CN114163494A - 一种拮抗氧化应激损伤的章鱼抗氧化肽的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于海产品加工技术领域，公开了一种拮抗氧化应激损伤的章鱼抗氧化肽的制备方法和应用，本发明所述的抗氧化章鱼肽的制备分离纯化包括酶解，超滤，凝胶分离，半制备液相分离，鉴定和化学合成，结合体外ABTS自由基和活性氧自由基清除能力评价追踪获得。所述的抗氧化肽GGAW具有强的清除ABTS自由基和活性氧自由基清除能力，并且能拮抗H₂O₂诱导IEC‑6细胞氧化应激损伤，通过提高胞内SOD和GPX的活性，降低胞内ROS，MDA和LDH含量，有效预防H₂O₂诱导的细胞凋亡，提高细胞活性。可应用于食品，功能营养制品和保健食品领域的研制与开发。

Description

一种拮抗氧化应激损伤的章鱼抗氧化肽的制备方法和应用

技术领域

本发明属于海产品加工技术领域，更具体地，涉及一种拮抗氧化应激损伤的章鱼抗氧化肽的制备方法和应用。

背景技术

食源性抗氧化肽作为一种天然抗氧化剂，易吸收无免疫反应性，能很好的清除活性自由基ROS，防止或降低机体氧化应激发生，在糖尿病、动脉粥样硬化、关节炎和癌症等慢性疾病中起着积极作用。

章鱼是一种头足类软体动物，分布于世界各地的温带和热带水域，由于其蛋白质含量高，具有很高营养价值，同时具有降血糖、降血脂和抗氧化等多种生物活性，在食品工业中备受青睐。多项研究报道显示章鱼蛋白水解物具有很好的抗氧化活性，不同蛋白酶酶解获得的章鱼蛋白水解物具有很好清除DPPH自由基活性，防止胡萝卜素褪色，保护羟自由基诱导的DNA破坏。因此我们寻求食源性抗氧化肽来清除体内过多的自由基，预防或降低机体的氧化平衡失常导致的氧化应激损伤，以维持机体的健康。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供一种章鱼抗氧化肽。

本发明的第二个目的是提供上述章鱼抗氧化肽的应用。

本发明的第三个目的是提供上述章鱼抗氧化肽的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

章鱼抗氧化肽，所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的拮抗氧化应激损伤的抗氧化肽，其氨基酸序列为Gly-Gly-Ala-Trp，用单字母表示为GGAW，即由甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸-色氨酸4个氨基酸残基构成，ESI-MS测定分子量为389.42Da。

该抗氧化肽GGAW能有效清除ABTS自由基并具有强的活性氧自由基清除能力ORAC，并能保护肠上皮细胞IEC-6免受过氧化氢诱导的氧化应激损伤，有效提高胞内超氧化物歧化酶SOD，谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低胞内活性氧ROS和丙二醛MDA和胞外乳酸脱氢酶LDH含量。

因此，本发明还提供所述章鱼抗氧化肽在制备拮抗氧化应激损伤的功能产品中的应用。

优选的，所述章鱼抗氧化肽能清除ABTS自由基和活性氧自由基。

优选的，所述章鱼抗氧化肽能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。

优选的，所述章鱼抗氧化肽能降低氧化应激损伤细胞胞内活性氧，丙二醛和胞外乳酸脱氢酶的含量。

本发明还提供一种拮抗氧化应激损伤的功能产品，含有权利要求1所述章鱼抗氧化肽。

本发明还提供上述章鱼抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)酶解：采用碱性蛋白酶酶解章鱼肉，酶解条件：pH 8.0，加酶量3000U/g，料液比：1/2，温度50℃，酶解时间5h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，过筛，低温离心去除不溶性杂质，上清液经超滤，收集<3kDa组分，冷冻干燥得章鱼蛋白酶解物；

(2)分离纯化：章鱼蛋白酶解物采用凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速5.0mL/min，于波长220nm处收集具有清除ABTS自由基和活性氧自由基能力的活性组分，利用反相高效液相色谱进一步分离制备，RP-HPLC的分离条件为：YMC-Pack ODS-A column反相色谱柱，流速2.5mL/min，流动相A是0.1％TFA超纯水，流动相B是0.1％TFA乙腈，洗脱程序：1-10min，6％B，10-30min，6-49％B，检测波长是220nm，温度40℃，收集并对最高活性组分采用ESI-MS/MS鉴定，分离得到具有最好的抗氧化活性的蛋白肽即制备得到的章鱼抗氧化肽。

优选的，上述制备方法中，步骤(1)所述超滤是将上清液依次用0.2um，100kMWCO和3kMWCO超滤膜超滤。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种拮抗氧化应激损伤的章鱼抗氧化肽的制备方法和应用，本发明所述的抗氧化章鱼肽的制备分离纯化包括酶解，超滤，凝胶分离，半制备液相分离，鉴定和化学合成，结合体外ABTS自由基和活性氧自由基清除能力评价追踪获得。所述的抗氧化肽GGAW具有强的清除ABTS自由基和活性氧自由基清除能力，并且能拮抗H₂O₂诱导IEC-6细胞氧化应激损伤，通过提高胞内SOD和GPX的活性，降低胞内ROS，MDA和LDH含量，有效预防H₂O₂诱导的细胞凋亡，提高细胞活性。可应用于食品，功能营养制品和保健食品领域的研制与开发。

附图说明

图1为章鱼酶解物各超滤组分的抗氧化活性比较；

图2为章鱼酶解物超滤组分<3kDa的凝胶层析色谱图；

图3为章鱼酶解物<3kDa超滤组分的各凝胶分离组分的抗氧化活性比较；

图4为章鱼抗氧化凝胶组分F3的RP-HPL C分离色谱图；

图5为章鱼抗氧化凝胶组分F3的各RP-HPL C分离组分的抗氧化活性比较；

图6为章鱼抗氧化肽GGAW保护H2O2诱导的IEC-6氧化应激损伤，(A)细胞活力，(B)ROS，(C)MDA，(D)LDH，(E)SOD和(F)GSH-PX浓度。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备。

实施例1

本发明所述的抗氧化章鱼肽的制备分离纯化包括酶解，超滤，凝胶分离，半制备液相分离，鉴定和化学合成，结合体外ABTS自由基和活性氧自由基清除能力评价追踪获得。

具体步骤包括：

(1)章鱼蛋白酶解：取鲜活章鱼，洗净，切小块绞肉机匀浆绞碎，加入2倍去离子水，搅拌均匀50℃保温15min，调节pH 8.0，加入碱性蛋白酶3000U/g，50℃恒温水浴振荡5h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温过200筛，30000g，4℃低温离心30min去除不溶性杂质，收集上清酶解液。

(2)章鱼蛋白酶解物超滤：上述收集到的上清酶解液依次用0.2um，10k和3kMWCO超滤膜超滤，分别收集超滤组分，薄膜蒸发浓缩，冷冻干燥得到粉末。经体外ABTS自由基和活性氧自由基清除能力评价收集活性较高的组分<3kDa(附图1)。

(3)章鱼蛋白酶解物的凝胶层析分离：上述<3kDa超滤组分采用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速5.0mL/min，于波长220nm处检测收集得到3个洗脱组分(附图2)，收集具有最好清除ABTS自由基和活性氧自由基能力的活性组分F3(附图3)，浓缩，冷冻干燥。

(4)章鱼抗氧化肽的反相液相分离：利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步分离制备，RP-HPLC的分离条件为：YMC-Pack ODS-A column(250×10mm,I.D.S-5μm,12nm)反相色谱柱，流速2.5mL/min，流动相A是0.1％TFA超纯水，流动相B是0.1％TFA乙腈，洗脱程序：1-10min，6％B，10-30min，6-49％B，检测波长是220nm，温度40℃。收集获得18个组分(附图4)，其中组分15，16和17具有最好的抗氧化活性(附图5)。

(6)章鱼抗氧化肽的鉴定和化学合成：采用高效液相色谱与电喷雾-四级杆-飞行时间串联质谱(ESI-AQ-TOF)联用进行肽序列鉴定。液相条件：YMC-Pack ODS-AQ(250×4.6mm,5μm)色谱柱，柱温40℃，流速1.0mL/min，流动相A为0.1％甲酸超纯水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，洗脱程序：1-10min，20％B；10-35min，20-100％B。质谱条件：正离子模式，一级质谱质量扫描范围200～2000Da，毛细管电压3.8kV。质谱数据采用PEAKS Studio8.0软件进行分析，获得抗氧化活性组分15含有抗氧化活性肽YDADPR,FFMR；活性组分16含有抗氧化活性肽ANQY，AMMLAW，FEGAW和GGAW；活性组分17含有抗氧化肽VDTVVCVW和VVCLW；通过化学合成和体外抗氧化活性评价都具有较好的清除ABTS和活性氧自由基能力，其中GGAW活性最佳(表1)。

表1章鱼抗氧化肽抗氧化活性比较

实施例2

抗氧化肽GGAW拮抗H₂O₂诱导的IEC-6细胞氧化损伤活性研究：将IEC-6于37℃恒温水箱中快速复苏，洗涤离心数次，于RPMI1640培养基及DMEM培养基中扩大培养备用。实验设5组，分别为对照组、H₂O₂组、低剂量样品+H₂O₂组，中剂量样品+H₂O₂组，高剂量样品+H₂O₂组。经0.25％胰蛋白酶消化5min成单细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞数，调整活细胞浓度为2.5×10⁵个/mL加于96孔培养板，培养24h使贴壁，按分组将培养液中分别加入低中高剂量的样品溶液，培养24h后加入H₂O₂(300μmol/L)继续培养6h。采用CCK-8方法检测细胞活性。

对样品按浓度梯度设为4个实验组：

(1)空白对照组

(2)模型对照组：H₂O₂组(300μmol/L)，以下简称H₂O₂组；

(3)GGAW(50μg/ml)+H₂O₂组(300μmol/L)，以下简称GGAW低剂量组；

(4)GGAW(100μg/ml)+H₂O₂组(300μmol/L)，以下简称GGAW中剂量组；

(5)GGAW(200μg/ml)+H₂O₂组(300μmol/L)，以下简称GGAW高剂量组；

将IEC-6细胞经0.25％胰蛋白酶消化0.5-2min成单细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞数，调整活细胞浓度为2.5×10⁵个/ml加于6孔板中，铺板按2ml/孔，培养24h使贴壁后，将各样品分别加入6孔板中，样品液200μl/孔，继续培养24h后，加入H₂O₂(300μmol/L)再培养6h后，采用Annexin-V荧光染色和流式细胞仪进行细胞凋亡检测。先用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1000rpm，4℃离心10min，弃上清液，加入1ml冷PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，重复离心两次。加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI Staining Solution，轻轻混匀，避光室温反应15min，加入300μl Bingding Buffer，上流式细胞仪检测观察细胞生长凋亡情况(图6)。

采用试剂盒检测分析SOD，GPX活性和MDA，ROS，LDH含量，结果显示提高胞内SOD和GSH-PX的活性，降低胞内ROS，MDA和LDH含量，有效预防H₂O₂诱导的细胞凋亡，提高细胞活性(图6)。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种拮抗氧化应激损伤的章鱼抗氧化肽的制备方法和应用

<130> ZM211272ZL

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Gly Gly Ala Trp

1

Claims (8)

1.章鱼抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述章鱼抗氧化肽在制备拮抗氧化应激损伤的功能产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述章鱼抗氧化肽能清除ABTS自由基和活性氧自由基。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述章鱼抗氧化肽能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述章鱼抗氧化肽能降低氧化应激损伤细胞胞内活性氧，丙二醛和胞外乳酸脱氢酶的含量。

6.一种拮抗氧化应激损伤的功能产品，其特征在于，含有权利要求1所述章鱼抗氧化肽。

7.权利要求1所述章鱼抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)酶解：采用碱性蛋白酶酶解章鱼肉，酶解条件：pH 8.0，加酶量3000U/g，料液比：1/2，温度50℃，酶解时间5h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，过筛，低温离心去除不溶性杂质，上清液经超滤，收集<3kDa组分，冷冻干燥得章鱼蛋白酶解物；

(2)分离纯化：章鱼蛋白酶解物采用凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速5.0mL/min，于波长220nm处收集具有清除ABTS自由基和活性氧自由基能力的活性组分，利用反相高效液相色谱进一步分离制备，RP-HPLC的分离条件为：YMC-Pack ODS-A column反相色谱柱，流速2.5mL/min，流动相A是0.1％TFA超纯水，流动相B是0.1％TFA乙腈，洗脱程序：1-10min，6％B，10-30min，6-49％B，检测波长是220nm，温度40℃，收集并对最高活性组分采用ESI-MS/MS鉴定，分离得到具有最好的抗氧化活性的蛋白肽即制备得到的章鱼抗氧化肽。

8.根据权利要求7所述章鱼抗氧化肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述超滤是将上清液依次用0.2um，100kMWCO和3kMWCO超滤膜超滤。

Images