CN111574612B - 一种促肝细胞生长素的制备方法 - Google Patents

一种促肝细胞生长素的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及促肝细胞生长素技术领域，尤其是涉及一种促肝细胞生长素的制备方法，包括以下步骤：S1.乳猪肝预处理；S2.酶解处理：将步骤S1得到的乳猪肝匀浆加蒸馏水配置成底物，调节pH值，水浴加热，然后加入沉淀剂和中性蛋白酶，得酶解液；S3.灭活、离心；S4.将步骤S3得到的离心液先经过截留分子量为100kDa的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再用截留分子量为6～10kDa的超滤膜进行超滤，滤液减压浓缩，得促肝细胞生长素。本发明提供一种促肝细胞生长素的制备方法，操作简单、条件温和，成本低廉、促肝细胞生长素产量高、活性佳、耗时短、工作效率高、且适于工业化生产。

Description

一种促肝细胞生长素的制备方法
技术领域
本发明涉及促肝细胞生长素技术领域，尤其是涉及一种促肝细胞生长素的制备方法。
背景技术
促肝细胞生长素(pHGF,Hepatocyte Growth-promoting Factor)，是一种从胎肝或再生肝中发现和分离的肝源性肝细胞生长因子，为小分子多肽与氨基酸的混合物。促肝细胞生长素能特异性促进肝细胞DNA合成和细胞分裂，稳定肝细胞膜，减轻肝细胞坏死，调节机体免疫功能，降低胆红素及羧甲基纤维素钠含量，抗肝纤维化，活跃肝细胞生物氧化功能和蛋白质合成作用，同时可改善肝脏微循环，临床上应用于各种重型病毒性肝炎(急性、亚急性、慢性重症肝炎的早期或中期)的辅助治疗。促肝细胞生长素具有年龄依耐性，器官特异性，无种属特异性，还具有耐热，易溶的特点。
目前促肝细胞生长素的制备方法主要为反复冻融法和酸水解法，以新鲜乳猪或乳牛肝脏为原料，其中采用反复冻融法时，反复冷冻与融化细胞中形成的冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂，释放出蛋白质，并降解为多肽，再通过超滤除去大分子物质，真空低温浓缩，得到促肝细胞生长素液，虽然制备的多肽活性较高，但是反复冻融法耗时长，工作效率低，制备得到的多肽收率低；其中采用酸水解法时，用盐酸调pH值为(3.2±02)，于-25℃冷冻，通过水浴解冻，用氢氧化钠调节pH值，再水浴加热，冷却，离心沉淀，上清液进行超滤，得促肝细胞生长素液，虽然酸水解法成本较低，制备的多肽收率高，但是多肽的活性较低。
因此，亟需一种成本低廉、促肝细胞生长素产量高、活性佳、工作效率高、耗时短且适于工业化生产的促肝细胞生长素的制备方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种促肝细胞生长素的制备方法，操作简单、条件温和，具有成本低廉、促肝细胞生长素产量高、活性佳、工作效率高、耗时短且适于工业化生产的优点。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种促肝细胞生长素的制备方法，包括以下步骤：
S1.乳猪肝预处理：取乳猪肝脏，去筋膜、结缔组织，用水洗净，切成2～5cm小块，称重，按1:(0.5～3)(W/V)加入纯化水，置于高速组织匀浆机中搅拌成粒径为0.5～2mm的乳猪肝匀浆；
S2.酶解处理：将步骤S1得到的乳猪肝匀浆加蒸馏水配置成质量浓度为1～9％的底物，调节底物的pH值，水浴加热，然后加入沉淀剂和1000～5000U/g中性蛋白酶，在40～60℃温度下恒温磁力搅拌酶解，得酶解液；
S3.灭活、离心：将步骤S2得到的酶解液在70～100℃水浴保温，然后冷却至室温，再进行离心得离心液；
S4.将步骤S3得到的离心液先经过截留分子量为100kDa的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再用截留分子量为6～10kDa的超滤膜进行超滤，滤液减压浓缩，即得促肝细胞生长素。
优选地，所述沉淀剂包括L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠。
更优选地，所述L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠的质量比为(2～3.5):1。
优选地，所述步骤S2中用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为6～8。
更优选地，所述步骤S2中用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为6.5。
优选地，所述步骤S2中水浴加热的温度为40～60℃，水浴加热时间为5～10min。
优选地，所述步骤S2酶解时间为1～3.5h。
优选地，所述步骤S3中酶解液在70～100℃水浴保温5～20min。
优选地，所述步骤S3离心速度为3000～5000r/min，离心时间为10～20min。
优选地，所述步骤S4滤液在60～90℃条件下减压浓缩。
在本发明中，首先对乳猪肝进行预处理，去筋膜、结缔组织，减少杂质的存在，将配制得到的底物用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为5～8，添加1000～5000U/g中性蛋白酶，并且在40～60℃温度下恒温磁力搅拌酶解，使得酶解较为完全，得到的促肝细胞生长素产量高、活性佳，但是在前期观察中，将底物中的杂质较多，杂质容易附着于促肝细胞生长素的表面，从而产生沉淀等现象，对制备促肝细胞生长素的含量和纯度产生一定影响，因此，本发明人经过大量实验，发现将L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠复配作为沉淀剂使用，可使得底物中杂质除去，并且其中的L-岩藻糖还可以提高中性蛋白酶的酶解能力，缩短制备促肝细胞生长素的时间，制备时间仅需2天，耗时短，而反复冻融法制备促肝细胞生长素所需要的时间是大于14天的，耗时较长，L-岩藻糖与中性蛋白酶还可以进一步提高促肝细胞生长素中多肽的产量和活性，提升了多肽的提取率，采用本发明方法制备的促肝细胞生长素产量至少是反复冻融法的5倍，促肝细胞生长素活性高。
酶解条件单因素试验：
取1mL步骤S2得到的酶解液在100℃水浴保温，保温时间为10min，然后冷却至室温，加入等体积的10％三氯乙酸除去大分子蛋白质，混合震荡，静置30min后，再进行离心得离心液，离心速度为4500r/min，离心时间为20min，以BCA法测定可溶性蛋白、多肽含量。
取1mL底物，用PBS稀释，涡旋、充分溶解，然后以3000r/min离心10min，取上清液以BCA法测定总蛋白含量。
按照下式计算水解度DH(degree of hydrolysis，％)。
Figure BDA0002519440740000031
式中，ρ0为底物中总蛋白量(mg/mL)，ρ1为酶解前底物上清液中可溶性蛋白、多肽含量(mg/mL)，ρ2为反应后酶解液中可溶性蛋白、多肽含量(mg/mL)。
(1)加酶量的考察：底物浓度5％，pH 7.0，温度50℃，酶解时间4h，加酶量1000U/g，2000U/g，3000U/g，4000U/g，5000U/g。
(2)pH的考察：底物质量浓度5％，温度50℃，酶解时间4h，加酶量3000U/g，pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。
(3)温度的考察：底物浓度5％，pH 7.0，加酶量3000U/g，酶解时间4h，温度40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。
(4)底物浓度的考察：pH 7.0，加酶量3000U/g，酶解时间4h，温度50℃，底物浓度1％、3％、5％、7％、9％。
加酶量、底物质量浓度、温度、pH的考察结果见图1。
由图1可知，加酶量由1000U/g增加到2000U/g时，水解度快速增大；加酶量在2000U/g到4000U/g，水解度缓慢增大，4000U/g到5000U/g趋于平稳，选取4000U/g作为响应面法加酶量因素零水平，进一步优化。水解度随底物浓度快速增大至平稳，选取7％作为响应面法底物浓度因素零水平，进一步优化。酶解温度和pH对水解度影响较小，不再进行优化。综上，选择加酶量、底物浓度、酶解时间进行响应面分析，优化最佳酶解条件，酶解温度固定45℃，pH固定为6.5。
由单因素实验结果，固定酶解温度45℃，pH 6.5，选取加酶量(A)、底物浓度(B)和酶解时间(C)3个因素，设置3因素3水平，以水解度DH为响应值进行BBD-RSM响应面分析，实验设计和分析采用Design Expert 8.0.6，结果见图2。
根据响应面优化理论，对实验结果采用多元二次回归方程拟合因素与水解度之间的函数关系，得到如下回归方程：
DH＝55.06+1.77A+1.13B+2.43C-1.53AB-1.69AC-0.31BC-3.95A2-12.6B2-4.17C2
模型预测的最优制备条件为：加酶量4164U/g，底物浓度7.0％，酶解时间1h，预测水解度为55.54％，提高了工作效率。在上述最优制备条件下，进行三次验证实验，水解度为(54.99±1.57)％，为预测值的99.02％，进一步验证了响应面设计的可靠性和准确性。
本发明酶解法和反复冻融法制备促肝细胞生长素，高效凝胶过滤色谱图和高效液相色谱图比较：
由图3可知，冻融法与酶解法制得的促肝细胞生长素色谱峰低分子量部分峰形相近，酶解法主要有5个峰，冻融法有8个色谱峰，且冻融法含有的大分子物质明显多于酶解法，酶解液第3个峰和第5个峰分别与苯丙氨酸和色氨酸保留时间一致，且酶解法与冻融法制备得到的促肝细胞生长素相比，本发明制备的促肝细胞生长素含小分子物质更多。
由图4可知，中性蛋白酶酶解液的色谱图与冻融法制备的促细胞生长素原料液相似，含有相同的多个特征峰，表明所含成分相似。但中性蛋白酶酶解液在保留时间25min左右(分子量相对较大的部分)的峰面积比原料液小，表明大分子物质更少。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的促肝细胞生长素的制备方法，操作简单、条件温和，成本低廉、工作效率高、耗时短且适于工业化生产；
2.本发明提供的促肝细胞生长素的制备方法，制备的促肝细胞生长素产量高、活性佳，底物中的杂质少，且L-岩藻糖还可以提高中性蛋白酶的酶解能力，进一步提高促肝细胞生长素产量；
3.本发明提供的促肝细胞生长素的制备方法，采用单因素和响应面法对底物的质量浓度、中性蛋白酶含量和酶解时间进行考察，利用Box-Behnken Design响应面法优化制备工艺，使得最大程度提高促肝细胞生长素产量和活性。
附图说明
图1为本发明中性蛋白酶水解肝脏单因素优化示意图；
图2为本发明促肝细胞生长素的制备方法的水解度的响应面和等高线图；
图3为本发明中性蛋白酶酶解液、促肝细胞生长素凝胶过滤色谱图对比图；
图4为本发明中性蛋白酶酶解液高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。
以下实施例中，部分原料和厂家如下：
本发明采用的中性蛋白酶来源于上海源叶生物科技有限公司，CAS号为9068-59-1；
本发明采用的L-岩藻糖来源于麦克林，CAS号为2438-80-4；
本发明采用的羧甲基纤维素钠来源于广州市中业化工有限公司，CAS号为32-143-12。
实施例1
一种促肝细胞生长素的制备方法，包括以下步骤：
S1.乳猪肝预处理：取1kg新鲜的乳猪肝脏，去掉筋膜、结缔组织，用水洗净，切成2cm小块，称重，按1:0.5(W/V)加入纯化水，置于高速组织匀浆机中搅拌成粒径为1mm的乳猪肝匀浆；
S2.酶解处理：将步骤S1得到的乳猪肝匀浆加蒸馏水配置成质量浓度为1％的底物，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为6，在40℃温度下水浴加热5min，然后加入10ml沉淀剂和1000U/g中性蛋白酶，在40℃温度下恒温磁力搅拌酶解，酶解时间为3h，得酶解液；
S3.灭活、离心：将步骤S2得到的酶解液在70℃水浴保温，保温时间为5min，然后冷却至室温，加入等体积的10％三氯乙酸除去大分子蛋白质，混合震荡，静置30min后，再进行离心得离心液，离心速度为3000r/min，离心时间为10min；
S4.将步骤S3得到的离心液先经过截留分子量为100kDa的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再用截留分子量为6kDa的超滤膜进行超滤，滤液在60℃条件下减压浓缩，即得促肝细胞生长素。
在本实施例中，沉淀剂包括质量比为2:1的L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠。
实施例2
一种促肝细胞生长素的制备方法，包括以下步骤：
S1.乳猪肝预处理：取1kg新鲜的乳猪肝脏，去掉筋膜、结缔组织，用水洗净，切成3cm小块，称重，按1:1(W/V)加入纯化水，置于高速组织匀浆机中搅拌成粒径为0.5mm的乳猪肝匀浆；
S2.酶解处理：将步骤S1得到的乳猪肝匀浆加蒸馏水配置成质量浓度为3％的底物，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为7，在45℃温度下水浴加热7min，然后加入10ml沉淀剂和3000U/g中性蛋白酶，在50℃温度下恒温磁力搅拌酶解，酶解时间为1.5h，得酶解液；
S3.灭活、离心：将步骤S2得到的酶解液在80℃水浴保温，保温时间为10min，然后冷却至室温，加入等体积的10％三氯乙酸除去大分子蛋白质，混合震荡，静置30min后，再进行离心得离心液，离心速度为4000r/min，离心时间为15min；
S4.将步骤S3得到的离心液先经过截留分子量为100kDa的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再用截留分子量为7kDa的超滤膜进行超滤，滤液在70℃条件下减压浓缩，即得促肝细胞生长素。
在本实施例中，沉淀剂包括质量比为2.5:1的L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠。
实施例3
一种促肝细胞生长素的制备方法，包括以下步骤：
S1.乳猪肝预处理：取1kg新鲜的乳猪肝脏，去掉筋膜、结缔组织，用水洗净，切成4cm小块，称重，按1:2(W/V)加入纯化水，置于高速组织匀浆机中搅拌成粒径为2mm的乳猪肝匀浆；
S2.酶解处理：将步骤S1得到的乳猪肝匀浆加蒸馏水配置成质量浓度为5％的底物，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为7.5，在50℃温度下水浴加热8min，然后加入10ml沉淀剂和4000U/g中性蛋白酶，在55℃温度下恒温磁力搅拌酶解，酶解时间为2.5h，得酶解液；
S3.灭活、离心：将步骤S2得到的酶解液在90℃水浴保温，保温时间为15min，然后冷却至室温，加入等体积的10％三氯乙酸除去大分子蛋白质，混合震荡，静置30min后，再进行离心得离心液，离心速度为4000r/min，离心时间为15min；
S4.将步骤S3得到的离心液先经过截留分子量为100kDa的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，滤液在80℃条件下减压浓缩，即得促肝细胞生长素。
在本实施例中，沉淀剂包括质量比为3:1的L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠。
实施例4
一种促肝细胞生长素的制备方法，包括以下步骤：
S1.乳猪肝预处理：取1kg新鲜的乳猪肝脏，去掉筋膜、结缔组织，用水洗净，切成5cm小块，称重，按1:3(W/V)加入纯化水，置于高速组织匀浆机中搅拌成粒径为1.5mm的乳猪肝匀浆；
S2.酶解处理：将步骤S1得到的乳猪肝匀浆加蒸馏水配置成质量浓度为9％的底物，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为8，在60℃温度下水浴加热10min，然后加入10ml沉淀剂和5000U/g中性蛋白酶，在60℃温度下恒温磁力搅拌酶解，酶解时间为3.5h，得酶解液；
S3.灭活、离心：将步骤S2得到的酶解液在100℃水浴保温，保温时间为20min，然后冷却至室温，加入等体积的10％三氯乙酸除去大分子蛋白质，混合震荡，静置30min后，再进行离心得离心液，离心速度为5000r/min，离心时间为20min；
S4.将步骤S3得到的离心液先经过截留分子量为100kDa的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再用截留分子量为6kDa的超滤膜进行超滤，滤液在90℃条件下减压浓缩，即得促肝细胞生长素。
在本实施例中，沉淀剂包括质量比为3.5:1的L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠。
实施例5
一种促肝细胞生长素的制备方法，包括以下步骤：
S1.乳猪肝预处理：取1kg新鲜的乳猪肝脏，去掉筋膜、结缔组织，用水洗净，切成3cm小块，称重，按1:1.5(W/V)加入纯化水，置于高速组织匀浆机中搅拌成粒径为1mm的乳猪肝匀浆；
S2.酶解处理：将步骤S1得到的乳猪肝匀浆加蒸馏水配置成质量浓度为7％的底物，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为6.5，在45℃温度下水浴加热5min，然后加入10ml沉淀剂和4164U/g中性蛋白酶，在40～60℃温度下恒温磁力搅拌酶解，酶解时间为1h，得酶解液；
S3.灭活、离心：将步骤S2得到的酶解液在100℃水浴保温，保温时间为10min，然后冷却至室温，加入等体积的10％三氯乙酸除去大分子蛋白质，混合震荡，静置30min后，再进行离心得离心液，离心速度为4500r/min，离心时间为20min；
S4.将步骤S3得到的离心液先经过截留分子量为100kDa的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再用截留分子量为6kDa的超滤膜进行超滤，滤液在65℃条件下减压浓缩，即得促肝细胞生长素。
在本实施例中，沉淀剂包括质量比为2.4:1的L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠。
对比例1
与实施例5相似，区别仅在于，不含有L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠，其余步骤和参数与实施例5相同。
对比例2
与实施例5相似，区别仅在于，不含有L-岩藻糖，其余步骤和参数与实施例5相同。
对比例3
与实施例5相似，区别仅在于，不含有羧甲基纤维素钠，其余步骤和参数与实施例5相同。
对比例4
与实施例5相似，区别仅在于，将中性蛋白酶换成胃蛋白酶，其余步骤和参数与实施例5相同。
对比例5
与实施例5相似，区别仅在于，采用反复冻融法制备促肝细胞生长素。
对比例6
与实施例5相似，区别仅在于，不含有步骤S4，直接将步骤S3得到的离心液减压浓缩，即得促肝细胞生长素。
试验例一、促肝细胞生长素活性测定和含量测定
采用MTT法测定实施例1～5及对比例1～6的刺激指数以验证促肝细胞生长素的活性，采用福林-酚法测定促肝细胞生长素中多肽的含量及提取率，结果见表1。
表1
Figure BDA0002519440740000091
Figure BDA0002519440740000101
根据表1的数据可知，本发明制备的促肝细胞生长素，其刺激指数、多肽含量和多肽提取率均较高，其中以实施例5为最佳实施例。
与实施例5相比，对比例1不含有L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠，其制备的促肝细胞生长素刺激指数较实施例5低，且得到的多肽含量和提取率均不如实施例5；
与实施例5相比，对比例2中的沉淀剂不含有L-岩藻糖，其效果和对比例1相似，说明L-岩藻糖可以与中性蛋白酶可以进一步提高促肝细胞生长素的刺激指数，并且还可以提升多肽含量和多肽提取率；
与实施例5相比，对比例3中不含有羧甲基纤维素钠，其效果和实施例1～5相似，促肝细胞生长素的刺激指数、多肽含量和多肽提取率均较高，说明羧甲基纤维素钠对促肝细胞生长素的刺激指数、多肽含量和多肽提取率影响较小；
对比例4制备的促肝细胞生长素过程中，将中性蛋白酶换成胃蛋白酶，其效果都大打折扣，促肝细胞生长素的刺激指数、多肽含量和多肽提取率不及实施例5；
对比例6制备过程中不采用步骤S4，其制备的促肝细胞生长素的刺激指数、多肽含量和多肽提取率不及实施例5，虽然没有第一次过滤、超滤膜超滤，但是含有沉淀剂，也可使得促肝细胞生长素的刺激指数、多肽含量和多肽提取率比对比例5的高；
对比例5采用反复冻融法，其促肝细胞生长素的刺激指数较低，多肽含量和多肽提取率不高。相同量乳猪肝脏酶解得到的多肽含量至少为冻融法的5倍。因酶解法酶切蛋白更彻底，所以大分子物质含量相对更少，简化了除去大分子的纯化(膜过滤)过程，乳猪肝脏的利用率更大，且制备时间较短，多肽属于生物制品，易分解，需要低温保存，缩短制备时间有利于维持肽链稳定；中性蛋白酶(100U/mg)规格250g，单价120元，可酶解约6kg底物，较为经济，且不引入其他化学试剂，有很好的工业应用前景。
试验例二、杂质测定
将实施例1～5及对比例1～6制备的促肝细胞生长素溶液根据药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-0860)-2002的规定，进行分析，结果见表2。
表2
Figure BDA0002519440740000111
Figure BDA0002519440740000121
根据表2可知，实施例1～5制备的促肝细胞生长素溶液蛋白质检查不发生浑浊或沉淀现象，其双缩脲鉴别、异毒常性及热原检查和过敏性试验均符合规定，对比例4制备的促肝细胞生长素溶液各指标也符合规定，对比例1未添加沉淀剂，其蛋白质检查有沉淀现象，对比例2或对比例3只添加沉淀剂中的一种，促肝细胞生长素溶液仍然有沉淀现象，说明L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠复配，使得促肝细胞生长素溶液不发生浑浊或沉淀现象，提高了促肝细胞生长素的纯度
对比例5采用反复冻融法制备的促肝细胞生长素溶液蛋白质检查有沉淀现象，其杂质较多，故促肝细胞生长素的纯度不及实施例5；
对比例6制备过程中不含有步骤S4，其蛋白质检查不发生浑浊或沉淀现象，进一步说明本发明所使用的沉淀剂在制备促肝细胞生长素所起到的作用。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.乳猪肝预处理：取乳猪肝脏，去筋膜、结缔组织，用水洗净，切成2～5cm小块，称重，按1: 0.5～3 (W/V)加入纯化水，置于高速组织匀浆机中搅拌成粒径为0.5～2mm的乳猪肝匀浆；
S2.酶解处理：将步骤S1得到的乳猪肝匀浆加蒸馏水配置成质量浓度为1～9％的底物，调节底物的pH值，水浴加热，然后加入沉淀剂和1000～5000U/g中性蛋白酶，在40～60℃温度下恒温磁力搅拌酶解，得酶解液；
S3.灭活、离心：将步骤S2得到的酶解液在70～100℃水浴保温，然后冷却至室温，再进行离心得离心液；
S4.将步骤S3得到的离心液先经过截留分子量为100kDa的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再用截留分子量为6～10kDa的超滤膜进行超滤，滤液减压浓缩，即得促肝细胞生长素；
所述沉淀剂包括L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠；
所述L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠的质量比为2～3.5:1。
2.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为6～8。
3.根据权利要求2所述的促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节底物的pH值为6.5。
4.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中水浴加热的温度为40～60℃，水浴加热时间为5～10min。
5.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2酶解时间为1～3.5h。
6.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中酶解液在70～100℃水浴保温5～20min。
7.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，所述步骤S3离心速度为3000～5000r/min，离心时间为10～20min。
8.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，所述步骤S4滤液在60～90℃条件下减压浓缩。
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