CN105890960A - 一种蛋白质预分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质预分离方法，用尺寸排阻色谱填料、反向色谱填料或离子交换色谱填料作为固定相填料，将固定相填料与蛋白质混合物混合后，先加入一个强度的洗脱缓冲液，充分混合并离心处理，收集洗脱缓冲液，再将固定相填料依次用不同强度的洗脱缓冲液洗脱，分别离心处理并收集洗脱缓冲液，基于蛋白质混合物中不同性质的蛋白质被分别收集到不同强度的洗脱缓冲液中，实现蛋白质混合物的预分离。与现有技术相比，本发明的预分离方法不仅处理容量无限制，非常有利于多维分离；而且仪器设备易得，分析成本低，操作也非常简便快速，适用于蛋白质的高分辨高效预分离。

Description

一种蛋白质预分离方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白质的预分离方法，主要涉及与生物质谱相关的系统生物学、蛋白质组学等技术领域。
背景技术
近两三年来，系统生物学成为了生物学的前沿研究方向，旨在系统研究人体疾病发生发展统计规律，从而实现个性化药物，也就是疾病的早预防、早诊断，和早治疗；同时也利用疾病标志物进行药物研发及治疗效果评估。疾病标志物一般是蛋白质；这些标志蛋白需从复杂的人体蛋白质混合物中定性定量鉴定出来；这个工作目前主要是由高效液相色谱-质谱联用分析来完成。由于蛋白质混合物往往包含数十万到数百万个蛋白，复杂性极高，质谱检测上游往往需要多维(包括反相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱等)预分离与分离。反相色谱因其洗脱流动相与质谱兼容，且同时具有高分辨的特点，一般被用在最后一维与质谱连用，实现在线分离分析；反相上游的预分离一般也是在色谱柱中进行的，且需要价格较昂贵的高压色谱泵来提供洗脱用的高压流动相。本发明发展了一种基于非色谱柱的预分离方法，能取得同样的预分馏效果；但避免了整套高效液相色谱仪器，大大节约了成本。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简便经济、高效、高分辨的蛋白质预分离方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种蛋白质预分离方法，用尺寸排阻色谱填料、反向色谱填料或离子交换色谱填料作为固定相填料，将固定相填料与蛋白质混合物混合后，先加入一个强度的洗脱缓冲液，充分混合并离心处理，收集洗脱缓冲液，再将固定相填料依次用不同强度的洗脱缓冲液洗脱，分别离心处理并收集洗脱缓冲液，基于蛋白质混合物中不同性质的蛋白质被分别收集到不同强度的洗脱缓冲液中，实现蛋白质混合物的预分离。
基于蛋白质混合物中不同性质的蛋白质，是指按蛋白质大小、疏水性、所带电荷数量等进行区分的蛋白质。
本发明的一个优选实施方式为，以反向色谱填料作为固定相填料，将固定相填料与蛋白质混合物混合后，先加入一个强度的洗脱缓冲液，充分混合并离心处理，收集洗脱缓冲液，再将固定相填料依次用不同强度的洗脱缓冲液洗脱，分别离心处理并单独收集洗脱缓冲液，基于蛋白质混合物中疏水性不同的蛋白质被分别收集到不同强度的洗脱缓冲液中，实现蛋白质混合物按疏水性不同的预分离。
对于上述优选实施方式，具体包括以下步骤：
(1)将反相色谱填料与蛋白质混合物混合后，加入一级洗脱缓冲液，充分混合后，离心后，液相即为一级洗脱缓冲液，固相为反相色谱填料；
(2)将上步骤处理后的反相色谱填料，依次用二级～五级洗脱缓冲液洗脱，分别离心处理并单独收集不同级别的洗脱缓冲液，基于蛋白质混合物中疏水性不同的蛋白质被分别收集到不同强度的洗脱缓冲液中，实现蛋白质混合物按疏水性不同的预分离。
进一步的，所述的反相色谱填料优选为反相C5填料，所述的反相C5填料经色谱纯乙腈润湿处理后使用。
进一步的，所述的蛋白质混合物为大肠杆菌蛋白质溶液。
进一步的，所述的一级洗脱缓冲液～五级洗脱缓冲液分别由不同体积比的A缓冲液与B缓冲液配制而成。在针对不同蛋白质混合物时，洗脱缓冲液的级数不仅仅限定为五级，可以采用更多级或更少级，级数要求是能够满足蛋白质按不同性质能够分离。
进一步的，所述的一级洗脱缓冲液～五级洗脱缓冲液中，B缓冲液的体积比分别为30％、40％、60％、80％以及100％。在针对不同蛋白质混合物时，不同级数洗脱缓冲液的组成可以变化，可以采用不同的A缓冲液与B缓冲液的配比，不同级数洗脱缓冲液的组成要求是能够满足蛋白质按不同性质能够分离。
进一步的，所述的缓冲液A的组成按体积比为：95％水、4.8％乙腈，0.2％甲酸；所述的缓冲液B的组成按体积比为：95％乙腈、4.8％水，0.2％甲酸。在针对不同蛋白质混合物时，A缓冲液与B缓冲液的组成也可以进行变化，A缓冲液与B缓冲液的组成满足在配制成不同级数洗脱缓冲液后能够满足蛋白质按不同性质能够分离的要求。
本发明涉及的方法同样适用于多肽混合物和其他混合物的预分离。
与现有技术相比，本发明的预分离方法基于所述蛋白混合物与色谱填料的不同结合力，用不同洗脱强度的缓冲液借助离心分步进行分离。本发明的预分离方法对蛋白质混合物进行预分离，分离效率高，操作简便，所需设备便宜易得。适用于蛋白质混合物的定性定量分析。
附图说明
图1为基于反相色谱填料和离心分离的大肠杆菌蛋白质混合物预分离实验流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
基于反相色谱填料和离心分离的大肠杆菌蛋白质混合物预分离实验流程如图1所示，具体步骤如下：
(1)反相C5填料的润湿。过程如下：用分析天平称取Phenomenex公司JupiterC5填料(粒径5um，表面积30050mg于1.5mL离心管中，用移液枪加入色谱纯乙腈500uL,在涡旋仪上混合10分钟后离心1分钟(15000rpm)，倾倒出上层清亮的乙腈。
(2)大肠杆菌蛋白质溶液(0.30ug/uL)66.7uL与30％v/v缓冲液B(另包含70％v/v缓冲液A)133.3uL混匀后加入到上述离心管中，在涡旋仪上混合10分钟后用离心1分钟(15000rpm)，用移液枪取出上层清夜，即为30％v/v缓冲液B的馏分；带填料的离心管继续下一步骤。
缓冲液A的组成为：95％水、4.8％乙腈，0.2％甲酸；缓冲液B的组成为：95％乙腈、4.8％水，0.2％甲酸；均为体积比。
(3)于上述步骤(2)中的离心管中加入200uL40％v/v缓冲液B(同时包含60％v/v缓冲液A)，在涡旋仪上混合10分钟后用离心1分钟(15000rpm)，用移液枪取出上层清夜，即为40％v/v缓冲液B的馏分。
(4)分别用60％v/v缓冲液B(同时包含40％v/v缓冲液A)、80％v/v缓冲液B(同时包含20％v/v缓冲液A)、100％v/v缓冲液B重复步骤(3)中的预分离，分别得到60％v/v缓冲液B、80％v/v缓冲液B和100％v/v缓冲液B对应的馏分。
从上述步骤预分离得到的5个馏分中的蛋白含量用BCA法测定的结果如表1所示。5个馏分的总回收率为47.9％；与基于色谱柱的预分离的效率相当。
表1大肠杆菌蛋白质混合物200ug预分离结果
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种蛋白质预分离方法，其特征在于，用尺寸排阻色谱填料、反向色谱填料或离子交换色谱填料作为固定相填料，将固定相填料与蛋白质混合物混合后，先加入一个强度的洗脱缓冲液，充分混合并离心处理，收集洗脱缓冲液，再将固定相填料依次用不同强度的洗脱缓冲液洗脱，分别离心处理并收集洗脱缓冲液，基于蛋白质混合物中不同性质的蛋白质被分别收集到不同强度的洗脱缓冲液中，实现蛋白质混合物的预分离。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白质预分离方法，其特征在于，基于蛋白质混合物中不同性质的蛋白质，是指按蛋白质大小、疏水性、所带电荷数量进行区分的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白质预分离方法，其特征在于，以反向色谱填料作为固定相填料，将固定相填料与蛋白质混合物混合后，先加入一个强度的洗脱缓冲液，充分混合并离心处理，收集洗脱缓冲液，再将固定相填料依次用不同强度的洗脱缓冲液洗脱，分别离心处理并单独收集洗脱缓冲液，基于蛋白质混合物中疏水性不同的蛋白质被分别收集到不同强度的洗脱缓冲液中，实现蛋白质混合物按疏水性不同的预分离。
4.根据权利要求3所述的一种蛋白质预分离方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将反相色谱填料与蛋白质混合物混合后，加入一级洗脱缓冲液，充分混合后，离心后，液相即为一级洗脱缓冲液，固相为反相色谱填料；
(2)将上步骤处理后的反相色谱填料，依次用二级～五级洗脱缓冲液洗脱，分别离心处理并单独收集不同级别的洗脱缓冲液，基于蛋白质混合物中疏水性不同的蛋白质被分别收集到不同强度的洗脱缓冲液中，实现蛋白质混合物按疏水性不同的预分离。
5.根据权利要求4所述的一种蛋白质预分离方法，其特征在于，所述的反相色谱填料优选为反相C5填料，所述的反相C5填料经色谱纯乙腈润湿处理后使用。
6.根据权利要求4所述的一种蛋白质预分离方法，其特征在于，所述的蛋白质混合物为大肠杆菌蛋白质溶液。
7.根据权利要求4所述的一种蛋白质预分离方法，其特征在于，所述的一级洗脱缓冲液～五级洗脱缓冲液分别由不同体积比的A缓冲液与B缓冲液配制而成。
8.根据权利要求7所述的一种蛋白质预分离方法，其特征在于，所述的一级洗脱缓冲液～五级洗脱缓冲液中，B缓冲液的体积比分别为30％、40％、60％、80％以及100％。
9.根据权利要求7所述的一种蛋白质预分离方法，其特征在于，所述的缓冲液A的组成按体积比为：95％水、4.8％乙腈，0.2％甲酸；所述的缓冲液B的组成按体积比为：95％乙腈、4.8％水，0.2％甲酸。
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