CN105037530B - 一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法 - Google Patents

一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法，针对天然釉原蛋白组分团聚性强、难以纯化分离的问题，本发明利用反相液相色谱的色谱制度，经过对少量样品的梯度洗脱和等度洗脱分析，确定目标蛋白的最有效洗脱浓度范围并设计出梯度洗脱和等度洗脱结合的洗脱制度，从粗提釉原蛋白中一步分离纯化出多种釉原蛋白目标组分。本发明具有过程简单，成本低，产品纯度高等特点，可用于大规模纯化制备多种釉原蛋白组分。

Description

一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及天然蛋白质组分的纯化分离技术领域，具体涉及到一种分离纯化制备牙釉质组织中多种釉原蛋白组分的方法。
背景技术
成熟的牙釉质是人体中最坚硬的生物矿物，牙釉质的有序多层级结构决定牙釉的力学性能。牙釉质的发育和矿化过程受到基质蛋白的调控，其中最主要的基质蛋白组分是釉原蛋白。不同分子量的釉原蛋白组分是源自全序列釉原蛋白，经历信使核糖核酸的选择性剪切或蛋白酶特异性作用而形成的蛋白家族，釉原蛋白含量占发育中的牙釉质基质蛋白总量的90％以上，不同物种的釉原蛋白具有显著的序列同源性，特别是在蛋白的氨基端和羧基端区域，这种序列上的高度保守表明不同物种的釉原蛋白分子间存在特定功能模块的保守性。在牙釉生物矿化过程中，对牙釉质有序多层级结构的构建起着重要的调控作用。不仅如此，以釉原蛋白为主的牙釉基质衍生物，被证明是一种能够诱导促进牙周再生的物质，已经商品化的牙釉基质衍生物药品(BIORA AB,Straumann.Malmo，Sweden)显示了卓越的治疗效果，但是其中具体的有效蛋白组分及其作用机理目前仍然不是十分清晰。分离得到高纯度的天然釉原蛋白组分，在牙釉质矿化机理研究和材料仿生研究，以及牙周再生治疗药物的研发生产等方面，均具有重大的意义。然而釉原蛋白分子具有相当强烈的团聚性，不同分子量片段的釉原蛋白分子，尤其是几种含量最大的釉原蛋白分子，同种分子和不同分子之间互相团聚，形成混合蛋白团聚体，对分离高纯度的单一釉原蛋白组分带来巨大的困难。
基因重组釉原蛋白技术可得到较高纯度的釉原蛋白，但是目前利用基因重组技术在大肠杆菌中表达得到的釉原蛋白与天然釉原蛋白仍存在一定差异，体现在天然釉原蛋白带有一个磷酸化的翻译后修饰位点，即16位上的丝氨酸残基，而基因重组蛋白不具有这个特点。此外，基因重组技术获得的主要是全序列釉原蛋白组分。
从动物的生长发育期牙釉组织中抽提得到粗提釉原蛋白的方案已经十分成熟。进而从粗提釉原蛋白中分离纯化天然釉原蛋白组分的研究工作，在国内国外都有进行，主要应用的是凝胶渗透色谱及反相液相色谱结合等多种方法组合的纯化方式，但现有方法都存在所得釉原蛋白产物纯度不高，纯化周期长，样品损失大，纯化过程重复性低，成本高昂等问题，应用单一技术一步分离纯化粗提釉原蛋白，克服蛋白团聚效应带来的困难，得到多种高纯度釉原蛋白组分的研究未见报道。
发明内容
本发明提供了一种可一步纯化粗提釉原蛋白中的团聚组分，获得多种高纯度天然釉原蛋白组分的分离纯化方法，该方法步骤简单，可重复性好，纯化效率高，成本较低。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法，包含以下步骤：
(1)目标釉原蛋白的反相液相色谱性质梯度洗脱分析:将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，用反相液相色谱系统对釉原蛋白的色谱性质进行梯度洗脱分析，使用任意一个普通梯度洗脱，仅需保证粗提釉原蛋白从色谱柱中完全洗脱的色谱梯度；根据得到的梯度洗脱图谱，确定目标釉原蛋白组分及其相关色谱信息，特别是目标釉原蛋白组分完全洗脱时对应的洗脱液有机相浓度；
(2)目标釉原蛋白的反相液相色谱性质等度洗脱分析：将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，用反相液相色谱系统对目标釉原蛋白的色谱性质进行等度洗脱分析；使用等度洗脱，目标釉原蛋白组分在步骤(1)色谱图中的完全洗脱时对应的洗脱液有机相浓度确定后，以此有机相浓度为参考数值，对该浓度数值附近的有机相浓度，进行一系列的等度洗脱，得到一系列等度洗脱图谱，比较等度洗脱图谱中洗脱峰的分离程度，根据峰分离程度大小确定目标釉原蛋白的最有效洗脱浓度范围(即保留因子的差值大时对应的洗脱浓度范围)；
(3)目标釉原蛋白反相液相色谱分离纯化：将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，根据步骤(2)得到的目标蛋白的最有效洗脱浓度范围，用反相液相色谱系统对目标釉原蛋白的色谱性质进行制备洗脱，洗脱过程中，要延长该最有效洗脱浓度范围对应的时间，进而分离出目标釉原蛋白组分，收集目标釉原蛋白色谱峰对应的洗脱液；采用该洗脱制度，对目标蛋白的一次处理量大，且适合多针连续进样和连续收集；
其中，步骤(1)(2)(3)所述反相液相色谱的条件为：流动相为A相-B相，所述A相为三氟乙酸水溶液，B相为三氟乙酸乙腈溶液。
所述反相液相色谱的条件，步骤(1)(2)采用短分析柱，步骤(3)根据需要选用制备柱或半制备柱。
所述三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.1％，三氟乙酸乙腈溶液的体积浓度为0.1％。
本发明提供的方法可获得多种高纯度的釉原蛋白组分，可用于牙釉质矿化机理研究和材料仿生研究，也可用于牙周再生药品的研发和生产。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明经过对少量样品的梯度洗脱和等度洗脱分析，便可确定目标蛋白的最有效洗脱浓度范围并设计出梯度洗脱和等度洗脱结合的洗脱方案，提供从粗提釉原蛋白中一步分离纯化得到多种高纯度釉原蛋白组分的方法。采用单一技术，通过色谱制度的特别设计，一步分离纯化多种目标釉原蛋白。具有工艺简单易行，操作简单，成本较低，回收率高，制备效率高，可重复性好等特点。
(2)本发明分离的蛋白组分，具有很高的纯度，可以排除其他蛋白组分的影响，适用于牙釉质矿化机理研究和材料仿生研究和牙周再生药品的研发和生产。
附图说明
图1为实施例1中粗提釉原蛋白的反相液相色谱性质梯度洗脱分析结果图。
图2为实施例1中粗提釉原蛋白的反相液相色谱性质等度洗脱分析结果图；从A到G，B流动相的浓度分别为38％，37％，36％，35.5％，35％，34.5％，34％。
图3为实施例1中反相液相色谱分离纯化团聚目标蛋白组分1和组分2的色谱图。
图4为实施例1中得到的组分1的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图，组分1分子量为16918.3，确定为釉原蛋白P148。
图5为实施例1中得到的组分2的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图，组分2分子量为5397.6，确定为釉原蛋白TRAP。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方法不限于此。
实施例1
一种分离纯化制备多种釉原蛋白组分的方法。实施例中以粗提猪牙釉原蛋白中含量最大的两种团聚性釉原蛋白为目标蛋白，其步骤如下：
(1)目标釉原蛋白的反相液相色谱性质梯度洗脱分析：流动相为A相-B相，所述A相为0.1％V/V三氟乙酸水溶液，B相为0.1％V/V三氟乙酸乙腈溶液。色谱柱为WatersSymmetry300TM C4,2.1*50mm,3.5μm分析短柱，流速为0.044ml/min，紫外检测波长为280nm。使用在100分钟流动相B的体积百分比由27％线性上升到47％的线性梯度。色谱图对比色谱梯度曲线，可以观察到含量最大的团聚体对应蛋白在38％浓度B流动相时，全部洗脱流出色谱柱，确定38％有机相浓度为等度梯度洗脱的参考值。
(2)目标釉原蛋白的反相液相色谱性质等度洗脱分析:流动相为A相-B相，所述A相为0.1％V/V三氟乙酸水溶液，B相为0.1％V/V三氟乙酸乙腈溶液。色谱柱为WatersSymmetry300TM C4,2.1*50mm,3.5μm分析短柱，流速为0.044ml/min,紫外检测波长为280nm。流动相B从38％浓度开始，进行一系列的等度洗脱，以峰形顶点对应时间，计算目标蛋白峰的保留因子变化情况，确定目标蛋白的最有效有机相洗脱浓度范围。等度洗脱数据显示猪釉原蛋白中最主要两种蛋白峰为peak 1和peak 2，按peak 1和peak 2的保留时间计算保留因子，比较保留因子的差值，确定粗提猪釉原蛋白中最主要团聚组分的最有效洗脱浓度范围。表1为按照peak1和peak2的保留时间计算的对应保留因子及其差值，可见35％-36％乙腈浓度范围对应的保留因子的差值显著大于其他浓度对应的差值，因此确定粗提猪釉原蛋白中最主要团聚组分中所含蛋白最有效洗脱浓度范围为35％-36％乙腈这一浓度范围。
表1
(3)目标釉原蛋白的反相液相色谱制备色谱制度设计:粗提猪釉原蛋白中最主要团聚组分中所含蛋白组分的最有效洗脱浓度范围为35％-36％，为达到最有效的分离效率，要延长这一洗脱浓度的持续时间，设计的色谱制度为在0-30分钟，流动相B的体积百分比由32％线性上升到35％；在30到70分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为65％和35％；在70到105分钟，流动相B的体积百分比由35％线性上升到38％；在105-110分钟，流动相B的体积百分比线性上升至45％；110-115分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为55％和45％；115-116分钟，流动相B的体积百分比线性下降至32％；在116-130分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为68％和32％。多针进样，收集含量较大的色谱峰对应的组分1和组分2，冷冻干燥得到蛋白干粉。
将得到的两种蛋白组分1和组分2，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行纯度评定和分子量检测。上述方法得到的两种团聚蛋白，蛋白质组分1和蛋白质组分2均具有很高的纯度。根据测得的蛋白质分子量与蛋白质库中猪釉原蛋白家族中各个蛋白进行比对，确定组分1为猪釉原蛋白家族中的P148,具有的氨基酸序列为：
MPLPPHPGHPGYINFSPYEVLTPLKWYQNMIRHPYTSYGYEPMGGWLHHQIIPVVSQQTPQSHALQPHHHIPMVPAQQPGIPQQPMMPLPGQHSMTPTQHHQPNLPLPAQQPFQPQPVQPQPHQPLQPQSPMHPIQPLLPQPPLPPMFS
组分2为猪釉原蛋白家族中的TRAP，具有的氨基酸序列为：
MPLPPHPGHPGYINFSPYEVLTPLKWYQNMIRHPYTSYGYEPMGGW
其中上标P为磷酸基。
组分1和组分2是粗提猪釉原蛋白团聚体中的蛋白组分，且以高纯度的状态得以分离纯化。组分1和组分2均带有一个磷酸化的翻译后修饰位点，即16位上的丝氨酸残基，因此，本发明方法可以制得天然釉原蛋白。

Claims (1)

1.一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)目标釉原蛋白的反相液相色谱性质梯度洗脱分析：将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，用反相液相色谱系统对釉原蛋白的色谱性质进行梯度洗脱分析，使用任意一个普通梯度洗脱，仅需保证粗提釉原蛋白从色谱柱中完全洗脱的色谱梯度；根据得到的梯度洗脱图谱，确定目标釉原蛋白组分及其相关色谱信息，特别是目标釉原蛋白组分完全洗脱时对应的洗脱液有机相浓度；
(2)目标釉原蛋白的反相液相色谱性质等度洗脱分析：将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，用反相液相色谱系统对目标釉原蛋白的色谱性质进行等度洗脱分析；使用等度洗脱，目标釉原蛋白组分在步骤(1)色谱图中的完全洗脱时对应的洗脱液有机相浓度确定后，以此有机相浓度为参考数值，对该浓度数值附近的有机相浓度，进行一系列的等度洗脱，得到一系列等度洗脱图谱，比较等度洗脱图谱中洗脱峰的分离程度，根据峰分离程度大小确定目标釉原蛋白的最有效洗脱浓度范围；
(3)目标釉原蛋白反相液相色谱分离纯化：将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，根据步骤(2)得到的目标蛋白的最有效洗脱浓度范围，用反相液相色谱系统对目标釉原蛋白的色谱性质进行制备洗脱，洗脱过程中，要延长该最有效洗脱浓度范围对应的时间，进而分离出目标釉原蛋白组分，收集目标釉原蛋白色谱峰对应的洗脱液；
其中，步骤(1)中，所述的色谱柱为2.1＊50mm，3.5μm分析短柱，反向色谱的条件为：流动相A相-B相，所述A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；使用在100分钟流动相B的体积百分比由27％线性上升到47％的线性梯度洗脱；
其中，步骤(2)中，所述的色谱柱为2.1＊50mm，3.5μm分析短柱，反向色谱的条件为：流动相A相-B相，所述A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；流动相B从38％浓度开始，进行一系列的等度洗脱；
其中，步骤(3)中，所述的色谱柱为制备柱或半制备柱；流动相A相-B相，所述A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；色谱制度为在0-30分钟，流动相B的体积百分比由32％线性上升到35％；在30到70分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为65％和35％；在70到105分钟，流动相B的体积百分比由35％线性上升到38％；在105-110分钟，流动相B的体积百分比线性上升至45％；110-115分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为55％和45％；115-116分钟，流动相B的体积百分比线性下降至32％；在116-130分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为68％和32％；
所述的釉原蛋白为猪釉原蛋白；
所述的目标釉原蛋白为P148和TRAP。
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