CN111875696B - 一种纯化Ferr的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白提取技术领域，尤其涉及一种纯化Ferr的方法。本发明提供的纯化Ferr的方法包括：胎盘组织匀浆经离心取上清液A；所述上清液A依次经热变除杂、等电点沉淀、DEAE离子交换层析获得Ferr溶液；该方法原料来源丰富且易获得，且该方法简单易行，避免了多次提取或层析造成的损失，条件温和保留了Ferr的活性。实验表明，浓缩后铁蛋白活性含量达100000ng/ml以上，稳定性良好，回收率达到85％以上(较改进前回收率提高20％左右)，可完全满足体外诊断试剂盒的要求。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白提取技术领域，尤其涉及一种纯化Ferr的方法。
背景技术
铁蛋白（Ferr）是体内含铁最丰富的一种蛋白质。肝、脾、心、肾、骨髓及肠黏膜是铁储备的主要场所，约占全身总铁的66%。测定铁蛋白是判断体内铁贮储量的重要指标。在诊断缺铁性贫血、铁负荷过度、营养状况调查等方面都有重要意义。铁蛋白作为一种肿瘤标志物，对临床某些恶性肿瘤的诊断也具有一定的参考价值，已经成为临床上肿瘤筛查的一个常规指标。
铁蛋白首次从马的脾脏中分离出来，此后科学家们陆续在人类及其他哺乳动物、植物、真菌和细菌等多种生物体内发现了铁蛋白，尽管不同生物的铁蛋白氨基酸序列具有极大的差别，但本质上都有相同的体系结构。典型的铁蛋白结构是由蛋白外壳和铁内核两部分构成，其中蛋白外壳是由24个亚基组装形成的笼状结构(外径12 nm，内径8 nm)。目前天然铁蛋白提取来源主要包含人肝脏、人脾脏、人心脏，原材料较难获得；铁蛋白的提取方法大多是用沉淀法、离子交换层析和疏水层析，但沉淀法得到的铁蛋白纯度不高，离子交换层析结合疏水层析纯化步骤较多，得到的铁蛋白回收率不高。因此，寻求一种材料来源丰富、操作相对简单、实用、回收率较高的纯化铁蛋白的方法势在必行。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种收率高、纯度大的纯化Ferr的方法。
本发明提供的纯化Ferr的方法包括：胎盘组织匀浆经离心取上清液A；所述上清液A依次经热变除杂、等电点沉淀、DEAE离子交换层析获得Ferr溶液；
所述热变除杂步骤中，温度为70℃，时间为40min~50min；
所述等电点沉淀步骤中，pH值为5.0；
所述DEAE离子交换层析步骤中，以含有NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱梯度为0.1~0.5mol/L，收集含有0.2 mol/L NaCl的洗脱液。
本发明中，DEAE离子交换层析洗脱缓冲液为pH6.8-7.0 0.01M PB+0.2M NaCl 或0.01MTris-HCl+0.2M NaCl，在此条件下可以将目的蛋白全部洗脱下来，避免了多步层析造成的目的蛋白损失。
在本发明中，所述上清液A的制备包括：胎盘去除表面层皮和脐带，冲洗后绞碎，以PBS缓冲液重悬获得胎盘组织匀浆，8000~15000rpm，4℃离心30min，取上清液A。所述离心的转速为10000~15000rpm，优选为10000rpm或15000rpm。所述胎盘为人胎盘。
在本发明中，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.0~7.4；每g胎盘组织与2mL PBS缓冲液混合。
本发明中，加热温度70℃，既避免了目的蛋白的变性失活又保证了杂蛋白的去除，此时目的蛋白活性浓度最高；加热至65℃，从电泳图上看杂蛋白的去除不充分，加热至75℃，目的蛋白的活性浓度降低。一些实施例中，所述热变除杂步骤中，70℃处理40~50min后，还包括8000~15000 rpm，4℃离心30 min，取上清液B。所述离心的转速为10000~15000rpm，优选为10000rpm或15000rpm。
在本发明中，等电点沉淀，先用醋酸盐调pH至5.0，接近胎盘铁蛋白的等电点，再加一步硫酸铵可以使目的蛋白更好的析出，比传统方法中的两步硫酸铵法缩减纯化步骤，避免了硫酸铵的大量引入，适合规模化放大；当用醋酸盐调pH大于或小于5.0时，目的蛋白沉淀均不彻底，回收率降低。一些实施例中，所述等电点沉淀步骤中，所述上清液B与1mol/L的醋酸缓冲液混合，混合液中加入硫酸铵至50%饱和度，4℃沉淀8~12h后，8000~15000rpm，4℃离心30min，取沉淀。所述离心的转速为10000~15000rpm，优选为10000rpm或15000rpm。具体实施例中，固体硫酸铵按照0.313g硫酸铵/ml上清加入。
一些实施例中，所述上清液B与1mol/L的醋酸缓冲液混合的体积比为1：1。所述醋酸缓冲液的pH值为5.4。
一些实施例中，所述沉淀以磷酸缓冲液或Tris-HCl溶液重悬，经离心取上清液C上DEAE离子交换层析柱；
所述磷酸缓冲液的浓度为0.01mol/L， pH值为6.8；
所述Tris-HCl溶液的浓度为0.01mol/L， pH值为7.0。
一些实施例中，所述梯度洗脱的洗脱液为含有NaCl的磷酸缓冲液或含有NaCl的Tris-HCl溶液；
所述磷酸缓冲液的浓度为0.01mol/L， pH值为6.8；
所述Tris-HCl溶液的浓度为0.01mol/L， pH值为7.0；
所述NaCl的浓度依次为0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L。
本发明所述方法还包括浓缩Ferr溶液的步骤，所述浓缩采用中空纤维柱或膜包，截留分子量为100KDa。
一些实施例中，100KD中空纤维柱或膜包浓缩洗滤，置换铁蛋白保存缓冲液为50mMTris-HCl+0.15M NaCl pH8.0。
以本发明所述方法制备的Ferr蛋白。
以本发明所述方法制备的Ferr铁蛋白，活性含量达100000ng/ml以上，稳定性良好，回收率达到85%以上。
所述制得的Ferr蛋白加入防腐剂2-8℃保存。所述防腐剂选自0.2%P300或0.2%叠氮化钠。
本发明提供的纯化Ferr的方法包括：胎盘组织匀浆经离心取上清液A；所述上清液A依次经热变除杂、等电点沉淀、DEAE离子交换层析获得Ferr溶液；该方法原料来源丰富且易获得，且该方法简单易行，避免了多次提取或层析造成的损失，条件温和保留了Ferr的活性。实验表明，浓缩后铁蛋白活性含量达100000ng/ml以上，稳定性良好，回收率达到85%以上（较改进前回收率提高20%左右），可完全满足体外诊断试剂盒的要求。
具体实施方式
本发明提供了一种纯化Ferr的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
铁蛋白的纯化方法包括下述步骤：
第一步，将人胎盘用自来水冲洗解冻，去除胎盘表面层皮和脐带，少许冲洗后进行进一步处理（冲洗过程中要轻，尽量不将组织破坏，并且不要过度清洗）；
第二步，将胎盘用绞肉机绞碎，称取湿重，每g胎盘加入2mL 0.01M PBS pH7.2进行匀浆，匀浆至糊状，倒入到烧杯中（要匀浆充分）；
第三步，10000rpm 4℃离心30min，去除组织碎片，量取上清体积；
第四步，上清转入烧杯中，水浴锅温度设置为70℃，烧杯放入水浴锅中，待烧杯中匀浆上清的温度升至70℃时开始计时加热40min，然后迅速在冰中冷却，冷却至室温后，10000rpm 、4℃离心30min去除热变性蛋白质；
第五步，量取上清体积，加入等体积的0.1M 醋酸缓冲液 pH5.4，按上清与0.1M 醋酸缓冲液 pH5.0总体积之和加入硫酸铵至50％饱和度，搅拌30min至硫酸铵全部溶解，4℃过夜沉淀蛋白；
第六步，10000rpm 4℃离心30min去除上清，沉淀用pH 6.8 0.01M的磷酸缓冲液重悬，重悬后离心取上清进行洗滤；
第七步，将第六步得到的粗提物过DEAE离子交换柱，依次用含有0.1 mol/L、0.2mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L NaCl 的pH 6.8 0.01M的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集含有0.2M NaCl的洗脱液，100KD中空纤维浓缩洗滤得到Ferr，加入0.2%叠氮化钠后4℃保存。
经检测，收率为87%，纯度为93%。
实施例2
铁蛋白的纯化方法包括下述步骤：
第一步，将人胎盘用自来水冲洗解冻，去除胎盘表面层皮和脐带，少许冲洗后进行进一步处理（冲洗过程中要轻，尽量不将组织破坏，并且不要过度清洗）；
第二步，将胎盘用绞肉机绞碎，称取湿重，每g胎盘加入2mL0.01M PBS pH7.0进行匀浆，匀浆至糊状，倒入到烧杯中（要匀浆充分）；
第三步，15000rpm 4℃离心30min，去除组织碎片，量取上清体积；
第四步，上清转入烧杯中，水浴锅温度70℃，烧杯放入水浴锅中，待烧杯中匀浆上清的温度升至70℃时开始计时，加热50min，然后迅速在冰中冷却，冷却至室温后，15000rpm、4℃离心30min去除热变性蛋白质；
第五步，量取上清体积，加入等体积的0.1M 醋酸缓冲液 pH5.5，按上清与0.1M 醋酸缓冲液pH5.0总体积之和加入硫酸铵至50％饱和度，搅拌40min至硫酸铵全部溶解，4℃过夜沉淀蛋白；
第六步，15000rpm 4℃离心30min去除上清，沉淀用pH 7.0 0.01M的Tris-HCl重悬，重悬后离心取上清进行浓缩洗滤；
第七步，将第六步得到的粗提物过DEAE离子交换柱，依次用含有0.1 mol/L、0.2mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L NaCl 的pH 7.0 0.01M的Tris-Hcl进行梯度洗脱，收集含有0.2 M NaCl的洗脱液，100KD膜包浓缩洗滤得到Ferr，加入0.2%P300，4℃保存。
经检测，收率为88%，纯度为92%。
对比例1
铁蛋白的纯化方法包括下述步骤：
第一步，将人胎盘用自来水冲洗解冻，去除胎盘表面层皮和脐带，少许冲洗后进行进一步处理（冲洗过程中要轻，尽量不将组织破坏，并且不要过度清洗）；
第二步，将胎盘用绞肉机绞碎，称取湿重，每g胎盘加入2mL 0.01M PBS pH7.2进行匀浆，匀浆至糊状，倒入到烧杯中（要匀浆充分）；
第三步，10000rpm 4℃离心30min，去除组织碎片，量取上清体积；
第四步，上清转入烧杯中，水浴锅温度设置为65℃，烧杯放入水浴锅中，待烧杯中匀浆上清的温度升至65℃时开始计时加热40min，然后迅速在冰中冷却，冷却至室温后，10000rpm 、4℃离心30min去除热变性蛋白质；
第五步，量取上清体积，加入等体积的0.1M 醋酸缓冲液 pH5.4，按上清与0.1M 醋酸缓冲液 pH5.0总体积之和加入硫酸铵至50％饱和度，搅拌30min至硫酸铵全部溶解，4℃过夜沉淀蛋白；
第六步，10000rpm 4℃离心30min去除上清，沉淀用pH 6.8 0.01M的磷酸缓冲液重悬，重悬后离心取上清进行洗滤；
第七步，将第六步得到的粗提物过DEAE离子交换柱，依次用含有0.1 mol/L、0.2mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L NaCl 的pH 6.8 0.01M的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集含有0.2M NaCl的洗脱液，100KD中空纤维浓缩洗滤得到Ferr，加入0.2%叠氮化钠后4℃保存。
经检测，收率为87%，纯度为70% 。说明杂蛋白的去除不充分
对比例2
铁蛋白的纯化方法包括下述步骤：
第一步，将人胎盘用自来水冲洗解冻，去除胎盘表面层皮和脐带，少许冲洗后进行进一步处理（冲洗过程中要轻，尽量不将组织破坏，并且不要过度清洗）；
第二步，将胎盘用绞肉机绞碎，称取湿重，每g胎盘加入2mL 0.01M PBS pH7.2进行匀浆，匀浆至糊状，倒入到烧杯中（要匀浆充分）；
第三步，10000rpm 4℃离心30min，去除组织碎片，量取上清体积；
第四步，上清转入烧杯中，水浴锅温度设置为75℃，烧杯放入水浴锅中，待烧杯中匀浆上清的温度升至75℃时开始计时加热40min，然后迅速在冰中冷却，冷却至室温后，10000rpm 、4℃离心30min去除热变性蛋白质；
第五步，量取上清体积，加入等体积的0.1M 醋酸缓冲液 pH5.4，按上清与0.1M 醋酸缓冲液 pH5.0总体积之和加入硫酸铵至50％饱和度，搅拌30min至硫酸铵全部溶解，4℃过夜沉淀蛋白；
第六步，10000rpm 4℃离心30min去除上清，沉淀用pH 6.8 0.01M的磷酸缓冲液重悬，重悬后离心取上清进行洗滤；
第七步，将第六步得到的粗提物过DEAE离子交换柱，依次用含有0.1 mol/L、0.2mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L NaCl 的pH 6.8 0.01M的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集含有0.2M NaCl的洗脱液，100KD中空纤维浓缩洗滤得到Ferr，加入0.2%叠氮化钠后4℃保存。
经检测，收率为65%，纯度为90%。用Ferr检测发光试剂盒检测其活性，发现目的蛋白的活性浓度降低。
对比例3
铁蛋白的纯化方法包括下述步骤：
第一步，将人胎盘用自来水冲洗解冻，去除胎盘表面层皮和脐带，少许冲洗后进行进一步处理（冲洗过程中要轻，尽量不将组织破坏，并且不要过度清洗）；
第二步，将胎盘用绞肉机绞碎，称取湿重，每g胎盘加入2mL 0.01M PBS pH7.2进行匀浆，匀浆至糊状，倒入到烧杯中（要匀浆充分）；
第三步，10000rpm 4℃离心30min，去除组织碎片，量取上清体积；
第四步，上清转入烧杯中，水浴锅温度设置为70℃，烧杯放入水浴锅中，待烧杯中匀浆上清的温度升至70℃时开始计时加热40min，然后迅速在冰中冷却，冷却至室温后，10000rpm 、4℃离心30min去除热变性蛋白质；
第五步，量取上清体积，加入等体积的0.1M 醋酸缓冲液 pH5.4，按上清与0.1M 醋酸缓冲液 pH＞5.0总体积之和加入硫酸铵至50％饱和度，搅拌30min至硫酸铵全部溶解，4℃过夜沉淀蛋白；
第六步，10000rpm 4℃离心30min去除上清，沉淀用pH 6.8 0.01M的磷酸缓冲液重悬，重悬后离心取上清进行洗滤；
第七步，将第六步得到的粗提物过DEAE离子交换柱，依次用含有0.1 mol/L、0.2mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L NaCl 的pH 6.8 0.01M的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集含有0.2M NaCl的洗脱液，100KD中空纤维浓缩洗滤得到Ferr，加入0.2%叠氮化钠后4℃保存。
经检测，收率为69%，纯度为89% 。说明目的蛋白沉淀均不彻底，回收率降低。
对比例4
铁蛋白的纯化方法包括下述步骤：
第一步，将人胎盘用自来水冲洗解冻，去除胎盘表面层皮和脐带，少许冲洗后进行进一步处理（冲洗过程中要轻，尽量不将组织破坏，并且不要过度清洗）；
第二步，将胎盘用绞肉机绞碎，称取湿重，每g胎盘加入2mL 0.01M PBS pH7.2进行匀浆，匀浆至糊状，倒入到烧杯中（要匀浆充分）；
第三步，10000rpm 4℃离心30min，去除组织碎片，量取上清体积；
第四步，上清转入烧杯中，水浴锅温度设置为70℃，烧杯放入水浴锅中，待烧杯中匀浆上清的温度升至70℃时开始计时加热40min，然后迅速在冰中冷却，冷却至室温后，10000rpm 、4℃离心30min去除热变性蛋白质；
第五步，量取上清体积，加入等体积的0.1M 醋酸缓冲液 pH5.4，按上清与0.1M 醋酸缓冲液 pH＜5.0总体积之和加入硫酸铵至50％饱和度，搅拌30min至硫酸铵全部溶解，4℃过夜沉淀蛋白；
第六步，10000rpm 4℃离心30min去除上清，沉淀用pH 6.8 0.01M的磷酸缓冲液重悬，重悬后离心取上清进行洗滤；
第七步，将第六步得到的粗提物过DEAE离子交换柱，依次用含有0.1 mol/L、0.2mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L NaCl 的pH 6.8 0.01M的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集含有0.2M NaCl的洗脱液，100KD中空纤维浓缩洗滤得到Ferr，加入0.2%叠氮化钠后4℃保存。
经检测，收率为65%，纯度为90%。说明目的蛋白沉淀均不彻底，回收率降低。
对比例5
铁蛋白的纯化方法包括下述步骤：
第一步，将人胎盘用自来水冲洗解冻，去除胎盘表面层皮和脐带，少许冲洗后进行进一步处理（冲洗过程中要轻，尽量不将组织破坏，并且不要过度清洗）；
第二步，将胎盘用绞肉机绞碎，称取湿重，每g胎盘加入2mL 0.01M PBS pH7.2进行匀浆，匀浆至糊状，倒入到烧杯中（要匀浆充分）；
第三步，10000rpm 4℃离心30min，去除组织碎片，量取上清体积；
第四步，上清转入烧杯中，水浴锅温度设置为70℃，烧杯放入水浴锅中，待烧杯中匀浆上清的温度升至70℃时开始计时加热40min，然后迅速在冰中冷却，冷却至室温后，10000rpm 、4℃离心30min去除热变性蛋白质；
第五步，量取上清体积，加入等体积的0.1M 醋酸缓冲液 pH5.4，按上清与0.1M 醋酸缓冲液 pH=5.0总体积之和加入硫酸铵至50％饱和度，搅拌30min至硫酸铵全部溶解，4℃过夜沉淀蛋白；
第六步，10000rpm 4℃离心30min去除上清，沉淀用pH 6.8 0.01M的磷酸缓冲液重悬，重悬后离心取上清进行洗滤得到Ferr，加入0.2%叠氮化钠后4℃保存。
经检测，收率为86%，纯度为71%。不经DEAE层析，抗原比活过低。
实施例3 纯化物性能测定
1、铁蛋白含量测定方法： Ferr检测发光试剂盒。
2、铁蛋白稳定性测定方法：2-8℃复溶稳定性和37℃14天加速热稳定性。
3、测定结果
3.1 铁蛋白含量测定结果
按照上述铁蛋白含量测定方法测定实施例1和实施例2和对比例5纯化得到的铁蛋白，其结果如下表1所示：
表1
结论：实施例1和实施例2纯化得到的铁蛋白抗原比活均高于对比例5。
3.2 稳定性测定结果
按照上述酶稳定性测定方法测定实施例1和实施例2纯化得到的铁蛋白，其稳定性结果如下表2所示：
表2
注：表中01代表对照，02代表实施例1，03代表实施例2；Q1代表水平1，Q2代表水平2，Q3代表水平3。
从表2数据可以看出：实施例1和实施例2纯化得到的铁蛋白2℃-8℃放置14d和37℃放置14d稳定性降幅均在10%以下 ，稳定性满足要求。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种纯化Ferr的方法，其包括：胎盘组织匀浆经离心取上清液A；所述上清液A依次经热变除杂、等电点沉淀、DEAE离子交换层析获得Ferr溶液；
所述热变除杂步骤中，温度为70℃，时间为40min~50min；
所述等电点沉淀步骤中，pH值为5.0；
所述DEAE离子交换层析步骤中，以含有NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱梯度为0.1~0.5mol/L，收集含有0.2 mol/L NaCl的洗脱液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上清液A的制备包括：胎盘去除表面层皮和脐带，冲洗后绞碎，以PBS缓冲液重悬获得胎盘组织匀浆，8000~15000rpm，4℃离心30min，取上清液A。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.0~7.4；每g胎盘组织与2mL PBS缓冲液混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热变除杂步骤中，70℃处理40~50min后，还包括8000~15000 rpm，4℃离心30 min，取上清液B。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述等电点沉淀步骤中，所述上清液B与0.1mol/L的醋酸缓冲液混合，混合液中加入硫酸铵至50%饱和度，4℃沉淀8~12h后，8000~15000rpm，4℃离心30min，取沉淀。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上清液B与0.1mol/L的醋酸缓冲液混合的体积比为1：1。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述沉淀以磷酸缓冲液或Tris-HCl溶液重悬，经离心取上清液C上DEAE离子交换层析柱；
所述磷酸缓冲液的浓度为0.01mol/L， pH值为6.8；
所述Tris-HCl溶液的浓度为0.01mol/L， pH值为7.0。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱液为含有NaCl的磷酸缓冲液或含有NaCl的Tris-HCl溶液；
所述磷酸缓冲液的浓度为0.01mol/L， pH值为6.8；
所述Tris-HCl溶液的浓度为0.01mol/L， pH值为7.0；
所述NaCl的浓度依次为0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L。
9.根据权利要求1~7任一项所述的方法，其特征在于，还包括浓缩Ferr溶液的步骤，所述浓缩采用中空纤维柱或膜包，截留分子量为100KDa。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括浓缩Ferr溶液的步骤，所述浓缩采用中空纤维柱或膜包，截留分子量为100KDa。
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