CN111978374B - 一种免疫调节活性六肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫调节活性六肽及其制备方法和应用。将大豆蛋白加水分散，加蛋白酶水解后，高温使酶失活，离心获得蛋白水解物的上清液，膜分离后干燥，采用反相色谱柱纯化活性肽，用水、乙醇溶液梯度洗脱，收集特定浓度乙醇溶液洗脱组分，浓缩后再采用Sephadex LH‑20色谱柱纯化，收集特定浓度乙醇溶液洗脱组分，浓缩后干燥得到目标免疫调节活性六肽。本发明利用大豆蛋白制备免疫调节活性六肽，其产率为21～76g/kg(纯度为75～95％)。本发明为免疫调节活性六肽的制备提供了一种新的方法，对于推动大豆蛋白的深加工利用，提升产品附加值，促进该行业的可持续发展具有重要的意义。
Description
技术领域：
本发明属于农产品加工领域，具体涉及一种免疫调节活性六肽及其制备方法和应用。
背景技术：
活性肽属于重要的食品功能因子，具有调节免疫、抗氧化、预防骨质疏松等生物活性，广泛应用于保健食品等产品生产，深受消费者的欢迎。大豆蛋白为大宗蛋白原料，价格低廉，易于获取，非常适合加工活性肽等高价值产品。活性肽的生物活性与其化学结构，特别是氨基酸序列高度相关。目前虽然有不少关于大豆活性肽的报道，但活性较高的活性肽产品仍然很少。因此，有必要开展大豆活性肽的制备工艺、结构鉴定与活性评价研究，揭示主要活性肽的化学结构，这对于大豆蛋白的高值化利用具有重要意义。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种从大豆蛋白中分离得到的免疫调节活性六肽。
本发明发现并制备了一种免疫调节活性六肽，经液质联用色谱解析确定结构为如式(I)所示：
Gln-Pro-Lys-Gln-Glu-Glu
式(I)。
本发明的第二个目的是提供一种制备免疫调节活性六肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将大豆蛋白加水分散，加蛋白酶水解后，高温使酶失活，离心获得蛋白水解物的上清液，膜分离后干燥，获得大豆蛋白水解物，大豆蛋白水解物采用反相色谱柱纯化活性肽，用水、乙醇水溶液梯度洗脱，收集特定浓度乙醇溶液洗脱组分，浓缩后再采用Sephadex LH-20色谱柱纯化，收集特定浓度乙醇溶液洗脱组分，浓缩后干燥得到目标免疫调节活性六肽。
优选，所述的“大豆蛋白水解物采用反相色谱柱纯化活性肽，用水、乙醇水溶液梯度洗脱，收集特定浓度乙醇溶液洗脱组分，浓缩后再采用Sephadex LH-20色谱柱纯化，收集特定浓度乙醇溶液洗脱组分，浓缩后干燥得到目标免疫调节活性六肽”是将大豆蛋白水解物采用C18反相色谱柱纯化，用水-乙醇作为洗脱剂，按乙醇体积分数从0％按照2％的幅度逐渐上升到20％梯度洗脱，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽成分，浓缩后用Sephadex LH-20色谱柱纯化，用体积分数6％乙醇水溶液洗脱，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽组分，浓缩后干燥得到目标免疫调节活性六肽。
优选，所述的将大豆蛋白加水分散，是将大豆蛋白加入5～20倍质量的水中，然后搅拌分散。
优选，所述的“加蛋白酶水解后，高温使酶失活，离心获得蛋白水解物的上清液，膜分离后干燥获得大豆蛋白水解物”是按照大豆蛋白的质量加入0.1％～1.0％的碱性蛋白酶，pH 7.5～9.5，温度30～65℃，酶解1～5小时，然后加入0.1％～1.0％的中性蛋白酶，pH6.0～8.0，温度40～60℃，酶解1～5小时，升温至90℃保持20分钟使酶失活，离心获得蛋白水解物的上清液，采用截留分子量3000道尔顿的超滤膜过滤，收集透过液喷雾干燥，得到大豆蛋白水解物。
本发明的第三个目的是提供上述免疫调节活性六肽在制备免疫调节活性药物、食品或保健品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种免疫调节活性药物、食品或保健品，其含有上述免疫调节活性六肽作为活性成分。
本发明的第五个目的是提供了大豆蛋白在制备上述免疫调节活性六肽中的应用。
本发明从大豆蛋白在制备免疫调节活性六肽，其产率为21～76g/kg(纯度为75～95％)，其具有良好的免疫调节活性，可应用于制备免疫调节活性药物、食品或保健品。本发明为免疫调节活性六肽的制备提供了一种新的方法，对于推动大豆蛋白的深加工利用，提升产品附加值，促进该行业的可持续发展具有重要的意义。
附图说明：
图1是免疫调节活性六肽的二级质谱；
图2是免疫调节活性六肽诱导巨噬细胞的NO生成量。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：免疫调节活性六肽制备分离和结构鉴定
一、免疫调节活性六肽的制备分离
1)选料：选择大豆分离蛋白。
2)准备：加入大豆分离蛋白10倍质量的水，然后搅拌分散。
3)酶水解：按照大豆分离蛋白的质量加入0.5％的碱性蛋白酶(诺维信)，pH 8.5，温度50℃，酶解3小时，然后加入0.5％的中性蛋白酶(诺维信)，pH 7.0，温度50℃，酶解3小时。升温至90℃保持20分钟使酶失活，离心获得蛋白水解物的上清液，采用截留分子量3000道尔顿的超滤膜过滤，收集透过液喷雾干燥，得到大豆蛋白水解物。
4)柱纯化：将大豆蛋白水解物采用C18反相色谱柱(15×460mm)纯化，用水、乙醇水溶液梯度洗脱，具体是乙醇体积分数从0％按照2％的幅度逐渐上升到20％，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽成分，浓缩后用Sephadex LH-20色谱柱(15×460mm)纯化，用体积分数6％乙醇水溶液洗脱，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽组分，浓缩后干燥得到目标免疫调节活性六肽。
采用该方法获得的免疫调节活性六肽产率为65g/kg，纯度为95％。
二、免疫调节活性六肽的结构鉴定
免疫调节活性六肽可溶于水，该免疫调节活性六肽经高分辨液质联用色谱分析，结果见图1。依据二级质谱信息，鉴定该免疫调节活性六肽的结构如式(I)所示(氨基酸序列)。
Gln-Pro-Lys-Gln-Glu-Glu
式(I)
该免疫调节活性六肽在阳离子模式下的分子离子峰m/z为379.687，z为2。m/z630.274、533.221、405.162、277.103、148.061分别为碎片Pro-Lys-Gln-Glu-Glu、Lys-Gln-Glu-Glu、Gln-Glu-Glu、Glu-Glu、Glu的y离子信号；m/z 611.315、482.273、354.214、226.155、129.102分别为碎片Gln-Pro-Lys-Gln-Glu、Gln-Pro-Lys-Gln、Gln-Pro-Lys、Gln-Pro、Gln的b离子信号。这些信号的存在证实了该免疫调节活性六肽的结构为Gln-Pro-Lys-Gln-Glu-Glu。将该鉴定结构，经人工合成后，再用液质联用色谱检测，发现与被鉴定物质的出峰保留时间一致，且质谱碎片一致。因此，确定该结构为上述结构。
三、免疫调节活性六肽的活性测试
取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h。弃去培养基后加入含不同浓度多肽(免疫调节活性六肽Gln-Pro-Lys-Gln-Glu-Glu)的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养基，对照孔加入不含样品的培养基。置于培养箱中继续培养24h后，收集培养基，采用一氧化氮检测试剂盒(Griess Reagent检测法)测定一氧化氮(NO)的释放量，每个测试三个重复。根据标准品曲线计算出培养基中NO的浓度，其中不加样品处理的细胞作为空白对照。
实验结果如图2所示，图2显示了该免疫调节活性六肽Gln-Pro-Lys-Gln-Glu-Glu的免疫调节活性，以诱导巨噬细胞的NO生成量为指标。与空白对照相比，该免疫调节活性六肽Gln-Pro-Lys-Gln-Glu-Glu在最低的用量(0.1mg/ml)条件下即可产生显著的促进NO生成的效应，证实具有显著的免疫调节活性。在0.1～1.2mg/ml的用量范围内，该免疫调节活性六肽Gln-Pro-Lys-Gln-Glu-Glu的免疫调节活性呈现明显的量效关系。在1.2mg/ml用量条件下，NO浓度高达3.9±0.4μM。
实施例2：
一、免疫调节活性六肽的制备分离
1)选料：选择大豆分离蛋白。
2)准备：加入大豆分离蛋白5倍质量的水，然后搅拌分散。
3)酶水解：按照大豆分离蛋白的质量加入0.1％的碱性蛋白酶，pH7.5，温度30℃，酶解1小时，然后加入0.1％的中性蛋白酶，pH6.0，温度40℃，酶解1小时。升温至90℃保持20分钟使酶失活，离心获得蛋白水解物的上清液，采用截留分子量3000道尔顿的超滤膜过滤，收集透过液喷雾干燥。
4)柱纯化：将大豆蛋白水解物采用C18反相色谱柱(15×460mm)纯化，用水、乙醇水溶液梯度洗脱，具体是乙醇体积分数从0％按照2％的幅度逐渐上升到20％，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽成分，浓缩后用Sephadex LH-20色谱柱(15×460mm)纯化，用体积分数6％乙醇水溶液洗脱，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽组分，浓缩后干燥得到目标免疫调节活性六肽。
采用该方法获得的免疫调节活性六肽产率为21～42g/kg，纯度为75～95％。
实施例3：
一、免疫调节活性六肽的制备分离
1)选料：选择大豆分离蛋白；
2)准备：加入大豆分离蛋白20倍质量的水，然后搅拌分散。
3)酶水解：按照大豆分离蛋白的质量加入1.0％的碱性蛋白酶，pH8.5，温度50℃，酶解5小时，然后加入1.0％的中性蛋白酶，pH7.0，温度50℃，酶解5小时。升温至90℃保持20分钟使酶失活，离心获得蛋白水解物的上清液，采用截留分子量3000道尔顿的超滤膜过滤，收集透过液喷雾干燥，获得大豆蛋白水解物。
4)柱纯化：将大豆蛋白水解物采用C18反相色谱柱(15×460mm)纯化，用水、乙醇水溶液梯度洗脱，具体是乙醇体积分数从0％按照2％的幅度逐渐上升到20％，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽成分，浓缩后用Sephadex LH-20色谱柱(15×460mm)纯化，用体积分数6％乙醇水溶液洗脱，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽组分，浓缩后干燥得到目标免疫调节活性六肽。
采用该方法获得的免疫调节活性六肽产率为61～76g/kg，纯度为75～95％。
实施例4：
一、免疫调节活性六肽的制备分离
1)选料：选择大豆分离蛋白；
2)浸提：加入大豆分离蛋白10倍质量的水，然后搅拌分散；
3)酶水解：按照大豆分离蛋白的质量加入0.5％的碱性蛋白酶，pH9.5，温度65℃，酶解3小时，然后加入0.5％的中性蛋白酶，pH8.0，温度60℃，酶解3小时。升温至90℃保持20分钟使酶失活，离心获得蛋白水解物的上清液，采用截留分子量3000道尔顿的超滤膜过滤，收集透过液喷雾干燥，得到大豆蛋白水解物。
4)柱纯化：将大豆蛋白水解物采用C18反相色谱柱(15×460mm)纯化，用水、乙醇水溶液梯度洗脱，具体是乙醇体积分数从0％按照2％的幅度逐渐上升到20％，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽成分，浓缩后用Sephadex LH-20色谱柱(15×460mm)纯化，用体积分数6％乙醇水溶液洗脱，收集体积分数6％乙醇浓度洗脱的目标活性肽组分，浓缩后干燥得到目标免疫调节活性六肽。
采用该方法获得的免疫调节活性六肽产率为35～49g/kg，纯度为75～95％。
Claims (5)
1.免疫调节活性六肽，其氨基酸序列为：Gln-Pro-Lys-Gln-Glu-Glu。
2.权利要求1所述的免疫调节活性六肽在制备免疫调节活性药物或食品中的应用。
3.权利要求1所述的免疫调节活性六肽在制备免疫调节活性保健品中的应用。
4.一种免疫调节活性药物或食品，其特征在于，含有权利要求1所述的免疫调节活性六肽作为活性成分。
5.一种免疫调节活性保健品，其特征在于，含有权利要求1所述的免疫调节活性六肽作为活性成分。
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