CN104664039A - 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用 - Google Patents

一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104664039A
CN104664039A CN201510094674.7A CN201510094674A CN104664039A CN 104664039 A CN104664039 A CN 104664039A CN 201510094674 A CN201510094674 A CN 201510094674A CN 104664039 A CN104664039 A CN 104664039A
Authority
CN
China
Prior art keywords
saury
peptide
mei lade
uric acid
trioxypurine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510094674.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104664039B (zh
Inventor
赵谋明
刘洋
苏国万
赵容钟
赵强忠
林恋竹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGDONG HUATAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201510094674.7A priority Critical patent/CN104664039B/zh
Publication of CN104664039A publication Critical patent/CN104664039A/zh
Priority to PCT/CN2015/098528 priority patent/WO2016138783A1/zh
Priority to US15/554,396 priority patent/US10575537B2/en
Application granted granted Critical
Publication of CN104664039B publication Critical patent/CN104664039B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/04—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from fish or other sea animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/04—Animal proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：将秋刀鱼绞碎，加水加热搅拌，调节pH值至4.2，离心分离，取沉淀；往沉淀物中加水、蛋白酶和单体氨基酸，调节pH值至7.0，水解后再加入还原糖反应，离心，取上清液即为秋刀鱼美拉德肽液；将肽液喷雾干燥得到秋刀鱼美拉德肽干粉。本发明方法实现了酶解与美拉德反应的连续作用制备出美拉德肽，简化生产工艺流程，缩短生产周期，降低生产成本，且制得的目标美拉德肽的降尿酸作用显著，经大鼠动物实验表明采用本发明方法制备的降尿酸美拉德肽可显著降低大鼠的血尿酸水平，并对大鼠的肾脏功能具有一定程度的保护作用。

Description

一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用
技术领域
本发明涉及一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制备方法和应用。
背景技术
尿酸是人体嘌呤代谢的产物。正常状态下，人体血尿酸含量为200～410μmol/L，女性普遍低于男性。人体尿酸水平的升高通常与人体嘌呤代谢异常或肾脏排泄异常息息相关，国际上将男性血尿酸浓度超过420μmol/L、女性超过357μmol/L时定义为高尿酸血症。而高尿酸血症往往会引起通风。痛风在公元前2640年即被埃及人定义，并于公元前400年被记录到希波克拉底的医学著作中。如今，由于饮食结构和生活方式的改变，高尿酸血症及痛风患者也随之增加，已成为现代社会常见的一种风湿性疾病。
人们一般很少关注自已的血尿酸水平，往往是等到出现了痛风的症状才采取治疗。目前以消炎、镇痛治疗为主，如秋水仙碱及非甾体抗炎药物，持续用药1到2周后能明显改善痛风症状。吲哚美辛也能够治疗急性痛风，而注射促肾上腺皮质激素具有更好的、更快速的疗效。别嘌呤醇是目前市面上唯一一款通过抑制黄嘌呤氧化酶活性而减少尿酸生成、降低血尿酸浓度的药物，其作用靶点明确，但起效慢，且在使用初期会加剧痛风症状。但无论是消炎、镇痛药物，还是作用机理明确的别嘌呤醇药物，在治疗时往往会出现一定的毒副作用，因此对于已患有痛风石的患者多采取手术剔除痛风石、矫正关节来进行治疗。而在无症状高尿酸血症的治疗中，医生建议通过调整饮食结构或口服一些食源性的药物来进行治疗，达到缓慢降低血尿酸水平的目的。
蛋白质是我们日常生活中必不可少的营养元素，且在蛋白质中蕴含着很多的生物活性物质——生物活性肽，其中可能具有降血压、降胆固醇、抗血栓、抗癌、抗氧化等生物活性。但这些生物活性肽隐藏在蛋白质内部或仅是蛋白质的某个基因片段，当人们摄食这些蛋白质食物时，蛋白质进入人体胃和肠道中，这些生物活性肽也不能被胃和肠道中酶系作用而完全释放出来。现代生物酶解技术是一种可高效释放蛋白质内部生物活性肽的方法，该法主要是模仿人体内消化系统的蛋白水解过程，且由于是在体外作用，其水解条件和蛋白酶的种类和浓度均可调整，所以可高效获取目标生物活性的生物活性肽。
另外，美拉德反应是食品加工或储存过程中常发生于还原糖与氨基酸、多肽、蛋白质或任何含氮化合物之间的非酶褐变反应，其反应历程较快，内部的成分变化复杂，甚至会生成某些具有较强生物活性的物质，如目前报道较多的是美拉德反应可以显著增强蛋白肽的抗氧化活性，因此，美拉德反应也是一种提升蛋白肽生物活性的有效的处理手段之一。
秋刀鱼属于海洋中上层鱼类，其肉含有丰富的蛋白质，但附加值较低，主要作为食用或饲料，价格低廉。目前已有通过生物酶解制备抗氧化肽的研究，仍未见利用秋刀鱼来制备降尿酸组分的研究。如果以秋刀鱼为原料制备出具有明显降低尿酸的蛋白肽产品，不仅可拓展秋刀鱼的应用领域和提高其经济价值，更重要的可改善人们的生活质量，具有极大的社会意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，该方法的创新点在于实现酶解与美拉德反应的连续作用，以及外加单体氨基酸作为酶解体系的底物抑制剂来达到调节酶解进程的目的。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽。
本发明的再一目的在于提供上述的秋刀鱼美拉德肽的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)秋刀鱼预处理：秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质量3～5倍的水，在40～50℃下加热搅拌1～2小时，调节体系pH值至4.2，继续搅拌加热1～1.5小时，离心分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物；
(2)酶解-美拉德连续发应：往秋刀鱼沉淀物中加入其质量1～1.5倍的水，然后加入蛋白酶和单体氨基酸，调节体系pH值至7.0，在50～55℃下保温水解6～9小时后，加入还原糖，在100～121℃下加热1.0～2.0小时，离心，取上清液，得到秋刀鱼美拉德肽液；将美拉德肽液真空浓缩、喷雾干燥，得到秋刀鱼美拉德肽干粉；
以秋刀鱼沉淀物的质量为计算基准，蛋白酶的加入量占1.5～3.0％，单体氨基酸的加入量占0.1～0.3％，还原糖的加入量占0.5～2.5％；
所述的调节体系pH值是用0.5mol/L的NaOH溶液或HCl溶液调节；
所述的离心是5000r/min离心15～20min；
步骤(2)所述的蛋白酶是商业用的碱性蛋白酶和风味蛋白酶，优选诺维信公司的碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L)和风味蛋白酶(Flavourzyme 500MG)；
步骤(2)所述的单体氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸，优选色氨酸；
步骤(2)所述的还原糖为葡萄糖、木糖或核糖。
由上述方法制得的秋刀鱼美拉德肽可用于制备降尿酸药物或保健品；使用时，所述的秋刀鱼美拉德肽可以与具有降尿酸作用的中草药复配。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明结合生物酶解和美拉德反应技术来制备具有降尿酸作用的美拉德肽，首先通过在酶解前期添加单体氨基酸，一方面可直接增加最终酶解产物中某些氨基酸的含量，另一方面通过对酶解体系进行底物抑制，反向调控酶解进程，促成或抑制某些氨基酸的生成，改变酶解产物的氨基酸组成，提高酶解产物的降尿酸活性或美拉德反应活性；然后在酶解结束后直接添加还原糖实现酶解与美拉德反应的连续作用制备出美拉德肽，既简化了生产工艺流程，缩短生产周期，降低生产成本，又使制得的目标美拉德肽的降尿酸作用显著增强，经大鼠动物实验表明采用本发明方法制备的降尿酸美拉德肽可显著降低大鼠的血尿酸水平，并对大鼠的肾脏功能具有一定程度的保护作用。
(2)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、所得美拉德肽的降尿酸活性强。
附图说明
图1是实施例2和对比例产品的尿酸峰色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下各实施例中，采用反相高效液相色谱法测定尿酸值的方法如下：
(1)溶液的配置
0.2mol/L(pH 7.5)磷酸缓冲液(PBS)：准确称取30.0838g Na2HPO4·12H2O和2.4962g NaH2PO4·2H2O，用去离子水溶解，定容至500ml。
黄嘌呤溶液：准确称取6.4mg黄嘌呤，先用1ml 1M NaOH将其溶解，再加入100ml PBS，以1M HCl调节pH值至7.5。
黄嘌呤氧化酶：取120μl酶液，以PBS稀释至8ml。
尿酸标曲：准确称取10mg尿酸，加入10ml水，再稀释至0.1～0.9mg/ml。
醋酸胺-冰醋酸：准确称取醋酸胺3.85g定容至1000ml，然后加入4ml冰醋酸。
(2)样品预处理：
将样品稀释至40mg/ml，在96孔酶标板中依次加入50μl样品与50μl黄嘌呤，每个样品做3个平行，37℃保温10min后加入150μl黄嘌呤氧化酶，37℃继续保温20min后加入80μl 1M HCl终止反应，过0.25μm水性膜，待测。
色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱(5μm，4.6×250mm,安捷伦),
液相条件：洗脱液为10％甲醇+90％醋酸胺-冰醋酸溶液，进样体积为20μL，流速1ml/min，检测波长为290nm，运行时间10min。
(3)计算公式
式中：
A0——未添加肽样品进行高效液相色谱分析，尿酸峰的峰面积
A——添加肽样品进行高效液相色谱分析，尿酸峰的峰面积
以下各实施例中，肽样品对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用的实验方法如下：
(1)实验材料
动物：SPF级SD大鼠140只，雄性，体重200±20g，购自广州中医药大学实验动物中心。
药品和试剂：别嘌醇片(广东彼迪药业有限公司)；氧嗪酸钾(山东中科泰斗化学有限公司)；羧甲基纤维素钠(上海赛璐珞厂)；尿酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
仪器：TGL-16G型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；多功能酶标仪(BioTelc USA,Synergy HT)。
动物饲养状况：动物饲养于暨南大学SPF级实验动物中心，饲养鼠料、铺料均由暨南大学实验动物中心提供。自由食水，灯照12h，室温为(20±2)℃，相对湿度(60～70)％。
(2)实验方法
动物分组和造模：取正常健康SD雄性大鼠140只，随机分为正常对照组(20只)和造模组(120只)，造模组大鼠每天灌胃氧嗪酸钾(2g/kg)，连续处理7天，然后3％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，眼结膜取血(0.5ml)，以4℃、3000r/min、离心15min，取上层血清测定尿酸含量；正常对照组大鼠灌胃给予等容积的溶媒。将尿酸含量高于110umol/L的大鼠确定为造模成功。
将造模成功的大鼠按尿酸含量随机分为模型对照组(等容积溶媒)、受试药肽样品组(200mg/kg)和别嘌醇组(50mg/kg)，每组大鼠14只，每只每天灌胃氧嗪酸钾(2g/kg)，灌胃给药(给药容积10ml/kg)，模型大鼠给予等容积的蒸馏水。上述肽样品处理10d、20d时，于末次给药50min，3％戊巴比妥钠(30mg/kg)后，眼结膜取血(0.5ml)，测定血清尿酸含量；抗痛风肽处理第30d时，3％戊巴比妥钠麻醉后腹腔动脉取血5ml，除测定血清尿酸含量外，同时测定血清肌酐和尿素氮含量。
血清尿酸测定：采用钨酸法并严格按试剂盒说明进行操作和测定。
血清尿素氮和肌酐测定：采用二乙酰肟法测定血清尿素氮含量；采用苦味酸法测定血清肌酐含量，具体操作严格按试剂盒说明进行测定。
血清黄嘌呤氧化酶(XOD)及腺苷脱氨酶(ADA)活力测定XOD测定取血清100μL，ADA测定取血清20μL，均按试剂盒说明和操作要求进行测定。
统计学处理：所有数据均以表示，采用spss16.0统计软件处理，各组组间差异比较采用t检验方法，P<0.05为差异具有统计学意义。
实施例1
一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)秋刀鱼预处理：将秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质量3倍的水，在40℃下加热搅拌2小时，然后加入HCl溶液(0.5mol/L)调整体系pH至4.2，继续搅拌加热1小时，离心(5000r/min，15～20min)分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物。
(2)酶解-美拉德连续反应：往秋刀鱼沉淀物中加入1倍的水，采用0.5mol/L的NaOH溶液将体系pH调至7.0，将秋刀鱼浆液温度升至55℃，加入秋刀鱼沉淀物质量0.5％的诺维信公司的Alcalase 2.4L和1.0％的诺维信公司的Flavourzyme500MG，以及0.10％的酪氨酸，在55℃下保温水解6小时后，加入秋刀鱼沉淀物质量的0.5％木糖，在110℃下加热1.5小时，然后在5000r/min下离心15～20min，取上清液，得到秋刀鱼美拉德肽液；
(3)将秋刀鱼美拉德肽液真空浓缩至固形物30％以上，喷雾干燥，得秋刀鱼美拉德肽产品A。
秋刀鱼美拉德肽产品A产品对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
实施例2
一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)秋刀鱼预处理：将秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质量5倍的水，在50℃下加热搅拌1小时，然后加入HCl溶液(0.5mol/L)调整体系pH至4.2，继续搅拌加热1.5小时，离心(5000r/min，15～20min)分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物。
(2)酶解-美拉德连续反应：往秋刀鱼沉淀物中加入1.5倍的水，采用0.5mol/L的NaOH溶液将体系pH调至7.0，将秋刀鱼浆液温度升至50℃，加入秋刀鱼沉淀物质量0.8％的诺维信公司的Alcalase 2.4L和1.2％的诺维信公司的Flavourzyme 500MG，以及0.20％的色氨酸，在50℃下保温水解9小时后，加入秋刀鱼沉淀物质量的1.5％葡萄糖，在121℃下加热1.0小时，然后在5000r/min下离心15～20min，取上清液，得到秋刀鱼美拉德肽液；
(3)将秋刀鱼美拉德肽液真空浓缩至固形物30％以上，喷雾干燥，得秋刀鱼美拉德肽产品B。
秋刀鱼美拉德肽产品B产品对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
秋刀鱼美拉德肽产品B尿酸峰色谱图如图1。
实施例3
一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)秋刀鱼预处理：将秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质量4倍的水，在45℃下加热搅拌1.5小时，然后加入HCl溶液(0.5mol/L)调整体系pH至4.2，继续搅拌加热1.2小时，离心(5000r/min，15～20min)分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物。
(2)酶解-美拉德连续反应：往秋刀鱼沉淀物中加入1.2倍的水，采用0.5mol/L的NaOH溶液将体系pH调至7.0，将秋刀鱼浆液温度升至53℃，加入秋刀鱼沉淀物质量0.5％的诺维信公司的Alcalase 2.4L和1.5％的诺维信公司的Flavourzyme 500MG，以及0.3％的苯丙氨酸，在53℃下保温水解9小时后，加入秋刀鱼沉淀物质量的2.5％葡萄糖，在100℃下加热2.0小时，然后在5000r/min下离心15～20min，取上清液，得到秋刀鱼美拉德肽液；
(3)将秋刀鱼美拉德肽液真空浓缩至固形物30％以上，喷雾干燥，得秋刀鱼美拉德肽产品C。
秋刀鱼美拉德肽产品C产品对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
对比例1
一种秋刀鱼肽，其制备方法如下：
(1)将秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质量5倍的水，在50℃下加热搅拌1小时，然后加入HCl溶液(0.5mol/L)调整体系pH至4.2，继续搅拌加热1.5小时，离心(5000r/min，15～20min)分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物。
(2)往秋刀鱼沉淀物中加入1.5倍的水，采用0.5mol/L的NaOH溶液将体系pH调至7.0，将秋刀鱼浆液温度升至50℃，加入秋刀鱼沉淀物质量0.8％的诺维信公司的Alcalase 2.4L和1.2％的诺维信公司的Flavourzyme 500MG，在55℃下保温水解9小时后，在95℃下加热15min灭酶，然后在5000r/min下离心15～20min，取上清液，得到秋刀鱼肽液；
(3)将秋刀鱼肽液真空浓缩至固形物30％以上，喷雾干燥，得对比产品1。
对比产品1对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
对比产品1尿酸峰色谱图如图1。
对比例2
一种秋刀鱼肽，其制备方法如下：
(1)将秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质量5倍的水，在50℃下加热搅拌1小时，然后加入HCl溶液(0.5mol/L)调整体系pH至4.2，继续搅拌加热1.5小时，离心(5000r/min，15～20min)分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物。
(2)往秋刀鱼沉淀物中加入1.5倍的水，采用0.5mol/L的NaOH溶液将体系pH调至7.0，将秋刀鱼浆液温度升至50℃，加入秋刀鱼沉淀物质量0.8％的诺维信公司的Alcalase 2.4L和1.2％的诺维信公司的Flavourzyme 500MG，以及0.15％的色氨酸，在55℃下保温水解9小时后，在95℃下加热15min灭酶，然后在5000r/min下离心15～20min，取上清液，得到秋刀肽液；
(3)将秋刀鱼肽液真空浓缩至固形物30％以上，喷雾干燥，得对比产品2。
对比产品2对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
对比产品2尿酸峰色谱图如图1。
对比例3
一种秋刀鱼肽，其制备方法如下：
(1)将秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质量5倍的水，在50℃下加热搅拌1小时，然后加入HCl溶液(0.5mol/L)调整体系pH至4.2，继续搅拌加热1.5小时，离心(5000r/min，15～20min)分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物。
(2)往秋刀鱼沉淀物中加入1.5倍的水，采用0.5mol/L的NaOH溶液将体系pH调至7.0，将秋刀鱼浆液温度升至50℃，加入秋刀鱼沉淀物质量0.8％的诺维信公司的Alcalase 2.4L和1.2％的诺维信公司的Flavourzyme 500MG，在55℃下保温水解9小时后，加入秋刀鱼沉淀物质量的0.5％葡萄糖，在121℃下加热1.0小时，然后在5000r/min下离心15～20min，取上清液，得到秋刀鱼美拉德肽液；
(3)将秋刀鱼美拉德肽液真空浓缩至固形物30％以上，喷雾干燥，得对比产品3。
对比产品3对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
对比产品3尿酸峰色谱图如图1。
表1金枪鱼提取物作用不同时间对氧嗪酸钾诱致高尿酸血症大鼠血清尿酸含量的影响
注：与正常组比较：ap<0.01,cp>0.05；与模型组比较：bp<0.01,cp<0.05,fp>0.05.
表2金枪鱼提取物作用30d对氧嗪酸钾诱致高尿酸血症大鼠血清肌酐及尿素氮含量的影响
注：与正常对照组比较：ap<0.01.与模型组比较：bp<0.01,cp<0.05,fp>0.05.
表3实施例及对照例产品30d对氧嗪酸钾诱致高尿酸血症大鼠血清ADA及XOD含量的影响
注：与正常对照组比较：ap<0.01.与模型组比较：bp<0.01,cp<0.05,fp>0.05.
在人体的嘌呤代谢中，ATP等经过一系列的代谢反应，生成次黄嘌呤及黄嘌呤，而两者皆会被人体内的黄嘌呤氧化酶(XOD)氧化生成尿酸，因此，抑制黄嘌呤氧化酶的活性，从某种程度上可抑制了尿酸的生成，降低体内尿酸水平。
本发明采用体外高效液相色谱法测定黄嘌呤氧化酶的被抑制情况，首先是将待测样品与黄嘌呤氧化酶混合使其相互作用，如果样品能够与黄嘌呤氧化酶发生作用，并抑制该酶的酶活力，那么在黄嘌呤水解体系中，生成的尿酸量将会减少，通过检测尿酸的生成量将可计算出黄嘌呤氧化酶的抑制率。
由图1可见，与空白组(PBS)相比，实施例和对比例中得到的产品均能起到抑制黄嘌呤氧化酶活力的作用，但不同的产品呈现出明显不同的抑制率。对比产品1的黄嘌呤氧化酶抑制率达到10.40％，说明采用酶解的方法水解秋刀鱼蛋白可得到具有一定降尿酸活性的蛋白肽产品；对比产品2的黄嘌呤氧化酶抑制率提升到了12.34％，提高了18.7％左右，而对比产品1与2相比，主要的区别是产品2在酶解前加入了单体氨基酸，由于在酶解过程中，随着酶解的进行，单体氨基酸会对酶解体系产生底物抑制的作用，改变最终酶解产物的氨基酸组成，从而提高降尿酸的活性；对比产品3的黄嘌呤氧化酶抑制率较对比产品1和2均有明显的提升，对比产品3主要是在1的基础上添加还原糖进行了美拉德反应，说明秋刀鱼酶解产物在美拉德反应的过程中产生了具有较强降尿酸作用的物质。上述可知，秋刀鱼酶解产物具有一定的降尿酸作用，此外，加入单体氨基酸协同水解或对酶解产物进行美拉德反应均能提升其降尿酸活性。因此，结合该三种方法制备得到的秋刀鱼美拉德肽B(实施例2)的黄嘌呤氧化酶抑制率高达25.59％。
由表1可见，模型大鼠在氧嗪酸钾处理近40d时，血清尿酸含量明显增高(p<0.01)，而采用别嘌醇处理后，大鼠的血清尿酸含量显著降低(p<0.01)，主要是因为别嘌呤醇本身就是通过抑制黄嘌呤氧化酶活性而减少尿酸生成、降低血尿酸浓度的药物。而其他给药组(实施例产品和对比例产品)均具有明显的降低大鼠血清尿酸的作用，整体来说，实施例的产品比对比例产品的降尿酸作用更强。
表2显示给药后大鼠的血清肌酐及尿素氮含量情况，由结果可知，各实施例产品均能显著降低大鼠血清肌酐及尿素氮含量(p<0.01)。而血肌酐是人体肌肉代谢的产物，尿素氮是人体蛋白质代谢的主要终末产物。正常情况下，两者均由肾小球滤过后经肾脏排出体外，其血浆中的水平可以反映出肾脏功能的状态。上述结果表明采用本发明工艺制备的秋刀鱼美拉德肽有明显降低血肌酐水平的作用，对该高尿酸模型大鼠的肾脏功能具有一定程度的保护作用。
黄嘌呤氧化酶(XOD)和腺苷脱氨酶(ADA)是尿酸代谢的关键酶。其中XOD广泛存在于各种动物及人体内。其主要存在于肝脏中，其次是小肠，其余组织中的含量不足肝和小肠含量的3％。它能够连续氧化黄嘌呤和次黄嘌呤生成尿酸，直接调控体内尿酸水平的变化；而ADA则可催化腺嘌呤核苷分解为次黄嘌呤核苷，最终经过XOD的氧化作用生成尿酸。XOD与ADA活性的升高有利于促进核酸的分解代谢，促进尿酸的生成增加。由表3可见，在氧嗪酸钾处理动物近40d时，模型大鼠血清黄嘌呤氧化酶(XOD)与腺苷脱氨酶(ADA)活力明显增强(p<0.01)。实施例产品(秋刀鱼美拉德肽A、B、C)表现出较强的降低大鼠血清ADA及XOD含量的作用，虽然对比例产品也对这两种酶具有一定的降低作用，但整体比实施例产品的作用要差。
综上所述，采用本发明制备的降尿酸肽对高尿酸所致大鼠肾脏功能损伤引起的血中高尿素氮和肌酐水平有降低作用，提示其对肾脏功能具有一定的保护作用，且能降低血清中XOD和ADA酶活力，提示其是通过降低关键酶的酶活力，以致减少核酸的分解代谢来达到减少尿酸生成的目的。因此，采用本发明方法制备的降尿酸肽具有较好的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)秋刀鱼预处理：秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质量3～5倍的水，在40～50℃下加热搅拌1～2小时，调节体系pH值至4.2，继续搅拌加热1～1.5小时，离心分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物；
(2)酶解-美拉德连续发应：往秋刀鱼沉淀物中加入其质量1～1.5倍的水，然后加入蛋白酶和单体氨基酸，调节体系pH值至7.0，在50～55℃下保温水解6～9小时后，加入还原糖，在100～121℃下加热1.0～2.0小时，离心，取上清液，得到秋刀鱼美拉德肽液；将肽液真空浓缩、喷雾干燥，得到秋刀鱼美拉德肽干粉；
以秋刀鱼沉淀物的质量为计算基准，蛋白酶的加入量占1.5～3.0％，单体氨基酸的加入量占0.1～0.3％，还原糖的加入量占0.5～2.5％；
步骤(2)所述的单体氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；
步骤(2)所述的还原糖为葡萄糖、木糖或核糖。
2.根据权利要求1所述的具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的蛋白酶为碱性蛋白酶和风味蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，其特征在于：碱性蛋白酶为诺维信公司的Alcalase 2.4L，风味蛋白酶为诺维信公司的Flavourzyme 500MG。
4.一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽，其特征在于：是由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。
5.权利要求4所述的秋刀鱼美拉德肽在制备降尿酸药物或保健品中的应用。
6.根据权利要求5所述的秋刀鱼美拉德肽在制备降尿酸药物或保健品中的应用，其特征在于：所述的秋刀鱼美拉德肽与具有降尿酸作用的中草药复配。
CN201510094674.7A 2015-03-03 2015-03-03 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用 Active CN104664039B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510094674.7A CN104664039B (zh) 2015-03-03 2015-03-03 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用
PCT/CN2015/098528 WO2016138783A1 (zh) 2015-03-03 2015-12-23 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用
US15/554,396 US10575537B2 (en) 2015-03-03 2015-12-23 Saury Maillard peptide and its preparation method and application

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510094674.7A CN104664039B (zh) 2015-03-03 2015-03-03 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104664039A true CN104664039A (zh) 2015-06-03
CN104664039B CN104664039B (zh) 2017-08-25

Family

ID=53300044

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510094674.7A Active CN104664039B (zh) 2015-03-03 2015-03-03 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10575537B2 (zh)
CN (1) CN104664039B (zh)
WO (1) WO2016138783A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016138783A1 (zh) * 2015-03-03 2016-09-09 华南理工大学 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用
CN106928345A (zh) * 2017-03-03 2017-07-07 江西师范大学 一种高抗氧化活性鱼胶原多肽的制备方法
CN108841908A (zh) * 2018-08-03 2018-11-20 福建中医药大学 一种具有降尿酸活性的海洋低聚肽的制备方法
WO2019140815A1 (zh) * 2018-01-16 2019-07-25 江门市江户泉食品有限公司 鳗鱼酱油及其制作方法
CN111887202A (zh) * 2020-08-26 2020-11-06 安发（福建）生物科技有限公司 一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法
CN112245563A (zh) * 2020-09-29 2021-01-22 古鲟（大连）生物科技发展有限公司 可降尿酸的鲟鱼肽复合粉

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102325312B1 (ko) * 2020-01-02 2021-11-11 한국식품연구원 그래프팅기술을 이용한 곤충 유래 식품 단백질의 제조방법 및 이에 따라 제조된 곤충 유래 조성물
CN111533783B (zh) * 2020-05-21 2022-03-18 昆明医科大学 一种抗痛风活性多肽rdp2及其制备方法与应用
CN113735934B (zh) * 2021-09-14 2023-08-08 江南大学 一种选择性制备肽美拉德反应中间体和糖肽交联物的方法
CN116803295B (zh) * 2023-06-19 2024-05-03 成都六然医疗科技有限公司 一种降尿酸组合物及其制备方法
CN117229354B (zh) * 2023-09-21 2024-02-27 中国海洋大学 一种金枪鱼源降尿酸混合物、组合物、制备方法及应用
CN117285596B (zh) * 2023-11-27 2024-01-26 中国科学院烟台海岸带研究所 一种具有降尿酸功能的六肽rl6及其应用
CN117820431B (zh) * 2024-03-04 2024-05-28 中国农业大学 一种具有降尿酸功效的青稞酒糟肽及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101589793A (zh) * 2009-06-30 2009-12-02 华南理工大学 一种鱼类调味品及其制备方法
CN104337836A (zh) * 2014-09-30 2015-02-11 华南理工大学 一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1166316C (zh) * 2001-07-12 2004-09-15 广东省微生物研究所 利用低值小杂鱼制备蛋白提取物的方法
KR100901188B1 (ko) * 2007-07-24 2009-06-04 주식회사 바이오뉴트라 꽁치류의 가수분해물을 포함하는 인지기능장애 예방 또는개선용 조성물
KR101126163B1 (ko) * 2009-11-06 2012-03-22 한국식품연구원 장기 숙성 재래 간장에서 분리한 메일라드 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 ｔｒｐｖ１ 활성 관련 질환 또는 염증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN101986872A (zh) * 2010-09-02 2011-03-23 天津春发食品配料有限公司 一种天然鱼肉香精
KR101275750B1 (ko) * 2011-02-15 2013-06-17 황문일 꽁치 액젓을 이용한 장류 및 이의 제조방법
CN104664039B (zh) 2015-03-03 2017-08-25 华南理工大学 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101589793A (zh) * 2009-06-30 2009-12-02 华南理工大学 一种鱼类调味品及其制备方法
CN104337836A (zh) * 2014-09-30 2015-02-11 华南理工大学 一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孟艳丽: "《温度对鲢鱼肽美拉德反应产物的》", 《海洋湖沼通报》 *
李银娟: "低苦味大豆抗氧化肽的制备及应用", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技Ⅰ辑》 *
董蕊: "蜂蜜中氨基酸含量对抗氧化能力的影响", 《食品科学》 *
陈建华: "秋刀鱼蛋白酶解物的制备及氨基酸评价", 《食品研究与开发》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016138783A1 (zh) * 2015-03-03 2016-09-09 华南理工大学 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用
US10575537B2 (en) 2015-03-03 2020-03-03 South China University Of Technology Saury Maillard peptide and its preparation method and application
CN106928345A (zh) * 2017-03-03 2017-07-07 江西师范大学 一种高抗氧化活性鱼胶原多肽的制备方法
CN106928345B (zh) * 2017-03-03 2020-06-09 江西师范大学 一种高抗氧化活性鱼胶原多肽的制备方法
WO2019140815A1 (zh) * 2018-01-16 2019-07-25 江门市江户泉食品有限公司 鳗鱼酱油及其制作方法
CN108841908A (zh) * 2018-08-03 2018-11-20 福建中医药大学 一种具有降尿酸活性的海洋低聚肽的制备方法
CN111887202A (zh) * 2020-08-26 2020-11-06 安发（福建）生物科技有限公司 一种急性高尿酸血症小鼠模型的构建方法
CN112245563A (zh) * 2020-09-29 2021-01-22 古鲟（大连）生物科技发展有限公司 可降尿酸的鲟鱼肽复合粉

Also Published As

Publication number Publication date
US10575537B2 (en) 2020-03-03
CN104664039B (zh) 2017-08-25
US20180042264A1 (en) 2018-02-15
WO2016138783A1 (zh) 2016-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104664039A (zh) 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用
US10455849B2 (en) Method for the preparation of a protein peptide, a protein peptide and use thereof
US6262019B1 (en) Method of treatment of glutathione deficient mammals
JP4897229B2 (ja) メイラード反応阻害剤
CN100512808C (zh) 促进创面修复愈合的复方氨基酸外用制剂及制法和其应用
CN104673865B (zh) 具有降尿酸作用的秋刀鱼美拉德肽及其制备方法和用途
CN102526698A (zh) 虫草多肽氨基酸营养液
CN111887370A (zh) 一种降尿酸海洋鱼低聚肽壳寡糖固体饮料
CN109939143A (zh) 一种用于降血糖控制并发症的中药组合物及其制备方法
CN111802653A (zh) 一种金枪鱼低聚肽粉组合物及其制备方法和应用
CN101428037B (zh) 含修复因子的抗衰老组合物
CN104757535A (zh) 黑枸杞减肥片(茶)
Cui et al. Screening of xanthine oxidase inhibitory peptides by ligand fishing and molecular docking technology
CN104738743A (zh) 一种降尿酸肽饮料及其制备方法
McMullen Fructose increases uric acid contributing to metabolic syndrome-herbal, nutritional and dietary strategies to reduce uric acid
CN111346111B (zh) 一种复方海洋中药提取物及其在降糖方面的应用
US20060105965A1 (en) Method for enhancing energy levels and reducing the effects of stress using nutraceutical formulations
CN101868230A (zh) 干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂以及用于预防或治疗老年性贫血的蛋氨酸应用和含有蛋氨酸的组合物
JPH09194390A (ja) 内臓脂肪蓄積抑制剤
KR20040099587A (ko) 혈압 강하 기능을 가지는 키토산 함유 소금의 제조방법
CN108991358A (zh) 一种辅助降血脂、降血糖、缓解痛风保健食品及生产方法
CN114376983B (zh) 一种适用于高尿酸人群的天然提取物复合颗粒剂
JP2006016340A (ja) ザクロ抽出物を有効成分とする、血中尿酸値低下剤
CN111132678A (zh) 用于治疗慢性低度系统性炎症(clgsi)和相关疾病的卵硫醇
CN109010330B (zh) 染料木黄酮在降低后口动物体内n-羟乙酰神经氨酸方面的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210917

Address after: 529100 No. 23, wuqiji Avenue, Huicheng, Xinhui District, Jiangmen City, Guangdong Province

Patentee after: JIANGMEN EDOIZUMI FOODS Co.,Ltd.

Address before: 511458 Guangdong, Guangzhou, Nansha District, 25 South Road, South China Road, Guangzhou, China

Patentee before: SOUTH CHINA University OF TECHNOLOGY

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220321

Address after: 526238 No. 4, Gutang West Road, high tech Zone, Zhaoqing City, Guangdong Province

Patentee after: GUANGDONG HUATAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

Address before: 529100 No. 23, wuqiji Avenue, Huicheng, Xinhui District, Jiangmen City, Guangdong Province

Patentee before: JIANGMEN EDOIZUMI FOODS Co.,Ltd.