CN105995119A

CN105995119A - 一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料及其制备方法

Info

Publication number: CN105995119A
Application number: CN201610461123.4A
Authority: CN
Inventors: 阮雄中; 马剑; 郑丽蓉
Original assignee: Yangzhou Ji Baili Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yangzhou Ji Baili Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-06-23
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2016-10-12

Abstract

一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料及其制备方法。本发明涉及构建医药实验动物模型技术领域，其制备方法是：按比例称取大豆油及可可脂加热融化呈半流态脂料；再称取原材料：酪蛋白、玉米淀粉、麦芽糊精、蔗糖、纤维素、L‑胱氨酸、复合矿物质、无水磷酸氢钙、碳酸钙、一水合柠檬酸钾、复合维生素和氯化胆碱；将所称取的原材料混合，通过环模制粒机制成直径为10mm，长度为10～20mm的饲料颗粒；再通过除湿机再进行除湿干燥24～48h，最终得干燥后饲料颗粒；将产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。本发明产品营养成分稳定，符合啮齿动物进食习惯的硬度和口感；本发明中的模型成功率高，过程简单，成模效果好。

Description

一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料及其制备方法

技术领域

本发明涉及构建医药实验动物模型技术领域，涉及一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料及其制备方法。

背景技术

肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration，HLD)，又称Wilson病，是一种常染色体隐性遗传性疾病，是先天性铜代谢障碍性疾病。临床上以肝脏损害、肾脏损害、锥体外系症状与角膜色素环等为主要表现。

铜是人体必需的微量元素，作为辅基参与多种重要生物酶合成。正常成人每日从饮食摄取铜2～5mg，约30％在胃、十二指肠及空肠上端吸收入血，大部分与白蛋白疏松结合进入肝细胞，在肝细胞中铜与α2球蛋白牢固结合成铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)，CP有氧化酶活性，呈深蓝色，剩余铜被结合到其他特殊铜蛋白中。正常人每日胆汁排铜量约1200μg。约70％的CP存在于血浆，其余存在于血管外，血液循环中90％～95％的铜结合在CP上。CP有重要生理功能，可作为铜的供体参与细胞色素C及其他铜蛋白合成，具有亚铁氧化酶作用，将亚铁氧化为高铁状态，使氧还原成水。剩余的铜通过胆汁、尿液和汗液排出体外。肝豆状核变性患者铜蓝蛋白合成障碍，90％以上患者血清CP量明显减少，但肝内前铜蓝蛋白(Apo-CP)含量及结构正常，提示生化障碍发生在肝内Apo-CP与铜结合环节，CP合成障碍是本病基本的遗传缺陷。肝内铜代谢紊乱引起血清CP合成障碍，导致CP降低，尿铜排泄增多，胆道排铜减少，过量铜在肝脏、脑、肾脏及角膜等组织沉积致病。

正常肝铜含量为50μg/g干重，肝豆状核变性患者肝铜含量多为250μg以上/g干重。肝脏功能主要指标谷丙转氨酶的正常参考值为0～40U/L。肝豆状核变性患者通常尿铜量>200μg/24h(正常<50μg/24h)。

肝豆状核变性动物模型可以较好地模拟肝铜沉积诱导肝损伤的病理过程，且具有简单实用、重复性好等特点，是研究铜代谢障碍性疾病较为理想的动物模型。

目前，国内常用高剂量硫酸铜溶液对啮齿类动物进行灌胃制作肝豆状核变性动物模型；灌胃法的缺点是：1、在使用过程中灌胃法虽然使用的剂量准确，但是在操作过程中会给动物的身体造成一定的刺激，特别是容易伤及消化道及容易将药物误入气管，从而造成由于呼吸窒息导致动物的非正常性死亡，而且使用灌胃法也不符合啮齿类动物自由采食的进食习惯；2、工作人员在操作过程中不仅操作的工作量大，增加工作人员的工作负担，长时间的操作容易出现差错，从而导致动物的死亡率增加以及增加了实验结果的不稳定性；3、灌胃法容易导致实验动物产生应激反应，并且还容易导致表型不稳定、实验数据有偏差及成模率低；本发明通过使用强化碳酸铜的高铜饲料喂养啮齿类动物，制备过程中采用单一、稳定营养素构成的营养成分稳定的饲料，这样的饲料颗粒具有成型效果好、硬度强、不易破碎的特点，不仅保证了动物的摄食量，并且更好的保证啮齿类动物本身的磨牙过程；符合啮齿动物进食习惯的硬度和口感，本发明诱导的肝豆状核变性动物模型成功率高。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种由单一稳定的营养素构成同时强化碳酸铜(是正常饲料的25～30倍)的造模饲料，该饲料构建肝豆状核变性动物模型的成功率高、成模效果好、可重复性强。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料，由以下重量比的组份组成：酪蛋白15％～30％、玉米淀粉30％～50％、麦芽糊精10％～25％、蔗糖15％～30％、纤维素4％～10％、大豆油1％～8％、可可脂0.5％～7％、L-胱氨酸0.1％～1％、复合矿物质0.5％～4％、无水磷酸氢钙1％～3％、碳酸钙0.2％～1％、一水合柠檬酸钾0.5％～3％、复合维生素0.5％～3％和氯化胆碱0.2％～1％。

所述复合矿物质由下述组分按重量比组成：氯化钠0.1％～1％、氧化镁0.01％～0.2％、硫酸镁0.1％～1％、四水合钼酸铵0.0001％～0.008％、硫酸铬钾0.004％～0.01％、碳酸铜0.02％～0.1％、柠檬酸铁0.05％～0.5％、碳酸锰水合物0.01％～0.1％、碘酸钾0.00005％～0.0005％、氟化钠0.0008％～0.001％、亚硒酸钠0.00005％～0.0005％、碳酸锌0.005％～0.08％和玉米淀粉0.2％～1％。

所述复合维生素由下述组分按重量比组成：维生素A醋酸酯0.0005％～0.005％、维生素D₃ 0.005％～0.05％、维生素E醋酸酯0.08％～0.3％、维生素K₁0.0001％～0.001％、生物素0.001％～0.05％、维生素B₁₂0.001％～0.01％、叶酸0.0001％～0.001％、烟酸0.007％～0.07％、泛酸钙0.005％～0.01％、维生素B₆0.0001％～0.001％、维生素B₂0.0001％～0.001％、维生素B₁0.0001％～0.001％和玉米淀粉0.4％～2.5％。

其制备方法包括以下步骤：

1)、原材料预处理，

首先，称取大豆油1％～8％，可可脂0.5％～7％，将大豆油和可可脂加热至80～90℃融化，加入原材料总重量5％～12％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；搁置待用；

按照比例称取原材料：酪蛋白、玉米淀粉、麦芽糊精、蔗糖、纤维素、L-胱氨酸、复合矿物质、无水磷酸氢钙、碳酸钙、一水合柠檬酸钾、复合维生素和氯化胆碱；

2)、制备混合料，

将所称取的原材料混合，搅拌均匀，加入上述半流态脂料，继续混合2～4分钟；

3)、制备产品，

在20～30℃下，通过环模制粒机制成直径为10mm，长度为10～20mm的饲料颗粒；在18～25℃下，将饲料颗粒通过除湿机再进行除湿干燥24～48h，最终得干燥后饲料颗粒，饲料颗粒中水分的含量为5％～10％；

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

钴60辐射源产生γ射线，作用于微生物，可以直接或者间接破坏微生物的细胞核，从而杀死微生物，起到消毒杀菌的作用。

其中：酪蛋白：具有pH敏感性，在肠胃的酸性环境下可以凝固变成凝胶状因此酪蛋白消化率较缓慢；消化慢有很多好处，可以长时间保护，修复和滋养身体。

玉米淀粉：含有丰富的营养素，玉米中含有大量的卵磷脂、亚油酸、谷物醇、维生素E、纤维素等，具有降血压、降血脂、抗动脉硬化、预防肠癌、美容养颜、延缓衰老等多种保健功效。

麦芽糊精：具有增稠性强，载体性好，发酵性小，填充效果好，不吸潮、无异味、易消化、低热、低甜度等特点。麦芽糊精含有大量的多糖类，另外还含有钙、铁等对人体有益的微量元素及矿物质，并能促进人体正常的物质代谢。

蔗糖：是光合作用的主要产物，是植物储藏、积累和运输糖分的主要形式，由一分子葡萄糖和一分子果糖脱水缩合形成，易溶于水较难溶于乙醇。

纤维素：能保持肠道通畅，排毒通便，维护肌肤健康。

大豆油：含棕榈酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亚油酸、亚麻油酸以及多量的维生素E、维生素D、维生素A、胡萝卜素、钙、磷、铁和丰富的卵磷脂，消化吸收率高达98％。可促进胆固醇分解排泄，减少血液中胆固醇在血管壁的沉积，降低心血管病发病率，保护机体，促进大脑、神经的生长发育。

可可脂：是从可可液块中取出的乳黄色硬性天然植物油脂，是一种非常独特的油脂。是一种既有硬度，溶解得又快的油脂。可可脂是已知最稳定的食用油，含有能防止变质的天然抗氧化剂。

L-胱氨酸：有促进机体细胞氧化和还原机能，增加白血球和阻止病原菌发育等作用。

氯化胆碱：氯化胆碱属B族维生素之一，它是生物组织中乙酰胆碱、卵磷酯和神经磷酯的组成部分，在动物体内可以调节脂肪的代谢与转化，可以预防肝脏中沉积及其组织变性作为一种甲基的供体，可促进氨基酸的再形成，提高氨基酸的利用率。

碳酸铜：提供铜元素，铜是人体必需的微量元素，作为辅基参与多种重要生物酶合成。

无水磷酸氢钙：主要提供磷、钙等矿物质营养，动物极易消化吸收。可加速动物生长发育，缩短育肥期，快速增重；能提高动物的配种率及成活率，同时具有增强动物抗病耐寒能力，对畜禽的软骨症、白痢症、瘫疾症有防治作用。

碳酸钙：可作补钙剂吸收率可达39％，仅次于果酸钙可溶于胃酸，已成为剂型最多、应用最多的补钙剂。

一水合柠檬酸钾：又称枸橼酸钾，用作缓冲剂、螯合剂、稳定剂、抗氧化剂、乳化剂、调味剂等。

维生素D₃：提高肌体对钙、磷的吸收，使血浆钙和血浆磷的水平达到饱和程度；促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全；通过肠壁增加磷的吸收，并通过肾小管增加磷的再吸收；维持血液中柠檬酸盐的正常水平；维生素D₃是活性的7-脱氢胆固醇。

维生素K₁：可促使肝脏合成凝血酶原，用于低凝血酶原血症；还具有镇痛、缓解支气管痉挛的作用，对内脏平滑肌绞痛、胆管痉挛、肠痉挛引起的绞痛有明显的效果；还可以用于多维食品和禽畜饲料的添加剂。

生物素：是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，维持上皮组织结构的完整和健全；增强机体免疫反应和抵抗力；维持正常生长发育。

烟酸：在体内转化为烟酸胺，烟酸胺是辅酶的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化工程和糖类无氧分解的过程。

泛酸钙：用于医药、食品及饲料添加剂。是辅酶A的成分，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢作用。

本发明的有益效果：本发明造模饲料中，强化碳酸铜含量(是正常饲料的25～30倍，正常饲料中铜含量为10mg/kg)，通过高铜饲料饲喂啮齿类动物，诱导肝豆状核变性模型，较好地模拟肝铜沉积诱导肝损伤的病理过程。产品采用单一稳定的营养素构成，营养成分稳定，符合啮齿动物进食习惯的硬度和口感。本发明构建模型成功率高，过程简单，成模效果好。

附图说明

图1是本发明的制备流程示意图；

图2是Wistar大鼠血清铜(Cu)含量曲线图；

图3是Wistar大鼠肝组织铜(Cu)含量曲线图；

图4是Wistar大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)水平曲线图。

具体实施方式

下面就具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

为了理解本发明，下面对本发明进行进一步的详细说明。

一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料，由以下重量比的组份组成：酪蛋白15％～30％、玉米淀粉30％～50％、麦芽糊精10％～25％、蔗糖15％～30％、纤维素4％～10％、大豆油1％～8％、可可脂0.5％～7％、L-胱氨酸0.1％～1％、复合矿物质0.5％～4％、无水磷酸氢钙1％～3％、碳酸钙0.2％～1％、一水合柠檬酸钾0.5％～3％、复合维生素0.5％～3％和氯化胆碱0.2％～1％。

其制备方法包括以下步骤：

1)、原材料预处理，

2)、制备混合料，

3)、制备产品，

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

具体实施例一

1)、原材料预处理，

首先，称取原材料中的材料：大豆油1％，可可脂0.5％，将大豆油和可可脂加热至80℃融化，往加热融化后的大豆油和可可脂混合物中加入原材料总重量5％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；搁置待用；

按照比例称取原材料中其他的材料：酪蛋白15％、玉米淀粉30％、麦芽糊精10％、蔗糖15％、纤维素4％、L-胱氨酸0.1％、复合矿物质0.5％、无水磷酸氢钙1％、碳酸钙0.2％、一水合柠檬酸钾0.5％、复合维生素0.5％和氯化胆碱0.2％；

2)、制备混合料，

将上述所称取的原材料混合，搅拌均匀，加入上述半流态脂料，继续混合2～4分钟；

3)、制备产品，

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

具体实施例二：

1)、原材料预处理，

首先，称取原材料中的材料：大豆油8％，可可脂7％，将大豆油和可可脂加热至90℃融化，往加热融化后的大豆油和可可脂混合物中加入原材料总重量12％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；搁置待用；

按照比例称取原材料中其他的材料：酪蛋白30％、玉米淀粉50％、麦芽糊精25％、蔗糖30％、纤维素10％、L-胱氨酸1％、复合矿物质4％、无水磷酸氢钙3％、碳酸钙1％、一水合柠檬酸钾3％、复合维生素3％和氯化胆碱1％；

2)、制备混合料，

3)、制备产品，

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

具体实施例三：

1)、原材料预处理，

首先，称取原材料中的材料：大豆油4.5％，可可脂3.8％，将大豆油和可可脂加热至85℃融化，往加热融化后的大豆油和可可脂混合物中加入原材料总重量9％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；搁置待用；

按照比例称取原材料中其他的材料：酪蛋白23％、玉米淀粉40％、麦芽糊精18％、蔗糖23％、纤维素7％、L-胱氨酸0.6％、复合矿物质2.3％、无水磷酸氢钙2％、碳酸钙0.6％、一水合柠檬酸钾1.8％、复合维生素1.8％和氯化胆碱0.6％。

2)、制备混合料，

3)、制备产品，

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

经动物试验表明，本发明采用由单一稳定的营养素构成同时强化碳酸铜的高铜饲料；构建模型成功率高，模型制作过程简单，成模效果好；可重复，稳定性好等并为动物试验资料所证明，本发明的有关动物试验资料：

1.动物模型制备

健康雄性Wistar大鼠，40只，3月龄，体重210±25g，随机将大鼠分为模型组和对照组。模型组大鼠喂养本发明高铜饲料，对照组大鼠喂养普通饲料，各组均自由进食、饮水。喂养12周；检测血清和肝组织铜含量，血清谷丙转氨酶(ALT)。

2.血清和肝组织铜(Cu)以及血清谷丙转氨酶(ALT)的测定方法

血清铜检测以待测血清用去离子水1：10稀释后混匀，采用原子吸收分光光度计测量。肝组织300～500mg，先用0.9％NaC1反复洗净，再用干净滤纸吸干，用浓硝酸(分析纯)10mL低温加热进行消化，等组织完全溶解至黄色澄清透明后，用原子吸收法测铜含量。血清标本上自动生化仪测定谷丙转氨酶(ALT)。

3.实验结果

1)、大鼠肝组织的变化

对照组大鼠肝小叶正常，中央静脉、肝血窦结构清晰，模型组大鼠肝脏可见线粒体肿胀，内质网扩张，溶酶体颗粒明显增多。Wistar大鼠喂养高铜饲料12周，肝组织的大量铜离子沉积，最高达到对照组的数十倍，铜离子在肝脏的过量沉积可以导致肝细胞的破坏。

2)、血清和肝组织铜(Cu)含量以及血清谷丙转氨酶(ALT)的变化

模型组大鼠的血清铜含量为(4.68±0.37mg/mL)，显著高于对照组(1.99±0.31mg/mL)；模型组大鼠的肝组织铜含量为(15.93±3.22mg/kg)，显著高于对照组(0.41±0.23mg/kg)，说明随着高铜饲料喂养时间的延长，肝组织和血清铜含量增加，但肝组织的铜含量增加幅度更大。模型组大鼠的血清谷丙转氨酶(ALT)水平为(198.27±15.42U/L)，明显高于对照组(37.06±1.13U/L)。模型组大鼠的谷丙转氨酶大量升高，肝细胞损害严重。

Claims

1.一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料，其特征在于，由以下重量比的组份组成：酪蛋白15％～30％、玉米淀粉30％～50％、麦芽糊精10％～25％、蔗糖15％～30％、纤维素4％～10％、大豆油1％～8％、可可脂0.5％～7％、L-胱氨酸0.1％～1％、复合矿物质0.5％～4％、无水磷酸氢钙1％～3％、碳酸钙0.2％～1％、一水合柠檬酸钾0.5％～3％、复合维生素0.5％～3％和氯化胆碱0.2％～1％。

2.根据权利要求1所述的一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料，其特征在于，所述复合矿物质由下述组分按重量比组成：氯化钠0.1％～1％、氧化镁0.01％～0.2％、硫酸镁0.1％～1％、四水合钼酸铵0.0001％～0.008％、硫酸铬钾0.004％～0.01％、碳酸铜0.02％～0.1％、柠檬酸铁0.05％～0.5％、碳酸锰水合物0.01％～0.1％、碘酸钾0.00005％～0.0005％、氟化钠0.0008％～0.001％、亚硒酸钠0.00005％～0.0005％、碳酸锌0.005％～0.08％和玉米淀粉0.2％～1％。

3.根据权利要求1所述的一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料，其特征在于，所述复合维生素由下述组分按重量比组成：维生素A醋酸酯0.0005％～0.005％、维生素D₃0.005％～0.05％、维生素E醋酸酯0.08％～0.3％、维生素K₁0.0001％～0.001％、生物素0.001％～0.05％、维生素B₁₂0.001％～0.01％、叶酸0.0001％～0.001％、烟酸0.007％～0.07％、泛酸钙0.005％～0.01％、维生素B₆0.0001％～0.001％、维生素B₂0.0001％～0.001％、维生素B₁0.0001％～0.001％和玉米淀粉0.4％～2.5％。

4.一种权利要求1所述的一种构建肝豆状核变性动物模型的高铜饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、原材料预处理，

2)、制备混合料，

3)、制备产品，

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。