CN104789623A - 一种蛋白肽的制备方法、蛋白肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白肽的制备方法及使用该制备方法制备出的肽粉，以及所述肽粉在降低尿酸的食品或保健品中的应用，能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性，有效降低尿酸。本发明实施例方法包括：将金枪鱼绞碎，水蒸汽或水加热，得到预处理后的金枪鱼，将预处理后的金枪鱼酶解，灭酶，离心，除去杂质，得到上清液，浓缩、干燥得到目标肽粉。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，尤其涉及一种蛋白肽的制备方法、蛋白肽及其应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高和膳食结构的改变，痛风发病率逐年上升，社会关注度明显提高。无论是发达国家还是发展中国家，近年来都呈现发病率显著增高的趋势，严重地区患病率甚至达到20％。治疗痛风的药物普遍存在较严重的不适应症及副作用，故2009年，部分内分泌、代谢、心脑血管专家及肾脏病的学者形成共识，认为通过保健食品调理，将是比较合理的方法。目前，全世界健康食品产业进入一个迅速扩张期。近二十年来，由于国人膳食结构不尽合理，致使我国亚健康人群扩大，也导致近年来我国医疗费用呈节节上升趋势。
黄嘌呤氧化酶是参与痛风发生与发展过程中的关键酶，，也是开发抗痛风药物的重要靶标。研究表明，通过抑制黄嘌呤氧化酶，能够有效降低血浆尿酸水平，可用于预防和治疗痛风及高尿酸血症。肽是来源于蛋白质分子的功能性片段，其辅助治疗痛风的功效已于近年有少量报道，如胶原及其酶解物对于控制尿酸有显著疗效(专利号WO2008066070-A1、JP2008547008-X)。从理论上，生物活性肽潜在具有改善高尿酸血症的重要作用机制——调控嘌呤代谢关键酶系。生物活性肽对嘌呤代谢酶的调控作用可通过以下途径实现：蛋白活性肽具有螯合金属离子的能力，而金属离子是嘌呤代谢关键酶催化反应的激活剂，肽螯合相关金属离子可抑制某些嘌呤代谢酶活性，减少尿酸生成。
目前市售降尿酸食品和保健品，大多为植物提取物，且降尿酸成分不明确，降低尿酸功效不显著。
发明内容
本发明提供一种蛋白肽的制备方法及使用该制备方法制备出的肽粉，以及所述肽粉在降低尿酸的食品或保健品中的应用。
本发明原料来自金枪鱼，原料更易得，所制备出的肽粉经动物实验，降低尿酸的功效明显，黄嘌呤氧化酶抑制率高，能有效改善痛风综合症。
有鉴于此，本发明提供一种蛋白肽的制备方法，可包括：
(1)将金枪鱼绞碎，水蒸汽或水加热至熟，得到预处理后的金枪鱼；
(2)将所述预处理后的金枪鱼酶解，灭酶，离心分离得到上清液；
(3)将所述上清液浓缩、干燥得到目标肽粉。
优选地，所述水蒸汽或水加热的过程包括：使用水蒸汽或水在80-100℃下加热5-30min。
优选地，所述酶解和所述灭酶包括：将所述预处理后的金枪鱼与蛋白酶混合，反应温度50-60℃，反应时间3.0-9.0h；反应结束后灭酶，灭酶温度90℃-100℃，灭酶时间10-20min。
优选地，所述酶解所用蛋白酶为酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、水解蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和Alcalase蛋白酶中的一种或多种，所述蛋白酶的使用量为所述预处理后的金枪鱼重量的0.5％-3.0％。
优选地，所述上清液浓缩之前还包括除去所述上清液中的杂质，得到处理后的上清液。
优选地，除去所述上清液中的杂质包括：
(1)向所述上清液中加入活性炭，加入量为所述上清液重量的1.0-2.5％；
(2)在70-90℃温度下搅拌0.5-2.0h；
(3)过滤，除去活性炭；
优选地，所述浓缩过程采用三效浓缩机，操作条件为0.03-0.08MPa，60-80℃的真空条件下浓缩至固形物含量30-45％。
本发明所述金枪鱼为鲣鱼、蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼中的 一种或多种。
本发明还提供一种蛋白肽，所述蛋白肽使用前述制备方法制备，所述蛋白肽的特征为重量比不小于70％的蛋白肽的分子量小于5000Da。
本发明还提供一种蛋白肽的应用，所述蛋白肽使用前述制备方法制备，应用于降尿酸的食品或保健品中。
本发明实施例中，金枪鱼经粉碎处理后，加入脱腥剂处理后，加入金枪鱼1-10倍重量的食用级水或者使用水蒸气，于80-100℃下加热5-10min，冷却；按照金枪鱼的重量加入酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、水解蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和Alcalase蛋白酶(加酶量0.5％-3.0％)，于55℃水浴振荡反应3.0-8.0h；反应结束后将水解液置于沸水中保温10-20min灭酶，离心分离，取上清液；用活性炭除杂及离子交换树脂分离蛋白肽：向所述上清液中按1.0-2.5％重量比加入活性炭进行粗滤，在70-90℃温度下搅拌0.5-2.0h。用微滤装置过滤料液，除去活性炭；利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析进行分离，以0.1mol/L的氯化钠溶液为洗脱剂，收集洗脱液；用三效浓缩机浓缩所述洗脱液，在0.03-0.08MPa，60-80℃的真空条件下，将所述洗脱液浓缩至固含量30-45％，喷雾干燥，得到目标肽粉；经MALDI-TOF-MS质谱监测主要肽功效组分的分子量均小于5000Da。
将金枪鱼预处理后，使用蛋白酶降解为蛋白肽，得到的活性蛋白肽具有螯合金属离子的能力，而金属离子是嘌呤代谢关键酶黄嘌呤氧化酶催化反应的激活剂，肽螯合金属离子可抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少尿酸生成，降低血浆尿酸水平，从而有效预防和治疗痛风及高尿酸血症。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种蛋白肽的制备方法及使用该制备方法制备出的肽粉，用于改善痛风综合症。
本发明一种蛋白肽的制备方法，将金枪鱼绞碎，水蒸汽或水在80-100℃ 下加热5-30min，得到预处理后的金枪鱼；将所述预处理后的金枪鱼将所述预处理后的金枪鱼与蛋白酶混合，反应温度50-60℃，反应时间3.0-9.0h；反应结束后灭酶，灭酶温度90-100℃，灭酶时间10-20min，酶解所用蛋白酶为酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、水解蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和Alcalase蛋白酶中的一种或多种，所述蛋白酶的使用量为所述预处理后的金枪鱼重量的0.5％-3.0％。
灭酶后离心，得到上清液，向上清液中加入活性炭，加入量为所述上清液重量的1.0-2.5％；在70-90℃温度下搅拌0.5-2.0h；过滤，，除去活性炭；采用三效浓缩机浓缩，操作条件为0.03-0.08MPa，60-80℃的真空条件下浓缩至固形物含量为30-45％；干燥得到目标肽粉。
实际应用中，可以将目标肽粉与土茯苓、菊苣、车前、薏苡仁等中草药配伍，制备出具有降尿酸功能的保健食品或保健品。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
将蓝鳍金枪鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，得到500kg蓝鳍金枪鱼碎肉，加入1000kg水，在90℃下搅拌加热25min，，得到蓝鳍金枪鱼肉浆，然后温度降至55℃；向蓝鳍金枪鱼肉浆内加入其量13kg中性蛋白酶，在55℃下保温水解6小时，然后在90℃下加热20min进行灭酶，最后使用离心机离心，取上清液，得到金枪鱼酶解粗液；向金枪鱼酶解粗液加入5kg活性炭，在50℃下保温搅拌0.8小时，然后通过0.5μm滤纸过滤，所得滤液为金枪鱼酶解精制液，采用真空浓缩法将金枪鱼酶解精制液浓缩至固形物30％，进行喷雾干燥，得金枪鱼提取物1。
金枪鱼提取物1对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
本发明实施例制备的活性蛋白肽具有螯合金属离子的能力，而金属离子是嘌呤代谢关键酶黄嘌呤氧化酶催化反应的激活剂，肽螯合金属离子可抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少尿酸生成，降低血浆尿酸水平，，从而有效预防和治疗痛风及高尿酸血症。
实施例2
(1)将黄鳍金枪鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，得到500kg黄鳍金枪鱼碎肉，加入500kg水，在80℃下搅拌加热30min，得到黄鳍金枪鱼肉浆，然后温度降至50℃。
(2)往黄鳍金枪鱼肉浆内加入3kg的中性蛋白酶、5kg的风味蛋白酶和3kg的水解蛋白酶，在50℃下保温水解8小时，然后在90℃下加热30min进行灭酶，最后离心，取上清液，得到金枪鱼酶解粗液。
(3)往金枪鱼酶解粗液中加入5kg的活性炭，在50℃下保温搅拌0.5小时，然后通过0.5μm滤纸过滤，所得滤液为金枪鱼酶解精制液。
(4)将金枪鱼酶解精制液真空浓缩至固形物30％以上，，进行喷雾干燥，得金枪鱼提取物2。
金枪鱼提取物2对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
本发明实施例制备的活性蛋白肽具有螯合金属离子的能力，而金属离子是嘌呤代谢关键酶黄嘌呤氧化酶催化反应的激活剂，肽螯合金属离子可抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少尿酸生成，降低血浆尿酸水平，，从而有效预防和治疗痛风及高尿酸血症。
实施例3
(1)将鲣鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，，得到250kg鲣鱼碎肉，将长鳍金枪鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，得到250kg长鳍金枪鱼，将两种鱼的碎肉合并，加入1500kg的水，在100℃下搅拌加热10min，得到鲣鱼肉浆，然后温度降至50℃。
(2)往鲣鱼肉浆内加入其量3kg酸性性蛋白酶、3.5kg的风味蛋白酶、1kg木瓜蛋白酶、1kg中性蛋白酶、2kgAlcalase蛋白酶和2kg的胰蛋白酶，在50℃下保温水解9小时，然后在95℃下加热15min进行灭酶，最后离心，取上清液，得到鲣鱼酶解粗液。
(3)往鲣鱼酶解粗液中加入其质量0.8％的活性炭，在50℃下保温搅拌1.0小时，然后通过0.5μm滤纸过滤，所得滤液为鲣鱼酶解精制液。
(4)将鲣鱼酶解精制液真空浓缩至固形物30％，进行喷雾干燥，得金枪 鱼提取物3。
金枪鱼提取物3对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
本发明实施例制备的活性蛋白肽具有螯合金属离子的能力，而金属离子是嘌呤代谢关键酶黄嘌呤氧化酶催化反应的激活剂，肽螯合金属离子可抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少尿酸生成，降低血浆尿酸水平，，从而有效预防和治疗痛风及高尿酸血症。
对比例1
(1)A：将秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，得到500kg秋刀鱼碎肉，加入1000kg的水，在80℃下搅拌加热30min，，得到秋刀鱼肉浆，然后温度降至50℃。
B：将红三鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，得到500kg红三鱼碎肉，加入1000kg，在80℃下搅拌加热30min，得到红三鱼肉浆，然后温度降至50℃。
C：将马鲛鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，得到500kg马鲛鱼碎肉，加入1000kg的水，在80℃下搅拌加热30min，得到马鲛鱼肉浆，然后温度降至50℃。
(2)分别往三种鱼肉浆内加入6kg的中性蛋白酶和10kg的风味蛋白酶，在50℃下保温水解8小时，然后在95℃下加热15min进行灭酶，最后离心，取上清液，分别得到三种鱼酶解粗液。
(3)分别往三种鱼酶解粗液中加入其质量0.5％的活性炭，在50℃下保温搅拌1.0小时，然后通过0.5μm滤纸过滤，所得滤液为鱼酶解精制液。
(4)分别真空浓缩三种鱼酶解精制液至固形物30％以上，进行喷雾干燥，分别得到秋刀鱼提取物、红三鱼提取物和马鲛鱼提取物。
秋刀鱼提取物、红三鱼提取物和马鲛鱼提取物对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
对比例2
(1)将蓝鳍金枪鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，得到500kg蓝鳍金枪鱼碎肉，加入500kg的水，在85℃下搅拌加热25min，得到蓝 鳍金枪鱼肉浆，然后温度降至45℃。
(2)A：将蓝鳍金枪鱼肉浆中的pH调至8.0，往蓝鳍金枪鱼肉浆内加入7.5kg的碱性蛋白酶和12.5kg的风味蛋白酶，在45℃下保温水解9小时，然后在95-100℃下加热15-30min进行灭酶，最后离心，取上清液，得到金枪鱼酶解液A。
B：将蓝鳍金枪鱼肉浆中的pH调至4.5，往蓝鳍金枪鱼肉浆内7.5kg的酸性蛋白酶和12.5kg的风味蛋白酶，在45℃下保温水解9小时，然后在95-100℃下加热15-30min进行灭酶，最后离心，取上清液，得到金枪鱼酶解液B。
(3)往金枪鱼酶解液8kg的活性炭，在50℃下保温搅拌1.0小时，然后通过0.5μm滤纸过滤，所得滤液为金枪鱼提取溶液。
(4)真空浓缩金枪鱼提取溶液，喷雾干燥，分别得金枪鱼提取物对照组A、B。
金枪鱼提取物对照组A、B对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1、表2和表3。
SPF级SD大鼠180只，雄性，体重200±20g，广州中医药大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(粤)2013-0020)。试剂：：别嘌醇片(广东彼迪药业有限公司，产品批号20130302)；氧嗪酸钾(山东中科泰斗化学有限公司，批号：Batch No.120901)；羧甲基纤维素钠(上海赛璐珞厂，产品标准号：GB2760)；尿酸试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号：20130529)。
动物分组和造模：取正常健康SD雄性大鼠165只，随机分为正常对照组(15只)和造模组(150只)，造模组大鼠每天灌胃氧嗪酸钾(2g·kg-1)，连续处理7天，然后3％戊巴比妥钠(30mg·kg-1)腹腔注射麻醉，眼结膜取血(0.5ml)，以4℃、3000rpm、离心15min，取上层血清测定尿酸含量；正常对照组大鼠灌胃给予等容积的溶媒。将尿酸含量高于110μmol·L-1的大鼠确定为造模成功。将造模成功的大鼠按尿酸含量随机分为模型对照组(等容积溶媒)、受试药肽金枪鱼提取物1(200mg·kg-1)、金枪鱼提取物2(200mg·kg-1)、金枪鱼提取物3(200mg·kg-1)、秋刀鱼提取物(200mg·kg-1)、红三鱼提取物(200mg·kg-1)、马鲛鱼提取物(200mg·kg-1)、金枪鱼提取物对照组A (200mg·kg-1)、金枪鱼提取物对照组B(200mg·kg-1)和别嘌醇组(50mg·kg-1)，每组大鼠15只，灌胃给药(给药容积10ml/kg)，模型大鼠给予等容积的蒸馏水。上述肽样品处理10d、20d时，于末次给药50min，3％戊巴比妥钠(30mg·kg-1)后，眼结膜取血(0.5ml)，测定血清尿酸含量；抗痛风肽处理第30d时，3％戊巴比妥钠麻醉后腹腔动脉取血5ml，除测定血清尿酸含量外，同时测定血清肌酐和尿素氮含量。
血清尿酸测定：采用钨酸法并严格按试剂盒说明进行操作和测定。
血清尿素氮和肌酐测定：采用二乙酰肟法测定血清尿素氮含量；采用苦味酸法测定血清肌酐含量，具体操作严格按试剂盒说明进行测定。
统计学处理：所有数据均以表示，采用spss16.0统计软件处理，各组组间差异比较采用t检验方法，P<0.05为差异具有统计学意义。
表1金枪鱼提取物对氧嗪酸钾诱致高尿酸血症大鼠体重变化的影响
注：与正常对照组比较：ap<0.01，cp<0.01；与模型组比较：bp<0.01； ep<0.05；fp>0.05。
表2金枪鱼提取物作用不同时间对氧嗪酸钾诱致高尿酸血症大鼠血清尿酸含量的影响
注：与正常组比较：ap<0.01，cp>0.05；与模型组比较：：bp<0.01，，ep<0.05，fp>0.05.
表3金枪鱼提取物作用30d对氧嗪酸钾诱致高尿酸血症大鼠血清肌酐及尿素氮含量的影响
注：与正常组比较：ap<0.01，cp>0.05；与模型组比较：：bp<0.01，，ep<0.05，fp>0.05.
由于大鼠和人类共享90％的基因，全球范围内，大鼠在人体生理和疾病 研究过程中是公认的实验模型。在降尿酸功效验证实验中，，由于大鼠体内存在尿酸酶，会在代谢过程中降解尿酸，因此，本动物实验是通过给大鼠每天灌胃氧嗪酸钾，阻断老鼠体内尿酸酶的作用，使大鼠的血液内尿酸水平增加，并将尿酸含量高于110μmol·L-1的大鼠确定为造模成功，再进行灌药实验。
由表1可见，金枪鱼提取物和对照样组在模型动物处理前后，各组大鼠体重之间未见明显差异，说明给药不造成负面影响。
氧嗪酸钾是一种尿酸酶抑制剂，作为化学诱导剂可抑制尿酸分解，增加体内血清尿酸水平，造成高尿酸血症动物模型。由表2可见，模型大鼠和各组给药前大鼠经过氧嗪酸钾处理1周后，血清尿酸含量明显高于正常对照组大鼠(p<0.01)；而模型组大鼠在后续氧嗪酸钾处理10d，20d和30d时，血尿酸含量明显高于正常对照组大鼠(p<0.01)。对于高尿酸模型大鼠，给予药物处理后，受试药金枪鱼提取物1在处理第10d时，而金枪鱼提取物2和3在处理第20d和30d时，可明显降低模型组大鼠血清尿酸含量(p<0.05，p<0.01)，且作用效果稳定。而秋刀鱼提取、红三鱼提取物、马鲛鱼提取物、金枪鱼对照组A和B在处理第30d时仍未表现出降低血酸的作用(p>0.05)；别嘌醇组具有非常明显的降低模型大鼠血清尿酸的作用(p<0.01)。由表2可见，采用相同工艺作用不同原料获得的鱼提取物不存在降低模型大鼠血清尿酸的作用，说明只有金枪鱼中具有某些降尿酸作用的活性片段，经过生物酶解后释放出来。此外，以金枪鱼为原料，采用非本专利使用的酶制剂对其进行水解获得的金枪鱼提取物(金枪鱼提取物对照1、2)，并不具有显著的降尿酸作用，由此说明，必须是酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、水解蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和Alcalase蛋白酶中的一种或多种酶水解金枪鱼才能将其内含降尿酸作用的片段释放。因此，采用本发明方法制备的金枪鱼提取物具有较好的应用前景。
本发明实施例提供的一种蛋白肽的制备方法制备出的肽粉，具有螯合金属离子的能力，而金属离子是嘌呤代谢关键酶黄嘌呤氧化酶催化反应的激活剂，肽螯合金属离子可抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少尿酸生成，降低血浆尿酸水平，从而有效预防和治疗痛风及高尿酸血症，用于改善痛风综合症效果显著。
实际应用中，可以将本发明的目标肽粉与土茯苓、菊苣、车前、薏苡仁、姜黄等中草药配伍制备出具有降尿酸功能的保健食品，也可以与薏苡仁、木瓜、山药等药食同源的药材、芹菜等含钾的蔬菜、生姜、蒜等制成食品。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将金枪鱼绞碎，加水加热或用水蒸汽加热，得到预处理后的金枪鱼；
(2)将所述预处理后的金枪鱼酶解，灭酶，离心分离得到上清液；
(3)将所述上清液浓缩、干燥得到目标肽粉，所述目标肽粉即为蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述加水加热或用水蒸汽加热的过程包括：使用水蒸汽或水在80-100℃下加热5-30min。
3.根据权利要求1所述的蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述酶解和所述灭酶包括：将所述预处理后的金枪鱼与蛋白酶混合，反应温度50-60℃，反应时间3.0-9.0h；反应结束后灭酶，灭酶温度90℃-100℃，灭酶时间10-20min。
4.根据权利要求1所述的蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述酶解所用蛋白酶为酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、水解蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和Alcalase蛋白酶中的一种或多种，所述蛋白酶的使用量为所述预处理后的金枪鱼重量的0.5％-3.0％。
5.根据权利要求1所述的蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述上清液浓缩之前还包括除去所述上清液中的杂质，得到处理后的上清液。
6.根据权利要求5所述的蛋白肽的制备方法，其特征在于，除去所述上清液中的杂质包括：
(1)向所述上清液中加入活性炭，加入量为所述上清液重量的1.0-2.5％；
(2)在70-90℃温度下搅拌0.5-2.0h；
(3)过滤，除去活性炭。
7.根据权利要求1所述的蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述浓缩过程采用三效浓缩机，操作条件为0.03-0.08MPa，60-80℃的真空条件下浓缩至固形物含量为30-45％。
8.根据权利要求1所述的蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述金枪鱼为鲣鱼、蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼中的一种或多种。
9.如权利要求1～8任一项所述的蛋白肽的制备方法所制备的蛋白肽，所述蛋白肽的特征为重量比不小于70％的蛋白肽的分子量小于5000Da。
10.权利要求1～8任一项所述的蛋白肽的制备方法所制备的蛋白肽在降低尿酸的食品或保健品中的应用。
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