合作用，建立急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，造模时间短、且符合人体高尿酸血症肾损害的临床特点，适于用作筛选抗高尿酸血症肾损害药物的模型。

Description

一种急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及高尿酸血症动物模型技术领域，特别涉及一种急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法。

背景技术

高尿酸血症是一类体内嘌呤代谢异常或肾脏排泄尿酸功能减弱，从而导致体内尿酸生成过多或排泄减少，进而导致血清尿酸水平过高的一类疾病，是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症，长期高尿酸血症常会诱发肾脏的损害。调查研究结果表明，随着人们生活水平的提高，高尿酸血症的发病率日益上升，高尿酸血症肾损害病例也在增加。目前治疗高尿酸血症肾损伤的药物，毒副作用很大、患者顺应性差。所以需要建立稳定合理的高尿酸血症肾损害模型用以筛选出新的高效低毒的抗高尿酸血症以及高尿酸血症肾病的药物。

现有高尿酸血症肾损害模型大多为大鼠模型，而且制备模型的时间长短不一，其中，时间过短的模型常常只有尿酸的升高，并未出现肾脏损害，与人体高尿酸血症肾病发病过程并不相同；而时间太长的模型往往会对模型动物的一般情况造成影响，可做为病理机制的观察模型，但不利于药物疗效的观察与筛选，因此，现有高尿酸血症肾损害模型不适于用作筛选抗高尿酸血症肾损害药物的模型。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，旨在解决现有高尿酸血症肾损害模型不适于用作筛选抗高尿酸血症肾损害药物的模型的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

以次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾为造模剂，对试验小鼠进行持续6～7天的造模试验，获得急性高尿酸血症肾损害小鼠模型；

观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用。

优选地，所述次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾的给药剂量对应为500～700mg/kg、200～300mg/kg和200～300mg/kg。

优选地，所述次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾的给药剂量对应为600mg/kg、250mg/kg和250mg/kg。

优选地，所述次黄嘌呤和乙胺丁醇的给药方式为灌胃给药，每天一次；

所述氧嗪酸钾的给药方式为皮下注射给药，每天一次。

优选地，所述次黄嘌呤和乙胺丁醇在进行灌胃给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述次黄嘌呤和乙胺丁醇分别配制成次黄嘌呤混悬液和乙胺丁醇混悬液；

所述氧嗪酸钾在进行皮下注射给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述氧嗪酸钾配制成氧嗪酸钾混悬液；

其中，所述羧甲基纤维素钠水溶液中的羧甲基纤维素钠的质量浓度为0.5％。

优选地，所述造模试验的试验时间为7天。

优选地，所述试验小鼠为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为18～30g。

优选地，所述试验小鼠的饲养条件为：饲养环境温度22～26℃，饲养环境湿度40～60％。

优选地，观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用的步骤，具体包括：

在所述造模试验期间，每天对试验小鼠进行称重，并计算相对体重，分析所述造模剂对试验小鼠体重的影响；

在最后一次对试验小鼠使用所述造模剂后1h，从试验小鼠的眼部采集血液样品，将所述血液样品在室温条件下静置1～2h后离心，收集血清，测定所述血清的生化指标，分析所述造模剂对试验小鼠血清生化指标的影响；以及，

在所述造模试验结束后，摘取试验小鼠的全肾组织，作为肾组织样品，将所述肾组织样品用10％的福尔马林溶液固定，然后经过脱水、石蜡包埋、切片以及HE染色处理后，使用光学显微镜观察所述肾组织样品的病理变化并拍照，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用；

其中，所述血清的生化指标包括尿酸、尿素氮以及肌酐的浓度水平。

本发明提供的技术方案中，以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，同时，采用次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾联用作为造模剂，对试验小鼠进行造模试验，进而建立急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，其中，次黄嘌呤为尿酸前体物质，氧嗪酸钾为尿酸酶抑制剂、而乙胺丁醇能减少尿酸排泄，通过多种机制造模剂的协同作用，制备出类似于人体高尿酸血症肾损害发病过程的模型，该模型造模时间短、且符合人体高尿酸血症肾损害的临床特点，而且对小鼠的一般生长情况无明显副作用，适于用作筛选抗高尿酸血症肾损害药物的模型。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中各组小鼠相对体重的计算结果图；

图2为本发明实施例1中空白组小鼠肾组织样品的肾髓质的观测结果图；

图3为本发明实施例1中空白组小鼠肾组织样品的肾小管的观测结果图；

图4为本发明实施例1中模型组小鼠肾组织样品的肾皮质的观测结果图；

图5为本发明实施例1中模型组小鼠肾组织样品的肾髓质的观测结果图；

图6为本发明实施例1中对照组小鼠肾组织样品的肾皮质的观测结果图；

图7为本发明实施例1中对照组小鼠肾组织样品的肾髓质的观测结果图；

图8为本发明实施例2中各组小鼠相对体重的计算结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提出一种急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：以次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾为造模剂，对试验小鼠进行持续6～7天的造模试验，获得急性高尿酸血症肾损害小鼠模型；观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用。

以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，有利于建立与人体高尿酸血症肾损害发病过程类似的高尿酸血症模型。所述试验小鼠可选择生长状况良好、体质健康的小鼠作为试验对象，具有廉价易得、来源广泛且易于饲养的优点，在本实施例中优选为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为18～30g，SPF级昆明小鼠是医学生物研究中常用的试验动物，标准化程度高、便于给药且采样容易，而优选为雄性小鼠，其更为健壮，且符合临床高尿酸血症肾病高发于男性患者的特点，在试验过程中可以尽量避免由于小鼠自身体质不足而导致的试验误差。

进一步地，在所述造模试验期间，应该为所述试验小鼠提供适宜的饲养环境，例如设置一定的环境温度和湿度等，一般来说，小鼠的适宜饲养温度为20～30℃、湿度为40～70％，而在本实施例中，所述试验小鼠的饲养条件优选为：饲养环境温度22～26℃，饲养环境湿度40～60％，且所述试验小鼠为自由采食和饮水，在此种饲养条件下，所述试验小鼠的生长状况更佳，有利于所述造模试验的顺利进行。

采用次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾联用作为造模剂，对试验小鼠进行造模试验，其中，次黄嘌呤为尿酸前体物质，氧嗪酸钾为尿酸酶抑制剂、而乙胺丁醇能减少尿酸排泄，通过多种机制造模剂的协同作用，制备出类似于人体高尿酸血症肾损害发病过程的模型。一般建立动物模型时，造模剂的给药方式可以是将造模剂加入到饲料中进行饲喂，也可以采用药物灌服或者注射的方式进行，在本实施例中，所述次黄嘌呤和乙胺丁醇的给药方式为次黄嘌呤混悬液和乙胺丁醇混悬液混合灌胃，灌胃体积优选为10～20mL/kg(按照试验小鼠的体重计算，每千克体重的药物灌胃体积为10～20mL)，每天一次；所述氧嗪酸钾的给药方式为氧嗪酸钾混悬液皮下注射，每天一次，皮下注射体积优选为10～15mL/kg(按照试验小鼠的体重计算，每千克体重的皮下药物注射体积为10～15mL)。采用灌胃给药和皮下注射给药的方式，相较于将造模剂加入到饲料中饲喂小鼠的方法，其更能够精确控制造模剂的用量，而且针对不同种类的药物，分别采用灌胃给药和皮下注射给药的方式，便于小鼠对所述造模剂的吸收或利用，使所述造模剂对所述试验小鼠的肾功能产生影响而成功建立急性高尿酸血症肾损害小鼠模型。

所述造模剂的给药剂量太低，使所述试验小鼠产生肾损害的时间较长，而所述造模剂的给药剂量太大，不仅无法使所述试验小鼠产生效果更好的高尿酸血症肾损害模型，反而容易造成药物的浪费或者对所述试验小鼠产生其他的副作用。在本实施例中，所述次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾的给药剂量对应为500～700mg/kg、200～300mg/kg和200～300mg/kg，其中，所述给药剂量按照所述试验小鼠的体重进行计算，即所述试验小鼠的每千克体重对应的次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾的给药量为500～700mg、200～300mg和200～300mg。进一步地，所述次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾的给药剂量优选为600mg/kg、250mg/kg和250mg/kg。

所述次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾在进行灌胃给药或皮下注射给药时，一般需要都是将药物配制成药物溶液或药物混悬剂进行，以利于药物在动物体内的吸收，而由于所述次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾的水溶性较差，优选为将上述三种药物配制成药物混悬液的方式进行。另外，在配制药物混悬液时，通常会加入助悬剂(指能增加分散介质的粘度以降低微粒的沉降速度或增加微粒亲水性的附加剂)，以使药物颗粒能够均分分散在溶剂中而形成稳定的药物混悬剂。在本实施例中，所述次黄嘌呤和乙胺丁醇在进行灌胃给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述次黄嘌呤和乙胺丁醇分别配制成次黄嘌呤混悬液和乙胺丁醇混悬液；所述氧嗪酸钾在进行皮下注射之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述氧嗪酸钾配制成氧嗪酸钾混悬液；其中，所述羧甲基纤维素钠水溶液中的羧甲基纤维素钠的质量浓度为0.5％。使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为药物混悬液的助悬剂，其性质稳定、受pH值影响小，有利于使上述三种药物顺利配制成稳定的药物混悬剂，进而便于进行灌胃给药或皮下注射。需要注意的是，所述次黄嘌呤混悬液、乙胺丁醇混悬液和氧嗪酸钾混悬液在使用时需要摇匀后再进行灌胃或者皮下注射。

所述造模试验的试验时间应该根据所述造模试验过程中，所述造模剂对所述试验小鼠肾功能产生的影响而定，试验时间过短，所述造模剂对所述试验小鼠肾功能的影响不显著，无法建立效果稳定的高尿酸血症模型，而在能够成功建立所述高尿素血症肾损害模型的前提下，所述造模试验的试验时间当然应该尽量简短以降低试验成本、减少不必要的工作量。在本实施例中，所述造模试验的试验时间为6～7天，更优选为7天。通过以小鼠作为模型动物，采用次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾联用作为造模剂，在所述造模试验过程中，每天使用所述次黄嘌呤混悬液和乙胺丁醇混悬液混合灌胃一次，同时使用所述氧嗪酸钾混悬液皮下注射一次，连续使用7天，即可成功建立效果稳定的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型。

可选地，观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用的步骤，具体包括：

在所述造模试验期间，每天观察所述试验小鼠的一般生长情况(例如采食、饮水情况是否正常，是否出现腹泻等状况)并称重，计算所述试验小鼠相对体重，分析所述造模剂对所述试验小鼠的一般生长状况和体重的影响，其中，所述试验小鼠相对体重的计算方式为：相对体重(％)＝(给药后每天体重/给药前体重)*100。通过所述试验小鼠体重变化的观测，判断所述造模试验除诱导小鼠发生肾损害之外，是否还会对小鼠产生其他的不良反应。

在最后一次对试验小鼠使用所述造模剂后1h(即最后一次对试验小鼠进行次黄嘌呤和乙胺丁醇混合灌胃、以及氧嗪酸钾皮下注射后1h)，从试验小鼠的眼部(例如眼球或眼眶等部位)采集血液样品，将所述血液样品在室温条件下静置1～2h后离心，收集血清，测定所述血清的生化指标，包括尿酸、尿素氮以及肌酐的浓度水平(分别按照尿酸测定试剂盒、尿素氮测定试剂盒和肌酐测定试剂盒的操作说明书进行测定)，分析所述造模剂对试验小鼠血清生化指标的影响。人体在发生高尿酸血症时，血清生化指标最明显的表现在于：血清尿酸水平和尿素氮水平显著升高，而肌酐水平无明显变化。通过尿酸、尿素氮和肌酐水平的测定，可以明确判断出所述造模试验是否成功诱导所述试验小鼠产生高尿酸血症。

另外，人体在发生高尿酸血症时，会使肾组织出现严重损伤，因此，观测所述试验小鼠的肾组织病理变化，也可以作为判断所述急性高尿酸血症肾损害小鼠模型构建是否成功的参考因素。在所述造模试验结束后，摘取试验小鼠的全肾组织，作为肾组织样品，将所述肾组织样品用10％的福尔马林溶液固定，然后经过脱水、石蜡包埋、切片以及HE染色(苏木精-伊红染色法，hematoxylin-eosin staining，简称HE染色)处理后，使用光学显微镜观察所述肾组织样品的病理变化并拍照，观察所述试验小鼠肾组织的损伤情况，并结合上述测定的血清生化指标的变化情况，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用，进而判断所述造模试验是否成功构建成所述急性高尿酸血症肾损害小鼠模型。

本发明提供的技术方案中，以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，同时，采用次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾联用作为造模剂，进而建立急性高尿酸血症肾损害小鼠模型，其中，次黄嘌呤为尿酸前体物质，氧嗪酸钾为尿酸酶抑制剂、而乙胺丁醇能直接损伤肾功能，通过多种机制造模剂的协同作用，使得试验小鼠的血清尿酸水平显著上升，病理结果也显示出肾脏出现了明显的损伤，表明高尿酸血症肾损害模型构建成功，通过此种方法制备出类似于人体高尿酸血症肾损害发病过程的模型，7天即可成功建立，且该模型的重复性好、效果稳定，与人体高尿素血症肾损害发病机制相似，符合人体高尿酸血症肾损伤的临床特点，而且对模型动物的一般生长情况无明显副作用，适于用作筛选抗高尿酸血症肾损害药物的模型。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建

1、模型动物选取：SPF级雄性昆明种小鼠30只，体重为25～30g，由华中科技大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(鄂)2016-0009，饲养环境温度为22～26℃、湿度为40～60％，小鼠自由采食和饮水。

2、药物溶液配制：将次黄嘌呤(批号G1725018，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、盐酸乙胺丁醇(每粒0.25g，批号T17A002，杭州民生药业有限公司)、氧嗪酸钾盐(批号P137112，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)和腺嘌呤(批号Y26J8C40561，购自上海源叶生物科技有限公司)，均采用0.5％的CMC-Na水溶液配制成混悬液，备用；

3、造模试验：将30只试验小鼠按体重分层随机分为三组，每组10只，分别为空白组、模型组和对照组，进行造模试验，各组小鼠均提供相同量的饮用水和饲料，小鼠均为自由饮食。在造模试验期间，模型组的小鼠每天早上灌胃600mg/kg的次黄嘌呤和250mg/kg的乙胺丁醇一次，同时皮下注射250mg/kg的氧嗪酸钾一次；对照组的小鼠每天早上灌胃100mg/kg的腺嘌呤和250mg/kg的乙胺丁醇一次(参照现有公开文献中的构建高尿酸血症肾损害模型的方法进行)；空白组的小鼠每天早上灌胃相同体积的CMC-Na水溶液(浓度为0.5％)一次；其中，灌胃体积为20mL/kg，皮下注射体积为15mL/kg，共给药及造模7天。

4、指标观测：包括各组小鼠的体重变化、小鼠血清生化指标变化以及肾组织样品的病理变化，观测方法和结果如下：

(1)小鼠体重变化

在造模试验期间，每天观察小鼠的一般生长情况并称重，计算小鼠相对体重(％)＝(给药后每天体重/给药前体重)*100，然后采用SPSS 24.0统计软件进行数据统计，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有极显著统计学意义。造模试验期间各组小鼠相对体重的计算及统计结果如图1所示。

由图1中的结果可知，模型组和对照组的小鼠体重呈上升趋势，但与空白组相比，均无统计学差异(P＞0.05)，说明使用次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾作为造模剂诱导7天，以及使用腺嘌呤和乙胺丁醇作为造模剂诱导7天，对试验小鼠的体重均无明显影响。

(2)血样生化指标变化

在最后一次使用造模剂对小鼠进行诱导处理后1h，从各组小鼠的眼球采集血液样品，在室温下静置1～2h后，以3500r/min的转速离心10min(采用上海安亭科学仪器厂的TGL-16C台式离心机进行)，收集血清，冻存在-20℃温度下，作为血样备用。然后按照尿酸测定试剂盒(尿酸酶比色法，批号20171201，购自南京建成生物工程研究所)、尿素氮测定试剂盒(脲酶法，批号20171103，购自南京建成生物工程研究所)和肌酐测定试剂盒(批号20171102，购自南京建成生物工程研究所)的操作说明书，测定所述血样中的尿酸、尿素氮和肌酐的浓度水平，测定结果如下表1所示(表1中，与空白组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01)。

表1实施例1中各组小鼠血样生化指标的变化(n＝10)

组别	尿酸(μmol/L)	尿素氮(mmol/L)	肌酐(μmol/L)
				空白组	173.7±22.6	5.8±1.1	123.0±8.2
模型组	600.2±49.4##	10.0±1.5##	107.0±7.6
				对照组	149.9±17.8	10.6±2.3##	115.6±23.4

由表1中的测定结果可知，与空白组比较，模型组小鼠血样中的尿酸、尿素氮水平均极显著升高(P＜0.01)，而肌酐水平无显著差异；对照组小鼠血样中的尿酸和肌酐水平无差异，而尿素氮水平极显著升高(P＜0.01)，说明发明采用的以次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾联合使用作为造模剂，诱导7天可成功建立小鼠高尿酸血症肾损害模型。

(3)肾组织样品病理变化

在造模试验结束后，摘取各组小鼠的全肾组织，作为肾组织样品，将肾组织样品用10％的福尔马林溶液固定，然后经过脱水(采用ASP 200S全自动脱水机进行)、石蜡包埋、切片(采用德国徕卡公司的RM2016轮转式切片机进行)以及HE染色处理(采用5300全自动染封一体机进行)后，使用光学显微镜(尼康公司，Eclipse ci光学显微镜)观察所述肾组织样品的病理变化并拍照(标尺＝50μm，放大200倍)，拍摄结果如图2至7所示，其中，图2和图3分别为空白组小鼠肾组织样品的肾髓质和肾小管的观测结果图，图4和图5分别为模型组小鼠肾组织样品的肾皮质和肾髓质的观测结果图，图6和图7分别为对照组小鼠肾组织样品的肾皮质和肾髓质的观测结果图。

由图2至图7中的结果可知，空白组小鼠肾组织样品的肾髓质皮质分界清晰，肾小球毛细血管襻结构清晰，肾小管上皮细胞结构正常，肾小管刷状缘排列整齐规则，未见明显炎症反应；模型组的肾皮质中部分近曲小管内可见嗜酸性不溶性蛋白(图4中A处所示)，肾髓质中未见明显盐类结晶；对照组的肾皮质中多见肾小管上皮细胞水肿(图6中B处所示)，少见肾小管上皮细胞坏死(图6中C处所示)、核固缩、碎裂，少量肾小管扩张，肾髓质中少量小管中可见核碎裂状的细胞(图6和图7中D处所示)。上述观测结果表明，模型组和对照组的试验小鼠都有严重的肾脏损伤，与血清尿素氮检查结果相符。(此处需要说明的是，图2至图7中，虚线圆形标记并不是光学显微镜所观测结果直接显示的，而使为了便于区分肾组织样品发生的病理变化而另外添加的标记。)

综上所述，相比于对照组中采用腺嘌呤和乙胺丁醇作为造模剂，该方法虽然诱导试验小鼠的肾脏出现一定程度的损伤，但是不能显著提高试验小鼠的血清尿酸水平，说明是采用的造模剂导致了试验小鼠的肾损伤，这种造模方法与人体高尿酸血症肾损害的发病机制不符合。而本发明实施例采用的以次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾联合使用作为造模剂，与空白组相比，小鼠血清尿酸和尿素氮水平极显著升高，表明小鼠的血清尿酸有显著升高，肾脏出现了一定的损伤，且病理切片结果显示肾脏损伤，这与血清生化指标相对应。上述结论均表明，通过本发明实施例提供的方法所建立的高尿酸血症肾损害模型，与人体高尿酸血症肾损害的发病机制相似，具有相似的血清生化指标和肾脏病理结果。

实施例2别嘌醇对急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的验证

1、模型动物选取：SPF级雄性昆明种小鼠30只，体重为18～22g，由华中科技大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(鄂)2016-0009，饲养环境温度为22～26℃、湿度为40～60％，小鼠自由采食和饮水。

2、药物溶液配制：将次黄嘌呤(批号G1725018，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、盐酸乙胺丁醇(每粒0.25g，批号T17A002，杭州民生药业有限公司)、氧嗪酸钾盐(批号P137112，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)和别嘌醇(批号Y27O8C46913，购自上海源叶生物科技有限公司)，均采用0.5％的CMC-Na水溶液配制成混悬液，备用；

3、验证试验：将30只试验小鼠按体重分层随机分为三组，每组10只，分别为空白组、模型组和别嘌醇组，进行造模试验，各组小鼠均提供相同量的饮用水和饲料，小鼠均为自由饮食。在造模试验期间，别嘌醇组的小鼠每天早上灌胃5mg/kg的别嘌醇一次，空白组和模型组的小鼠每天早上灌胃等体积的CMC-Na水溶液(浓度为0.5％)一次，然后模型组和别嘌醇组的小鼠在分别灌胃CMC-Na水溶液和别嘌醇后0.5h，给予600mg/kg的次黄嘌呤和250mg/kg的乙胺丁醇混合灌胃一次，同时皮下注射250mg/kg的氧嗪酸钾一次；其中，灌胃体积为10～20mL/kg，皮下注射体积为10～15mL/kg，共给药及造模7天。

4、指标观测：包括各组小鼠的体重变化、小鼠血清生化指标变化以及肾组织样品的病理变化，观测方法和结果如下：

(1)小鼠体重变化

在造模试验期间，每天观察小鼠的一般生长情况并称重，计算小鼠相对体重(％)＝(给药后每天体重/给药前体重)*100，然后采用SPSS 24.0统计软件进行数据统计，数据以()表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有极显著统计学意义。造模试验期间各组小鼠相对体重的计算及统计结果如图8所示。

由图8中的结果可知，各组小鼠的体重都在增长，与正常组相比，模型组小鼠体重增长率无统计学差异，说明本发发明实施例采用的造模方法对小鼠体重无明显的影响。与模型组相比，别嘌醇组小鼠体重增长率亦无统计学差异，但其小鼠体重增加率不如空白组和模型组的快。

(2)血样生化指标变化

在最后一次使用造模剂对小鼠进行诱导处理后1h，从各组小鼠的眼眶采集血液样品，在室温下静置1～2h后，以3500r/min的转速离心10min(采用上海安亭科学仪器厂的TGL-16C台式离心机进行)，收集血清，冻存在-20℃温度下，作为血样备用。然后按照尿酸测定试剂盒(尿酸酶比色法，批号20171201，购自南京建成生物工程研究所)、尿素氮测定试剂盒(脲酶法，批号20171103，购自南京建成生物工程研究所)和肌酐测定试剂盒(批号20171102，购自南京建成生物工程研究所)的操作说明书，测定所述血样中的尿酸、尿素氮和肌酐的浓度水平，测定结果如下表2所示(表2中，##表示与空白组比较，P＜0.01；*表示与模型组比较，P＜0.05，**表示与模型组比较，P＜0.01)。

表2实施例2中各组小鼠血样生化指标的变化(n＝10)

组别	尿酸(μmol/L)	尿素氮(mmol/L)	肌酐(μmol/L)
				空白组	195.7±18.4	6.6±1.6	59.2±28.8
模型组	577.6±52.9##	9.2±1.2##	82.2±20.9
				别嘌醇组	158.2±31.5**	14.4±4.5*	74.7±16.0

由表2中的测定结果可知，与空白组相比，模型组的血清尿酸极显著升高(P＜0.01)，表明高尿酸血症模型制备成功；模型组的血清尿酸氮极显著升高(P＜0.01)，表明肾脏已经出现了明显的损伤；模型组血清肌酐水平有升高的趋势，但是没有统计学差异。综合上述结果，表明模型组的高尿酸血症肾损害模型已成功制备。

别嘌醇可抑制黄嘌呤氧化酶，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转化为尿酸，即尿酸合成减少，进而降低血中尿酸浓度，减少尿酸盐在骨、关节及肾脏的沉着，是抑制尿酸合成的药物，在本实施例中，选取别嘌醇作为阳性药物，验证利用本发明实施例中模型组所构建的高尿酸血症肾损害模型，进行抗高尿酸血症药物筛选的有效与否。与模型组相比，别嘌醇组血清尿酸极显著降低(P＜0.01)，表明对于模型组构建的高尿酸血症肾损害模型，阳性药别嘌醇能有效降低其血清尿酸水平，显示所构建的模型较为合理；别嘌醇组血清尿素氮显著升高(P＜0.05)，显示别嘌醇对肾脏有损害的作用，与其有肾毒性相符。综上所述，表明通过本发明实施例提供的方法构建的高尿酸血症肾损伤模型比较合理，适宜于用作抗高尿酸血症药物筛选的模型。

(3)小鼠脏器指数变化

在造模试验结束后，取各组小鼠肾脏、肝脏、脾脏和胸腺称重，并计算脏器指数，各组小鼠脏器指数的水平变化如下表3所示(表3中，与空白组比较，**表示P＜0.01)。

表3实施例2中各组小鼠脏器指数的水平变化(n＝10)

由表3所知，与正常组相比，模型组和别嘌呤醇组的小鼠肾脏指数极显著上升(P＜0.01)，说明模型组的小鼠肾脏表现出了一定程度的损伤，且别嘌醇并不能起到改善高尿酸血症小鼠的肾损伤作用。与空白组相比，模型组的肝脏、脾脏、胸腺指数均无统计学差异，说明本发明实施例所提供的高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法对小鼠的其他脏器无明显的损伤。

综上所述，本发明提供的高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，将小鼠血清尿酸成功诱导至600μmol/L左右，表明高尿酸血症已经成功制造成功。尿素氮是衡量肾脏功能的重要指标，本构建方法将模型组小鼠的血清尿素氮水平大幅度升高，与空白组相比，有极显著差异(P＜0.01)，表明肾脏功能已经明显受损，病理结果也显示出肾脏出现了明显的损伤，表明高尿酸酸血症肾损伤模型已经成功制备，且血清尿酸水平较为理想，和人的高尿酸血症患者的血清尿酸水平相当，表明此种模型较为合理，且与人体高尿酸血症肾损害的发病机制相似，是一个筛选抗高尿酸血症和抗高尿酸肾损伤药物的良好模型。而且，模型组的小鼠血清尿酸的方差比较小，表明模型效果稳定且较容易重复，有利于用作药物筛选的模型。此外，本方法中所采用的模型动物和造模剂均廉价易得，且一周内可诱导出小鼠急性高尿酸血症肾损害模型，试验周期短，有利于降低试验成本。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

以次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾为造模剂，对试验小鼠进行持续6～7天的造模试验，获得急性高尿酸血症肾损害小鼠模型；

观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用。

2.如权利要求1所述的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾的给药剂量对应为500～700mg/kg、200～300mg/kg和200～300mg/kg。

3.如权利要求2所述的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾的给药剂量对应为600mg/kg、250mg/kg和250mg/kg。

4.如权利要求1所述的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述次黄嘌呤和乙胺丁醇的给药方式为灌胃给药，每天一次；

所述氧嗪酸钾的给药方式为皮下注射给药，每天一次。

5.如权利要求4所述的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述次黄嘌呤和乙胺丁醇在进行灌胃给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述次黄嘌呤和乙胺丁醇分别配制成次黄嘌呤混悬液和乙胺丁醇混悬液；

所述氧嗪酸钾在进行皮下注射给药之前，还包括：以羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂，将所述氧嗪酸钾配制成氧嗪酸钾混悬液；

其中，所述羧甲基纤维素钠水溶液中的羧甲基纤维素钠的质量浓度为0.5％。

6.如权利要求1所述的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述造模试验的试验时间为7天。

7.如权利要求1所述的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述试验小鼠为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为18～30g。

8.如权利要求7所述的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述试验小鼠的饲养条件为：饲养环境温度22～26℃，饲养环境湿度40～60％。

9.如权利要求1所述的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，观测试验小鼠的体重、血清尿酸水平和肾功能变化以及肾脏病理学改变，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用的步骤，具体包括：

在所述造模试验期间，每天对试验小鼠进行称重，并计算相对体重，分析所述造模剂对试验小鼠体重的影响；

在最后一次对试验小鼠使用所述造模剂后1h，从试验小鼠的眼部采集血液样品，将所述血液样品在室温条件下静置1～2h后离心，收集血清，测定所述血清的生化指标，分析所述造模剂对试验小鼠血清生化指标的影响；以及，

在所述造模试验结束后，摘取试验小鼠的全肾组织，作为肾组织样品，将所述肾组织样品用10％的福尔马林溶液固定，然后经过脱水、石蜡包埋、切片以及HE染色处理后，使用光学显微镜观察所述肾组织样品的病理变化并拍照，分析所述造模剂对试验小鼠肾损害的作用；

其中，所述血清的生化指标包括尿酸、尿素氮以及肌酐的浓度水平。