SU578836A3 - Способ получени орготеина - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГОТЕИНА

применением эритроцитов, не содержаших сыворотки , но предпочтительным исходным материалом  вл етс  цельна  кровь.

Цельную кровь и особенно эритроциты, не со держащие сьшоротки, смешивают с водой (например , 1-2 об.ч.) перед нагреванием. Вода может содержать буфер или ионы двухвалентного металла, например меди или цинка, при небольших концентраци х , например, ниже 0,5 М. При использовании цельной крови добавл ют тринатрийцитрат или другой ингибитор свертьшани  дл  предотвращени  свертьшаий  крови перед лизисом гемоглобина .

. Значение рН при иагреваш и равно 7. При более низких значени х рН, например ниже 5, гемоглобин денатурируетс , осаждаетс  лишь частично. Значение рН эритроцитов регулируют добавлением подход щего ко.пичества кислоты или основани .

Стадию нагревани  ведут при температуре 60-80°С, предпочтительно 70-75° С, до осаждени  всего или почти всего гемоглобина. Повышение температуры и более длительное нагревание способствуют снижению общего выхода орготеина. Более низка  температура и короткое нагревание привод т к получению менее чистого орготеина. При 75°С нагревание ведут 1-2ч. Стадию нагревани  можно осуществл ть периодически или непрерьтно .

Термолабильные белки, в том числе фермеиты, уда.ш1ют из эритроцитов путем термоденатурации вместе с гемоглобином. Основным компонентом таких термолабильных белков  вл етс  карбоангидраза . Эритроциты нагревают до инактивировани  карбоангидразы.

При осаждении гемоглобина карбоангидраза и большинство других термолабильных ферментов и белков неферментного происхождени  в верхнем слое жидкости также осаждаютс , ввиду того, что гемоглобин более стоек.

Полноту осаждени  гемоглобина устанавливают по окрашиванию верхнего сло  жидкости, котора  .становитс  бледно-розовой.

При использовании старой крови возможны случаи, когда все окрашенные вещества гемоглоби на могут не осадитьс , если стадию нагревани  осуществл ют в кислой среде. Если это происходит перед или после удалени  гемоглобина, осажденного на стадии нагревани , то любые остаточные скрещивающие вещества можно осадить доведением значени  рН до 7 или до 7,5 перед осажде1шем орготеина. Осажденные вещества красного цвета удал ют таким же образом, как при осаждении гемоглобина на стадии нагревани . После нагревани  эритродать охлавдают до температуры ниже 50° С, предпочтительно до комнатной температуры, пропусканием через теплообменник. Гемоглобин и .другие белки, осажденные на стадии нагревани , удал ют центрифугированием и отбрасывают (можно также использовать отстаивание или фильтро . вание).

После удалени  осажденного гемоглобина выдел ют орготеин из верхнего сло  жидкости, например , добавлением ацетона к охлажденному раствору ,  иофилизацией, ультрафильтрованием или же адсорбцией на колонке с ионообменной смолой с последующим элюированием. Предпочтительнее всего выдел ть орготеин ионообменной хроматографией .

Вьщел ть орготеин можно пропусканием верхнего сло  жидкости, по.Г1ученного на стадии нагревани , через ДЭАЭ-целлюлозу. Верхний слой жидкости можно также подвергать очистке с использованием молекул рноситовой хроматографии, например , пропусканием через колонку, заполненную декстрановой смолой, сшитой эпихлоргидрином.

Неочищенный .орготеин, содержащийс  в верхнем слое жидкости, подвергают очистке путем избирательного выпаривани  инородных белков, предпочтительно с протеиназой. Strep, griseus с

панкреатином, субтилизином, попашюм или бромелиаином при весовом соотношении фермента и белков в верхнем слое жидкости примерно от 1:2 до 1:1000, в зависимости от выбранного фермента и соотношени  инородных белков и орготеина в

смеси. Чистый орготеин вьщел ют из смеси, например , ультрафильтрованием. Остатки белков и избыток ионов удал ют из варочной смеси диализом перед вьщелением из этой смеси орготеина.

После удалени  осажденных посторонних белков орготеин осаждают остаточным количеством ацетона - от 3/4 до 1,5 об.ч. в расчете на водный раствор.

Предварительное осаждение посторонних белков и орготеина провод т на холоду, например при

О-5° С, но можно его прюводить и при комнатной температуре до точки кипени  ацетона. Осаждегшый орготеин отдел ют от остаточного количества растворите .ш и влаги, например, сушкой, вымораживанием или лиофилизацией или же повторным растворением в водном св зующем дл  последующей очистки во избежание потерь орготеина.

Пример. Промытые эритроадты быков лизируют двукратным объемом воды, содержащей 1 мг двухвалентной меди и 1 мг двухвалентного

цинка на 5 мг орготеина, наход щегос  в эритроцитах , и нагревают до 70-75°С в течение 1-2ч при З51ачении , т.е. при изоэлектрической точке гемоглобина. Разбавл ют в 2-3 раза, охлаждают и центрифугируют полученный шлам при температуре

4С. Верхний слой жидкости, полученный после центрифугирова}ш  и содержащий в значительной степени очищенный орготеин, подвергают диализу и лиофилизируют. Выход орготеина 70%.

Пример 2. Суспендируют промытые консервироващые эритроциты, замороженные и не содержащие сьшоротки, в двойном (по объему) количестве воды. Подкисл ют до рН 5,5 уксусной кислотой . Суспензию нагревают 15 мин при 65° С. Полученную жидкость охлаждают до температуры окружаюшей среды (лли более 1шзкой температуры)

И удал ют осажденные бедки центрифугированием. Довод т рН до 7,5 с целью осаждени  веществ, окрашенных в красный цвет, и центрифугируют. Верхний слой жидкости после центрифугировани  сменшрают с 3/4 объема ацетоиа, охлажденного льдом, центрифугируют и осадок отбрасывают. Добавл ют вторую порцию 3/4 объема холодного ацетона , центрифугируют и отдел ют осадок, содержащий 50% орготеииа. Дл  сохранени  неочищенного орготеина осадок подвергают сушке вымораживанием , а затем его лиофилизируют.

П р и м е р 3, Используют эритроциты человека , быков, лощадей, кур, овец или свиней. Методика аналогична примеру 2, но осаждение ацетоном замен ют на ферментативное переваривание бе/псовых примесей, например, добавлением к верхнему слою жидкости после стадии нагревани  1-Змг панкреатина на 1 мл исходных консервированных эритроцитов и вьщерживани  смеси при 37° С в тече1ше 15-48 ч. В результате происходит переваривание почти всех белков, за исключением орготеина , на небольшие диализуемые фрагменты. Из полученной смеси путе м ультрафильтровани  выде11 ют в значительной степени очищенный орготеин.

П р и м е р 4. Следуют методике, описанной в примере 1, но в качестве исходного материала примен ют цельную кровь, стабилизированную против коагул ции цитратом натри . Смешивают 2 об.ч. свежей бычьей крови (85 мг/мл общего белка, 20 мг/мл орготеина) и 1 об.ч. 3,8%-ного водного раствора тринатрийцитрата с 2 об.ч. воды, содержа; щей 25 мг/мл двухвалентной меди и 25 мг/мл двухвалентного цинка. Получают раствор цельпой крови, содержащей 1000мг ионов двухвалентной меди и двухвалентного цинка на 100 мл. Раствор нагревают до 7 5° С и выдерживают при этой температуре 2 ч. Затем охлаждают до 10° С добавлением 150 мл лед ной воды. Это разбавление устран ет необходимость отдельной стадии промывки после центрифугировани . Центрифугируют и отдел ют верхний слой жидкости, содержащий 1,6 мг/мл белка и 12-17 мг/мл орготеина, что представл ет собой 40-кратную очистку и извлечение 70% орготеина исходной крови. При использовании непромытых эритроцитов (90 мг/мл общего белка) вместо цельной крови извлекают 9О/Ь орготеина. Очищенный орготеин въщел ют из верхнего сло  жидкости лиофилизацней, или фильтрованием через молекул рное сито, или хроматографией с применением ДЭАЭ-целлюлозы.

Дл  последующей очистки орготеина смешивают 50 мл верхнего сло  жидаости после стадии термической очистки, содержащей 12-17 мг/мл

орготеина, с 50-150мг панкреатина и 0,1% азида натри  (дл  предотвращени  роста бактерий) и выдерживают при температуре 37° С в течение 15ч, после чего охлаждают. Получают раствор, содержащий 1 мг/мл общего белка и 12 мг/мл орготеина.

Неочищенный орготеин можно выделить в чистом состо нии путем хроматографии через гЬть из молекул рного сита пропусканием 2-5 г неочищенного орготеина через колонку размером 3,2 см 38,5 см, заполненную сверхтонким Сефадексом G-75, представл ющим собой декстр ковую смолу, сиштую зпихлоргидрином. Собирают элюат на фракции по 5,4 мл и определ ют их поглощение. Начина  примерно с 50-ой фракции, крива  поглощени  круто пошшмаетс , достига 

пика примерно на 68-ой фракции. Фракции 66-73 содержат большую часть всего орготеина в ультрашстом состо нии.

Claims (1)

1. Патент США №3579495, кл. 260-115, I97k