CN110468172A - 一种分离纯化重组lea蛋白的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离纯化重组LEA蛋白的方法及试剂盒，本发明通过盐析去除杂蛋白、采用Ni‑NTA柱亲和层析分离纯化重组LEA蛋白，省去了复杂分子筛的纯化步骤，提高了制备效率，缩短了纯化时间，降低了制备成本。本发明大幅提高了LEA蛋白分离产量，并保持了LEA蛋白结构完整性以确保在应用中应有的蛋白活性。

Description

一种分离纯化重组LEA蛋白的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，涉及一种可溶性重组蛋白的分离纯化方法，具体涉及一种重组LEA蛋白的分离纯化方法。本发明还涉及一种分离纯化重组LEA蛋白的试剂盒。

背景技术

LEA蛋白(Late embryogenesis abundant protein)即胚胎发育后期丰富蛋白，主要作用是参与抵御逆境胁迫，保护逆境中的生物能够维持正常的生命代谢活动。LEA蛋白最早在棉花的子叶中发现，保护组织细胞在种子成熟过程中免受脱水给种子造成的伤害，随后在植物组织细胞、种子细胞和低等动物细胞中都发现LEA蛋白的表达。在干旱、高盐等逆境条件下，诱导产生的高亲水性蛋白保护细胞免受干旱、高盐等逆境的损伤。

研究者已经先后从棉花、大麦、拟南芥、西红柿和一些禾谷类等多种植物以及一些低等动物中克隆了lea基因，并进行了功能研究。LEA蛋白广泛存在于植物和低等生物钟，根据LEA蛋白序列所含有的保守基序，被分为LEA1～LEA6，以及Dehydrin和SMP，共8个家族。LEA蛋白的分子量大多在10KD-30KD之问，少量在30KD以上，其共同特点是富含亲水性的氨基酸，如色氨酸、苏氨酸、丝氨酸等。经大量研究发现，较高的亲水性和热稳定性是大部分LEA蛋白的共同特征。

LEA蛋白能够参与到作物抵御环境胁迫的过程当中，并在此中起到关键作用，这与其氨基酸构成及结构是密切相关的。LEA蛋白含有较高的极性氨基酸，使得其具有较强的亲水性；其次，LEA蛋白通常有保守的重复序列，这些序列在胁迫条件下可以形成高度螺旋折叠，这样的结构可能与某些变性蛋白的膜系统产生疏水作用，通过稳定脂膜或功能蛋白来阻止大量水分散失，从而降低外界环境给细胞内的代谢带来的影响；此外，溶解状态下LEA蛋白在随机构象和α-螺旋之间存在着一种动态平衡，这种动态平衡也是LEA蛋白能够参与作物抵御环境胁迫的原因之一。

以往LEA蛋白的纯化方法主要是使用液相色谱，通过离子交换层析柱和分子筛进行纯化，这种方法纯化LEA蛋白的过程复杂，LEA蛋白的制备效率低，也需要较长的纯化时间。

发明内容

本发明的目的提供一种步骤简化、制备效率高的分离纯化重组LEA蛋白的方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种分离纯化重组LEA蛋白的方法，包括如下步骤：

a)、将重组LEA质粒转化到Rosseta表达菌株，IPTG诱导目标蛋白表达；

b)、经细胞破碎处理所述的菌株样品并获得包含所述LEA蛋白的裂解液；

c)、向裂解液中加入硫酸铵以去除杂质蛋白来获取包含所述蛋白的第一次纯化液；

d)、经Ni-NTA亲和层析处理所述第一次纯化液，通过至少一次咪唑溶液洗脱收集包含所述LEA蛋白的洗脱液。

上述步骤a)具体为转化重组LEA-pET15b质粒并诱导表达获得包含所述LEA蛋白的大肠杆菌样品。

优选地，在步骤b)中，提取重组蛋白质的蛋白抽提液的pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为10～100mmol/L、MgCl₂浓度为0.5～2.5mmol/L。

在上述技术方案的基础上，在步骤b)之后、步骤c)之前还包括如下步骤：

所述裂解液经过离心、去除沉淀步骤，加入30％硫酸铵沉淀杂质蛋白来获得包含所述LEA蛋白的粗提液。

在步骤c)之后、步骤d)之前还包括如下步骤：

向所述裂解液中加入60％硫酸铵，离心获取蛋白的沉淀，沉淀加入溶液溶解获得所述LEA蛋白的第一次纯化液。

更进一步地，在步骤d)中，首先将所述蛋白溶液结合Ni-NTA柱，然后用低浓度咪唑缓冲液洗脱两次，最后高浓度咪唑缓冲液进行洗脱并收集包含所述LEA蛋白的洗脱液；其中，所述低浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L；洗脱缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为300～500mmol/L。

进一步优选地，上述步骤c)中的第一次纯化液还可进行进一步的盐析、过滤步骤。

另外，本发明用于分离纯化重组LEA蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：

用于提取重组蛋白质的蛋白抽提液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为10～100mmol/L、MgCl₂浓度为0.5～2.5mmol/L；

用于去除杂质蛋白的硫酸铵溶液：30％硫酸铵；

用于沉淀目标蛋白的硫酸铵溶液：60％硫酸铵；

用于Ni-NTA清洗层析柱的清洗缓冲液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L；

以及用于洗脱层析柱的洗脱缓冲液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为300～500mmol/L。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

本发明通过盐析去除杂蛋白、采用Ni-NTA柱亲和层析分离纯化LEA蛋白，省去了复杂分子筛的纯化步骤，提高了制备效率，缩短了纯化时间，纯化时间由8小时缩短到5小时。

本发明大幅提高了LEA蛋白分离产量，每1000mL菌株制备LEA蛋白由8mg提高到12mg，并保持了LEA蛋白结构完整性以确保在应用中应有的蛋白活性。

附图说明

图1是本发明的实施例1的破碎前菌体和破碎后上清液进行蛋白SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色，LEA蛋白分子量16KDa，结果显示LEA蛋白溶解表达并且电泳结果大小正确；

图2是本发明的实施例1的吸取30％硫酸铵沉淀前和沉淀、60％硫酸铵沉淀前和沉淀、80％硫酸铵沉淀前和沉淀，SDS-PAGE蛋白变性胶电泳、考马斯亮蓝染色，显示30％硫酸铵去除大量的杂蛋白，60％硫酸铵使LEA蛋白沉淀，80％硫酸铵沉淀中基本没有LEA蛋白；

图3是本发明的实施例1的Ni-NTA柱亲和层析结果图。Ni-NTA柱亲和层析结果：显示20-50mM咪唑去除杂蛋白，300mM咪唑洗脱液中富集纯化的LEA蛋白；

图4是本发明的对比例的分子筛层析后的洗脱液的光吸收分析图，层析结果显示纯化的LEA蛋白洗脱峰在92-130mL排出体积处；

图5是本发明的实施例1的LEA蛋白经过分子筛层析纯化蛋白电泳图，纯化的LEA蛋白分子量约为16KD；

图6是本发明的实施例1的Ni-NTA柱亲和层析纯化的LEA蛋白与对比例分子筛层析纯化LEA蛋白电泳对比图。纯化1样品为实施1中300mM咪唑洗脱液中富集纯化的LEA蛋白，纯化2样品为对比例经过分子筛层析纯化LEA蛋白，两者纯度相似，都达到95％以上。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

在本实施例中，“杂质蛋白”为除重组LEA蛋白外的其他蛋白。

如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练入员所熟悉的意义相同。

实施例1

一种分离纯化重组LEA蛋白的方法，具体步骤如下：

步骤1：将重组LEA-pET15b质粒(购买于Addgene，编号：Plasmid#53093)转化到Rosseta表达菌株(购买于Novagen，编号：70954-3)，IPTG诱导目标蛋白表达，离心收集菌株。

步骤2：用超声细胞破碎菌株、获得LEA蛋白裂解液，所用菌株破碎和LEA蛋白抽提液的pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为20mmol/L、NaCl浓度为100mmol/L、MgCl₂浓度为2.0mmol/L。吸取少量破碎前菌体和破碎后上清液进行蛋白变性胶电泳电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝染色检测LEA蛋白的表达，结果如图1所示。

步骤3：在1000g低速离心机上离心10分钟，保持转头在4℃条件下。

步骤4：收上清液，在12000g高速离心机上离心30分钟，保持转头温度在4℃。

步骤5：收集离心分离的上清液，加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为30％(w/v)，在4℃条件下混合均匀。

步骤6：待沉淀形成后，在15500g高速离心机上离心30分钟，保持转头温度在4℃。

步骤7：收集上清液，向裂解液中加入终浓度为60％(w/v)硫酸铵，在4℃条件下混合均匀。

步骤8：待沉淀形成后，在15500g高速离心机上离心30分钟，保持转头温度在4℃。

步骤9：离心获取蛋白的沉淀，沉淀加入溶液包含所述蛋白的第一次纯化液。吸取30％硫酸铵沉淀前和沉淀、60％硫酸铵沉淀前和沉淀、80％硫酸铵沉淀前和沉淀，进行蛋白变性胶电泳电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝染色检测LEA蛋白的纯化，结果如图2所示。

步骤10：将第一纯化液进一步进行过滤，进行Ni-NTA柱亲和层析。将过滤后的第一纯化液加入到Ni-NTA柱上，，然后用低浓度咪唑缓冲液洗脱两次，最后高浓度咪唑缓冲液进行洗脱并收集包含所述LEA蛋白的洗脱液；其中，所述低浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为20mmol/L、NaCl浓度为100mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L。所述高浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为20mmol/L、NaCl浓度为100mmol/L、咪唑浓度为300mmol/L。

步骤11：吸取少量洗脱液进行蛋白变性胶电泳(SDS-PAGE)，用考马斯亮蓝染色，结果如图3所示。

对比例

取实施例1中步骤10得到的混合洗脱液浓缩至5mL，再将浓缩液加入到分子筛色谱层析柱中进行层析；

用洗脱液洗脱、获得纯化的LEA蛋白，结果如图4所示；

吸取少量洗脱液进行蛋白变性胶电泳电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝染色，选取LEA蛋白富集组分，得到纯化的LEA蛋白，结果如图5所示；

将纯化的LEA蛋白的洗脱液浓缩至2mL，从1000mL菌株浆裂解液可得到7mg纯化的LEA蛋白。

将本对比例分子筛层析纯化得到的LEA蛋白(纯化2样品)与上述实施例1中Ni-NTA柱亲和层析、300mM咪唑洗脱液中富集纯化得到的LEA蛋白(纯化1样品)进行纯度比较，电泳结果如图6所示，从图6可知，Ni-NTA柱亲和层析与分子筛层析纯化LEA蛋白的纯度相似，两者纯度都达到95％以上。

实施例2

与实施例1相比较，不同之处在于以下两个方面：

步骤2：所用菌株破碎和LEA蛋白抽提液的pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15mmol/L、NaCl浓度为50mmol/L、MgCl₂浓度为1.0mmol/L。

步骤10：所述低浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为20mmol/L、NaCl浓度为100mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L。所述高浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为20mmol/L、NaCl浓度为100mmol/L、咪唑浓度为300mmol/L。

实施例3

与实施例1相比较，不同之处在于以下两个方面：

步骤2：所用菌株破碎和LEA蛋白抽提液的pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为25mmol/L、NaCl浓度为100mmol/L、MgCl₂浓度为2.5mmol/L。

步骤10：所述低浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为20mmol/L、NaCl浓度为100mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L。所述高浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为20mmol/L、NaCl浓度为100mmol/L、咪唑浓度为500mmol/L。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)、将重组LEA质粒转化到Rosseta表达菌株，IPTG诱导目标蛋白表达；

b)、经细胞破碎处理所述的菌株样品并获得包含所述LEA蛋白的裂解液；

c)、向裂解液中加入硫酸铵以去除杂质蛋白来获取包含所述蛋白的第一次纯化液；

d)、经Ni-NTA亲和层析处理所述第一次纯化液，通过至少一次咪唑溶液洗脱收集包含所述LEA蛋白的洗脱液。

2.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于：

所述步骤a)具体为转化重组LEA-pET15b质粒并诱导表达获得包含所述LEA蛋白的大肠杆菌样品。

3.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于：

在步骤b)中，提取重组蛋白质的蛋白抽提液的pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为10～100mmol/L、MgCl₂浓度为0.5～2.5mmol/L。

4.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于，在步骤b)之后、步骤c)之前还包括如下步骤：

所述裂解液经过离心、去除沉淀步骤，加入30％硫酸铵沉淀杂质蛋白来获得包含所述LEA蛋白的粗提液。

5.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于，在步骤c)之后、步骤d)之前还包括如下步骤：

向所述裂解液中加入60％硫酸铵，离心获取重组LEA蛋白的沉淀，沉淀加入溶液溶解获得所述LEA蛋白的第一次纯化液。

6.根据权利要求1所述的分离纯化重组LEA蛋白的方法，其特征在于：

在步骤d)中，首先将所述蛋白溶液结合Ni-NTA柱，然后用低浓度咪唑缓冲液洗脱两次，最后高浓度咪唑缓冲液进行洗脱并收集包含所述LEA蛋白的洗脱液；其中，所述低浓度咪唑缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L；洗脱缓冲液pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为300～500mmol/L。

7.一种分离纯化重组LEA蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

用于提取重组蛋白质的蛋白抽提液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为10～100mmol/L、MgCl₂浓度为0.5～2.5mmol/L；

用于去除杂质蛋白的硫酸铵溶液：30％硫酸铵；

用于沉淀目标蛋白的硫酸铵溶液：60％硫酸铵；

用于Ni-NTA清洗层析柱的清洗缓冲液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为20～50mmol/L；

以及用于洗脱层析柱的洗脱缓冲液：pH为8.0～8.4、Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、NaCl浓度为50～200mmol/L、咪唑浓度为300～500mmol/L。