CN111887202A - 一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其中，其包括以下步骤：每天为试验小鼠给予含带鱼饲料以持续7～8天的造模试验；在造模试验的最后两天，每天分别给予次黄嘌呤和氧嗪酸钾。其有益效果是，本发明的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，由于采用次黄嘌呤、氧嗪酸钾和带鱼为造模剂的组合，相对于现有技术而言，其可以通过多种机制造模剂的协同作用，制备出类似于人体高尿酸血症发病过程的模型，从而减少造模时间。

Description

一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及小鼠诱导技术领域，尤其涉及一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法。

背景技术

高尿酸血症是一类体内嘌呤代谢异常或肾脏排泄尿酸功能减弱，从而导致体内尿酸生成过多或排泄减少，进而导致血清尿酸水平过高的一类疾病，是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症，长期高尿酸血症常会诱发肾脏的损害。调查研究结果表明，随着人们生活水平的提高，高尿酸血症的发病率日益上升，高尿酸血症肾损害病例也在增加。目前治疗高尿酸血症的药物，毒副作用很大，患者适应性差。

目前建立高尿酸血症小鼠模型的方法主要采用增加尿酸前体物质、抑制尿酸酶活性及抑制尿酸排泄等方法，多采用大鼠进行造模。

在专利申请号为201810751048.4的发明专利中，以增加尿酸前体物质酵母膏和抑制尿酸酶活性的氧嗪酸钾为造模剂，构建小鼠的亚急性高尿酸血症小鼠模型，此方法耗时较长，而且往往会对模型动物的一般情况造成影响；

在专利申请号为201810751049.9的发明专利中，以次黄嘌呤、乙胺丁醇和氧嗪酸钾作为造模剂，构建小鼠急性高尿酸血症小鼠模型，此方法构建的小鼠急性高尿酸血症模型操作繁琐，模型间个体差异大，不适于用作筛选抗高尿酸血症药物的模型。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种通过以次黄嘌呤、氧嗪酸钾和带鱼为造模剂的急性高尿酸血症肾损害小鼠模型的构建方法，其解决了诱导小鼠模型耗时较长，操作繁琐，模型间个体差异大的技术问题。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

本发明提供一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其包括以下步骤：每天为试验小鼠给予含带鱼饲料以持续7～8天的造模试验；在造模试验的最后两天，每天分别给予次黄嘌呤和氧嗪酸钾。

可选地，在给予含带鱼饲料后次黄嘌呤和氧嗪酸钾再给予。

可选地，将带鱼煮熟干燥后，粉碎成粉末和饲料充分混匀制成饲料后饲喂小鼠。

可选地，次黄嘌呤和氧嗪酸钾的给与方式是分别制成悬液后绩效进行腹腔注射。

可选地，次黄嘌呤和氧嗪酸钾的给药剂量对应为250～500mg/kg、150～300mg/kg。

可选地，带鱼给药剂量为0.4g/只/天。

可选地，试验小鼠为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为30～40g。

可选地，试验小鼠的饲养条件为：饲养环境温度22～24℃，饲养环境湿度40～70％。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：本发明的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，由于采用次黄嘌呤、氧嗪酸钾和带鱼为造模剂的组合，相对于现有技术而言，其可以通过多种机制造模剂的协同作用，制备出类似于人体高尿酸血症发病过程的模型，从而减少造模时间。

其中，次黄嘌呤为尿酸前体物质，氧嗪酸钾为尿酸酶抑制剂，而带鱼为高嘌呤食物，在体内易氧化为尿酸，实现多种机制的协同作用，不仅缩短了造模时间，还可使试验小鼠的血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现。类似于人体高尿酸血症发病过程的模型，且符合人体高尿酸血症的临床特点，适于用作筛选抗高尿酸血症药物的模型。

附图说明

图1为本发明实施例2中各组小鼠相对体重的计算结果图；

图2为本发明实施例3中各组小鼠血清尿酸检测统计结果图；

图3为本发明实施例3中模型+带鱼组小鼠血清尿酸浓度SD值下降的结果图；

图4为本发明实施例3中各组小鼠成模率统计结果图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明为缩短造模时间，提供一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其包括以下步骤：每天为试验小鼠给予含带鱼饲料以持续7～8天的造模试验；在造模试验的最后两天，每天分别给予次黄嘌呤和氧嗪酸钾。

本发明的关键点在于：通过含带鱼饲料、次黄嘌呤和氧嗪酸钾的多种机制的协同作用，缩短造模时间，操作更简单。本发明采用含带鱼饲料使必须的，带鱼是嘌呤含量高的海产品，经试验表明：并不是所有的嘌呤含量高的海产品与本发明中的次黄嘌呤和氧嗪酸钾之间具有协同作用，特别是应用于雄性小鼠的急性高尿酸血症的模型的构建。

本发明通过观测试验小鼠的体重和血清尿酸水平，分析造模剂对试验小鼠高尿酸血症的作用。

为提高含带鱼饲料、次黄嘌呤和氧嗪酸钾之间的多种机制的协同作用，在给予含带鱼饲料后次黄嘌呤和氧嗪酸钾再给予。由于次黄嘌呤为尿酸前体物质，氧嗪酸钾为尿酸酶抑制剂，而带鱼为高嘌呤食物，在体内可氧化为尿酸。

【给药方式】

一般建立动物模型时，造模剂的给药方式可以是将造模剂加入到饲料中进行饲喂，也可以采用药物灌服或者注射的方式进行。

本发明为易于吸收，将带鱼煮熟干燥后，粉碎机粉碎成粉末和饲料充分混匀制成饲料后饲喂小鼠。带鱼的给药方式为加入到饲料中进行饲喂。采用饲料饲喂的给药方式，让小鼠自由饮食，相较于其他给药方式更易操作。

次黄嘌呤和氧嗪酸钾的给药方式为次黄嘌呤混悬液和氧嗪酸钾混悬液分别腹腔注射。本发明以羧甲基纤维素钠水溶液(质量浓度为0.5％)为溶剂，分别将次黄嘌呤、氧嗪酸钾配制成次黄嘌呤混悬液和氧嗪酸钾混悬液。而采用腹腔注射的给药方式，能够精确控制造模剂的用量。

本发明通过定量的投喂含带鱼饲料，可以将小鼠分别独立饲养，便于定量控制饲料，并结合腹腔注射给药的方式，缩短三种造模剂的给药时间。相对于全部通过注射的方式，或者全部通过饲料喂养的方式，本发明的两种给药方式减少了单一方式对小鼠基础身体的影响，便于小鼠对所述造模剂的吸收或利用，间接提高成功率，也简化了操作。本发明的两种给药方式只有在本发明的含带鱼饲料、次黄嘌呤和氧嗪酸钾三种造模剂的前提下才能实现。

【投喂量】

如果造模剂的给药剂量太低，使试验小鼠产生高尿酸血症的时间较长，或者，造模剂的给药剂量太大，不仅无法使所述试验小鼠产生效果更好的高尿酸血症模型，反而容易造成药物的浪费或者对试验小鼠产生其他的副作用。

本发明中，在造模期间，每天投喂，含带鱼饲料的饲喂剂量优选为0.4g/只/天(按照试验小鼠的日进食量计算，成年小鼠日进食量4-8g)。

次黄嘌呤和氧嗪酸钾分别以悬液的形式腹腔注射，在造模的最后两天每天注射，注射体积分别为：为0.1-0.2ml/10g(按照试验小鼠的体重计算，每10g体重的药物注射体积为0.1-0.2ml)，每天一次。

在造模期间，次黄嘌呤和氧嗪酸钾的给药剂量对应为250～500mg/kg、150～300mg/kg。

【试验小鼠】

试验小鼠可选择生长状况良好、体质健康的小鼠作为试验对象，具有廉价易得、来源广泛且易于饲养的优点。为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为30～40g。SPF级昆明小鼠是医学生物学研究中常用的试验动物，标准化程度高、便于给药且采样容易，而优选为雄性小鼠，其更为健壮，且符合临床高尿酸血症高发于男性患者的特点，在试验过程中可以尽量避免由于小鼠自身体质不足而导致的试验误差。

在本发明造模剂的影响下，试验小鼠的饲养条件为：饲养环境温度22～24℃，饲养环境湿度40～70％。试验小鼠为自由采食和饮水，在此种饲养条件下，所述试验小鼠的生长状况更佳，有利于所述造模试验的顺利进行。

【造模时间的选择】

造模剂对试验小鼠肾功能产生的影响而定，试验时间过短，造模剂对试验小鼠肾功能的影响不显著，无法建立效果稳定的高尿酸血症模型。本发明在能够成功建立高尿酸血症模型的前提下，造模试验的试验时间为7～8天，更优选为8天。通过以小鼠作为模型动物，采用带鱼饲料饲喂试验小鼠8天，在第7天和第8天，每天使用次黄嘌呤和氧嗪酸钾悬液腹腔注射一次，连续使用两天，即可成功建立效果稳定的急性高尿酸血症小鼠模型。

本发明还可以通过观测试验小鼠的体重和血清尿酸水平的改变，分析造模剂对试验小鼠高尿酸血症的作用步骤，具体包括：

在造模试验期间，每天观察试验小鼠的一般生长情况(例如采食、饮水情况是否正常，是否出现腹泻等状况)并定期称重，计算试验小鼠相对体重，分析造模剂对试验小鼠的一般生长状况和体重的影响，其中，试验小鼠相对体重的计算方式为：相对体重＝给药后每天体重/给药前体重)。通过试验小鼠体重变化的观测，判断造模试验除诱导小鼠发生高尿酸血症。

在最后一次对试验小鼠使用造模剂后2h(即最后一次对试验小鼠进行次黄嘌呤和氧嗪酸钾腹腔注射后2h)，从试验小鼠的眼部(例如眼球或眼眶等部位)采集血液样品，将血液样品在室温条件下静置1-2h后离心，收集血清，测定血清的生化指标，即尿酸的浓度水平(按照尿酸测定试剂盒的操作说明书进行测定)，分析造模剂对试验小鼠血清尿酸的影响。人体在发生高尿酸血症时，血清生化指标最明显的表现在于：血清尿酸水平显著升高。通过血清尿酸水平的测定，可以明确判断出造模试验是否成功诱导试验小鼠产生高尿酸血症。

本发明以小鼠作为模型动物，其血清尿酸水平和高尿酸血症患者的尿酸水平相当，且血清尿酸水平稳定、易重现，同时，采用次黄嘌呤、氧嗪酸钾和带鱼联用作为造模剂，能更稳定地建立急性高尿酸血症小鼠模型，其中，次黄嘌呤为尿酸前体物质，氧嗪酸钾为尿酸酶抑制剂，而带鱼是含高嘌呤食物，嘌呤在体内可氧化为尿酸，通过多种机制造模剂的协同作用，使得试验小鼠的血清尿酸水平显著上升，表明高尿酸血症模型构建成功，通过此种方法制备出类似于人体高尿酸血症发病过程的模型，8天即可成功建立，且该模型的重复性好、效果稳定，与人体高尿酸血症发病机制相似，符合人体高尿酸血症的临床特点，而且对模型动物的一般生长情况无明显副作用，适于用作筛选抗高尿酸血症药物的模型。

为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1

急性高尿酸血症小鼠模型的构建，其步骤为：

S1模型动物选取：SPF级雄性昆明种小鼠56只，体重为30-40g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK(沪)2018-0004，饲养环境温度为22-24℃、湿度为40-60％，小鼠自由采食和饮水。

S2药物配制：将新鲜带鱼(购自物美超市)放水煮熟，放入烘箱烘干，用粉碎机粉碎成粉末，取试验小鼠饲料，用粉碎机粉碎，和带鱼粉末按照1:10的比例充分混匀后，用热开水将混合粉末弄成糊状，放入饲料压榨机里压成条状，放入烘箱烘干后备用；次黄嘌呤和氧嗪酸钾均采用0.5％羧甲基纤维素钠水溶液配制成混悬液，备用；

S3造模试验：将56只小鼠随机分为7组，每组8只，分别为空白组、模型高剂量组、模型中剂量组、模型低剂量组、模型高剂量+带鱼组、模型中剂量+带鱼组、模型低剂量+带鱼组，进行造模试验，各组小鼠均提供相同量的饮用水和饲料，小鼠均为自由饮食。在造模试验期间，模型高剂量+带鱼组、模型中剂量+带鱼组、模型低剂量+带鱼组以带鱼饲料饲喂8天，在第7天和第8天时，模型高剂量组和模型高剂量+带鱼组每天早上腹腔注射500mg/kg次黄嘌呤和300mg/kg氧嗪酸钾，模型中剂量组和模型中剂量+带鱼组每天早上腹腔注射375mg/kg次黄嘌呤和225mg/kg氧嗪酸钾，模型低剂量组和模型低剂量+带鱼组每天早上腹腔注射250mg/kg次黄嘌呤和150mg/kg氧嗪酸钾一次(参照现有公开文献中的构建高尿酸血症模型的方法进行)；空白组小鼠每天早上腹腔注射相同体积的CMC-Na水溶液(浓度为0.5％)一次；其中，带鱼饲料饲喂量为4g/天/只，腹腔注射体积为100μL/10g，共给药及造模8天。

实施例2小鼠相对体重变化

在实施例1的造模试验期间，每天观察小鼠的一般生长情况并定期称重，计算小鼠的相对体重，小鼠相对体重＝给药后每天体重/给药前体重，然后采用Prism 6.07统计软件进行数据统计，数据以(χ±S)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义，以P<0.01为差异有极显著统计学意义。造模试验期间各组小鼠相对体重的计算及统计结果如图1所示。

由图1中的结果可知，模型组和模型+带鱼组的小鼠体重在第1至第7天呈上升趋势，但与空白组相比，均无统计学差异(P>0.05)，说明带鱼饲料作为造模剂诱导7天，对试验小鼠的体重均无明显影响，但是次黄嘌呤、氧嗪酸钾和带鱼作为造模剂联合诱导1-2天后，模型组和模型+带鱼组小鼠体重下降，但与空白组相比，均无统计学差异(P>0.05)。

实施例3血样生化指标变化

在实施例1的造模试验的最后一次使用造模剂对小鼠进行诱导处理后2h，从各组小鼠的眼球采集血液样品，在室温下静置1-2h后，以4800rpm/min的转速离心15min(采用GENE Company的GENESPEED X1微型离心机进行)，收集血清，按照尿酸测定试剂盒(尿酸酶比色法，批号20190125，购自南京建成生物工程研究所)的操作说明书，测定所述血样中的尿酸浓度水平，测定结果如下表1所示(表1中，与空白组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01)。

表1实施例1中各组小鼠血清尿酸浓度的变化(χ±S，n＝8)

实施例1中各组别小鼠血清尿酸浓度SD值下降的百分比如下计算，模型+带鱼组小鼠血清浓度SD值下降(％)＝(模型加带鱼组小鼠血清浓度SD值-模型组小鼠血清浓度SD值)/模型组小鼠血清浓度SD值*100，数值如表2所示：

表2各组别小鼠血清尿酸浓度SD值下降的百分比

由表1、表2、图2、图3和图4中尿酸测定结果及SD值变化可知，与空白组比较，模型组和模型+带鱼组小鼠血样中的尿酸水平均显著升高(P<0.05)，说明本发明采用的以次黄嘌呤、氧嗪酸钾和带鱼联合使用作为造模剂，诱导8天可成功建立小鼠高尿酸血症模型，而模型组和模型+带鱼组相比较，模型+带鱼组小鼠SD值更小，个体间差异小，尿酸检测值均一，模型+带鱼组小鼠成模率更高。

相比于采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾作为造模剂，该方法虽然诱导试验小鼠出现高尿酸血症，但是试验小鼠血清尿酸个体差异大，说明采用的造模剂稳定性还有待改进。而本发明实施例采用的以次黄嘌呤、氧嗪酸钾和带鱼联合使用作为造模剂，与空白组相比，小鼠血清尿酸水平显著升高。上述结论均表明，通过本发明实施例提供的方法所建立的高尿酸血症模型，与人体高尿酸血症的发病机制相似，具有相似的血清生化指标。

综上所述，本发明提供的高尿酸血症小鼠模型的构建方法，将小鼠血清尿酸成功诱导至500μmol/L左右，表明高尿酸血症模型已经成功构建，且血清尿酸水平较为理想，和人的高尿酸血症患者的血清尿酸水平相当，表明此种模型较为合理，是一个筛选抗高尿酸血症药物的良好模型。而且，模型+带鱼组的小鼠血清尿酸的SD值比较小，表明模型+带鱼效果稳定且较容易重复，有利于用作药物筛选的模型。此外，本方法中所采用的模型动物和造模剂均廉价易得，且8天内可诱导出小鼠急性高尿酸血症模型，试验周期短，有利于降低试验成本。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其特在在于，其包括以下步骤：每天为试验小鼠给予含带鱼饲料以持续7～8天的造模试验；在造模试验的最后两天，每天分别给予次黄嘌呤和氧嗪酸钾。

2.如权利要求1所述的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其特征在于：在给予含带鱼饲料后次黄嘌呤和氧嗪酸钾再给予。

3.如权利要求1所述的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其特征在于：将带鱼煮熟干燥后，粉碎成粉末和饲料充分混匀制成饲料后饲喂小鼠。

4.如权利要求1所述的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其特征在于：次黄嘌呤和氧嗪酸钾的给与方式是分别制成悬液后进行腹腔注射。

5.如权利要求1所述的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述次黄嘌呤和氧嗪酸钾的给药剂量对应为250～500mg/kg、150～300mg/kg。

6.如权利要求1所述的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其特征在于：带鱼给药剂量为0.4g/只/天。

7.如权利要求1所述的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述试验小鼠为SPF级雄性昆明种小鼠，体重为30～40g。

8.如权利要求7所述的急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述试验小鼠的饲养条件为：饲养环境温度22～24℃，饲养环境湿度40～70％。

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