CN102776262B - 一种高f值金枪鱼寡肽制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于寡肽制备技术领域，具体涉及一种高F值金枪鱼寡肽制备方法。本发明采用固定化酶解方法和活性炭动态吸附法，具有良好的酶解效率，适用于工业化生产。

Description

一种高F值金枪鱼寡肽制备方法

技术领域

本发明属于寡肽制备技术领域，具体涉及一种高F值金枪鱼寡肽制备方法。

背景技术

金枪鱼(Tunas) 又叫鲔鱼、吞拿鱼，属鲈形目(Perciformes)鲭科(Scombridae)，作为一种深海鱼类，金枪鱼不仅肉味鲜美，而且营养价值非常高，富含蛋白质、不饱和脂肪酸和维生素，以“纯天然、营养价值高”而享誉国际市场。金枪鱼的主要加工种类有蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼和大眼金枪鱼。浙江省是我国金枪鱼加工中心，拥有全国最大的金枪鱼加工基地，金枪鱼除了鲜销外，其加工产品的附加值非常高，一般经过冷冻处理用于制作寿司及罐装食品。金枪鱼在加工过程中产生大量碎肉，这些碎肉同金枪鱼的鱼肉主体一样营养丰富，目前尚无有效的工业化深加工方法。 

高F值寡肽是由3～7个氨基酸残基所组成的混合小肽混合物，F值是指混合物中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，简称BCAA）和芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸，简称AAA）的摩尔比值，是为了纪念德国著名学者Fischer 在上个世纪70年代提出的“伪神经传递质假说”而命名的。小肽分子与游离氨基酸相比具有渗透压低、抗原性低等优点，所以更容易被吸收。研究表明高F值寡肽能够改进肝脏疾病（肝硬化、肝性脑病），常被用于辅助治疗肝性脑病以及改善手术后和卧床病人的蛋白质营养状况，另外，高F值寡肽还具有抗疲劳和醒酒等多种生物活性。但是，相对于水产蛋白及加工副产物蛋白水解液的抗氧化肽和ACE降压肽研究而言，水产蛋白高F值寡肽的研究还较少，而以金枪鱼碎肉为原料制备高F值寡肽的研究还未见报道。

目前高F值寡肽制备主要采用二步酶解法，第一步酶切：在原料蛋白肽链的芳香族氨基酸处切割使芳香族氨基酸暴露出来；第二步酶切：将芳香族氨基酸切掉，释放到水解液中为游离型，使寡肽剩下含量高的支链氨基酸。所以，酶解法制备高F值寡肽关键点之一是要选择特异性蛋白酶，提高酶解效率，释放芳香族氨基酸。

获得高F值寡肽关键点之二是要最大限度地去除蛋白水解液中芳香族氨基酸，提高支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值（F值>20）。蛋白质水解液中的芳香族氨基酸去除方法很多，如离子交换法、凝胶过滤法、膜分离法、活性炭吸附色谱法等，其中活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸有选择性吸附特性，利用这一特性，可将寡肽和芳香族氨基酸分离，而且从工业应用角度考虑，活性炭吸附法更易推广使用，适合大规模生产。

现有的活性炭吸附法都采用活性炭静态吸附法，在酶解液中直接加入活性炭进行吸附，这种方法洗脱效果有限，酶解液中有较多的活性炭残留，吸附使用过的活性炭再生困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高F值金枪鱼寡肽的制备方法，具有良好的酶解效率，适用于工业化生产。 

本发明的具体技术方案是：  

一种高F值金枪鱼寡肽的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：

预处理：称取解冻后的金枪鱼碎肉，采用匀浆机匀浆两分钟，直到无大块鱼肉为止，然后按一定比例w/v=1:7加入蒸馏水，放在反应器中，35°C保温；

固定化酶制备：

称取一定量的壳聚糖，用2%乙酸溶液至完全溶解，用注射器将制备好的壳聚糖凝胶按1:3 90%乙醇溶液中，凝结2h，加入5%戊二醛，开动磁力搅拌器，在150rpm转速下振荡1h，用去离子水充分洗涤，至无戊二醛残液，得到交联好的载体；

在交联好的载体中，加入一定量由pH 3.0的乳酸-乳酸钠配置的胃蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交联10h，用蒸馏水洗涤，布氏漏斗抽滤得到固定化胃蛋白酶；

在交联好的载体中，加入一定量由蒸馏水配制的木瓜蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交联10h，用蒸馏水洗涤，布氏漏斗抽滤得到固定化木瓜蛋白酶；

将固定化胃蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶装配于一个两层筒状酶反应器中，该酶反应器由上下两层旋转筐连接而成，将固定化胃蛋白酶装配在上面一个旋转筐夹层中，将固定好的木瓜蛋白酶装在下面一个旋转筐夹层中；

酶解：让反应液依次流过这两个旋转筐，所述旋转筐内部设有主轴带动叶轮转动，使酶解液与固定化酶发生相对运动，利于固定化酶与酶解液充分接触；

其中，第一步酶解条件如下：调节反应液pH至2.0，放入上层旋转筐内进行酶解，酶解温度为40℃，每隔半小时调节一次pH值，让酶解液保持在pH2.0下进行酶解，酶解时间为4小时；

第二步酶解条件如下：打开上下层旋转筐之间的阀门，让第一步酶解液流入下层旋转筐中，调节第一步酶解液pH至6.5 ，酶解温度55℃，酶解时间3小时，每隔半小时调节一次pH值，让酶解液始终保持在pH6.5下进行酶解；酶解完成后酶解液调节pH至中性，冷却至室温，从下层旋转筐取出后4500r/min 离心15min，提取上清液备用；

微滤：第二步酶解得到的上清液经5000Da微滤膜微滤，压力为30psi ，温度35°C，除去未水解的大分子蛋白质和多肽；

活性炭动态吸附：将活性炭颗粒装载于玻璃吸附柱中制备而成的活性炭吸附柱对微滤后的滤液进行动态吸附，其中活性炭颗粒由粒度200目、比表面积1200㎡的活性炭一和粒度200目，比表面积1300㎡的活性炭二按质量比1:2装填，活性炭颗粒与物料比为1:10，调节微滤液的pH2.0~4.0，以0.5ml/min流速进行层析，吸附温度为40℃，动态吸附3小时，以3000r/min离心10min，去上清液即为高F值金枪鱼寡肽溶液。

所述活性炭吸附柱包含用于吸附酶解液中芳香族氨基酸的竖向流体通道和用于活性炭吸附柱洗脱的横向流体通道，两个流体通道均设有独立流体泵。

所述活性炭吸附柱的底部设有加热部件。

本发明的另一个方案，所述活性炭动态吸附步骤，将活性炭装入吸附反应器，该吸附反应器包含一个旋转夹层筒，旋转夹层筒夹层为解吸管路，旋转夹层筒的内侧管路为吸附管路， 

吸附时，打开泵一，设定泵一压力为0.04Mpa，吸附温度40℃，酶解液进入媳妇管路，开动叶片，使其与活性炭充分接触，同时打开左侧泵二，设定压力为0.02Mpa，设定解吸温度15℃，让解吸液流入解析管路中，由于压力较小，不会进入到酶解液中，解吸液会将活性炭吸附好的芳香族氨基酸解吸下来，打开右侧泵三，设定压力为﹣1000Pa，使解吸液流出，动态吸附3小时后，以3000r/min离心10min，取上清液即为高F值金枪鱼寡肽溶液。

活性炭颗粒装进吸附柱的夹层中，吸附和解吸同时进行，互不干扰，通过增加吸附泵的压力，让酶解液进入装有活性炭的夹层中，再降低解吸泵压力，让在活性炭夹层中的洗脱液流出）

由于酶解需要的pH值环境各不相同，现有技术中往往仅仅进行一次pH的调整，这种做法会引起酶解效率的下降，因为随着酶解的持续进行，溶液环境中的pH值也在不断的变化，因此，本发明通过多次调整溶液pH值，确保酶解在最合适的条件下进行，提高了酶解效率。

附图说明

图1为本发明高F值金枪鱼寡肽的制备方法流程图。

图2为本发明制备方法所用酶反应器结构示意图。

图3为本发明所用吸附反应器结构示意图。

其中，上层旋转筐1，下层旋转筐2，阀门3，同心转轴4，叶片5，旋转夹层筒6，泵一7，泵二8，泵三9，转轴10，叶片11。

具体实施方式

实施例一

高F值金枪鱼寡肽的制备方法包括以下步骤：

预处理：称取50g 解冻后的金枪鱼碎肉，采用匀浆机匀浆两分钟，直到无大块鱼肉为止，然后按w/v=1:7加入蒸馏水，放在反应器中，35°C保温；

第一步酶解：用6mol/L 的HCl溶液调节反应液pH至2.0 ，按照 800U/g 加入胃蛋白酶，放置于35°C振荡水浴箱中水浴4h，每隔半小时用6mol/L 的HCl溶液调节一次pH值，让酶解液始终在pH2.0下进行酶解；调节反应器温度为95°C灭酶15min，调节pH至中性，冷却至室温，然后抽滤，滤液备用；

第二步酶解：取第一步酶解的滤液按照E/S=1% 加入肌动蛋白酶，用2mol/L HCL和NaOH调节滤液pH至6.5 ，放置于37°C振荡水浴箱中水浴3h，每隔半小时调节一次pH值，让酶解液始终在pH6.5下进行酶解；酶解完成后95°C灭酶15min，调节pH至中性，冷却至室温，4500r/min 离心15min，上清液备用；

微滤：第二步酶解得到的上清液经5000Da微滤膜微滤，压力为30psi ，温度35°C，除去未水解的大分子蛋白质和多肽，

活性炭动态吸附：将活性炭装载于玻璃吸附柱中制备而成的活性炭吸附柱对微滤后的滤液进行动态吸附。木质颗粒活性炭（粒度200目，比表面积1200㎡）和木质颗粒活性炭（粒度200目，比表面积1300㎡）按质量比1:2 装填，活性炭与物料比1:10，吸附温度为40℃，调节微滤液pH 2.0-4.0，以0.5ml/min流速上层析柱，当到达80ml时，以同样速度上洗脱液，一般吸附时pH变化不大，如有变化，每隔半小时调节一次pH，直到稳定为止，动态洗脱3h，3000 r/min 离心10 min，取上清液，OD₂₂₀nm/OD₂₆₀nm达到最大值，即高F值金枪鱼寡肽溶液。

 活性炭再生：用0.8mol/L的氨水和0.8mol/L的无水乙醇等体积比混合作为洗脱液，对动态吸附饱和的活性炭吸附柱进行洗脱。下表为不同浓度洗脱液洗脱效果表。

实施例二

与实施例一不同的是，本实施例采用固定化酶反应器。

固定化酶制备：

  称取一定量的壳聚糖，用2%乙酸溶液至完全溶解，用注射器将制备好的壳聚糖凝胶按1:3 90%乙醇溶液中，凝结2h，加入5%戊二醛，开动磁力搅拌器，在150rpm转速下振荡1h，用去离子水充分洗涤，至无戊二醛残液。

 在交联好的载体中，加入一定量由pH=3.0的乳酸-乳酸钠配置的胃蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交联10h，用蒸馏水洗涤，布氏漏斗抽滤得到固定化酶。

在交联好的载体中，加入一定量由蒸馏水配制的木瓜蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交联10h，用蒸馏水洗涤，布氏漏斗抽滤得到固定化酶。

第一步酶解：调节反应液pH至2.0 ，按照 800U/g 加入固定化胃蛋白酶，放置于40°C振荡水浴箱中水浴4h，每隔半小时调节一次pH值，让酶解液始终在pH2.0下进行酶解。

第二步酶解：打开阀门，让第一步酶解液流入下面的酶解筒中，按照E/S=1% 加入固定化木瓜蛋白酶，调节滤液pH至6.5 ，放置于55°C振荡水浴箱中水浴3h，每隔半小时调节一次pH值，让酶解液始终在pH6.5下进行酶解；酶解完成后调节pH至中性，冷却至室温，4500r/min 离心15min，提取上清液备用；

  将固定好的胃蛋白酶酶装在上面一个旋转筐夹层中，将固定好的木瓜蛋白酶装在下面一个旋转筐夹层中，让酶解液依次流过这两个旋转筐中，此设计的关键在于旋转筐，让筐内固定化酶旋转起来，而其内部由主轴带动一个叶轮转动，由于受到离心力和搅动力的双重作用，使酶解液与固定化酶发生相对运动，利于固定化酶与酶解液充分接触，酶解完全。 采用酶反应器的优点如下 ： 

1、相比于那种静态的插入酶板，优点在于受到离心力和搅动力的双重作用，使酶解液与固定化酶发生相对运动，利于固定化酶与酶解液充分接触，酶解效果明显好于静态插入酶板的方法，水解度多出15%，蛋白转化率也明显增强。

2、与非固定化酶解相比，缩短了酶解时间，提高了生产效率。

3、上面酶解好后，打开阀门，酶解液便可流入第二个旋转筐中，这时，上面的旋转框就可以继续酶解。

4、两个旋转框同时工作，互不影响。

活性炭动态吸附：将活性炭装载于玻璃吸附柱中制备而成的活性炭吸附柱对微滤后的滤液进行动态吸附。木质颗粒活性炭（粒度200目，比表面积1200㎡）和木质颗粒活性炭（粒度200目，比表面积1300㎡）按质量比1:2 装填，活性炭与物料比1:10，吸附温度为40℃，调节微滤液pH 2.0-4.0，以0.5ml/min流速上层析柱，当到达80ml时，以同样速度上洗脱液，一般吸附时pH变化不大，如有变化，每隔半小时调节一次pH，直到稳定为止，动态洗脱3h，3000 r/min 离心10 min，取上清液，OD₂₂₀nm/OD₂₆₀nm达到最大值，即高F值金枪鱼寡肽溶液。

实施例三

与实施例二不同的是，本实施例采用吸附反应器替代活性炭吸附柱。

将活性炭装入旋转夹层中，吸附时，打开泵一，设定压力为0.04Mpa，吸附温度40℃，酶解液进入活性炭柱中，开动叶片，使其与活性炭充分接触，同时打开左侧泵二，设定压力为0.02Mpa，设定解吸温度15℃，让解吸液流入旋转夹层中，由于压力较小，不会进入到酶解液中，解吸液会将活性炭吸附好的芳香族氨基酸解吸下来，打开右侧泵三，设定压力为﹣1000Pa，使解吸液流出。吸附管路和解析管路相对独立。

Claims (3)

1.一种高F值金枪鱼寡肽的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：

预处理：称取解冻后的金枪鱼碎肉，采用匀浆机匀浆两分钟，直到无大块鱼肉为止，然后按一定比例w/v=1:7加入蒸馏水，放在反应器中，35°C保温；

固定化酶制备：

称取一定量的壳聚糖，用2%乙酸溶液至完全溶解，用注射器将制备好的壳聚糖凝胶按1:3 注射到90%乙醇溶液中，凝结2h，加入5%戊二醛，开动磁力搅拌器，在150rpm转速下振荡1h，用去离子水充分洗涤，至无戊二醛残液，得到交联好的载体；

在交联好的载体中，加入一定量由pH 3.0的乳酸-乳酸钠配置的胃蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交联10h，用蒸馏水洗涤，布氏漏斗抽滤得到固定化胃蛋白酶；

在交联好的载体中，加入一定量由蒸馏水配制的木瓜蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交联10h，用蒸馏水洗涤，布氏漏斗抽滤得到固定化木瓜蛋白酶；

将固定化胃蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶装配于一个两层筒状酶反应器中，该酶反应器由上下两层旋转筐连接而成，将固定化胃蛋白酶装配在上面一个旋转筐夹层中，将固定好的木瓜蛋白酶装在下面一个旋转筐夹层中；

酶解：让反应液依次流过这两个旋转筐，所述旋转筐内部设有主轴带动叶轮转动，使酶解液与固定化酶发生相对运动，利于固定化酶与酶解液充分接触；

其中，第一步酶解条件如下：调节反应液pH至2.0，放入上层旋转筐内进行酶解，酶解温度为40℃，每隔半小时调节一次pH值，让酶解液保持在pH2.0下进行酶解，酶解时间为4小时；

第二步酶解条件如下：打开上下层旋转筐之间的阀门，让第一步酶解液流入下层旋转筐中，调节第一步酶解液pH至6.5 ，酶解温度55℃，酶解时间3小时，每隔半小时调节一次pH值，让酶解液始终保持在pH6.5下进行酶解；酶解完成后酶解液调节pH至中性，冷却至室温，从下层旋转筐取出后4500r/min 离心15min，提取上清液备用；

微滤：第二步酶解得到的上清液经5000Da微滤膜微滤，压力为30psi ，温度35°C，除去未水解的大分子蛋白质和多肽；

活性炭动态吸附：将活性炭颗粒装载于玻璃吸附柱中制备而成的活性炭吸附柱对微滤后的滤液进行动态吸附，其中活性炭颗粒由粒度200目、比表面积1200㎡的活性炭一和粒度200目，比表面积1300㎡的活性炭二按质量比1:2装填，活性炭颗粒与物料比为1:10，调节微滤液的pH2.0~4.0，以0.5ml/min流速进行层析，吸附温度为40℃，动态吸附3小时，以3000r/min离心10min，取上清液即为高F值金枪鱼寡肽溶液。

2.根据权利要求1所述的高F值金枪鱼寡肽的制备方法，其特征在于所述活性炭吸附柱包含用于吸附酶解液中芳香族氨基酸的竖向流体通道和用于活性炭吸附柱洗脱的横向流体通道，两个流体通道均设有独立流体泵。

3.根据权利要求1所述的高F值金枪鱼寡肽的制备方法，其特征在于所述活性炭吸附柱的底部设有加热部件。

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