CN112920255B - 一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法。该抑制肽的序列如SEQ ID NO:1所示。该方法包括：将蓝圆鲹去除头尾和内脏，洗净沥干后，绞成蓝圆鲹肉糜；将蓝圆鲹肉糜与水混合，得到混合液，加入蛋白酶，进行酶解，灭酶，离心得到酶解液；将酶解液过超滤膜，取滤过液，干燥得到蓝圆鲹肽粉；将所述蓝圆鲹肽粉溶解水中，得到蓝圆鲹肽溶液；将蓝圆鲹肽溶液上样至固载有Fe2+亲和层析柱中，洗脱，将洗脱液进行透析，取保留液，浓缩，干燥，得到所述新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽。该新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽具有很高的黄嘌呤氧化酶抑制活性。该方法工艺较为简单，产品安全，可应用于实际生产中。

Description

一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，具体涉及一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法。
背景技术
生物活性肽是对生物体的生命活动有益或具有特定生理作用的肽类化合物，已被证明具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血脂、降血压、降血糖等多种生物活性。生物活性肽具有免疫原性弱、安全性高、易被人体吸收及加工性能好等特点，被广泛应用于化妆品、医药和保健食品等多个领域。
黄嘌呤氧化酶(XOD，EC 1.17.3.2)是尿酸合成过程中的关键酶，其在生物体嘌呤代谢的过程中可催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进而生成尿酸。因此，抑制黄嘌呤氧化酶活性已成为众多降尿酸活性产品的重要功能指标。黄嘌呤氧化酶抑制肽是一种能够抑制黄嘌呤氧化酶活性的肽类物质，目前国内外已从植物蛋白、动物蛋白水解物中发现黄嘌呤氧化酶抑制肽，但其分离制备手段缺乏针对性与靶向性，均为常规手段，从而导致目标肽富集程度低。
蓝圆鲹，鲈形目鲹科圆鲹属，是我国重要的海洋经济鱼类之一，其产量大、分布广、蛋白质含量高、营养丰富，是一种优质的海洋蛋白资源。目前，蓝圆鲹主要以冰鲜及冷冻产品为主，部分用于生产饲料，其精深加工水平较低，亟需采用现代加工技术提升其高值化利用水平。目前利用蓝圆鲹制备高附加值的黄嘌呤氧化酶抑制肽的方法尚未见报道。
文献(邹琳，杭妙佳，李阳，杜鹃，冯凤琴.鲣鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽酶法制备工艺优化.浙江大学学报(农业与生命科学版),2019,45(5):550-562.)中记载了一种鲣鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽酶法制备工艺。但该研究采用的制备方法较为普通，未对目标肽进行有效的定向分离富集，导致杂组分较多，活性也不高。该工艺也是通过酶解法制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的，目前对黄嘌呤氧化酶抑制肽制备大多采用酶解法，如何将黄嘌呤氧化酶抑制肽从酶解物中进行定向分离尚缺乏相关的针对性技术。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法。
本发明首次发现蓝圆鲹多肽的黄嘌呤氧化酶抑制活性与其Fe2+结合活性密切相关，因此创新性采用IMAC-Fe2+对蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽进行了高效分离富集，得到的产物具有很好的黄嘌呤氧化酶抑制活性。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供的一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)蓝圆鲹预处理：将蓝圆鲹去除头尾和内脏，洗净沥干后，绞成蓝圆鲹肉糜；
(2)蓝圆鲹蛋白酶限制性酶解：将步骤(1)所述蓝圆鲹肉糜与水混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值为6.0-9.0，加入蛋白酶，进行酶解处理，灭酶处理，离心取上清液，得到酶解液；
(3)超滤分离富集：将步骤(2)所述酶解液过超滤膜，取滤过液，干燥得到蓝圆鲹肽粉；将所述蓝圆鲹肽粉溶解水中，得到蓝圆鲹肽溶液；
(4)制备层析柱：将固定化金属离子亲和层析柱填料浸泡在乙醇溶液中，取出，装柱，得到层析柱，用水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中的乙醇，然后用Fe2+溶液洗柱(固载Fe2+于层析柱)，用水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中未结合的Fe2+，得到固载有Fe2+亲和层析柱(IMAC-Fe2+)；
(5)IMAC-Fe2+分离富集：将步骤(3)所述蓝圆鲹肽溶液上样至固载有Fe2+亲和层析柱中，用水洗脱，得到第一次洗脱液，再用缓冲液洗脱，得到第二次洗脱液，将所述第二次洗脱液进行透析处理，取保留液，浓缩，干燥，得到所述新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽。
进一步地，步骤(2)所述蓝圆鲹肉糜与水的质量比为1:1-3；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶及碱性蛋白酶中的一种以上；所述蛋白酶的质量为蓝圆鲹肉糜质量的0.1-1％；所述酶解处理的温度为45-65℃，酶解处理的时间为2-10小时；所述灭酶处理的温度为85-100℃，灭酶处理的时间为10-30min；所述离心的转速为5000-10000rpm，离心的时间为10-40min。
进一步地，步骤(3)所述超滤膜的截留分子量为1-10kDa；所述干燥的方式为冷冻干燥或喷雾干燥；所述蓝圆鲹肽溶液的浓度为10-100mg/mL。
进一步地，步骤(4)所述固定化金属离子亲和层析柱填料的型号为IMAC-SepharoseTM6，固定化金属离子亲和层析柱填料的生产商家为美国通用电气公司。
进一步地，步骤(4)所述乙醇溶液的体积百分比浓度为5-30％，所述固定化金属离子亲和层析柱填料浸泡在乙醇溶液中的时间为时间为2-24h。
进一步地，步骤(4)中，用于洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中乙醇的水体积为层析柱体积的2-10倍；步骤(4)中，用于洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中未结合的Fe2+的水体积为层析柱体积的2-10倍。
进一步地，步骤(4)所述Fe2+溶液为FeCl2溶液或FeSO4溶液；所述Fe2+溶液的pH值为2.0-6.0；所述Fe2+溶液的浓度为50-400mM；所述Fe2+溶液的体积为层析柱体积的2-10倍。
进一步地，步骤(5)中，水的体积为固载有Fe2+亲和层析柱体积的2-10倍；所述缓冲液的浓度为7.0-9.0，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述缓冲液的浓度为5-50mM，所述缓冲液含有50-1000mM的NaCl；所述缓冲液的体积为固载有Fe2+亲和层析柱体积的1-10倍。
进一步地，步骤(5)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为300-100Da，所述透析处理的时间为8-48小时，透析处理的温度为2-20℃。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法，所用的原料为海洋大宗鱼类蓝圆鲹，资源丰富，产量大，价格便宜。
(2)本发明提供的新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽，具有很高的黄嘌呤氧化酶抑制活性，黄嘌呤氧化酶抑制活性最高可达94.17％，制备工艺较为简便，产品安全，可应用于实际生产。
附图说明
图1为实施例2中步骤(3)得到的蓝圆鲹肽对黄嘌呤氧化酶(XOD)的抑制活性的结果图；
图2为实施例2中步骤(3)得到的蓝圆鲹肽对金属离子结合活性的结果图；
图3为实施例2的新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的定向分离富集的结果图；
图4为实施例2的新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽主效成分的结构鉴定的结果图；
图5为实施例2的新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽结合XOD的效果示意图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例中使用的固定化金属离子亲和层析柱填料的型号为IMAC-SepharoseTM6，该固定化金属离子亲和层析柱填料的生产商家为美国通用电气公司。
实施例1
一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)蓝圆鲹预处理：将蓝圆鲹去除头尾和内脏，洗净沥干后，绞成蓝圆鲹肉糜；
(2)酶解：将步骤(1)所述蓝圆鲹肉糜与水混合，所述蓝圆鲹肉糜与水的质量比为1:1，得到混合液，调节所述混合液的pH值为6.0，加入蛋白酶(实施例1的蛋白酶为胰蛋白酶与木瓜蛋白酶复配，胰蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比为1:1)，所述蛋白酶的质量为蓝圆鲹肉糜质量的0.1％，进行酶解处理，所述酶解处理的温度为45℃，酶解处理的时间为2小时，灭酶处理，所述灭酶处理的温度为85℃，灭酶处理的时间为30min，离心取上清液，所述离心的转速为5000rpm，离心的时间为40min，得到酶解液；
(3)超滤分离富集：将步骤(2)所述酶解液过超滤膜，所述超滤膜截留分子量为10kDa，取滤过液，干燥(干燥的方式为喷雾干燥)得到蓝圆鲹肽粉；将所述蓝圆鲹肽粉溶解水中，得到蓝圆鲹肽溶液，所述蓝圆鲹肽溶液的浓度为10mg/mL；
(4)制备层析柱：将固定化金属离子亲和层析柱填料(IMAC-SepharoseTM6)浸泡在体积百分比浓度为5％的乙醇溶液中，浸泡的时间为2h，取出，装柱，得到层析柱，用2倍层析柱体积的水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中的乙醇，然后用2倍层析柱体积的Fe2+溶液(实施例1的Fe2+溶液为50mM的FeCl2溶液，pH为2.0)洗柱，用1倍层析柱体积的(水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中未结合的Fe2+，得到固载有Fe2+亲和层析柱；
(5)将步骤(3)所述蓝圆鲹肽溶液上样至固载有Fe2+亲和层析柱中，用2倍层析柱体积的水洗脱，得到第一次洗脱液，再用1倍层析柱体积的缓冲液洗脱，所述缓冲液为PBS缓冲液，缓冲液的pH值为7.0，所述缓冲液的浓度为5mM，所述缓冲液含有50mM的NaCl，得到第二次洗脱液，收集第二次洗脱液，将所述第二次洗脱液装入透析袋中进行透析处理，透析处理采用的透析袋截留分子量为300Da，透析处理的温度为2℃，透析处理的时间为8h，取保留液，浓缩，干燥，得到所述新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽。
实施例2
一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)蓝圆鲹预处理：将蓝圆鲹去除头尾和内脏，洗净沥干后，绞成蓝圆鲹肉糜；
(2)酶解：将步骤(1)所述蓝圆鲹肉糜与水混合，所述蓝圆鲹肉糜与水的质量比为1:2，得到混合液，调节所述混合液的pH值为7.0，加入中性蛋白酶，所述中性蛋白酶的质量为蓝圆鲹肉糜质量的0.3％，进行酶解处理，所述酶解处理的温度为50℃，酶解处理的时间分别为2小时、4小时、5小时、6小时、7小时及8小时，灭酶处理，所述灭酶处理的温度为90℃，灭酶处理的时间为15min，离心取上清液，所述离心的转速为8000rpm，离心的时间为20min，得到6份酶解时间不同的酶解液；
(3)超滤分离富集：分别将步骤(2)的酶解液过超滤膜，所述超滤膜截留分子量为1kDa，取滤过液，分别干燥(干燥的方式为冷冻干燥)得到6份蓝圆鲹肽粉；将6份所述蓝圆鲹肽粉分别溶解于水中，得到6份蓝圆鲹肽溶液，所述蓝圆鲹肽溶液的浓度为50mg/mL；
(4)制备层析柱：将固定化金属离子亲和层析柱填料(IMAC-SepharoseTM6)浸泡在体积百分比浓度为15％的乙醇溶液中，浸泡的时间为12h，取出，装柱，得到层析柱，用5倍层析柱体积的水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中的乙醇，然后用5倍层析柱体积的Fe2+溶液(实施例2的Fe2+溶液为200mM的FeCl2溶液，pH为3.0)洗柱，用5倍层析柱体积的水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中未结合的Fe2+，得到固载有Fe2+亲和层析柱(标记为IMAC-Fe2+)；
(5)将步骤(3)所述蓝圆鲹肽溶液分别上样至固载有Fe2+亲和层析柱中，用5倍层析柱体积的水洗脱，得到第一次洗脱液，再用5倍层析柱体积的缓冲液洗脱，所述缓冲液为PBS缓冲液，缓冲液的pH值为7.5，所述缓冲液的浓度为20mM，所述缓冲液含有500mM的NaCl，得到第二次洗脱液，收集第二次洗脱液，将所述第二次洗脱液装入透析袋中进行透析处理，透析处理采用的透析袋截留分子量为200Da，透析处理的温度为4℃，透析处理的时间为24h，取保留液，浓缩，干燥，得到所述新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽。
实施例3
一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)蓝圆鲹预处理：将蓝圆鲹去除头尾和内脏，洗净沥干后，绞成蓝圆鲹肉糜；
(2)酶解：将步骤(1)所述蓝圆鲹肉糜与水混合，所述蓝圆鲹肉糜与水的质量比为1:3，得到混合液，调节所述混合液的pH值为9.0，加入蛋白酶(实施例3的蛋白酶为复合蛋白酶与碱蛋白酶复配，所述复合蛋白酶与碱蛋白酶质量比为1:1)，所述蛋白酶的质量为蓝圆鲹肉糜质量的1％，进行酶解处理，所述酶解处理的温度为65℃，酶解处理的时间为10小时，灭酶处理，所述灭酶处理的温度为100℃，灭酶处理的时间为10min，离心取上清液，所述离心的转速为10000rpm，离心的时间为10min，得到酶解液；
(3)超滤分离富集：将步骤(2)所述酶解液过超滤膜，所述超滤膜截留分子量为5kDa，取滤过液，干燥(干燥的方式为喷雾干燥)得到蓝圆鲹肽粉；将所述蓝圆鲹肽粉溶解水中，得到蓝圆鲹肽溶液，所述蓝圆鲹肽溶液的浓度为100mg/mL；
(4)制备层析柱：将固定化金属离子亲和层析柱填料(IMAC-SepharoseTM6)浸泡在体积百分比浓度为30％乙醇溶液中，浸泡的时间为24h，取出，装柱，得到层析柱，用10倍层析柱体积的水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中的乙醇，然后用10倍层析柱体积的Fe2+溶液(实施例3的Fe2+溶液为400mM的FeSO4溶液，pH为6.0)洗柱，用10倍层析柱体积的水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中未结合的Fe2+，得到固载有Fe2+亲和层析柱；
(5)将步骤(3)所述蓝圆鲹肽溶液上样至固载有Fe2+亲和层析柱中，用10倍层析柱体积的水洗脱，得到第一次洗脱液，再用10倍层析柱体积的缓冲液洗脱，所述缓冲液为PBS缓冲液，缓冲液的pH值为9.0，所述缓冲液的浓度为50mM，所述缓冲液含有1000mM的NaCl，得到第二次洗脱液，收集第二次洗脱液，将所述第二次洗脱液装入透析袋中进行透析处理，透析处理采用的透析袋截留分子量为100Da，透析处理的温度为20℃，透析处理的时间为48h，取保留液，浓缩，干燥，得到所述新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽。
效果验证
1、将实施例2中步骤(3)得到的6份蓝圆鲹肽作为待测样品分别进行XOD抑制活性测定。实验组为待测样品；对照组为PBS缓冲液。
该测试包括：
在96酶标仪检测板中分别加入50μL待测样品(15mg/mL)及50μL浓度为0.05U/mL的XOD，然后在新的反应孔中加入50μL磷酸缓冲盐(20mM,pH 7.5)和50μL浓度为0.05U/mL的XOD，37℃孵育30min，分别往实验组和对照组中加入150μL浓度为0.42mmol/L黄嘌呤溶液，此时酶促反应被启动，持续记录反应体系在290nm处吸光值。每个样品做三个平行，以PBS缓冲液做空白对照，酶促反应体系的初始反应速率记为V0，样品存在时酶促反应体系的初始速率记为VS，按照以下公式计算样品对XOD抑制活性：
Figure BDA0002939273290000101
式中V0：酶促反应体系的初始反应速率；
VS：样品存在时酶促反应体系的初始速率。
图1为实施例2中步骤(3)得到的蓝圆鲹肽对黄嘌呤氧化酶(XOD)的抑制活性的结果图；如图1所示，当采用中性蛋白酶在酶解时间达到6h时，制备的蓝圆鲹酶解物(蓝圆鲹肽)的XOD抑制活性达到最大值，其值为61.82％，随后有所降低。这可能是因为6h以后蛋白酶特异性切位点随着酶解时间增加而逐渐减少，酶解产生的多肽也会与底物蛋白竞争酶的结合位点，使得酶解效率降低。酶解时间过长肽段会进一步降解成小分子肽或氨基酸，导致XOD抑制活性降低。图1中的同一指标数值上的不同字母表示在P<0.05范围内存在显著性差异。其他实施例中制备的蓝圆鲹肽也同样具有黄嘌呤氧化酶的抑制活性，可参照图1所示。
2、将实施例2中步骤(3)得到的6份蓝圆鲹肽分别作为待测样品进行金属离子结合活性的测定。
该测试包括：
将蓝圆鲹肽分别与Fe2+、Mg2+、Cu2+这3种矿物离子在37℃，矿物离子的初始浓度均为5mg/mL，中性条件下结合40min。结合后将溶液全部移入透析袋(截留分子质量：100Da)，每隔4h换一次水，共透析24h。透析结束后记录膨胀后体积v，取5mL透析后溶液于消化管内，加10mL浓硝酸进行微波消解。将消解后溶液用超纯水定容至50mL，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测金属离子质量浓度c，计算得出矿物离子与多肽的结合率。
Figure BDA0002939273290000111
式中：c为检测出金属离子的质量浓度/(mg/L)；v为膨胀后体积/mL；n表示稀释倍数：m为金属离子总添加量/mg。
图2所示，对比不同酶解时间得到的蓝圆鲹酶解物(所述蓝圆鲹肽)的Fe2+、Mg2+和Cu2+结合能力，发现Fe2+结合能力最高，约为相同条件下Mg2+和Cu2+结合活性的三倍。其中蓝圆鲹6h酶解产物的Fe2+结合率达到最高，其值为61.56％，明显高于Mg2+结合率(13.99％)和Cu2+结合率(17.12％)。结合图1结果可知，蓝圆鲹酶解物(所述蓝圆鲹肽)在具有XOD抑制活性的同时，具备较强的Fe2+结合能力。因此本发明通过研究创新性发现，蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的活性与其Fe2+结合能力密切相关，可根据此特性对其进行定向分离。图2中同一离子结合率数值上的不同字母表示数值间存在显著性差异(P<0.05)。其他实施例制备的蓝圆鲹肽同样在具有XOD抑制活性的同时具备较强的Fe2+结合能力，可参照图2所示。
图3为实施例2中采用固定化金属离子亲和层析柱(所述固载有Fe2+亲和层析柱，标记为IMAC-Fe2+)对蓝圆鲹酶解物(所述蓝圆鲹肽，酶解时间为6h)中的黄嘌呤氧化酶抑制肽进行定向分离富集，图3中的F1组分是不具有结合Fe2+活性的组分，F2是具有结合Fe2+活性的组分，即目标肽组分。通过XOD抑制活性的分析(测试方法可参照上述蓝圆鲹肽对金属离子结合活性测试方法)，F2组分其XOD抑制率高达94.17％(15mg/mL)，显著性高于酶解物的XOD抑制活性(61.82％，15mg/mL)。图3中的F1表示实施例2步骤(5)的第一次洗脱液；图3中的F2表示实施例2步骤(5)的第二次洗脱液。其他实施例中步骤(5)的第二次洗脱液也同样具有结合Fe2+的活性，可参照图3所示。
对F2组分主成分肽进行结构鉴定，结果如图4所示，图4为实施例2的新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽主效成分的结构鉴定的结果图；由图4可知，F2组分主成分肽的结构为FPSV，分子量为448.51Da。其他实施例制备的新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的主效成分结构同样为FPSV，分子量同样为448.51Da，可参照图4所示。
采用分子对接技术对实施例2得到的新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽与黄嘌呤氧化酶(XOD)进行测试。结果如图5所示，该新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽主要通过其苯丙氨酸残基(Phe)与XOD催化活性中心的Phe914、Phe1009和Ala1079进行结合，从而抑制XOD的催化活性。图5中的数字表示从N端向C端计，该氨基酸在XOD酶蛋白中的位置。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种新型蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)
<400> 1
Phe Pro Ser Val
1

Claims (10)

1.一种蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种制备权利要求1所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）蓝圆鲹预处理：将蓝圆鲹去除头尾和内脏，洗净沥干后，绞成蓝圆鲹肉糜；
（2）酶解：将步骤（1）所述蓝圆鲹肉糜与水混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值为6.0-9.0，加入蛋白酶，进行酶解处理，灭酶处理，离心取上清液，得到酶解液；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶及碱性蛋白酶中的一种以上；
（3）超滤分离富集：将步骤（2）所述酶解液过超滤膜，取滤过液，干燥得到蓝圆鲹肽粉；将所述蓝圆鲹肽粉溶解水中，得到蓝圆鲹肽溶液；
（4）制备层析柱：将固定化金属离子亲和层析柱填料浸泡在乙醇溶液中，取出，装柱，得到层析柱，用水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中的乙醇，然后用Fe2+溶液洗柱，用水洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中未结合的Fe2+，得到固载有Fe2+亲和层析柱；
（5）将步骤（3）所述蓝圆鲹肽溶液上样至固载有Fe2+亲和层析柱中，用水洗脱，得到第一次洗脱液，再用缓冲液洗脱，得到第二次洗脱液，将所述第二次洗脱液进行透析处理，取保留液，浓缩，干燥，得到所述蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽。
3.根据权利要求2所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述蓝圆鲹肉糜与水的质量比为1:1-3；所述蛋白酶的质量为蓝圆鲹肉糜质量的0.1-1%；所述酶解处理的温度为45-65℃，酶解处理的时间为2-10小时；所述灭酶处理的温度为85-100℃，灭酶处理的时间为10-30min；所述离心的转速为5000-10000rpm，离心的时间为10-40min。
4.根据权利要求2所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述超滤膜的截留分子量为1-10kDa；所述干燥的方式为冷冻干燥或喷雾干燥；所述蓝圆鲹肽溶液的浓度为10-100 mg/mL。
5.根据权利要求2所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述固定化金属离子亲和层析柱填料的型号为IMAC-SepharoseTM6，固定化金属离子亲和层析柱填料的生产商家为美国通用电气公司。
6.根据权利要求2所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述乙醇溶液的体积百分比浓度为5-30%，所述固定化金属离子亲和层析柱填料浸泡在乙醇溶液中的时间为2-24 h。
7.根据权利要求2所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，用于洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中乙醇的水体积为层析柱体积的2-10倍；步骤（4）中，用于洗去固定化金属离子亲和层析柱填料中未结合的Fe2+的水体积为层析柱体积的2-10倍。
8.根据权利要求2所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述Fe2+溶液为FeCl2溶液或FeSO4溶液；所述Fe2+溶液的pH值为2.0-6.0；所述Fe2+溶液的浓度为50-400 mM；所述Fe2+溶液的体积为层析柱体积的2-10倍。
9.根据权利要求2所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，水的体积为固载有Fe2+亲和层析柱体积的2-10倍；所述缓冲液的浓度为7.0-9.0，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述缓冲液的浓度为5-50mM，所述缓冲液含有50-1000 mM的NaCl；所述缓冲液的体积为固载有Fe2+亲和层析柱体积的1-10倍。
10.根据权利要求2-9任一项所述的蓝圆鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述透析处理采用的透析袋截留分子量为300-100Da，所述透析处理的时间为8-48小时，透析处理的温度为2-20℃。
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