CN111925412A - 一种黄嘌呤氧化酶抑制肽 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种黄嘌呤氧化酶抑制肽，其氨基酸序列为Glu‑Glu‑Ala‑Lys(EEAK)。四肽EEAK对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值为173.00±0.06μM，对黄嘌呤氧化酶有持续稳定的抑制效果，且具有安全无毒副作用，易于吸收，可产业化等突出优点。活性四肽EEAK或其衍生物可用于制备痛风治疗/预防药物，或作为功能食品添加剂，供痛风患者长期治疗保健，具有广泛的应用前景和十分重要的意义。

Description

一种黄嘌呤氧化酶抑制肽
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种黄嘌呤氧化酶抑制肽。
背景技术
痛风是最常见的第二大代谢疾病，也会引起高血压、心血管疾病和糖尿病等并发症。此外，随着人民生活水平的提高，痛风的患病率逐年增加，且患病人群呈现年轻化的趋势，这就引起了人们的高度关注。因此研究关于抗痛风的药品、保健食品以及抑制机理就变得至关重要。黄嘌呤氧化酶(XO)可以与黄嘌呤和次黄嘌呤结合产生尿酸。因此，XO被认为是预防和治疗痛风及相关疾病的关键靶点。
合成类的XO抑制剂(例如别嘌呤醇和非布索坦等)这些合成类的抑制剂长期服用后会产生一些毒副作用，如患皮疹、过敏反应、血压升高以及患白内障的风险增加等。因此，寻找鉴定天然类的XO抑制剂比化学合成的XO抑制剂更可取。
Murota等用细菌蛋白酶酶解鲨鱼软骨制备得到水提物，进一步将其分离纯化并鉴定得到一些多肽序列，通过人工化学合成这些多肽序列并进行体外及体内降尿酸活性的验证，最后鉴定出一种口服后具有抗高尿酸血症活性的肽YLDNY。
黎青勇等人从脱酚核桃水解物中鉴定出两种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的生物活性肽WPPKN和DIYTE。实验结果表明，这两种肽具有较高的黄嘌呤氧化酶抑制活性，前者对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值为17.75±0.12mg/mL，后者对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值为19.01±0.23mg/mL。
但是，现有技术中对于天然类的XO抑制剂的类型报道还非常有限，因此，开发新型的天然类XO抑制剂是非常有意义的。
金枪鱼是一种低脂肪高蛋白食物，蛋白质含量高达24.88％，具有广泛的生物活性。目前已经报道从金枪鱼蛋白中分离纯化出的活性肽具有抗高血压和抗氧化作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黄嘌呤氧化酶抑制肽。
在本发明中，所述四肽Glu-Glu-Ala-Lys(EEAK)对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值为173.00±0.06μM。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
利用胃肠道蛋白酶对金枪鱼蛋白酶解产生的活性多肽进行筛选，经过水溶性、生物活性及与黄嘌呤氧化酶结合能力的筛选；并对筛选出的活性肽进行黄嘌呤氧化酶体外抑制活性IC50值测定，最终筛选出IC50值最低的活性肽，即为所述黄嘌呤氧化酶抑制肽。具体如下：
(1)蛋白酶解及活性肽筛选
本发明借助ExPASy PeptideCutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)在线虚拟酶切工具对金枪鱼蛋白序列进行虚拟酶解，筛选得到未经报道的三肽和四肽。通过在线工具ToxinPred和peptide property calculator对未经报道的三肽序列进行毒性和水溶性性质的预测。筛选得到无毒、水溶性好的三肽和四肽。
(2)靶向筛选
从PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)中获得黄嘌呤氧化酶的晶体结构(PDB ID：3NVY)，并将其作为蛋白靶标，通过Discovery Studio(DS)2017的CDOCKER程序进行分子对接来筛选能与黄嘌呤氧化酶紧密结合的三肽和四肽。以‘CDOCKER-INTERACTION-ENERGY’数值、形成氢键的数目及作用的关键氨基酸为指标，筛选得到具有潜在黄嘌呤氧化酶抑制活性的四肽EEAK。
(3)黄嘌呤氧化酶抑制活性测定
通过高效液相色谱法对活性肽EEAK的黄嘌呤氧化酶体外抑制活性进行验证。取黄嘌呤氧化酶溶液30μL(0.025U/ml)再加入10μL四肽EEAK混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热10min，然后加入30μL(5mmol/l)黄嘌呤储备液充分混合，37℃保温20min后，得到反应液。取该反应液用HPLC进行分析。
色谱条件：柱温31℃，流速0.5mL/min，进样量10μL，流动相为水-TFA(0.5％)∶甲醇＝97∶3等度洗脱，检测波长254nm。
利用下列公式计算不同浓度四肽EEAK的抑制率：
黄嘌呤氧化酶抑制活性(％)＝(A-B)/(C-B)×100％
其中A是黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤和酶促肽样品存在下反应的峰面积；B是相同体积的酶促肽样品被缓冲溶液替代所测得的峰面积；C是相同体积的酶促肽样品和黄嘌呤氧化酶被缓冲液替代测得的峰面积。IC50值定义为在测定条件下抑制50％黄嘌呤氧化酶活性的抑制剂浓度。
黄嘌呤氧化酶活性的定义：黄嘌呤氧化酶活性的一个单位(U)定义为在37℃下每分钟催化黄嘌呤形成1mol的尿酸所需的酶量。
活性肽的获得可利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对金枪鱼骨骼肌球蛋白重链进行酶解并通过多维色谱纯化(凝胶过滤色谱、亲和色谱和半制备液相色谱)实现；也可通过固相化学合成方法实现。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明首次从金枪鱼蛋白中筛选出一种对黄嘌呤氧化酶具有显著抑制活性的四肽EEAK，明确了四肽EEAK的结构。四肽EEAK对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值为173.00±0.06μM，并阐明了四肽EEAK的作用机制。因此四肽EEAK作为功能成分用于具有辅助治疗痛风的食品、保健品以及药品中，具有良好的潜力和应用前景。
附图说明
本发明附图2幅，其中：
图1 EEAK与黄嘌呤氧化酶的对接结果3D图；
图2 EEAK与黄嘌呤氧化酶的对接结果2D图；
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例从金枪鱼蛋白中筛选并鉴定出一种对黄嘌呤氧化酶具有显著抑制作用的四肽EEAK，包括如下步骤：
(1)金枪鱼蛋白的虚拟酶解及初步筛选。基于在线程序ExPASy PeptideCutter，使用典型的胃肠道消化蛋白酶即胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)、胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)和胰凝乳蛋白酶(EC 3.4.21.1)对金枪鱼骨骼肌球蛋白重链进行模拟酶解，金枪鱼骨骼肌球蛋白重链氨基酸序列通过NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，其编号为BAA12730.1。选择未经报道的三肽和四肽使用在线工具ToxinPred和Peptide propertycalculator进行毒性和水溶性性质的预测。筛选得到无毒、溶解性好的三肽和四肽。
(2)使用DS软件(全称为Discovery Studio 2017 R2 Client)将上述所得无毒、溶解性好的三肽和四肽与黄嘌呤氧化酶进行分子对接，成功对接的活性肽结果如表1所示：
表1
肽序列 能量kcal/mol 肽序列 能量kcal/mol 肽序列 能量kcal/mol
EEAK 103.73 SESK 78.42 STE 67.79
EDK 100.47 SVAK 78.07 SGN 67.14
EDE 93.54 ETM 76.6 TQK 66.98
EAK 88.79 VDK 75.52 AEF 66.93
EEST 88.64 NDEH 74.94 GEH 66.48
EAD 87.27 DEEK 74.94 TEE 64.44
EAE 86.04 NEM 73.94 AEL 64.01
EGD 85.71 EQY 73.34 GGK 61.84
HDCD 84.45 TDK 73.13 AQK 61
EEA 84.02 NGQR 72.61 AQR 60.38
ENK 83.59 EAIK 72.03 ANR 56.36
EDM 83.44 CSE 71.64 ADW 56.25
EDD 82.21 AEE 70.88 VER 55.26
DAQ 81.45 AER 69.66 QDVQ 41.65
ESR 81.32 NDM 69.53 INTK -30.75
ENA 81.17 NDA 68.57 TIDD -32.63
EAR 79.87 QST 68.34 ANR 56.36
DAL 79.55 AEK 68.23
EIQ 79.13 SEY 68.18
由表1数据可知：由能量值对接结果进行评定得到EEAK的对接结果最好。
(3)四肽EEAK对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值进行计算，方法原理为：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生尿酸，具体操作为：采用高效液相色谱法对反应前后黄嘌呤的含量进行测定，进而对四肽EEEAK的黄嘌呤氧化酶抑制活性进行测定。取黄嘌呤氧化酶溶液30μl(0.025U/ml)加入10μL四肽EEAK混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热10min，然后加入30μL(5mmol/l)黄嘌呤储备液充分混合，37℃保温20min后，得到反应液。同时用磷酸钠(pH 7.4)缓冲液分别替代抑制剂溶液和抑制剂、黄嘌呤氧化酶溶液作为空白对照组，该反应液直接用HPLC系统进行分析。
色谱条件：柱温31℃，流速0.5mL/min，进样量10μL，流动相为水-TFA(0.5％)∶甲醇＝97∶3等度洗脱，检测波长254nm。
结果为：四肽EEAK对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值为173.00±0.06μM。
(4)使用DS软件分析四肽EEAK与黄嘌呤氧化酶之间的相互作用方式，四肽EEAK与黄嘌呤氧化酶之间的3D空间相互作用如图1所示，由图1可知：四肽EEAK与黄嘌呤氧化酶的最佳对接姿势；四肽EEAK与黄嘌呤氧化酶之间的二维平面图如图2所示，由图2可知：四肽EEAK能与黄嘌呤氧化酶的Phe649残基、Leu648残基、Lys771残基、Ser876残基、Phe914残基、Thr1010残基、Glu802残基和Arg880残基发生相互作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的黄嘌呤氧化酶抑制肽，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (2)

1.一种黄嘌呤氧化酶抑制肽，其特征在于，所述四肽氨基酸序列为Glu-Glu-Ala-Lys。
2.根据权利要求1所述的四肽，其特征在于，根据高效液相色谱法测定活性肽Glu-Glu-Ala-Lys对黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值为173.00±0.06μM。
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