发明内容
本发明的一个方面提供了一种制备N端为焦谷氨酸的寡肽的方法,该方法包括:
方法(一):将N端为谷氨酸的寡肽样品溶解在pH值2~6的缓冲液中,加入催化量的CuCl2,于60~95℃加热,将溶液冷冻干燥后即得相应的N端为焦谷氨酸的寡肽。或
方法(二):将N端为谷氨酸的寡肽样品在固相下均匀加热,得到相应的N端为焦谷氨酸的寡肽。其中,均匀加热的方式例如:将样品在导热良好的金属板上铺成薄层然后加热,为达到此目的可以采取其他类似的加热手段,如微波加热、铺成薄层光照加热等。
上述方法中,其中寡肽是指氨基酸数目少于等于10的多肽,优选氨基酸数为3的寡肽。
上述方法(一)中,缓冲液的pH优选为3.5~4.5,缓冲液可以是甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液或磷酸盐缓冲液等,所述甲酸铵缓冲液是指甲酸铵和甲酸构成的缓冲溶液;所述乙酸铵缓冲液是指乙酸铵和乙酸构成的缓冲溶液;所述的磷酸盐缓冲液是指阴离子为PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -,阳离子为H+、Na+或/和K+构成的缓冲溶液。优选使用磷酸盐缓冲溶液,更优选磷酸的纳盐缓冲溶液或磷酸的钾盐缓冲溶液。缓冲液中样品浓度为0.1~10mg/ml,优选为0.5~3mg/ml。催化量的CuCl2可以以固体的形式加入,也可以配置成溶液滴加,优选配置成0.05-0.2mol/l的CuCl2滴加1~10滴。加热温度优选为60~90℃,更优选80~90℃,加热时间1~4h,优选1.5~3h。
上述方法(二)中,优选在100~150℃加热0.5~4h,更优选在120~130℃加热1~2h。
本发明的另一个方面在于提供了下述三个三肽化合物的制备方法。本发明所称的“三肽化合物”,如无特别说明即是指下述三个具体的三肽中的一个或全部:焦谷氨酰赖氨酰色氨酸(pyroGlu-Lys-Trp)、焦谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸(pyroGlu-Asn-Trp)、焦谷氨酰谷氨酰胺酰色氨酸(pyroGlu-Gln-Trp)。所述的三肽化合物均为现有技术公开过的从蛇毒中提取的寡肽。所述的“原料三肽”是谷氨酰赖氨酰色氨酸(Glu-Lys-Trp)、谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸(Glu-Asn-Trp)、谷氨酰谷氨酰胺酰色氨酸(Glu-Gln-Trp)。
上述三个三肽化合物的制备方法包括:
方法(一):将N端为谷氨酸的原料三肽样品溶解在pH值2~6的缓冲液中,加入催化量的CuCl2,于60~95℃加热,将溶液冷冻干燥后即得相应的N端为焦谷氨酸的三肽化合物。或
方法(二):将N端为谷氨酸的原料三肽样品在固相下均匀加热,得到相应的N端为焦谷氨酸的三肽化合物。其中,均匀加热的方式例如:将样品在导热良好的金属板上铺成薄层然后加热,为达到此目的可以采取其他类似的加热手段,如微波加热、铺成薄层光照加热等。
上述方法(一)中,缓冲液的pH优选为3.5~4.5,缓冲液可以是甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液或磷酸盐缓冲液等,所述甲酸铵缓冲液是指甲酸铵和甲酸构成的缓冲溶液;所述乙酸铵缓冲液是指乙酸铵和乙酸构成的缓冲溶液;所述的磷酸盐缓冲液是指阴离子为PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -,阳离子为H+、Na+或/和K+构成的缓冲溶液。优选使用磷酸盐缓冲溶液,更优选磷酸的纳盐缓冲溶液或磷酸的钾盐缓冲溶液。缓冲液中样品浓度为0.1~10mg/ml,优选为0.5~3mg/ml。催化量的CuCl2可以以固体的形式加入,也可以配置成溶液滴加,优选配置成0.05-0.2mol/l的CuCl2滴加1~10滴。加热温度优选为60~90℃,更优选80~90℃,加热时间1~4h,优选1.5~3h。
上述方法(二)中,优选在100~150℃加热0.5~4h,更优选在120~130℃加热1~2h。
本发明仅涉及N末端为谷氨酸的寡肽或原料三肽经过焦谷氨酸化成为相应的N末端为焦谷氨酸的寡肽或三肽化合物,并不涉及肽键的形成。所述的N末端为谷氨酸的寡肽或原料三肽可以通过现有多肽合成技术获得,如固相合成、液相合成、酶合成等,也可以由天然产物提取得到。
本发明所述三肽化合物的结构确证:经过质谱分析采用本方法制备得到的三个三肽化合物的相对分子质量分别为:443、429和443。紫外吸收光谱扫描结果显示,三个样品均在280nm有最大吸收。对三个样品分别进行茚三酮反应检测,结果均不显色,提示样品N端-NH2封闭,即N端为焦谷氨酸。氨基酸测序表明:三个样品从C端到N端的氨基酸分别为Trp和Lys,Trp和Asn或Trp和Gln。综上数据分析得到的三个三肽化合物分别为:pyroGlu-Lys-Trp,pyroGlu-Asn-Trp,pyroGlu-Gln-Trp。
本发明所述的制备方法还可以包括如下的纯化步骤,所述的纯化步骤包括将反应产物进一步用制备型HPLC进行反相层析纯化。其中所用的层析柱可以为本领域常用的反相介质为填料的层析柱;优选硅胶为骨架,表面键合有C18或C8反相层析介质的层析柱;最优选硅胶为骨架,表面键合C18反相层析介质的层析柱。纯化所采用的洗脱方式优选为梯度洗脱。流动液优选由三氟乙酸(TFA)水溶液和三氟乙酸(TFA)乙腈溶液组成,更优选三氟乙酸(TFA)水溶液的浓度为0.05-0.2%,三氟乙酸(TFA)乙腈溶液的浓度为0.05-0.2%的流动相;最优选三氟乙酸(TFA)水溶液的浓度为0.1%,三氟乙酸(TFA)乙腈溶液的浓度为0.1%的流动相。
本发明所述的制备方法简便易行、所用的原料易于获得,成本低廉。并且该方法所得到产品易于后续处理,能够得到纯度很高的产品。
本发明的再一个方面在于提供所述寡肽在制备抗肿瘤药物中的应用。发明人通过体外肿瘤细胞增殖抑制试验进行筛选,发现本发明方法所制备的pyroGlu-Lys-Trp、pyroGlu-Asn-Trp和pyroGlu-Gln-Trp三肽化合物对胃腺癌细胞、乳腺癌细胞和人肝癌细胞均有较强的抑制活性。
具体实施方式
实施例1:N端为谷氨酸的多肽样品的合成
称取Fmoc-Trp-Wang Resin 0.6779g(0.59mmol/g)置于多肽合成仪的反应器中,加入10mlDMF混合1小时,使树脂充分溶胀。加入25%PIP(DMF)溶液10ml,混合30min后,用DMF洗涤,洗涤结束后即可进行偶联反应。混合反应器中加入0.7591g Fmoc-Lys(Trt)-OH,0.64mol/L HOBT(DMF)溶液2.5ml,0.53mol/L DIC(DMF)溶液3ml和DMF 3ml进行反应,反应温度为室温,以茚三酮反应确定反应终点,得到Fmoc-Lys(Trt)-Trp-Wang Resin。
偶联反应结束后,用10ml DMF洗涤,加入25%PIP的DMF溶液10ml,进行脱保护30min,反应结束后用DMF洗涤,向反应器加入0.6831gFmoc-Glu(OtBU)-OH,以及0.64mol/L HOBT(DMF)溶液2.5ml,0.53mol/L DIC(DMF)溶液3ml和DMF 3ml进行反应,反应温度为室温,以茚三酮反应确定反应终点,最终得到Fmoc-Glu(OtBU)-Lys(Trt)-Trp-Wang Resin。
真空干燥合成的树脂肽,加入裂解试剂进行裂解。裂解试剂的配比为:TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水/TIS=82/3/5/5/4/1,室温搅拌反应3小时,裂解结束后,用石英漏斗进行抽滤,树脂加少量TFA洗涤,合并抽滤液,向裂解抽滤液中,按10倍量加入冰乙醚,沉淀多肽,离心,弃上清,沉淀再加乙醚洗涤离心6次,真空干燥,称重得Glu-Lys-Trp 0.40241g。
以0.7011g Fmoc-Trp-Wang Resin(0.59mmol/g)、0.9426g Fmoc-Asn(Trt)-OH和0.704gFmoc-Glu(OtBU)-OH为原料,同法合成可得到Glu-Asn-Trp 0.18803g。
以0.7124g Fmoc-Trp-Wang Resin(0.59mmol/g)、1.027g Fmoc-Gln(Trt)-OH和0.715gFmoc-Glu(OtBU)-OH为原料,同法合成可得到Glu-Gln-Trp 0.22254g。
实施例2
将实施例1得到的Glu-Lys-Trp三肽溶解在pH为2的磷酸钠盐缓冲液中,控制样品浓度为1mg/ml,加入0.1mol/l的CuCl2三滴。于60℃水浴加热4h,将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Lys-Trp。产物使用Q-Tof mirco(Waters公司)质谱仪进行质谱分析,见附图1。
实施例3
将实施例1得到的Glu-Gln-Trp溶解在pH为6的磷酸钠盐缓冲液中,控制样品浓度为3mg/ml,加入0.1mol/l的CuCl2三滴。于85℃水浴加热2h,将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Gln-Trp。产物使用Q-Tof mirco(Waters公司)质谱仪进行质谱分析,见附图3。
实施例4
将实施例1得到的Glu-Asn-Trp溶解在pH为4磷酸钾盐缓冲液中,控制样品浓度为10mg/ml,加入0.2mol/l的CuCl2三滴。于90℃水浴加热2h,将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Asn-Trp。进一步纯化后可得纯度大于98%的终产物。
纯化条件:
层析柱:Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm);1.9×150mm
柱体积(CV):42.5ml
流速:10.0ml/min
流动液组成A:0.2%TFA水溶液 B:0.2%TFA的乙腈溶液
检测波长:215nm
梯度洗脱并收集洗脱液,利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析,根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。反相高效液相(RP-HPLC)色谱图见附图6。
产物使用Q-Tof mirco(Waters公司)质谱仪进行质谱分析,见附图2。
产物使用Q-Tof mirco(Waters公司)质谱仪进行高分辨率质谱分析,见附图4。
实施例5
将实施例1得到的Glu-Lys-Trp溶解在pH为3.5的乙酸铵缓冲液中,控制样品浓度为0.5mg/ml,调节,加入0.1mol/l的CuCl2三滴。于80℃水浴加热2h,将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Lys-Trp。进一步纯化后可得纯度大于98%的终产物。
纯化条件:
层析柱:Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm);1.9×150mm
柱体积(CV):42.5ml
流速:10.0ml/min
流动液组成A:0.1%TFA水溶液 B:0.1%TFA的乙腈溶液
检测波长:215nm
梯度洗脱并收集洗脱液,利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析,根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。反相高效液相(RP-HPLC)色谱图见附图5。
实施例6
将实施例1得到的Glu-Gln-Trp溶解在pH为4.5的甲酸铵缓冲液中,控制样品浓度为8mg/ml,加入0.1mol/l的CuCl2三滴。于75℃水浴加热3h,将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Gln-Trp。进一步纯化后可得纯度大于98%的终产物。
纯化条件:
层析柱:Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm);1.9×150mm
柱体积(CV):42.5ml
流速:10.0ml/min
流动液组成A:0.1%TFA水溶液 B:0.1%TFA的乙腈溶液
检测波长:215nm
梯度洗脱并收集洗脱液,利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析,根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。反相高效液相(RP-HPLC)色谱图见附图7。
实施例7
将实施例1得到的Glu-Lys-Trp铺成薄层,于100℃加热1h,促使焦谷氨酸化,即得pyroGlu-Lys-Trp。反应后样品进一步纯化后可得纯度大于98%的焦谷氨酸化样品。
实施例8
将实施例1得到的Glu-Asn-Trp铺成薄层,于150℃加热1h,促使焦谷氨酸化,即得pyroGlu-Asn-Trp。反应后样品进一步纯化后可得纯度大于98%的焦谷氨酸化样品。
纯化条件:
层析柱:Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm);1.9×150mm
柱体积(CV):42.5ml
流速:10.0ml/min
流动液组成A:0.2%TFA水溶液 B:0.2%TFA的乙腈溶液
检测波长:215nm
梯度洗脱并收集洗脱液,利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析,根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。
实施例9
将实施例1得到的Glu-Gln-Trp铺成薄层,于125℃加热1h,促使焦谷氨酸化,即得pyroGlu-Gln-Trp。反应后样品进一步纯化后可得纯度大于98%的焦谷氨酸化样品。
纯化条件:
层析柱:Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm);1.9×150mm
柱体积(CV):42.5ml
流速:10.0ml/min
流动液组成A:0.05%TFA水溶液 B:0.05%TFA的乙腈溶液
检测波长:215nm
梯度洗脱并收集洗脱液,利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析,根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。
实施例10:体外肿瘤细胞增殖抑制活性筛选
实验方法:将处于细胞对数生长期的人低分化胃腺癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞SMMC-7721分别按一定的细胞量(2500-4000/孔)接种于96孔培养板内,培养24h后分别加入以上实施例制备的焦环化的三肽样品,细胞在37℃,5%CO2条件下继续培养48小时后,加入MTT后继续培养4小时,用DMSO溶解,在酶标仪490nm下进行检测。具体数据见表一。
表一:pyroGlu-Lys-Trp对人低分化胃腺癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制率
表二:pyroGlu-Asn-Trp对人低分化胃腺癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制率
表三:pyroGlu-Gln-Trp对人低分化胃腺癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制率
由以上结果可知:本发明方法所制备的pyroGlu-Lys-Trp、pyroGlu-Asn-Trp和pyroGlu-Gln-Trp三肽化合物对胃腺癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231和人肝癌细胞SMMC-7721均有较强的抑制活性。