CN104531645A

CN104531645A - 一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法

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Publication number: CN104531645A
Application number: CN201410825894.8A
Authority: CN
Inventors: 史学伟; 徐亚男; 王军; 程卫东
Original assignee: SHIHEZI DEVELOPMENT ZONE SHIDA HEXU TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: SHIHEZI DEVELOPMENT ZONE SHIDA HEXU TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-25
Also published as: CN104531645B

Abstract

本发明公开了一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法，涉及生物工程领域，开发一种新的制备蛋白酶制剂的菌种。本发明主要技术方案为：假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，包括如下步骤：将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌发酵液；对星形假丝酵母菌发酵液进行盐析处理，得到假丝酵母蛋白酶；将假丝酵母蛋白酶溶解于缓冲溶液后，进行透析、提纯，得到假丝酵母蛋白酶液；将假丝酵母蛋白酶液超滤浓缩后，得到浓缩蛋白酶液；向浓缩蛋白酶液加入无机盐、载体辅料，充分混合后得到混合物；对混合物进行冷冻、干燥处理，得到假丝酵母蛋白酶制剂。本发明的制备方法成本低、环保、适用于工业化大批量生产酸性蛋白酶制剂；制备的蛋白酶制剂酶活力较高、稳定性好。

Description

一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种利用微生物液态发酵法生产假丝酵母蛋白酶制剂的方法。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，蛋白酶广泛应用于洗涤剂、饲料、食品工业、酿酒酿造、制革工业以及医药领域中；除此之外，蛋白酶还是用途最广泛的酶制剂之一，应用于洗涤剂、制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、酱油、纺织、医药品、化妆品等的生产和生物材料的提取上。蛋白酶的广泛应用，不仅简化了行业的生产工艺、节约成本、提高产品得率，而且对改善环境，减少二氧化碳排放也做出了积极贡献。近年来随着人们环保意识的增强，创建资源节约型、环境友好型社会的观念日益深入人心，为进一步推广蛋白酶的生产与应用创造了有利条件。

目前市场上蛋白酶品种虽然多，但是所用生产菌株的种类较少，仅限于传统上食品加工用的微生物和确认无害的菌株；另外，采用现有的生产蛋白酶的菌株的蛋白酶的产量不大，且生产的蛋白酶的酶活不高。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法，主要目的是开发新的制备蛋白酶制剂的菌种，制备出酶活较高的假丝酵母蛋白酶制剂，同时提高蛋白酶制剂的产量。

为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌发酵液；

对所述星形假丝酵母菌发酵液进行盐析处理，得到假丝酵母蛋白酶；

将所述假丝酵母蛋白酶溶解于缓冲溶液后，进行透析、提纯处理，得到假丝酵母蛋白酶液；

将所述假丝酵母蛋白酶液超滤浓缩后，得到浓缩蛋白酶液；

向所述浓缩蛋白酶液加入无机盐、载体辅料，充分混合后得到混合物；

对所述混合物进行冷冻、干燥处理，得到假丝酵母蛋白酶制剂。

前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌发酵液的步骤，包括：

对星形假丝酵母菌进行菌株诱变处理，得到诱变菌株；

从所述诱变菌株中筛选出产酶菌株；其中，所述产酶菌株为能够产生蛋白酶的星形假丝酵母菌菌株；

将所述产酶菌株活化后，接种于种子培养基，在28-37℃下培养18-24小时后，得到种子液；

将所述种子液以3-5％的接种量接种于第一发酵容器中，在28-37℃的温度及150-200转/分钟的搅拌速度下，使所述第一发酵容器中的种子液发酵18-24小时，得到第一发酵液；

将所述第一发酵液以3-5％的接种量接种于第二发酵容器中，在35-42℃的温度、150-200转/分钟的搅拌速度及0.1-0.3m³/h的通风量的条件下，使所述第二发酵容器中的第一发酵液发酵48-72小时，得到星形假丝酵母菌发酵液。

前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，采用硫酸铵对所述星形假丝酵母菌发酵液进行盐析处理。

前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，所述缓冲溶液为pH值为5-7的乙酸-乙酸钠溶液。

前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，对所述假丝酵母蛋白酶液进行超滤浓缩，得到浓缩蛋白酶液的步骤，具体为：

用截留分子量为8000-15000Da的超滤膜对所述假丝酵母蛋白酶液进行超滤、浓缩，得到浓缩蛋白酶液；

其中，所述假丝酵母蛋白酶液与所述浓缩蛋白酶液的体积比为6-10:1。

前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，向所述浓缩蛋白酶液加入无机盐、载体辅料，充分混合后得到混合物的步骤具体为：

向所述浓缩蛋白酶液加入无机盐，搅拌均匀使无机盐充分溶解，得到第一混合物；

向所述第一混合物中加入载体辅料，充分揉和，得到混合物。

前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，所述第一混合物中所述无机盐的浓度为0.5-1％；

所述载体辅料的添加量与第一混合物的重量比为0.8-1.2:1。

前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，所述载体辅料为玉米粉、米淀粉和豆饼粉中的任一种或几种的混合物。

前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，对所述混合物进行冷冻、干燥处理，得到假丝酵母蛋白酶制剂的步骤，包括：

将所述混合物在真空度为30-50Pa、温度为-18—-22℃的条件下冷冻8-10小时，再将所述混合物在真空度为30-50Pa、温度为-30—-36℃的条件下冷冻15-18小时后，将冷冻后的混合物粉碎、挤压、切割，得到假丝酵母蛋白酶颗粒；

将所述假丝酵母蛋白酶颗粒置于40-60℃下进行干燥处理后，在其表面涂覆氢化牛油后继续干燥处理，得到假丝酵母蛋白酶制剂。

另一方面，本发明实施例还提供一种假丝酵母蛋白酶制剂，所述假丝酵母蛋白酶制剂由上述任一项所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法制备而成。

本发明实施例提出的一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法，至少具有如下优点：

本发明实施例采用新的菌种假丝酵母制备出酶制剂，即假丝酵母蛋白酶制剂，所用的假丝酵母菌种为新开发菌种，符合FAO/WHO食品添加剂专家委员会JECFA的评估标准。所用的假丝酵母菌种经诱变选育产酶能力较高，制得假丝酵母蛋白酶制剂具有较高的酶活力，酸性蛋白酶活力≥2125U/g干基，活力回收率到达51.6％。

进一步地，本发明实施例制备的假丝酵母蛋白酶制剂以玉米粉、米淀粉和豆饼粉中的一种或几种为主要辅料，生产成本低；假丝酵母蛋白酶制剂在制备过程采用离心、超滤、盐析、透析、冷冻干燥等步骤，产品杂质含量低，符合食品添加剂标准的要求。

进一步地，本发明实施例在制备假丝酵母蛋白酶制剂的过程中无三废(废水、废渣、废气)排出，减少了能耗、运行成本较低，清洁生产，具有较大的环境优势。且本发明提供的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法适用于工业化大批量生产酸性蛋白酶制剂。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如下。

在葡萄酒酿造初期，若添加星形假丝酵母菌，不仅利于葡萄酒的澄清，还能增加酒体的稳定性；本发明的发明人发现这是因为星形假丝酵母菌能产生蛋白酶，蛋白酶葡萄酒酿造初期的蛋白质及含氮化合物水解掉，使其生成可溶性肽及氨基酸。基于此，本发明的发明人提出一种假丝酵母蛋白酶制剂及利用微生物液态发酵法生产假丝酵母蛋白酶制剂的方法，从而开发了新产酶菌株，且所制备的酶制剂具有较高且稳定的酸性酶活力，适用于食品工业。

具体地，本发明实施例提出的一种假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，包括如下步骤：

1)将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌发酵液。该步骤具体包括：

11)对星形假丝酵母进行菌株诱变处理，得到诱变菌株。

具体地，从培养假丝酵母菌体的固体平板上挑取星形假丝酵母(Candidastellata)的单菌落，将挑选出的星形假丝酵母的单菌落接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基上(具体地，将星形假丝酵母的单菌落接种于装有20-30毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的250毫升的三角瓶中)，在25-37℃的温度下于100-300转/分钟的摇床上培养24-48小时，得到发酵液。将发酵液放置在离心机中，在2000-8000转/分钟的转速下，离心3-10分钟，弃去上清液，用无菌水悬浮下层菌落(细胞)，得到菌液，且菌液中的细胞浓度为1×10⁸-8×10⁸个/毫升。吸取1-3毫升菌液放置于4℃冰箱中作为对照；从剩余的菌液中吸取4-6毫升(优选5毫升)加入无菌平板中，1×10⁵-5×10⁵J/mm²的计量处理无菌平板(在此，J/mm²是能量密度单位，表示单位面积吸收的能量；表示无菌平板中的菌液，每1mm²吸收紫外线能量为1×10⁵-5×10⁵J)。将磁力搅拌器置于紫外灯下照射30分钟后，再将无菌平板置于磁力搅拌器上，无菌平板等距放置，且距紫外灯30-40厘米处，照射10-30分钟后，得到第一诱变菌株。

将第一诱变菌株放入微波源为2450MHz、850W的微波炉中，每照射10秒，冷却10秒后再照射10秒，重复多次，冷却后，在28-37℃下培养24-72小时，得到诱变菌株。

该步骤中，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的配方为(g/L)：蛋白胨10.0、葡萄糖20.0、酵母浸出粉5.0、蒸馏水1000mL、pH值为7.0。

12)从所述诱变菌株中筛选出产酶菌株；其中，所述产酶菌株为能够产生蛋白酶的星形假丝酵母菌菌株。

具体地，该步骤包括产酶菌株初筛、产酶菌株复筛及产酶菌株获得三个步骤。其中，

产酶菌株初筛：取诱变菌株的菌悬液0.1毫升进行10倍系列稀释至10^-1-10^-6，分别取各个稀释梯度1毫升涂布于酪蛋白分离筛选培养基上，培养24-72小时后，将用柠檬酸调pH值至6.0的NaOH溶液喷于无菌平板上，选择其中显示透明圈直径较大的菌株，作为初筛菌株。

产酶菌株复筛：将初筛菌株接种于发酵培养基中，在28-37℃的温度下于100-300转/分钟转速的摇床上培养24-48小时；

产酶菌株的获得：将经产酶菌株复筛步骤处理后的菌液分别取1毫升置于离心管中，在离心机中以2000-8000转/分钟的转速离心8-15分钟后，取上清液与酪蛋白溶液混合(其中，上清液与酪蛋白溶液的体积比为0.8-1.2:1；酪蛋白溶液为2％酪蛋白溶液，配制方法：准确称取干酪素2克，加0.1摩尔每升氢氧化钠10毫升，在水浴中加热溶解，然后用pH为7.2的磷酸缓冲溶液定容至100毫升即成。)将上清液与酪蛋白的混合液在30-50℃水浴锅中反应8-15分钟后，加入适量三氯乙酸终止反应后，得到反应产物；向反应产物中加入福林酚试剂、碳酸钠试剂(福林酚试剂与反应产物的体积比为0.8-1.2:1，Na₂CO₃试剂的体积是反应产物的3-6倍)，摇匀后置于紫外分光光度计下，在波长为680nm下，测定吸光值；将吸光值大的菌株筛选出来，即为本发明的实施例所用的高产蛋白酶的星形假丝酵母菌株；

该步骤中的酪蛋白分离筛选培养基的配方为(g/L)：干酪素0.5、牛肉膏0.3、蛋白胨1.0、琼脂粉1.5、NaCl 1.0、蒸馏水100mL。

13)将所述产酶菌株活化后，接种于种子培养基，在28-37℃下，并在150-200转/分钟的摇床上培养18-24小时后，得到种子液。

14)将所述种子液以3-5％的接种量接种于发酵瓶中，将所述发酵瓶放置在150-200转/分钟的摇床上，使所述发酵瓶中的种子液在28-37℃的温度下发酵18-24小时，得到第一发酵液；

15)将所述第一发酵液以3-5％的接种量接种于发酵罐中，在35-42℃、150-200转/分钟的搅拌速度及0.1-0.3m³/h(优选为0.2m³/h)的通风量的条件下，使所述发酵罐中的第一发酵液发酵48-72小时，得到星形假丝酵母菌发酵液。

2)将所述星形假丝酵母菌发酵液进行盐析处理，得到假丝酵母蛋白酶。

该步骤具体为：用截留分子量为8000-15000Da(优选为10000Da)的超薄膜对步骤(1)得到的星形假丝酵母菌发酵液进行超滤浓缩3-5倍，得到浓缩发酵液(星形假丝酵母菌发酵液与浓缩发酵液的体积比为3-5：1)；将浓缩发酵液在4℃及8000转/分钟的转速下离心8-12分钟后取上清液，向上清液加入硫酸铵至25％饱和度后，将上清液与硫酸铵混合液在4℃下放置24小时后，在4℃、8000转/分钟的转速下离心10分钟后取上清液，向上清液中继续加入硫酸铵至70％饱和度，将上清液与硫酸铵混合液在4℃下放置24小时后，在4℃、8000转/分钟的转速下离心8-12分钟后，得到的下层沉淀为假丝酵母蛋白酶。

3)将所述假丝酵母蛋白酶沉淀溶解于缓冲溶液后，进行透析、提纯，得到假丝酵母蛋白酶液。

具体地，将假丝酵母蛋白酶溶解在pH值为5.0-7.0(优选地，pH值为6.0)的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，充分透析后，得到提纯后的假丝酵母蛋白酶液。

较佳地，该步骤中乙酸-乙酸钠缓冲溶液的量保证能够使假丝酵母蛋白酶溶解即可。

4)将所述假丝酵母蛋白酶液超滤浓缩后，得到浓缩蛋白酶液。

该步骤具体为：用截留分子量为8000-15000Da(优选为10000Da)的超滤膜对假丝酵母蛋白酶液进行超滤浓缩至6-10倍，得到浓缩蛋白酶液。

5)向所述浓缩蛋白酶液加入无机盐、载体辅料，充分混合后得到混合物。

该步骤具体为：

51)向浓缩蛋白酶液中加入无机盐，充分搅拌，使浓缩蛋白酶液充分溶解在无机盐溶液后，得到第一混合物；

该步骤中，无机盐溶液的加入量能保证使浓缩蛋白酶液充分溶解即可。无机盐选用含钙、镁、铁的无机盐。

其中，第一混合物中无机盐的浓度为0.5-1％。

52)向所述第一混合物中加入载体辅料，充分混合后，得到混合物。

该步骤中，载体辅料的加入量为第一混合物重量的0.9-1.1倍，优选地，载体辅料的加入量与第一混合物的重量一致。

该步骤中，载体辅料包括玉米粉、米淀粉和豆饼粉中的一种或几种的混合物。

6)对所述混合物进行冷冻、干燥处理，得到假丝酵母蛋白酶制剂。

该步骤具体为：将混合物在真空度为30-50Pa、温度为-20℃的条件下冷冻8-10小时后，再置于真空度为30-50Pa、-35℃的条件下冷冻15-18小时后；将冷冻后的假丝酵母蛋白酶制剂粉碎、挤压、切割，得到假丝酵母蛋白酶湿颗粒；将假丝酵母蛋白酶湿颗粒在40-60℃干燥后，在其表面涂上氢化牛油后继续干燥，得到假丝酵母蛋白酶制剂。

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

本实施例制备一种假丝酵母蛋白制剂，具体步骤如下：

1)菌株诱变

11)采用紫外光诱变假丝酵母：从假丝酵母菌体的固体平板上挑取星形假丝酵母(Candida stellata)的单菌落，将其接种于装有20毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的250毫升的三角瓶中，在30℃的温度下于200转/分钟的摇床上培养36小时，得到发酵液；将发酵液放置在离心机中以5000转/分钟的转速下离心6分钟后弃去上清液，将下层细胞用无菌水重新悬浮，得到菌液；使菌液中细胞浓度达2×10⁸个/毫升，吸取3毫升菌液放置于4℃冰箱中作为对照；剩余的菌液，分别吸取5毫升加入无菌平板中，以2×10⁵J/mm²的计量处理无菌平板，将无菌平板置于紫外灯已照射30分钟的磁力搅拌器上，等距离放置，且距紫外灯30厘米，照射10分钟，得到第一诱变菌株。

其中，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的配方为(g/L)：蛋白胨10.0、葡萄糖20.0、酵母浸出粉5.0、蒸馏水1000mL、pH7.0。

12)采用微波复合诱变：将第一诱变菌株放入微波源为2450MHz、850W的微波炉中，每照射10秒，冷却10秒后再照射10秒，重复两到三次，冷却后，在30℃下培养48小时，得到诱变菌株。

2)产酶菌株筛选

21)产酶菌株初筛：取诱变菌株的菌悬液0.1毫升进行10倍系列稀释至10^-1-10^-6，分别取各个稀释梯度1毫升涂布于酪蛋白分离筛选培养基上，培养36小时后，取用柠檬酸调pH值至6.0的NaOH溶液，喷于平板上，选择其中显示透明圈直径较大的菌株，作为初筛菌株。

其中，酪蛋白分离筛选培养基的配方为(g/L)：干酪素0.5、牛肉膏0.3、蛋白胨1.0、琼脂粉1.5、NaCl 1.0、蒸馏水100mL。

22)产酶菌株复筛：将初筛菌株接种于发酵培养基中，在30℃的温度下于200转/分钟的摇床上培养36小时。

发酵培养基的配方为(g/L)：干酪素0.5、蛋白胨1.0、NaCl 1.0、牛肉膏0.3、蒸馏水100mL。

23)产酶菌株的获得：将产酶菌株复筛处理后的菌液分别取1毫升置于离心管中，在离心机中以5000转/分钟的转速离心10分钟后，取上清液，并使上清液与酪蛋白溶液按照体积比为1:1的比例混合，将上清液与酪蛋白的混合物在30℃水浴锅中反应12分钟，加入适量三氯乙酸终止反应，得到反应产物；取1毫升反应产物，向反应产物中加入福林酚试剂1毫升，再加入Na₂CO₃试剂5毫升后，摇匀，在紫外分光光度计680nm下测定吸光值；将吸光值大的菌株筛选出来，即为本实施例所用的高产蛋白酶的星形假丝酵母菌株。

3)种子液的制备：将星形假丝酵母菌株经活化后，接种于种子培养基，在37℃的温度下于200转/分钟的摇床上培养18小时，得到种子液。

种子培养基的配方为(g/L)：蛋白胨5.0、酵母膏15.0、氯化钠4.0、葡萄糖10.0、琼脂20.0、蒸馏水1000mL、pH 7.0。

4)星形假丝酵母菌发酵液的培养：将步骤3)得到的种子液以3％的接种量接种于发酵三角瓶中，在37℃的温度下于200转/分钟的摇床上发酵18小时；然后以3％的接种量接种于发酵罐中，在37℃的温度下、200转/分钟的搅拌速度、0.2m³/h的通风量的条件下，好氧发酵48小时，即得到星形假丝酵母菌菌液。

5)假丝酵母蛋白酶制剂的制备：

51)发酵液的后处理：用截留分子量为10000的超滤膜对步骤4)制得的星形假丝酵母菌发酵液进行超滤浓缩3倍，得到浓缩发酵液；将浓缩发酵液进行硫酸铵盐析分级沉淀实验，确定硫酸铵分级沉淀的浓度为25％-70％；将浓缩发酵液在4℃、8000转/分钟的转速下离心10分钟后得到第一上清液；向第一上清液中加入硫酸铵至25％的饱和度后，将第一上清液与硫酸铵的混合物在4℃放置24小时后，再将第一上清液与硫酸铵的混合物在4℃、8000转/分钟的转速下离心10分钟后得到第二上清液，并向第二上清液中继续加入硫酸铵至70％饱和度，将第二上清液与硫酸铵的混合物在4℃放置24小时后，在4℃、8000转/分钟的转速下离心30分钟后得到沉淀，收集沉淀，将沉淀溶于pH值为6.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，充分透析，即得到提纯后的假丝酵母蛋白酶液。

52)真空冷冻干燥：用截留分子量为10000的超滤膜对假丝酵母蛋白酶液进行超滤浓缩6倍，得到浓缩蛋白酶液；向浓缩蛋白酶液中加入氯化钙(其中。氯化钙的加入量保证第一混合物中氯化钙的浓度为0.5％)；充分搅拌、溶解后得到第一混合物；向第一混合物中加入玉米粉载体辅料(玉米粉的量与第一混合物的量一致)，充分揉和，得到第二混合物。将第二混合物置于真空度30Pa、-20℃冷冻10小时后，再将其在-35℃冷冻15小时，经粉碎、挤压、切割后即得假丝酵母蛋白酶湿颗粒；将假丝酵母蛋白酶湿颗粒在40℃干燥后，在其表面涂氢化牛油后继续干燥，即得包被型假丝酵母蛋白酶制剂。

6)保存：常温下避光、干燥保存。

实施例2

本实施例制备一种假丝酵母蛋白制剂，具体步骤如下：

1)菌株诱变

11)采用紫外诱变假丝酵母：从假丝酵母菌体的固体平板上挑取星形假丝酵母(Candida stellata)的单菌落，将其接种于装有25毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的250毫升的三角瓶中，在35℃的温度下于100转/分钟的摇床上培养40小时，得到发酵液；将发酵液放置在离心机中以4000转/分钟的转速下离心8分钟后弃去上清液，将下层细胞用无菌水重新悬浮，得到菌液；使菌液细胞浓度达2×10⁸个/毫升，吸取3毫升放置于4℃冰箱中作为对照；剩余的菌液，分别吸取5毫升加入无菌平板中，以2×10⁵J/mm²的计量处理无菌平板，将无菌平板置于紫外灯已照射30分钟的磁力搅拌器上，等距离放置，且距紫外灯灯35厘米处，照射20分钟，得到第一诱变菌株。

其中，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的配方为(g/L)：蛋白胨10.0、葡萄糖20.0、酵母浸出粉5.0、蒸馏水1000mL、pH 7.0；

12)采用微波复合诱变：将第一诱变菌种放入微波源为2450MHz、850W的微波炉中，每照射10秒，冷却10秒后再照射10秒，重复两到三次冷却后，在37℃培养36小时，得到诱变菌株。

2)产酶菌株筛选

21)产酶菌株初筛：取诱变菌株的菌悬液0.1毫升进行10倍系列稀释至10^-1-10^-6，分别取各个稀释梯度1毫升涂布于酪蛋白分离筛选培养基上，培养48小时后，取用柠檬酸调pH值至6.0的NaOH溶液，喷于平板上，选择其中显示透明圈直径较大的菌株，作为初筛菌株；

酪蛋白分离筛选培养基的配方为(g/L)：干酪素0.5、牛肉膏0.3、蛋白胨1.0、琼脂粉1.5、NaCl 1.0、蒸馏水100mL；

22)产酶菌株复筛：将初筛菌株接种于发酵培养基中，在35℃的温度下于100转/分钟的摇床上培养24小时。

23)产酶菌株的获得：将产酶菌株复筛处理后的菌液分别取1毫升于离心管中，在离心机中以4000转/分钟的转速下离心12分钟后，取上清液，并使上清液与酪蛋白溶液按照体积比为1:1的比例混合，将上清液与酪蛋白在40℃水浴锅中反应10分钟，加入适量三氯乙酸终止反应，得到反应产物；取1毫升反应产物加入福林酚试剂1毫升，再加入Na₂CO₃试剂5毫升后，摇匀，在紫外分光光度计680nm下测定吸光值；将吸光值大的菌株筛选出来，即为本实施例所用的高产蛋白酶的星形假丝酵母菌株。

3)种子液的制备：将星形假丝酵母菌株经活化后，接种于种子培养基，在28℃的温度下于180转/分钟的摇床上培养20小时，得到为种子液。

种子培养基的配方为(g/L)：蛋白胨5.0、酵母膏15.0、氯化钠4.0、葡萄糖10.0、琼脂20.0、蒸馏水1000mL、pH 7.0；

4)星形假丝酵母菌发酵液的培养：将步骤3)得到的种子液以4％的接种量接种于发酵三角瓶中，在30℃的温度下于200转/分钟的摇床上发酵18小时；然后以4％的接种量接种于发酵罐中，在37℃的温度下、200转/分钟的搅拌速度、0.2m3/h的通风量的条件下，好氧发酵60小时，即得到星形假丝酵母菌菌液。

5)假丝酵母蛋白酶制剂成品的制备：

51)发酵液的后处理：用截留分子量为10000的超滤膜对步骤(4)制得的星形假丝酵母菌菌液进行超滤浓缩4倍，得到浓缩发酵液；将浓缩发酵液进行硫酸铵盐析分级沉淀实验，确定硫酸铵分级沉淀的浓度为25％-70％；将浓缩发酵液在4℃、8000转/分钟的转速下离心10分钟后得到第一上清液，向第一上清液中加入硫酸铵至25％饱和度后，将第一上清液与硫酸铵的混合物在4℃放置24小时后，再将第一上清液与硫酸铵的混合物在4℃、8000转/分钟的转速下离心10分钟后取上清液得到第二上清液，并向第二上清液中继续加入硫酸铵至70％饱和度，将第二上清液与硫酸铵的混合物在4℃放置24小时后，在4℃、8000转/分钟的转速下离心30分钟后得到沉淀，收集沉淀，使其混合，将沉淀溶于pH值为6.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，充分透析，即得到提纯后的假丝酵母蛋白酶液。

52)真空冷冻干燥：用截留分子量为10000的超滤膜对假丝酵母蛋白酶液进行超滤浓缩8倍，得到浓缩蛋白酶液；向浓缩蛋白酶液加入硫酸铁(其中，硫酸铁的加入量保证第一混合物中硫酸铁的浓度为1.0％)，充分搅拌、溶解后得到第一混合物；向第一混合物中加入等量豆饼粉载体辅料(豆饼粉的量与第一混合物的量一致)，充分揉和，得到第二混合物。将第二混合物置于真空度50Pa、-20℃冷冻8小时后，再将其在-35℃冷冻15小时，经粉碎、挤压、切割后即得假丝酵母蛋白酶湿颗粒；将假丝酵母蛋白酶湿颗粒在40℃干燥后，在其表面涂氢化牛油后继续干燥，即得包被型假丝酵母蛋白酶制剂成品。

6)保存：常温下避光、干燥保存。

实施例3

本实施例制备一种假丝酵母蛋白制剂，具体步骤如下：

1)菌株诱变

11)采用紫外诱变假丝酵母：从假丝酵母菌体的固体平板上挑取星形假丝酵母(Candida stellata)的单菌落，将其接种于装有30毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的250毫升的三角瓶中，在35℃的温度下于300转/分钟的摇床上培养30小时，得到发酵液；将发酵液放置在离心机中以6000转/分钟的转速下离心5分钟后弃去上清液，将下层细胞用无菌水重新悬浮，得到菌液；使菌液中细胞浓度达2×10⁸个/毫升，吸取3毫升菌液放置于4℃冰箱中作为对照；剩余的菌液，分别吸取5毫升加入无菌平板中，以2×10⁵J/mm²的计量处理无菌平板，将无菌平板置于紫外灯已照射30分钟的磁力搅拌器上，等距离放置，且距紫外灯40厘米处，照射10分钟，得到第一诱变菌株。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的配方为(g/L)：蛋白胨10.0、葡萄糖20.0、酵母浸出粉5.0、蒸馏水1000mL、pH 7.0。

12)采用微波复合诱变：将第一诱变菌株放入微波源为2450MHz、850W的微波炉中，每照射10秒，冷却10秒后再照射10秒，冷却后，在37℃培养24小时，得到诱变菌株。

2)产酶菌株筛选

21)产酶菌株初筛：取诱变菌株的菌悬液0.1毫升进行10倍系列稀释至10^-1-10^-6，分别取各个稀释梯度1毫升涂布于酪蛋白分离筛选培养基上，培养60小时后，取用柠檬酸调pH值至6.0的NaOH溶液，喷于平板上，选择其中显示透明圈直径较大的菌株，作为初筛菌株。

22)产酶菌株复筛：将初筛菌株接种于发酵培养基中，在28℃的温度下于300转/分钟的摇床上培养24小时。

23)产酶菌株的获得：将产酶菌株复筛处理后的菌液分别取1毫升于离心管中，在离心机中以6000转/分钟的转速离心8分钟后，取上清液，并使上清液与酪蛋白溶液按照体积比为1:1的比例混合，将上清液与酪蛋白的混合物在40℃水浴锅中反应10分钟，加入适量三氯乙酸终止反应，得到反应产物；取1毫升反应产物，向反应产物中加入福林酚试剂1毫升，再加入Na₂CO₃试剂5毫升后，摇匀，在紫外分光光度计680nm下测定吸光值；将吸光值大的菌株筛选出来，即为本实施例所用的高产蛋白酶的星形假丝酵母菌株。

3)种子液的制备：将星形假丝酵母菌株经活化后，接种于种子培养基，在28℃的温度下于200转/分钟的摇床上培养18小时，得到为种子液。

4)星形假丝酵母菌发酵液的培养：将步骤3)得到的种子液以5％的接种量接种于发酵三角瓶中，在30℃的温度下于200转/分钟的摇床上发酵18小时；然后以5％的接种量接种于发酵罐中，在37℃的温度下、200转/分钟的搅拌速度、0.2m³/h的通风量的条件下，好氧发酵60小时，即得到星形假丝酵母菌菌液，备用；

5)假丝酵母蛋白酶制剂的制备：

51)发酵液的后处理：用截留分子量为10000的超滤膜对步骤4)制得的星形假丝酵母菌发酵液进行超滤浓缩5倍，得到浓缩发酵液；将浓缩发酵液进行硫酸铵盐析分级沉淀实验，确定硫酸铵分级沉淀的浓度为25％-70％；将将浓缩发酵液在4℃、8000转/分钟的转速下离心10分钟后得到第一上清液，向第一上清液中加入硫酸铵至25％的饱和度后，将第一上清液与硫酸铵的混合物在4℃放置24小时后，再将第一上清液与硫酸铵的混合物在4℃、8000转/分钟的转速下离心10分钟后取上清液得到第二上清液，并向第二上清液中继续加入硫酸铵至70％饱和度，将第二上清液与硫酸铵的混合物在4℃放置24小时后，在4℃、8000转/分钟的转速下离心30分钟后得到沉淀，收集沉淀，使其混合，将沉淀溶于pH值为6.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，充分透析，即得到提纯后的假丝酵母蛋白酶液。

52)真空冷冻干燥：用截留分子量为10000的超滤膜对假丝酵母蛋白酶液进行超滤浓缩10倍，得到浓缩蛋白酶液；向浓缩蛋白酶液中加入硫酸镁(其中，硫酸镁的加入量保证第一混合物中硫酸镁的浓度为0.5％)；充分搅拌、溶解后得到第一混合物；向第一混合物中加入等量米淀粉载体辅料(米淀粉的量与第一混合物的量一致)，充分揉和得到第二混合物。将第二混合物置于真空度40Pa、-20℃冷冻9小时后，再将其在-35℃冷冻15小时，经粉碎、挤压、切割后即得假丝酵母蛋白酶湿颗粒；将假丝酵母蛋白酶湿颗粒在40℃干燥后，在其表面涂氢化牛油后继续干燥，即得包被型假丝酵母蛋白酶制剂。

6)保存：常温下避光、干燥保存。

实施例4

测定实施例1-实施例3制备的假丝酵母蛋白酶制剂的酶活力、酶活力回收率以及10个月、12个月内的酶活保存率，测定结果如表1所示。

表1

由表1可以看出，实施例1-实施例3制备的假丝酵母蛋白酶制剂具有较高的酶活力，酶活力回收率较好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌发酵液；

将所述假丝酵母蛋白酶液超滤浓缩后，得到浓缩蛋白酶液；

2.根据权利要求1所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌发酵液的步骤，包括：

对星形假丝酵母菌进行菌株诱变处理，得到诱变菌株；

3.根据权利要求1所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，采用硫酸铵对所述星形假丝酵母菌发酵液进行盐析处理。

4.根据权利要求1所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为pH值为5-7的乙酸-乙酸钠溶液。

5.根据权利要求1所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，对所述假丝酵母蛋白酶液进行超滤浓缩，得到浓缩蛋白酶液的步骤，具体为：

6.根据权利要求1所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，向所述浓缩蛋白酶液加入无机盐、载体辅料，充分混合后得到混合物的步骤，具体为：

7.根据权利要求6所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，所述第一混合物中所述无机盐的浓度为0.5-1％；

所述载体辅料的添加量与第一混合物的重量比为0.8-1.2:1。

8.根据权利要求1所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，所述载体辅料为玉米粉、米淀粉和豆饼粉中的任一种或几种的混合物。

9.根据权利要求1所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，对所述混合物进行冷冻、干燥处理，得到假丝酵母蛋白酶制剂的步骤，包括：

10.一种假丝酵母蛋白酶制剂，其特征在于，所述假丝酵母蛋白酶制剂由权利要求1-9任一项所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法制备而成。