CN117229354B - 一种金枪鱼源降尿酸混合物、组合物、制备方法及应用 - Google Patents
一种金枪鱼源降尿酸混合物、组合物、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种金枪鱼源降尿酸混合物、组合物、制备方法及应用,属于水产品精深加工技术领域,所述混合物的制备方法具体如下:金枪鱼肉使用质量比0.8%的碱性蛋白酶进行酶解获得的酶解液,进一步分离纯化获得。本发明还提供从所述混合物中分离出来的11中多肽组合物。本发明所述金枪鱼肽混合物和组合物均具有降尿酸活性强,具有很好的经济前景。
Description
技术领域
本发明属于水产品精深加工技术领域,尤其涉及一种金枪鱼源降尿酸混合物、组合物、制备方法及应用。
背景技术
近年来,随着生活方式、饮食习惯和周围环境等因素的改变,高尿酸血症(HUA)发病率呈现逐年上升的趋势。人体内尿酸的来源主要分为内源性和外源性两方面,其中67%是由体内核蛋白、核酸和磷酸核糖等物质分解代谢产生,而剩下的33%来源于富含核蛋白或嘌呤类物质的食物的降解。临床上,当男性血尿酸水平大于7.0mg/dL,女性血尿酸水平大于6.4mg/dL即可确诊为HUA。长期的高尿酸水平对血管、心脏、肾脏均会产生一系列不良影响,可增加患心脑血管疾病、高血压、糖尿病及肾脏疾病等的风险。减少尿酸的生成和促进尿酸排泄常用的治疗药物可以分为三类:第一类是抑制尿酸生成类药物,包括别嘌呤醇(Allopurinol)、非布索坦(Febuxostat)等;第二类是促进尿酸排泄类药物,包括丙磺舒、苯溴马隆、RDEA594等;第三类是促进尿酸分解类药物如Pegloticase。但是,这些药物常常伴随着副作用,如引起皮疹、胃肠道反应、骨髓抑制、肝功能损害等,所以急需研发一种安全易吸收、毒副作用小的新型功效因子。生物活性肽是潜在降尿酸功能因子,不仅来源广泛,毒副作用小且具有多种生理功能,其在医药及功能保健品方面的应用引起广泛关注。
金枪鱼是可将体温维持在比周围水体温度高的物种,是一些活跃而敏捷的食肉动物,含有丰富的蛋白质,具有较高的营养价值。鹅肌肽是天然存在于脊椎动物体内的一类组氨酸肽,具有水溶性和较强的而且具有显著的抗氧化、抗衰老、降尿酸等功能,在食品工业中已用作天然的抗氧化剂和降尿酸食疗。金枪鱼加工过程中会产生大量副产物如鱼骨、碎肉等,造成资源浪费和环境污染。金枪鱼碎肉以其良好的生物特性,与畜禽源副产物相比更低的抗原性、过敏性等成为了理想的研究对象。因此,研究副产物不仅可以大大降低成本,还能解决下脚料带来的环境污染问题,实现环境保护和资源利用的双赢。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种金枪鱼源降尿酸混合物、组合物、制备方法及应用。
本发明的另一目的在于对具有降尿酸活性的金枪鱼肽进行精制纯化。
本发明是通过如下技术方案来实现的:
一种金枪鱼源降尿酸肽混合物,所述混合物的制备方法,所述方法具体如下:金枪鱼肉使用质量比0.8%的碱性蛋白酶进行酶解获得的酶解液,进一步分离纯化获得。
进一步,所述的方法为在金枪鱼肉中加入一定质量的水,使其料液比质量比为1:2~1:5,然后加入质量百分比为0.8%的碱性蛋白酶,调节酶解体系pH值为8.5,在55℃下保温水解4小时;煮沸,得到金枪鱼酶解液进一步纯化分离获得。
进一步,所述的调节酶解体系pH值是用1mol/L的NaOH溶液或HCl溶液。
所述纯化分离的方法具体如下:上述制备的金枪鱼肽溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤后,采用SP-SephadexC25阳离子交换柱进行分离纯化:首先以0.02mol/LpH4.0的醋酸缓冲液平衡90-120min,上样后再用0-0.5mol/L的NaCl的醋酸缓冲液线性梯度洗脱,收集活性最高的第一个主峰;然后利用SephadexG15凝胶柱进一步分离纯化,洗脱液为超纯水,流速0.4-0.6mL/min,收集第一个主峰;最后利用反相高效液相色谱进一步分离纯化,洗脱液为乙腈和超纯水,流速0.5-1.0mL/min,活性最高的第一个主峰即为金枪鱼降尿酸肽的典型肽段组分。
本发明还提供所述混合物的在制备降尿酸药物中的应用。
本发明还提供一种金枪鱼源降尿酸肽组合物,所述组合物由11种多肽组成,具体为ALNDPFLDLR、APPHLF、DDAFLR、DDWLR、DFHLL、DPFLDLK、KLPDPGM、LNDPFLDLR、LYPLL、PPHLF、VEAPPHLF。
本发明还提供所述组合物的在制备降尿酸药物中的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果:本发明利用生物酶解技术来制备具有降尿酸作用的金枪鱼多肽组合物,简化了生产工艺流程,缩短生产周期,降低生产成本,又使制得的目标金枪鱼多肽组合物的降尿酸作用显著增强,经动物实验表明采用本发明方法制备的金枪鱼多肽组合物可显著降低小鼠的血尿酸水平,增加小鼠尿液及粪便排泄尿酸水平,并对大鼠的肾脏功能具有一定程度的保护作用。本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、所得金枪鱼多肽组合物的降尿酸活性强,具有很好的经济前景。
附图说明
图1为不同酶解物的XOD抑制活性图;
图2为不同酶解物对高尿酸HK-2细胞上清液尿酸含量的影响图;
图3为金枪鱼多肽组合物的性质及活性图;A为金枪鱼多肽的分子量分布;B为金枪鱼多肽浓度与XOD抑制活性曲线图;C为不同浓度金枪鱼多肽浓度细胞增殖率柱状图,D为不同浓度的金枪鱼多肽对高尿酸HK-2细胞上清液尿酸含量的影响;
图4为金枪鱼多肽组合物对小鼠血清尿酸含量的影响图;
图5为金枪鱼多肽组合物对小鼠尿液尿酸含量的影响图;
图6为金枪鱼多肽组合物对小鼠粪便尿酸含量的影响图;
图7为金枪鱼多肽组合物对小鼠肾脏及肝脏的保护作用图;A为A是肾脏,B为肝脏,其中,NC为对照组,MC为模型组,PC为别嘌呤组,TAP-L为金枪鱼肽低剂量组,TAP-H为金枪鱼肽低剂量组;
图8为金枪鱼多肽经阳离子交换柱的色谱图及活性测定图,A为金枪鱼多肽经SP-SephadexC25阳离子交换柱分离纯化色谱图,B为7种组份XOD的抑制活性图;
图9为金枪鱼多肽经凝胶柱的色谱图及活性测定图,A为金枪鱼多肽经凝胶柱的分离的色谱图,B为3种XOD的抑制活性图;
图10为金枪鱼多肽经反相高效液相色谱图及活性测定图;A为金枪鱼多肽经反相高效液相色谱图,B为6种XOD的抑制活性图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
UHPLC所用色谱柱为Agilent Advance-Bio Peptide Map C18column(2.1×150mm,2.7μm)。UHPLC参数:流动相A:0.1%甲酸-乙腈,流动相B:0.1%甲酸-水,流速:0.25mL/min,柱温:40℃,梯度洗脱程序0~2min(5%A)、2~27min(5%A~20%A)、27~37min(20%A~35%A)、37~39min(35%A~80%A)。扫描范围:50~1500m/z,电喷雾模式:电喷雾正离子,电喷雾电压5500v。
以下各实施例中,采用比色法测定XO抑制活性的方法如下:
(1)溶液的配置
0.2mol/L(pH 7.5)磷酸缓冲液(PBS):准确称取30.0838g Na2HPO4·12H2O和2.4962g NaH2PO4·2H2O,用去离子水溶解,定容至500mL。
黄嘌呤溶液:准确称取6.4mg黄嘌呤,先用1mL 1M NaOH将其溶解,再加入100mlPBS,以1M HCl调节pH值至7.5。
黄嘌呤氧化酶:取120μL酶液,以PBS稀释至8mL。
别嘌呤醇:准确称取1mg别嘌呤醇,定容至100mL,配置成10μg/mL的别嘌呤醇。
(2)样品预处理:
将样品稀释至20mg/mL,于96孔板中每孔加入50μL待测样品(或水作为对照)及50μL浓度为0.02U/mL的黄嘌呤氧化酶溶液,振荡30s,25℃保温5min,加入150μL 0.48mM的黄嘌呤溶液,振荡30s后,25℃保温25min,加入80μL的1M盐酸测定290nm处的吸光值。每个样品都需设空白,即加酶的同时加入80μL的1M盐酸。
(3)计算公式
式中:
A1——样品溶液加酶的吸光度;
A2——样品溶液不加酶吸光度;
A3——缓冲液代替样品溶液的空白组的吸光度;
A4——空白组不加酶的吸光度。
以下各实施例中,采用UPLC-QQQ测定鹅肌肽和肌肽含量的方法如下:
流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液。洗脱程序为0-7min,15-95%B;7-8min,95%B;8-9min,95-15%B;9-10min,15%B。进样体积:5μL,离子化模式:ESI+,扫描模式:多反应监测(MRM)。QQQ参数:Gas Temp:300℃;Gas Flow:8L/min,Nebulizer:35psi。
以下各实施例中,肽样品对HK-2高尿酸细胞的作用的实验方法如下:
HK-2细胞培养
(1)细胞复苏:将细胞从液氮中取出后,立刻37℃水浴加热并轻轻晃动,直至完全解冻。1200r/min离心5min后,弃掉上清,加入2mL的MEM完全培养基(含有10%的胎牛血清FBS和1%的双抗青霉素-链霉素混合液),吹打使细胞悬浮,转移至T25培养瓶中,再加入3mL培养基,“米”字型晃动培养瓶使细胞分布均匀,放置于5%CO2、37℃的培养箱中培养待用,每48h更换一次新鲜培养基。
(2)细胞传代:观察HK-2细胞生长状况,待细胞数量达到长满培养瓶底板80%-90%时进行传代。吸出瓶中的培养液,加入3mL PBS洗两次之后,加入新鲜的培养基,用移液枪将细胞轻轻吹打下来,取适量细胞接种于新的T25培养瓶中,加入适量培养基,放入培养箱中继续培养,完成传代。
(3)细胞冻存:配制细胞冻存液:60%的MEM培养基、30%的FBS、10%的二甲基亚砜(DMSO),混合均匀并过0.22μm滤膜除菌后制成。将细胞悬液1200r/min离心5min后弃掉上清液,加入细胞冻存液并吹打均匀后,转移至冻存管中。将冻存管放入梯度降温冻存盒中,放入-80冰箱,24h后转移至液氮中冻存。
操作步骤:
①接板:细胞经胰酶消化后计数,接种于96孔板中,密度为104个/孔(稀释至6.25*104个/mL),160μL完全培养基培养24h。
②预培养:对照组和模型组不做处理,阳性对照组100μmol/L别嘌呤醇,样品组加入40μL 5mg/mL肽(1mg/mL)或者200μL 5mg/mL的肽,预孵育24h。
③诱导:培养基吸出,每孔用PBS洗涤3次,模型组、阳性组、样品组都加入含3mmol/L腺苷无血清培养基250μL,对照组加无血清培养基,孵育24h。
④加酶:每孔加入50μL 0.01U/mLXO(溶于PBS),处理后6h收集上清液,HPLC测定尿酸含量。
高效液相色谱测定组分的降尿酸活性:
细胞上清液过0.22μm滤膜,利用液相上清液中生成的尿酸量。
流动相:20mM磷酸氢二钾缓冲溶液:甲醇=88:12;
色谱柱:Zorbax SB-C18(3.5μm,4.6*100mm);
进样体积:10μL;流速:0.3mL/min;柱温:30℃;检测波长:290nm;
运行时间:22min。
以下各实施例中,肽样品对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的影响的实验方法如下:
一、主要试剂材料及配制
1、0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)悬液:精确称取0.5g羧甲基纤维素钠溶解于100mL超纯水中,充分搅拌至溶解,紫外照射30min灭菌,4℃保存备用。
2、氧嗪酸钾-羧甲基纤维素钠悬液:用0.5%羧甲基纤维素钠悬液配成混悬液,按小鼠250mg/kg体重的标准剂量每日腹腔注射1次。
3、高嘌呤定制鼠粮:普通鼠粮100g,酵母提取物40g,圆酵母核糖核酸2g,以上原料混合均匀后委托公司完成重新制粒工作。
4、8周雄性Balb/c小鼠,每组13只,5组共50只。
二、动物实验
1、适应性喂养7d
标准饲料,自由饮水。第7天检测血清中尿酸、肌酐和尿素氮含量。
2、造模21d,隔天秤体重,收集尿液、粪便
①对照组(NC组):标准饲料,每天腹腔注射0.5%CMC-Na。
②模型组(MC组):高嘌呤饲料,每天注射250mg/kg氧嗪酸钾。
③别嘌呤组:高嘌呤饲料,每天注射250mg/kg氧嗪酸钾。
④金枪鱼肽低剂量组((TAP-L)):高嘌呤饲料,每天注射250mg/kg氧嗪酸钾。
⑤金枪鱼肽高剂量组((TAP-H)):高嘌呤饲料,每天注射250mg/kg氧嗪酸钾。
注:当血清尿酸水平达到110μmol/L时,视为造模成功。
3、边建模边干预30d,隔天秤体重,收集尿液、粪便
①对照组(NC组):标准饲料,每天腹腔注射0.5%CMC-Na。1h后灌胃生理盐水。
②模型组(MC组):高嘌呤饲料,每天注射200mg/kg氧嗪酸钾。1h后灌胃生理盐水。
③别嘌呤组:高嘌呤饲料,每天注射200mg/kg氧嗪酸钾。1h后灌胃10mg/kg别嘌呤醇。
④低剂量组(TAP-L):高嘌呤饲料,每天注射200mg/kg氧嗪酸钾。1h后灌胃200mg/kg多肽。
⑤高剂量组(TAP-H):高嘌呤饲料,每天注射250mg/kg氧嗪酸钾。1h后灌胃600mg/kg多肽。
4、动物取材:末次给药后小鼠禁食不禁水8h。取粪便及尿液,称量体质量,摘眼球取血,分离血清备用。迅速剥离肝脏、肾脏及肠道,称重,肾脏、盲肠、结肠拍照。每组各取0.1g置于液氮保存备用。另各取0.5cm3肝脏、肾脏及肠道于10%中性甲醛中固定备用。在无菌条件下仔细收集盲肠的腔内容物并在-80℃冷冻直至DNA提取。取出小肠、盲肠和结肠组织并用磷酸盐缓冲盐水冲洗以去除管腔内容物,然后储存在-80℃。
以下各实施例中,金枪鱼降尿酸肽的精制纯化实验方法如下:
1、金枪鱼肽溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤后,采用SP-SephadexC25阳离子交换柱进行分离纯化:首先以0.02mol/LpH4.0的醋酸缓冲液平衡90min,上样后再用0-0.5mol/L的NaCl的醋酸缓冲液线性梯度洗脱,收集活性最高的第一个主峰。
2、利用Sephadex G15凝胶柱进一步分离纯化,洗脱液为超纯水,流速0.5mL/min,收集第一个主峰。
3、利用反相高效液相色谱进一步分离纯化,洗脱液为乙腈和超纯水,流速0.8mL/min,活性最高的第一个主峰即为金枪鱼降尿酸肽的典型肽段组分。
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1:一种具有降尿酸活性的金枪鱼肽的制备方法,包括以下步骤:
(1)金枪鱼碎肉的预处理:金枪鱼去除筋膜,切成3cm*3cm的小块,经过绞肉机绞碎。
(2)酶解反应:往金枪鱼碎肉中加入一定质量的水,使其料液比为1:4,然后加入不同浓度的6种蛋白酶,具体为风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和木瓜蛋白酶,浓度梯度分别为质量百分比:0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%;反应液中用1mol/L的NaOH溶液或HCl溶液调节pH。碱性蛋白酶、胰酶的pH值为8.5,风味蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和木瓜蛋白酶的pH值为7.5;在50~55℃下保温水解3~6小时;煮沸灭酶5~10min,得到金枪鱼酶解液;将酶解液于8500r/min离心15~20min,浓缩、干燥,得到金枪鱼肽干粉;
(3)酶解物的筛选:通过XOD抑制活性和HK-2高尿酸细胞模型,评价不同酶解物的降尿酸活性,筛选出具有最优活性的金枪鱼肽。
(4)金枪鱼降尿酸肽的精制纯化:金枪鱼肽溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤后,采用SP-SephadexC25阳离子交换柱进行分离纯化:首先以0.02mol/LpH4.0的醋酸缓冲液平衡90min,上样后再用0-0.5mol/L的NaCl的醋酸缓冲液线性梯度洗脱,收集活性最高的第一个主峰;然后利用SephadexG15凝胶柱进一步分离纯化,洗脱液为超纯水,流速0.5mL/min,收集第一个主峰;最后利用反相高效液相色谱进一步分离纯化,洗脱液为乙腈和超纯水,流速0.8mL/min,活性最高的第一个主峰即为金枪鱼降尿酸肽的典型肽段组分。
在人体的嘌呤代谢中,ATP等经过一系列的代谢反应,生成次黄嘌呤及黄嘌呤,而两者皆会被人体内的黄嘌呤氧化酶(XOD)氧化生成尿酸,因此,抑制黄嘌呤氧化酶的活性,从某种程度上可抑制尿酸的生成,降低体内尿酸水平。图1显示,在风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶中6种酶中,碱性蛋白酶的XOD抑制活性较强,其中添加量为0.8%-3.2%时,活性最强。另外,当用0.8%碱性蛋白酶酶解金枪鱼碎肉时,公认具有降尿酸活性的鹅肌肽和肌肽的含量分别为8.79±0.28mg/g和4.69±0.03mg/g。
增加尿酸前体的量是构建高尿酸血症模型的常见方法。本实施例采用腺苷诱导HK-2细胞来增加细胞上清中尿酸的含量,从而构建高尿酸细胞模型。如图2所示,所有酶解物均表现出降尿酸效果,其中碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶酶解物的降尿酸较强。结合XOD抑制活性的结果,最终筛选出添加0.8%碱性蛋白酶的金枪鱼多肽组合物用作后续研究。
实施例2:一种具有降尿酸活性的金枪鱼多肽组合物的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)金枪鱼碎肉的预处理:金枪鱼去除筋膜,切成3cm*3cm的小块,经过绞肉机绞碎。
(2)酶解反应:往金枪鱼碎肉中加入一定质量的水,使其料液比为1:4,然后加入质量比0.8%的碱性蛋白酶,调节体系pH值为8.5,在55℃下保温水解4小时;煮沸灭酶10min,得到金枪鱼酶解液;将酶解液于8500r/min离心15~20min,浓缩、干燥,得到金枪鱼多肽干粉;
研究表明,通过酶法制备的小分子量(1kDa)寡肽更容易吸收并表现出特定的生物活性,各分子量的多肽占比如图3中的A所示。据现有报告,本实施例制备的金枪鱼肽XOD抑制的IC50值为2.498mg/mL(图3中的B),远小于目前制备的其他肽,说明TAP的XOD抑制活性较强,能通过抑制XOD的活性来有效抑制尿酸的生成。图3中的C表明,TAP的浓度为50-5000μg/mL时,对HK-2细胞无毒性。1mg/mL(TAP-L组)和5mg/mL(TAP-H组)的TAP均对高尿酸模型表现出降尿酸作用,且呈浓度依赖性(图3中的D)。
高尿酸血症是由尿酸产生和排泄失衡引起。为了探讨TAP对HUA的影响,建立了氧嗪酸钾(PO)诱导的HUA小鼠模型,并用200mg/kg(TAP-L)和600mg/kg(TAP-H)的TAP处理小鼠。如图4所示,与NC组(75.52±6.81μmol/L)相比,MC组(模型组)血清尿酸含量显著升高(149.32±20.68μmol/L)(P<0.01),证明高尿酸血症已成功建立。别嘌呤组组血清尿酸水平显著低于HUA小鼠(80.35±12.76μmol/L)(P<0.01)。TAP-L和TAP-H组的血清尿酸水平明显低于MC组,呈剂量依赖性,说明TAP可以通过降低尿酸的生成来降低小鼠体内尿酸水平,表明TAP是治疗高尿酸症的一种潜在选择。
在正常生理条件下,体内血清尿酸水平维持其产生和排泄之间的平衡,通常由肝脏嘌呤代谢合成,然后通过肾脏、肠道重吸收和尿液排出体外。每天大约75%的尿酸盐通过肾脏排出。排泄量减少会导致血清尿酸水平升高。如图5所示,与NC组相比,MC组的尿液尿酸水平显著降低(P<0.01)。相反,别嘌呤组和TAP组的尿酸水平显著升高(P<0.01)。同样地,图6表明,与NC组相比,MC组的粪便尿酸水平显著降低(P<0.01),而高剂量的TAP可以增加粪便尿酸的排泄(P<0.05),表明TAP的干预可以通过促进尿液和粪便中尿酸的排泄来降低UA水平。
据报道,PO诱导的高尿酸血症往往会导致氧化应激和肾功能障碍。组织病理学结果显示,NC组肾脏组织清晰完整,细胞排列紧密有序(图7)。模型组观察到PO引起的显著损伤,包括细胞数量减少、细胞排列不规则、细胞质空泡化和扩张,以及相邻近端管状细胞之间边界不清晰。与MC组相比,别嘌呤组组肾小管间质病变程度有所减轻,但仍存在一定程度的肾小管间质纤维化。TAP处理以一定的浓度依赖性方式减少了PO诱导的病理损伤,表明其在肾脏病理生理学中具有保护作用。TAP对肝脏也有相似的的保护作用。
金枪鱼降尿酸肽经SP-SephadexC25阳离子交换柱分离纯化后得到7个组分,其中F1的XOD抑制活性最高(图8),收集活性最高的峰进行下一步分离纯化。利用SephadexG15凝胶柱进一步分离纯化,得到3个组分,收集活性最高的F1进行下一步分离纯化(图9)。最后利用反相高效液相色谱进一步分离纯化,得到活性最强的峰,其IC50值为1.119mg/mL(图10),远低于分离纯化前的组分。将活性最高的组分进行序列鉴定,获得11种多肽,其氨基酸序列如表1为所示。
表1金枪鱼肽序列
综上所述,基于体外活性、细胞活性、动物实验等多种方法对本发明制备的降尿酸肽进行了活性评价。TAP具有较低的IC50,可以显著降低高尿酸细胞的尿酸水平。另外,TAP通过抑制尿酸生成、促进尿酸排泄等途径来降低高尿酸所致小鼠尿酸水平。H&E染色结果表明TAP对肾脏及肝脏具有一定的保护作用。因此,采用本发明方法制备的降尿酸肽具有较好的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种金枪鱼源降尿酸肽组合物,其特征在于,所述组合物是由金枪鱼源降尿酸肽混合物中分离出来的11种多肽组成,具体为ALNDPFLDLR、APPHLF、DDAFLR、DDWLR、DFHLL、DPFLDLK、KLPDPGM、LNDPFLDLR、LYPLL、PPHLF、VEAPPHLF。
2.权利要求1所述组合物的在制备降尿酸药物中的应用。
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