CN114751975A - 一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及金枪鱼骨胶原肽技术领域，为获得具有生物活性的金枪鱼骨胶原肽，公开一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，即将金枪鱼鱼骨粉与水混合制成鱼骨粉分散液，将分散液经蛋白酶酶解，所用蛋白酶中含有内切酶和外切酶，选自动物蛋白水解酶、海产品蛋白水解酶、骨蛋白水解酶或风味蛋白酶。本发明的制备方法所得金枪鱼鱼骨胶原肽的分子量较低，集中分布在500Da以内，与现有金枪鱼鱼骨蛋白利用相比，不需要经过复杂的纯化步骤即能够获得低分子范围的金枪鱼鱼骨胶原肽，生物活性高，能够用于促进成骨细胞的增殖和矿化，而且避免了金枪鱼鱼骨蛋白资源的浪费，金枪鱼鱼骨蛋白利用效率高。

Description

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及金枪鱼骨胶原肽技术领域，具体涉及一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法及金枪鱼骨胶原肽的应用。

背景技术

金枪鱼骨中蛋白质含量丰富，是一种可开发利用的蛋白质原料，将鱼骨作为提取生物活性肽的原材料，可以有效提高鱼骨的附加价值。现有的研究表明，从金枪鱼鱼骨中提取的胶原肽具有可以强化成骨细胞的增殖、促进成骨细胞分化的作用。

如发明人在专利申请CN202110334592.0中公开了一种从金枪鱼鱼骨中获得的功能短肽，具有促进骨前体细胞增强的作用。其制备过程为将金枪鱼鱼骨经酸性蛋白酶酶解后，再经乳酸菌发酵制备得到。但是金枪鱼鱼骨胶原肽含量丰富，仅提取其中的一种短肽而舍弃其他有效肽同样存在金枪鱼鱼骨中蛋白质资源未合理利用的问题。

一般而言，多肽的生物活性和其分子量具有密切关系。当多肽的分子量在3500Da以下时将表现出一定的生物活性。为使金枪鱼鱼骨蛋白资源得到充分合理利用，从金枪鱼鱼骨中制备低分子量的骨胶原肽混合物，骨胶原肽混合物的分子量较集中的分布在3500Da以内，将赋予骨胶原肽生物活性，而且还避免了为获得一种短肽而舍弃其他蛋白资源的浪费问题。

发明内容

为获得具有生物活性的金枪鱼骨胶原肽，本发明的目的在于提供一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，以期能够实现金枪鱼骨胶原肽的分子量集中分布在3500Da以内的较低范围，赋予骨胶原肽生物活性，充分提升金枪鱼鱼骨中蛋白质的利用率。

本发明提供如下的技术方案：

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)去除金枪鱼鱼骨表面油脂，清洗金枪鱼鱼骨至中性、干燥、粉碎得到金枪鱼鱼骨粉；

(2)将金枪鱼鱼骨粉与水混合制成鱼骨粉分散液，将分散液经蛋白酶酶解，所用蛋白酶中含有内切酶和外切酶；

(3)对分散液灭酶活处理，分离分散液的上清液，并将上清液经截留分子量3500Da的膜过滤后，除水干燥得到金枪鱼骨胶原肽。

在酶解过程中，内切酶将蛋白质的多肽链从中间切断形成小分子多肽，而外切酶则从多肽的游离羧基末端或氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。这样利用内切酶和外切酶的配合同时水解金枪鱼鱼骨胶原蛋白，可以将金枪鱼鱼骨胶原蛋白水解到较低分子量的多肽水平，经检测，大部分的多肽分子量低于1000Da，集中分布在500Da以内。

作为本发明方法的优选，步骤(1)中金枪鱼鱼骨表面油脂去除方法如下：清洗金枪鱼鱼骨、剪段、加水、加胃蛋白酶，调节pH值2.0～4.0酶解去除鱼骨表面碎肉，然后灭菌锅蒸煮后去除上层油脂，分离鱼骨后沥干，经小苏打脱色。金枪鱼鱼骨表面的碎肉、油脂等有可能在酶解过程中被分解掉，从而在多肽中引入异味物质，因此合适的前处理步骤对于保证多肽的质量是很有必要的。

作为本发明方法的优选，步骤(1)中金枪鱼鱼骨经超微粉碎制成金枪鱼鱼骨粉。鱼骨粉的粒径以超微粉级别有助于提高酶解的效率。

作为本发明方法的优选，步骤(2)中金枪鱼鱼骨粉与水的质量比为4～12:100。合适的金枪鱼鱼骨粉底物浓度将影响酶解效果，尤其是影响酶解反应速率。

作为本发明方法的优选，步骤(2)中所用含有内切酶和外切酶的蛋白酶为动物蛋白水解酶、海产品蛋白水解酶、骨蛋白水解酶或风味蛋白酶。上述蛋白酶中含有丰富的内切酶和外切酶，而且由于直接从动物、海产品中获得，所含的内切酶和外切酶的种类以及比例均处在天然合适的位置，从而保证蛋白酶发挥理想的水解效果，明显优于直接将两种内切酶和外切酶复配后的使用效果，以及单一酶的使用，在不需要过滤分解的情况下即可实现酶解后的多肽的小分子量化。

作为本发明方法的优选，步骤(2)中所用含有内切酶和外切酶的蛋白酶的添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的0.5％～3％。在一定范围内，酶的添加量越多，水解作用越强。但是过量添加后将导致底物与酶的结合位点不断减少，限制了酶效率的发挥。

作为本发明方法的优选，步骤(2)所用含有内切酶和外切酶的蛋白酶酶解的时间为4～8h，酶解温度为40～60℃，酶解pH范围为6.5～7.5。

作为本发明方法的优选，步骤(2)中还包括在含有内切酶和外切酶的蛋白酶酶解前，先添加胰蛋白酶酶解处理，所用含有内切酶和外切酶的蛋白酶为动物蛋白水解酶。发明人在基于本申请的研究工作中发现，经过水解后的酶解液中游离精氨酸含量最多，质量占比在30％以上，这与现有研究如贾建萍等(金枪鱼骨营养成分分析[J]，食品工业科技，2013，第10期，334-336)中指出金枪鱼骨胶原蛋白中氨基酸以甘氨酸为主有明显的差异。发明人认为，这可能是由于基于本申请的制备方法，精氨酸相对更容易断键，进而使多肽小分子化，甘氨酸虽然是胶原蛋白的特征氨基酸，但是不易断键。发明人基于研究结果，进一步地引入胰蛋白酶先进行酶解，使得肽链在精氨酸处大量断开，然后再利用动物蛋白酶水解，可以将大量的水解肽的分子量转变到1000Da以下，尤其是500Da以下，提高多肽的利用效果。

作为本发明方法的优选，胰蛋白酶的添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的1％～2％；酶解的时间为2～3h，酶解温度为30～40℃，酶解pH范围为7.0～9.0。

作为本发明方法的优选，分离上清液的方法为离心分离或者微孔滤膜过滤。上清液分离的目的主要是去除鱼骨粉以及蛋白质，完全不影响水解得到的多肽，同时也不会对多肽的分子量分布产生影响。当然，为了集中获得更低分子量的多肽，也可以进一步纯化分离。

金枪鱼骨胶原肽在促进成骨细胞矿化上的应用。采用本发明方法获得的金枪鱼骨胶原肽可以明显促进成骨细胞矿化。

本发明的有益效果如下：

本发明的制备方法所得金枪鱼鱼骨胶原肽的分子量较低，集中分布在3000Da以内，与现有金枪鱼鱼骨蛋白利用相比，不需要经过复杂的纯化步骤即能够获得低分子范围的金枪鱼鱼骨胶原肽，生物活性高，能够用于促进成骨细胞的增殖和矿化，而且避免了金枪鱼鱼骨蛋白资源的浪费，金枪鱼鱼骨蛋白利用效率高。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

为保持一致性，下述实施例和对比例中所用金枪鱼鱼骨采于浙江融创食品工业有限公司，-20℃保存，为同一批次金枪鱼鱼骨。

实施例1

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将金枪鱼鱼骨经水浸泡15分钟解冻，表面清洗后剪成2-3cm小段，加入2wt％的胃蛋白酶后调节pH值为3.0，55℃酶解3h，然后用灭菌锅120℃蒸煮30min去除上层油脂，沥干，再添加2wt％的食用小苏打，40℃处理2h进行脱色，定期搅拌后反复冲洗至中性，55℃烘箱烘干过夜后逐级粉碎至超微粉粒径，得到成品骨粉，平均粒径为10μm；

(2)将金枪鱼鱼骨粉与水按质量比10:100混合制成鱼骨粉分散液，向分散液中加入动物蛋白水解酶(购自南宁东恒华道生物公司)，添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的1％，调节pH值为7.5，在45℃酶解4h；

(3)将分散液在100℃水浴下灭酶15min，经5000r/min离心15min后过滤上清液，再将上清液经截留分子量为3500Da的卷式膜分离，然后冷冻干燥得到金枪鱼骨胶原肽。

实施例2

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将金枪鱼鱼骨经水浸泡15分钟解冻，表面清洗后剪成2-3cm小段，加入2wt％的胃蛋白酶后调节pH值为3.0，55℃酶解3h，然后用灭菌锅120℃蒸煮30min去除上层油脂，沥干，再添加2wt％的食用小苏打，40℃处理2h进行脱色，定期搅拌后反复冲洗至中性，55℃烘箱烘干过夜后逐级粉碎至超微粉粒径，得到成品骨粉，平均粒径为10μm；

(2)将金枪鱼鱼骨粉与水按质量比8:100混合制成鱼骨粉分散液，向分散液中加入动物蛋白水解酶、海产品蛋白水解酶、骨蛋白水解酶或风味蛋白酶，添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的2％，调节pH值为7.0，在55℃酶解8h；

(3)将分散液在100℃水浴下灭酶15min，然后5000r/min离心15min，再将上清液经截留分子量为3500Da的卷式膜分离，然后冷冻干燥得到金枪鱼骨胶原肽。

实施例3

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将金枪鱼鱼骨经水浸泡15分钟解冻，表面清洗后剪成2-3cm小段，加入2wt％的胃蛋白酶后调节pH值为3.0，55℃酶解3h，然后用灭菌锅120℃蒸煮30min去除上层油脂，沥干，再添加2wt％的食用小苏打，40℃处理2h进行脱色，定期搅拌后反复冲洗至中性，55℃烘箱烘干过夜后逐级粉碎至超微粉粒径，得到成品骨粉，平均粒径为10μm；

(2)将金枪鱼鱼骨粉与水按质量比12:100混合制成鱼骨粉分散液，向分散液中加入动物蛋白水解酶(购自南宁东恒华道生物公司)，添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的3％，调节pH值为6.5，在50℃酶解6h；

(3)将分散液在100℃水浴下灭酶15min，然后5000r/min离心15min，再将上清液经截留分子量为3500Da的卷式膜分离，然后冷冻干燥得到金枪鱼骨胶原肽。

实施例4

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，与实施例1不同之处为，所用蛋白酶为海产品蛋白水解酶，购自南宁东恒华道生物公司，酶解pH值为自然pH。

实施例5

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，与实施例1不同之处为，所用蛋白酶为骨蛋白水解酶，购自华懋双汇实业(集团)有限公司生物化学制药厂，酶解pH值为自然pH。

实施例6

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，与实施例1不同之处为，所用蛋白酶为风味蛋白酶，购自浙江一诺生物科技有限公司。

对比例1

与实施例1不同之处为，所用蛋白酶为胰蛋白酶，酶解温度为35℃。

对比例2

与实施例1不同之处为，所用蛋白酶为木瓜蛋白酶。

对比例3

与实施例1不同之处为，所用蛋白酶为中性蛋白酶。

对比例4

与实施例1不同之处为，所用蛋白酶为木瓜蛋白酶和赖氨酸氨肽酶、精氨酸氨肽酶，复合比为1:1:1。

上述各实施例和对比例的水解度测定以及多肽分子量分布测试。

1)水解度测试：

取5mL分离的上清液到60mL水中，混匀后用0.1mol/L的NaOH溶液滴定到pH＝8.2，加入10mL37％的甲醛溶液，混匀后再用0.1mol/L的NaOH溶液滴定到pH＝9.2，记下此时滴定到pH＝9.2所消耗NaOH溶液的体积为V₁。另外取65mL水做空白试验，记下消耗NaOH溶液的体积为V₂。取3次平行测量的平均值，用下式公式计算游离氨基酸态氮含量：

c：NaOH标准溶液浓度，单位摩尔每升(mol/L)；0.014：氮的克当量；100：单位换算系数；

V：吸取试样体积，单位为毫升(mL)。

原料中总氮含量的测定采用GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法，取3次平行测量的平均值。用下式公式计算水解度：

2)多肽分子量分布测试色谱条件：采用WATERS高效液相色谱仪和UV检测器，色谱柱TSKgel 2000SWXL(300mm×7.8mm)，流动相为乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1(V/V)，检测波长220nm，流速0.5mL/min，柱温30℃。

标样配制：称取细胞色素C(MW12400)、杆菌酶(MW1450)、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)标准品用流动相溶解配制成0.2mg/mL左右的标准分子量溶液。

样品制备：称取不同分子量的骨胶原肽冻干样品100mg于10mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤后供进样。用仪器自带GPC软件处理数据即峰面积占比，得到骨胶原肽的相对分子质量分布范围。

测试结果如下表1所示(各实施例和对比例测定重复3次，取平均测试结果)。

表1实施例1-6和对比例1-4中各水解度和骨胶原肽的分子量分布

从上表中可以看出，基于本申请的发明方法的金枪鱼鱼骨胶原蛋白的水解度可以达到60％以上，而获得的骨胶原肽的分子量分布集中在2000Da以下，应具有更高的生物活性。其中采用动物蛋白水解酶制备的金枪鱼骨胶原肽的分子量多在1000Da以下，尤其是500～180Da范围内占比最高，而在小于180Da以下也存在明显的占比，表现出深度水解。

实施例7

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，与实施例1不同之处为，步骤(2)中加入动物蛋白水解酶处理前，先向分散液中添加胰蛋白酶酶解处理，胰蛋白酶的添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的1％；酶解时间为3h，酶解温度为30℃，酶解pH范围为7.0，酶解后100℃水浴灭酶活15min，然后再引入动物蛋白水解酶。

实施例8

一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，与实施例1不同之处为，步骤(2)中加入动物蛋白水解酶处理前，先向分散液中添加胰蛋白酶酶解处理，胰蛋白酶的添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的2％；酶解的时间为2h，酶解温度为40℃，酶解pH范围为9.0，酶解后100℃水浴灭酶活15min，然后再引入动物蛋白水解酶。

对比例5

与实施例7的不同之处为，将胰蛋白酶替换为木瓜蛋白酶。

对比例6

与实施例7的不同之处为，将胰蛋白酶替换为糜蛋白酶。

对比例7

与实施例7的不同之处为，将胰蛋白酶替换为弹性蛋白酶。

对比例8

与实施例7的不同之处为，胰蛋白酶酶解后不灭活，直接添加动物蛋白水解酶。

对比例9

与实施例1的不同之处为，在动物蛋白水解酶处理后添加胰蛋白酶。

对比例10

与实施例1的不同之处为，以等量的I型胶原酶替代动物蛋白水解酶添加后酶解，然后再添加1wt％的木瓜蛋白酶酶解。

实施例7～实施例8和对比例5～10的制备方法的水解度，以及制备的骨胶原肽的分子量分布测试，测试结果如下表2所示。

表2实施例7-8、对比例5-10中水解度和分子量分布(三组重复，取均值)

从上表中可以看出，先用胰蛋白酶处理后灭活，再添加动物蛋白水解酶处理将有助于提升水解度，并且使得分子量集中分布在在500～180Da范围内，而小于180Da范围内的分子量占比也明显增加。但是将胰蛋白酶处理后直接添加动物蛋白则缺少此效果，而且水解度有所降低，这可能是因为胰蛋白酶与动物蛋白水解酶中的部分酶存在竞争的情形，或者胰蛋白酶本身是一种动物蛋白酶，额外加入的胰蛋白酶相当于增加了其占比，破坏了动物蛋白水解酶的相对平衡。另外，尽管木瓜蛋白酶相较胰蛋白酶直接使用水解效果较好，但是与动物蛋白水解酶联用并未有明显的增强效果，这可能是因为木瓜蛋白酶是植物蛋白水解酶，与动物蛋白水解酶的协同性不如胰蛋白酶。

金枪鱼骨胶原肽在促进成骨细胞增殖和矿化方面的效果

采用MC3T3-E1 Subclone14细胞体外培养方式测试金枪鱼骨胶原肽在促进成骨细胞增殖、矿化上的作用，具体如下。

1)促进成骨细胞增殖：

取对数生长期MC3T3-E1 Subclone14细胞进行计数，将细胞以5×10³个/孔的密度接种到96孔板中，每孔100μL，边缘孔加入PBS，放入培养箱孵育。第二天上午，弃去培养液，对照组加入100μL完全培养液，其余组分别加入100μL、浓度为0.10mg/mL的各实施例和对比例制备的冷冻干燥的金枪鱼骨胶原肽，每组6个重复，培养24h。培养时间结束时，每孔各加入10μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h后弃去培养液。每孔加入150μL的DMSO溶液，轻轻震荡混匀，在酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光值；

细胞增殖率(％)＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％；其中对照组为金枪鱼骨胶原肽浓度为0。

2)促进成骨细胞矿化

将对数生长期细胞以2×10⁴个/孔的密度接种于24孔板，每孔1mL。24h后，更换为含浓度0.10mg/mL的各实施例和对比例制备的金枪鱼骨胶原肽的分化诱导培养液进行培养，每个浓度设4个复孔。细胞每隔3-4天更换一次培养基，诱导分化21d。培养结束后按以下步骤进行茜素红染色实验：

(1)吸走培养液后，用预冷的PBS轻柔洗2次

(2)4％多聚甲醛固定15min，弃去固定液，超纯水洗3次

(3)将水完全吸干净后，慢慢加入茜素红S染液，室温染色20-30min

(4)弃去染料，超纯水洗3次

(5)每孔加入适当超纯水，在低倍镜视野(×40)下随机选取8个视野，进行矿化结节计数。计数方法由专人盲法进行。

上述测试结果如下表3所示。

表3金枪鱼骨胶原肽对成骨细胞的影响

从上表中可以看出，与对照组相比，本发明的方法制备的金枪鱼骨胶原肽可以体外促进成骨细胞，如MC3T3-E1 Subclone14细胞的增殖以及矿化。经分析发现，金枪鱼骨胶原肽对成骨细胞的增殖效果不仅和水解深度有关，还与3000Da以下分子量占比有关。促进细胞增殖与促进细胞矿化有一定的相关性，但是对细胞增殖效果越好并不意味着促进细胞矿化效果也越好，这个可以从对比例2与对比例6的比较可知，影响矿化效果的因素应该是500Da以下的分子量占比。

总结，本申请提供了一种制备金枪鱼骨胶原肽的方法，可以使分子量在1000Da，尤其是500Da以下的肽占据较大的比重，赋予了金枪鱼骨胶原肽很好的生物活性，比如促进成骨细胞增殖以及矿化。

Claims (10)

1.一种金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）去除金枪鱼鱼骨表面油脂，清洗金枪鱼鱼骨至中性、干燥、粉碎得到金枪鱼鱼骨粉；

（2）将金枪鱼鱼骨粉与水混合制成鱼骨粉分散液，将分散液经蛋白酶酶解，所用蛋白酶中含有内切酶和外切酶；

（3）对分散液灭酶活处理，分离分散液的上清液，将上清液经截留分子量3500Da的膜过滤，然后除水干燥得到金枪鱼鱼骨肽。

2.根据权利要求1所述的金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中金枪鱼鱼骨表面油脂去除方法如下：清洗金枪鱼鱼骨、剪段、加水、加胃蛋白酶，调节pH值2.0～4.0酶解去除鱼骨表面碎肉，然后灭菌锅蒸煮后去除上层油脂，分离鱼骨后沥干，经小苏打脱色。

3.根据权利要求1或2所述的金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中金枪鱼鱼骨经超微粉碎制成金枪鱼鱼骨粉。

4.根据权利要求1所述的金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中金枪鱼鱼骨粉与水的质量比为4～12:100。

5.根据权利要求1所述的金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中含有内切酶和外切酶的蛋白酶为动物蛋白水解酶、海产品蛋白水解酶、骨蛋白水解酶或风味蛋白酶。

6.根据权利要求1或5所述的金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所用含有内切酶和外切酶的蛋白酶的添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的0.5%～3%。

7.根据权利要求1或5所述的金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所用含有内切酶和外切酶的蛋白酶酶解时间4～8h，酶解温度40～60℃，酶解pH范围6.5～7.5。

8.根据权利要求1或5所述的金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中还包括在含有内切酶和外切酶的蛋白酶酶解前，先添加胰蛋白酶酶解处理，其中所用含有内切酶和外切酶的蛋白酶为动物蛋白水解酶。

9.根据权利要求8所述的金枪鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于，胰蛋白酶的添加量为金枪鱼鱼骨粉质量的1%～2%；酶解的时间为2～3h，酶解温度为30～40℃，酶解pH范围为7.0～8.0。

10.金枪鱼骨胶原肽在促进成骨细胞矿化上的应用。